Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Amputacja i regeneracja palców dorosłych myszy : prosty model do badania powstawania blastemy i kostnienia śródbłoniastego u ssaków

9.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59749

⸱

12 lipca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Texas A&M University, 2Department of Veterinary Integrative Biosciences, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Texas A&M University, 3Department of Neurosurgery, University of Mississippi Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół amputacji terminalnego paliczka dorosłej myszy w celu zbadania powstawania blastema u ssaków i kostnienia wewnątrzbłoniastego, analizowany za pomocą immunohistochemii fluorescencyjnej i sekwencyjnej tomografii mikrokomputerowej in vivo.

Streszczenie

Tutaj prezentujemy protokół amputacji dystalnego paliczka końcowego (P3) dorosłej myszy, proceduralnie prosty i powtarzalny model regeneracji epimorficznej u ssaków, który obejmuje powstawanie blastema i kostnienie śródbłoniaste analizowane za pomocą immunohistochemii fluorescencyjnej i sekwencyjnej mikrotomografii komputerowej in vivo (μCT). Regeneracja ssaków ogranicza się do amputacji przecinających dystalną część paliczka końcowego (P3); Palce amputowane na bardziej proksymalnym poziomie nie regenerują się i ulegają zwłóknieniu i tworzeniu się blizn. W odpowiedzi regeneracyjnej pośredniczy tworzenie proliferacyjnej blastemy, po której następuje regeneracja kości poprzez kostnienie śródbłoniaste w celu przywrócenia amputowanej długości szkieletu. Amputacja P3 jest modelem przedklinicznym do badania regeneracji epimorficznej u ssaków i jest potężnym narzędziem do projektowania strategii terapeutycznych mających na celu zastąpienie gojenia zwłóknienia skuteczną reakcją regeneracyjną. Nasz protokół wykorzystuje immunohistochemię fluorescencyjną do 1) identyfikacji wczesnych i późnych populacji komórek blastema, 2) badania rewaskularyzacji w kontekście regeneracji oraz 3) badania kostnienia wewnątrzbłoniastego bez konieczności stosowania skomplikowanych urządzeń do stabilizacji kości. Demonstrujemy również zastosowanie sekwencyjnego μCT in vivo do tworzenia obrazów o wysokiej rozdzielczości w celu zbadania zmian morfologicznych po amputacji, a także ilościowego określenia zmian objętości i długości tej samej cyfry w trakcie regeneracji. Uważamy, że protokół ten oferuje ogromną użyteczność w badaniu zarówno epimorficznych, jak i regeneracyjnych reakcji tkanek u ssaków.

Wprowadzenie

Ssaki, w tym ludzie i myszy, mają zdolność do regeneracji końcówek swoich palców po dystalnej amputacji paliczka końcowego (P3)1,2,3. U myszy reakcja regeneracyjna jest zależna od poziomu amputacji; Coraz częściej proksymalne amputacje palców wykazują stopniowo osłabioną odpowiedź regeneracyjną, aż do całkowitego niepowodzenia regeneracyjnego przy amputacjach przechodzących i proksymalnych do macierzy paznokcia P34,5,6,7,8. W regeneracji P3 pośredniczy tworzenie blastemy, definiowanej jako populacja proliferujących komórek, które ulegają morfogenezie w celu regeneracji amputowanych struktur9. Tworzenie blastemy w celu regeneracji struktur utraconych w wyniku amputacji, proces określany jako regeneracja epimorficzna, odróżnia wielotkankową odpowiedź regeneracyjną P3 od tradycyjnej naprawy tkanek po urazie6,10. Regeneracja P3 to powtarzalny i proceduralnie prosty model do badania złożonych procesów regeneracyjnych, w tym gojenia się ran11,12, histoliza kości11,12, rewaskularyzacja13, regeneracja nerwów obwodowych14, oraz blastemalna konwersja do kości poprzez śródbłoniaste kostnienie15.

Poprzednie badania z użyciem immunohistochemii wykazały, że blastema jest niejednorodna, awaskularna, niedotleniona i wysoce proliferacyjna11,13,15,16. Po dystalnej amputacji P3 wczesna blastema jest początkowo związana z okostną P3 i śródkrwistym i charakteryzuje się silną proliferacją i rodzącą się osteogenezą w sąsiedztwie powierzchni kości15. Po degradacji kości i zamknięciu rany, niejednorodna blastema powstaje w wyniku połączenia komórek związanych z okostną i endokostną, a następnie różnicowania składników blastemalnych, w tym kości, poprzez śródbłoniaste kostnienie15.

Naprawa kości w odpowiedzi na uraz zazwyczaj następuje przez kostnienie śródchrzęstne, tj. przez początkowy chrzęstny kalus, który tworzy szablon do późniejszego tworzenia kości17,18. Śródbłoniaste kostnienie kości długiej, tj. tworzenie kości bez chrzęstnego elementu pośredniego, jest zwykle wywoływane za pomocą złożonych urządzeń rozpraszających lub chirurgicznej fiksacji19,20. Reakcja na regenerację palców jest modelem przedklinicznym, który oferuje zalety w porównaniu z konwencjonalnymi modelami kostnienia śródbłonowego: 1) nie wymaga zewnętrznej lub wewnętrznej fiksacji po urazie w celu stymulacji kostnienia błoniastego, 2) jest wykonywana przy użyciu 4 cyfr od każdego zwierzęcia, maksymalizując w ten sposób próbki przy jednoczesnej minimalizacji wykorzystania przez zwierzęta, oraz 3) sekwencyjną analizę mikrotomografii komputerowej in vivo (μCT) można przeprowadzić z łatwością i szybkością.

W obecnym badaniu pokazujemy standaryzowaną płaszczyznę amputacji P3, aby uzyskać powtarzalną i solidną odpowiedź regeneracji. Dodatkowo demonstrujemy zoptymalizowany protokół immunohistochemii fluorescencji wykorzystujący skrawki parafiny do wizualizacji powstawania blastemy, rewaskularyzacji w kontekście regeneracji i konwersji blastemalnej do kości poprzez kostnienie śródbłoniaste. Demonstrujemy również zastosowanie sekwencyjnego μCT in vivo do identyfikacji zmian w morfologii, objętości i długości kości w tej samej palcu w trakcie regeneracji. Celem tego protokołu jest zbadanie powstawania blastemy u ssaków po amputacji oraz zademonstrowanie 2 technik, immunohistochemii fluorescencji i sekwencyjnej symulacji μCT in vivo, do badania wewnątrzbłoniastej regeneracji kości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie techniki użytkowania i wykorzystywania zwierząt były zgodne ze standardowymi procedurami operacyjnymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Texas A&M.

1. Amputacja dystalnej kończyny tylnej P3 dorosłej myszy

  1. Znieczulenie myszy CD-1 w wieku od 8 do 12 tygodni (tabela materiałów) za pomocą izofluranu w tlenie; początkowo znieczulenie w postaci 3% w komorze, a następnie 2% izofluranu dostarczanego przez nos przez cały czas trwania operacji. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
    nuta: Standaryzowane w naszym laboratorium badania amputacji P3 u dorosłych przeprowadza się na 8 do 12 tygodniowych myszach, a reakcja regeneracyjna jest zachowana we wszystkich badanych szczepach.
  2. Pod 10-krotnym mikroskopem preparacyjnym wysterylizuj palce kończyny tylnej za pomocą chirurgicznego jodu powidonu i 70% etanolu. Przytnij włosy z dala od pola operacyjnego za pomocą mikronożyczek. Zastosować miejscowo 1 μl bupiwakainy w celu znieczulenia miejsca operowanego.
  3. Amputuj dystalną końcówkę paliczka końcowego (P3) na palcach 2 i 4 każdej kończyny tylnej za pomocą sterylnego skalpela #10 (Rysunek 1A). Amputacja musi być wykonywana w warunkach aseptycznych, w tym sterylizacji narzędzi chirurgicznych. Pod mikroskopem preparacyjnym delikatnie rozchyl tylną łapę, aby odsłonić przyśrodkową powierzchnię palca. Trzymaj skalpel pod kątem równoległym do poduszeczki tłuszczowej, aby wykonać amputację pokazaną na Rysunek 1B. Nałóż 1 μl miejscowej bupiwakainy na miejsce amputacji.
    nuta: Amputacja przechodzi przez narząd paznokcia, skórę właściwą, kość P3, naczynia krwionośne i nerwy, ale nie przechodzi przez jamę szpiku ani poduszeczkę tłuszczową palca. Jeśli zaobserwuje się krwawienie, zastosuj bezpośredni ucisk za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką.
  4. Standardowa płaszczyzna amputacji dystalnej P3 usuwa około 15%–20% objętości kości P321. Można wykonać badanie mikrotomografią komputerową (patrz poniżej) w celu potwierdzenia prawidłowej długości amputacji.
  5. Umieść mysz z powrotem w czystej klatce i pozwól ranie się zagoić bez opatrunku. Monitoruj mysz przez 3 dni, aby upewnić się, że mysz wraca do normalnej aktywności.

2. Zbieranie cyfr i przygotowanie tkanek

  1. Poddaj mysz eutanazji za pomocą dwutlenku węgla (CO2) w zamkniętej komorze, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
  2. Użyj skalpela, aby odciąć palec w połowie sąsiedniego segmentu kości, kości paliczka środkowego (P2), w przybliżeniu w drugim wcięciu brzusznej poduszeczki tłuszczowej. Przenieść cyfrę (cyfry) do fiolki scyntylacyjnej o pojemności 20 ml zawierającej 10 ml świeżego buforowanego utrwalacza cynkowo-formalinowego, 18% roztworu formaldehydu (patrz tabela materiałów). Objętość utrwalacza powinna być co najmniej 20 razy większa od objętości obecnej tkanki.
    nuta: Cyfry są zbierane w różnych punktach czasowych po amputacji w celu zbadania pełnej reakcji regeneracyjnej. Ogólnie rzecz biorąc, w przypadku wczesnego tworzenia się blastemy, histolizy kości i zamykania rany, punkty czasowe pobierania to 4-8 dni po amputacji (DPA). Aby zbadać wczesną blastemę osteogenną, punkty czasowe pobierania to 9 i 10 DPA, a aby zobrazować ciągłą regenerację i mineralizację kości, punkty czasowe pobierania to 14, 21 i 28 DPA. Zbierane są również nieamputowane palce.
  3. Utrwal cyfrę na 24–48 godzin w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając na shakerze.
  4. Usuń utrwalacz i myj palec 2x przez 5 minut w 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze pokojowej.
  5. Umieścić 10 ml świeżego odkamieniacza I (patrz tabela materiałów), 10% roztworu kwasu mrówkowego, w fiolce scyntylacyjnej i delikatnie mieszać na shakerze przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po 2 godzinach zastąp odkamieniacz I świeżym roztworem i odkamienij cyfrę przez noc w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając na shakerze.
  6. Wyjmij odkamieniacz I i umyj cyfrę 2x przez 5 minut w 5 ml 1x PBS w temperaturze pokojowej.
  7. Przetworzyć cyfrę przez sortowaną serię etanolu. Proces ten można przeprowadzić ręcznie w fiolce scyntylacyjnej o pojemności 20 ml, używając 10 ml każdej cieczy, jeśli łącznie jest mniej niż 40 cyfr.
    1. Rozpocznij od 2 zanurzeń w świeżym 70% etanolu w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem na shakerze, 1 godzina każde, a następnie 2 zanurzenia w świeżym 95% etanolu w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem na shakerze po 1 godzinie.
    2. Zakończ odwadnianie palców 2 praniami świeżego 100% etanolu w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem na shakerze po 1 godzinie każde. Końcowe mycie w 100% etanolem można pozostawić na noc.
  8. W tej samej fiolce scyntylacyjnej zastąp 100% etanol 10 ml świeżych ksylenów i umieść fiolkę w dygestorii chemicznej na 1,5 godziny w temperaturze pokojowej. Powtórzyć ze świeżym płukaniem ksylenów w dygestoriach chemicznych przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej, w sumie 2 prania.
  9. Zastąpić ksyleny płynnym woskiem parafinowym stopionym w temperaturze 68 °C i umieścić fiolkę w inkubatorze w temperaturze 68 °C na 2 godziny 2 razy. Po 4 godzinach całkowitego zanurzenia w wosku parafinowym należy wbić cyfrę do cięcia parafiny.
    nuta: Przetwarzanie cyfr do celów histologicznych można przeprowadzić w automatycznym procesorze, zgodnie z tymi samymi wytycznymi.
  10. Przekroje cyfr o grubości 4–5 μm za pomocą mikrotomu. Podzielić na sekcje próbki umieścić na szkiełkach samoprzylepnych, używając łaźni wodnej o temperaturze 38–41 °C uzupełnionej histologicznym roztworem kleju, aby zapewnić przyleganie próbek do szkiełka. Umieść szkiełka na podgrzewaczu do szkiełka o temperaturze 37 °C do wyschnięcia.

3. Barwienie immunohistochemiczne palców dorosłych myszy w celu zbadania powstawania blastemy i kostnienia śródbłoniastego

  1. Podgrzewać szkiełka podzielone na sekcje w temperaturze 65 °C przez 45 minut, a następnie ogrzewać w temperaturze 37 °C przez nie mniej niż 15 minut, aby zapewnić przyleganie próbek do szkiełka.
  2. Szkiełka odparafinowania i rehydratacji 2x z 5-minutowymi płukaniami ksylenów, serią stopniowanego etanolu i zanurzeniem w wodzie. Umieść szkiełka w słoiku do barwienia o pojemności 50–100 ml i zanurz w 1x Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST).
    nuta: Nie dopuścić do wyschnięcia próbek podczas całego procesu barwienia. Na każdym etapie TBST szkiełka można inkubować do 2 godzin.
  3. Przygotuj komorę nawilżającą. Wystarczy zakryte plastikowe pudełko na suwaki o głębokości 1 cala z zwilżoną bibułką u podstawy.
  4. Przygotuj roztwór do odzyskiwania ciepła dla Runx2, Osterix (OSX) i antygenu jądrowego komórek proliferujących (PCNA). W celu pobrania antygenu wczesnego markera osteoprogenitorowego, Runx2, przygotuj 1x roztwór Tris-EDTA, pH 8. Dla markera osteoblastów, OSX, przygotuj 1x roztwór buforu cytrynianowego o pH 6. Barwienie immunologiczne PCNA można przeprowadzić w dowolnym roztworze.
  5. Przygotować roztwór do pobierania antygenu proteinazy K dla markera blastemy CXCR422 i markera komórek śródbłonka czynnika 8 Willebranda (vWF), umieszczając 100 μl roztworu proteinazy K na szkiełku w probówce mikrowirówki i podgrzewając do 37 °C (około 5 min).
    nuta: Pobieranie antygenu dla Runx2, OSX i PCNA odbywa się za pomocą odzyskiwania ciepła, a pobieranie antygenu CXCR4 i vWF odbywa się poprzez traktowanie proteinazy K.
  6. W celu pobrania przeciwciał wymagających ciepła należy zanurzyć szkiełka w słoiku do barwienia w odpowiednim roztworze do pobierania antygenu. Podgrzewanie przesuwa się do 95 °C przez 25 minut, upewniając się, że nie dojdzie do wrzenia. Wyjmij słoik do barwienia ze źródła ciepła i pozostaw do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 35 minut.
  7. W celu pobrania antygenu proteinazy K połóż szkiełka płasko w komorze nawilżającej i umieść 100 μl wstępnie podgrzanej proteinazy K na szkiełku. Przykryj szkiełka małym paskiem parafilmu, aby upewnić się, że szkiełka nie wyschną. Inkubować szkiełka podstawowe przez 12 minut w temperaturze 37 °C.
  8. Myć szkiełka 3 razy przez 5 minut w 1x TBST w słoiku do barwienia po pobraniu antygenu.
  9. Wyjmij szkiełka ze słoika do barwienia i umieść w komorze nawilżającej. Umieść 6-7 kropli roztworu blokującego (tabela materiałów) na szkiełku podstawowym i przykryj szkiełko świeżą folią parafinową, aby upewnić się, że szkiełko nie wyschnie. Inkubować szkiełka przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  10. Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe, rozcieńczając je w rozcieńczalniku przeciwciał (tabela materiałów). Wiruj każdy roztwór przeciwciała pierwszorzędowego przez 3 s. Przeciwciała pierwszorzędowe pochodzące od różnych gatunków gospodarzy mogą być łączone.
    nuta: Barwienie immunohistochemiczne dla Runx2 (królicze przeciwciało anty-Runx2, rozcieńczenie 1:250, przy końcowym stężeniu 4 μg/ml) w połączeniu z PCNA (monoklonalne mysie przeciwciało anty-PCNA, rozcieńczenie 1:2,000, przy końcowym stężeniu 0,5 μg/ml) i OSX (królicze przeciwciało anty-OSX, rozcieńczenie 1:400, przy końcowym stężeniu 0,125 μg/ml) w połączeniu z PCNA pokazano na Rysunek 2. Mysie przeciwciało anty-PCNA użyte w tym badaniu jest wysoce specyficzne i nie wymaga żadnych dodatkowych kroków blokujących poza tymi opisanymi w niniejszym protokole. Barwienie immunohistochemiczne przy użyciu CXCR4 (szczurze przeciwciało anty-CXCR4, rozcieńczenie 1:500 przy końcowym stężeniu 2 μg/ml) i vWF (królicze przeciwciało anty-ludzkie vWF VIII, rozcieńczenie 1:800, przy końcowym stężeniu 41,25 μg/ml) pokazano w Rysunek 2. Przeciwciała pierwszorzędowe zostały zoptymalizowane i przetestowane przez nasze laboratorium w warunkach określonych w tym protokole i są wymienione w Tabeli Materiałów.
  11. Ostrożnie usuń folię parafinową i delikatnie osusz szkiełko na bibułę, aby usunąć nadmiar roztworu blokującego. Umieścić 100–200 μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych na szkiełku, założyć osłonę parafilmu i wrócić do komory nawilżania. Inkubować szkiełka w zamkniętej komorze nawilżania przez noc w temperaturze 4 °C.
    nuta: Nie pozwól, aby szkiełka wyschły podczas opróżniania roztworu blokującego. Ten krok jest wykonywany szybko.
  12. Ostrożnie usunąć parafilm i delikatnie spuścić pierwotny roztwór przeciwciała ze szkiełka. Umieść szkiełko w słoiku do barwienia zawierającym świeży 1X TBST. Umyć świeżym 1x TBST przez 5 minut 3 razy.
  13. Przygotować przeciwciała drugorzędowe, łącząc je z rozcieńczalnikiem przeciwciał (tabela materiałów). Wirować roztwór przeciwciał drugorzędowych przez 3 s. Można łączyć przeciwciała drugorzędowe sprzężone z różnymi fluoroforami pochodzącymi od różnych gatunków.
    nuta: Fluorescencyjne przeciwciała drugorzędowe są wrażliwe na światło. Alexa Fluor 488-sprzężona kozia anty-mysia IgG (H+L) dla PCNA, rozcieńczona w stosunku 1:500 z końcowym stężeniem 4 μg / ml została użyta w Rysunek 2.
  14. Umieścić 200 μl roztworu przeciwciał wtórnych na szkiełku, przykryć szkiełko świeżą folią parafinową i ponownie umieścić w komorze nawilżania. Inkubować szkiełka w zamkniętej komorze nawilżania przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że komora nawilżania jest zamknięta, aby uniknąć światła.
  15. Ostrożnie usunąć folię parafinową i delikatnie spuścić wtórny roztwór przeciwciała ze szkiełka. Umieść szkiełko w słoiku do barwienia zawierającym świeże 1x TBST. Myć świeżym 1x TBST przez 5 min 3x. Unikać światła.
  16. Przygotuj plamę jądrową. Dodaj 20 μl DAPI (podstawowy roztwór DAPI to 5 mg/ml w H2O) do 200 ml 1x PBS i energicznie wstrząsnąć, aby zapewnić jednorodność. Zanurz slajdy na 5 minut w roztworze DAPI-PBS. Unikaj światła.
  17. Myć szkiełka w temperaturze dH2O przez 3 minuty. Zdekantować wodę i pozostawić szkiełka do wyschnięcia na powietrzu lub delikatnie zassać wodę ze szkiełka, upewniając się, że próbki nie są zakłócane podczas odkurzania. Unikaj światła.
  18. Ostrożnie wysuszyć szkiełka nakrywkowe za pomocą 100 μl środka montażowego zapobiegającego blaknięciu (tabela materiałów); należy unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza na szkiełku podczas montażu. Przechowuj szkiełka płasko i pozostaw medium montażowe do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej w światłoszczelnym pojemniku. Po wyschnięciu podłoża montażowego przechowywać szkiełka płasko w światłoszczelnym pojemniku w temperaturze 4 °C, aż będą gotowe do wyświetlenia.
    nuta: Jeśli po zamontowaniu wystąpi niedopuszczalny poziom pęcherzyków powietrza, zamontowaną prowadnicę można delikatnie umieścić w 1x PBS, szkiełko nakrywkowe można zdjąć, a po ponownym wypłukaniu szkiełka w wodzie i ponownym wysuszeniu można go ponownie zamontować.

4. Mikroskopia i analiza obrazu

UWAGA: W tym eksperymencie użyto obrazowania i analizy za pomocą mikroskopu dekonwolucji fluorescencji i związanego z nim oprogramowania, wyposażonego w 3 filtry fluorescencyjne (do wizualizacji sygnałów Alexa Fluor 488, 568 i 647 nm), oraz DAPI (419 nm).

  1. Zobrazuj slajd w 10-krotnym powiększeniu, aby uchwycić cały obszar blastema.
    nuta: Wykrywanie proliferujących przeciwciał pierwotnych osteoblastów wykorzystuje przeciwciała drugorzędowe (Alexa Fluor 488 i 647) z nienakładającymi się widmami emisyjnymi, aby zminimalizować nieprawidłową identyfikację współznakowanych komórek. Odejmowanie tła sygnału autofluorescencyjnego można przeprowadzić za pomocą filtra 568 nm, aby zapewnić integralność sygnałów 488 lub 647. Wykrywanie przeciwciał pierwotnych Blastema wykorzystuje przeciwciała drugorzędowe (Alexa Fluor 488 lub 568). Odejmowanie tła sygnału autofluorescencyjnego można przeprowadzić za pomocą filtra 568 w przypadku stosowania przeciwciała sprzężonego z 488, a filtra 488 przy użyciu przeciwciała sprzężonego z 568. Sygnał autofluorescencyjny jest zwykle związany z płytką paznokcia i erytrocytami w całym palcu i jest obserwowany w filtrach 488, 568 i 647.

5. Sekwencyjna mikrotomografia komputerowa in vivo (μCT)

  1. W tym eksperymencie przeprowadza się regenerację palców tego samego zwierzęcia zeskanowanego na 1 dzień przed amputacją (bez amputacji), 1 DPA i w różnych punktach czasowych, aż do całkowitej regeneracji przy 28 DPA przy użyciu vivaCT 40 (Tabela materiałów) i pokazano w Rysunek 3A.
  2. Wyposaż μCT w rurki, aby umożliwić przepływ tlenu do i z komory dla zwierząt μCT, upewniając się, że wypływający tlen jest wyposażony w filtr z węglem aktywnym, który wychwytuje izofluran.
    nuta: Upewnij się, że komora dla zwierząt μCT jest szczelnie zamknięta; W ten sposób stożek nosowy zwierzęcia nie jest wymagany do dostarczania izofluranu myszy podczas skanowania.
  3. Przygotuj parametry skanowania μCT. Cyfry są skanowane z rozmiarem woksela 10,5 μm, przy 55 kVp, 145 uA z 1000 projekcjami na 180° przy ciągłym obracaniu i z czasem integracji 200 ms, co daje maksymalnie 213 warstw na skan. Skany wykonane w tym eksperymencie trwają około 9 minut. Zmniejszony prąd elektryczny może być skompensowany proporcjonalnie wydłużonym czasem integracji, ale spowoduje to wydłużenie czasu skanowania.
  4. Znieczulić dorosłą mysz za pomocą izofluranu; początkowo znieczulić 3% w komorze, a następnie 1,5% izofluranu dostarczanego do komory zwierzęcia μCT przez cały czas trwania skanowania. Delikatnie umieść mysz w komorze dla zwierząt μCT z palcami kończyn tylnych ułożonymi w ścisłym powiązaniu, płaską, brzuszną stroną do góry z lewą łapą po lewej stronie i prawą łapą po prawej stronie na platformie skanującej, Następnie delikatnie zabezpiecz palce na miejscu za pomocą taśmy chirurgicznej. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
  5. Umieść mysz z powrotem w czystej klatce i monitoruj mysz aż do przebudzenia. Kontynuuj skanowanie tej samej myszy w dwutygodniowych lub tygodniowych punktach czasowych, aby zobrazować całą reakcję na regenerację kości.
  6. Po zeskanowaniu poczekaj do kilku godzin, aż nastąpi rekonstrukcja obrazu μCT. Korzystając z oprogramowania dostarczonego z μCT, przekonwertuj pliki na serię plików dicom; Każdy plik DICOM będzie odpowiadał jednemu wycinkowi skanowania, dlatego jeśli zeskanowano 213 wycinków, zostanie wygenerowanych 213 plików DICOM i przesłanych na serwer firmy.
  7. Pobierz serię dicom w jednym folderze za pomocą narzędzia do pobierania plików wsadowych w przeglądarce internetowej.
  8. Pobierz wtyczkę BoneJ23 i przeciągnij plik do folderu wtyczki ImageJ. W programie ImageJ otwórz serię plików dicom jako stos, przeciągając i upuszczając folder na pasek ImageJ. Otworzy się 16-bitowy stos obrazów wyświetlający wszystkie wartości szarości. Aby wyświetlić tylko kość, wykonaj progowanie obrazu (maguję > Dostosuj próg >).
    >nuta: Podczas przeglądania plików ImageJ dane wyjściowe ImageJ będą odpowiadać odwróconemu obrazowi cyfr; tj. cyfry ułożone na platformie skanowania brzuszną stroną do góry, z lewą łapą po lewej stronie platformy i prawą łapą po prawej stronie platformy, pojawią się jako grzbietowa strona do góry, prawa łapa po lewej stronie i lewa łapa po prawej stronie stosu obrazów ImageJ.
  9. Po otwarciu okna dialogowego progu przesuń dolny pasek, odpowiadający górnemu progowi, maksymalnie w prawo i dostosuj górny pasek, odpowiadający dolnemu progowi, aż tylko kość zostanie podświetlona na czerwono. Dolna wartość progowa wyniesie około 10 000–13 000 przy maksymalnym natężeniu sygnału 32 767. Kliknij przycisk Zastosuj, a następnie w nowym oknie dialogowym kliknij pozycję czarne tło. Kliknij przycisk OK.
  10. Zostanie wygenerowany 8-bitowy obraz wyświetlający wartości czarno-białe, przy czym biel odpowiada kości. Wybierz kość P3, rysując wokół niej prostokąt, a następnie zduplikuj stos. Wygeneruj obraz 3D (Wtyczki > przeglądarki 3D). Aby przyciąć niepotrzebną kość z obrazu, kliknij narzędzie do zaznaczania odręcznego i zakreśl kość, która ma zostać usunięta. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Wypełnij zaznaczenie, aby usunąć bone.
    nuta: Opisane powyżej kroki dotyczą ImageJ 1.52h, Java 8 i mogą się nieznacznie różnić w przypadku korzystania z innej wersji ImageJ. W przypadku progowania zalecamy określenie optymalnej wartości i konsekwentne stosowanie tej wartości.
  11. Określ ilościowo objętość kości na podstawie renderingu 3D za pomocą wtyczki BoneJ Volume Fraction (Plugins > BoneJ > Volume Fraction). Pojawi się okno wyników, a objętość kości (BV) zostanie wyświetlona w mm3.
  12. Określ ilościowo długość kości na podstawie renderingu 3D za pomocą narzędzia ImageJ do tworzenia punktów wielopunktowych.
    nuta: Długość kości jest dynamiczna w trakcie regeneracji P3; długość zmniejsza się między 7-10 DPA w związku z degradacją kości za pośrednictwem osteoklastów 11, a po niej następuje okres odrastania dystalnej kości między 14-28 DPA (Rysunek 3B). Długość jest mierzona od środkowej podstawy stawu P2/P3 do najdalszego punktu mineralizacji na dystalnym wierzchołku kości, ale nie obejmuje zdegradowanej kości, która została całkowicie oderwana (Rysunek 3B). BoneJ pozwala na pełną ocenę 3D architektury kości; W związku z tym kąt, pod jakim kość jest skanowana, nie zmieni możliwości pomiaru długości.
  13. Przechwyć obraz renderingu 3D, klikając przycisk Widok, a następnie zrób migawkę. Zapisz obraz jako plik tif lub jpeg.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Paliczki P3 regenerujące się u dorosłych myszy w 6/7 DPA (Rysunek 2A-D), 9 DPA (Rysunek 2E-H) oraz 10 DPA (Rysunek 2I-L) poddano immunobarwieniu przeciwciałami przeciwko Runx2, OSX i PCNA w celu wizualizacji błonistej regeneracji kości, a także immunobarwieniu przeciwciałami przeciwko CXCR4 i vWF w celu wizualizacji formowania blastemy. Przedstawiono również reprezentatywne rendery ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje ustandaryzowaną procedurę amputacji dystalnej części P3 u dorosłych myszy myszy, fluorescencyjne barwienie immunohistochemiczne w celu wizualizacji i zbadania powstawania blastema i kostnienia wewnątrzbłoniastego oraz sekwencyjne skanowanie μCT in vivo w celu identyfikacji zmian morfologicznych, objętościowych i długości kości po amputacji. Amputacja P3 jest unikalnym, proceduralnie prostym i powtarzalnym modelem do analizy proregeneracyjnego środowiska rany, które wyzwala powstawanie blastemy. Co wi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy członkom Laboratorium Muneoka i Texas Institute for Genomic Medicine (TIGM). Prace te były wspierane przez Texas A&M University.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Białkowa surowica blokowa bezDAKOX0909Gotowy do użycia
Mysie przeciwciało anty-PCNAAbcamab291:2000 rozcieńczenie
Szczurze przeciwciało anty-CXCR4R& D SystemsMAB21651rozcieńczenie 1:500
Królik przeciwciało anty-ludzkie vWF XIIIDAKOA00821:800 rozcieńczenie
Królik anty-osterix, przeciwciało SP7Abcamab225521:400 rozcieńczenie
Królik przeciwciało anty-Runx2Sigma-Aldrich Co.HPA022040Rozcieńczenie 1:250
Alexa Fluor 647-sprzężona koza anty-mysie IgG (H+L)InvitrogenA212351:500 rozcieńczenie
Alexa Fluor 488-sprzężony kozioł anty-królik IgG (H+L)InvitrogenA110081:500 rozcieńczenie
Alexa Fluor 568-sprzężony kozioł anty-szczurzy IgG (H+L)InvitrogenA110771:500 rozcieńczenie
Prolong Gold odczynnikzapobiegający blaknięciuInvitrogenP36930Gotowy do użycia
Dekalifikator Surgipath 1Leica Biosystems3800400Gotowy do użycia
Z-Fix, Wodny utrwalacz cynkowo-formalinowyAnatech LTD174Gotowy do użycia
CD-1 Mysz żeńskaEnvigoICR(CD-1)8-12-tygodniowy
vivaCT 40SCANCO Medical

Bibliografia

  1. Douglas, B. S. Conservative management of guillotine amputation of the finger in children. Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).
  2. Illingworth, C. M. Trapped fingers and amputated finger tips in children. Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).
  3. Borgens, R. B. Mice regrow the tips of their foretoes. Science. 217, 747-750 (1982).
  4. Neufeld, D. A., Zhao, W. Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation. Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).
  5. Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice. Developmental Biology. 315, 125-135 (2008).
  6. Takeo, M., et al. Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration. Nature. 499, 228-232 (2013).
  7. Chamberlain, C. S., et al. Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx. Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).
  8. Dawson, L. A., et al. Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice. Regeneration. 3, 39-51 (2016).
  9. Seifert, A. W., Muneoka, K. The blastema and epimorphic regeneration in mammals. Developmental Biology. 433, 190-199 (2018).
  10. Carlson, B. M. Principles of Regenerative Biology. , Elsevier. Burlington, MA. (2007).
  11. Fernando, W. A., et al. Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice. Developmental Biology. 350, 301-310 (2011).
  12. Simkin, J., et al. Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration. Regeneration. 2, 106-119 (2015).
  13. Yu, L., et al. Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration. Regeneration. 1, 33-46 (2014).
  14. Dolan, C. P., et al. Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice. Developmental Biology. 445, 237-244 (2018).
  15. Dawson, L. A., et al. Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).
  16. Sammarco, M. C., et al. Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).
  17. Einhorn, T. A. The science of fracture healing. Journal of Orthopaedic Trauma. 19, S4-S6 (2005).
  18. Shapiro, F. Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts. European Cells & Materials. 15, 53-76 (2008).
  19. Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation. Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).
  20. Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).
  21. Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine. Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).
  22. Lee, J., et al. SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2. Developmental Biology. 382, 98-109 (2013).
  23. Doube, M., et al. BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ. Bone. 47, 1076-1079 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Immunohistochemia fluorescencyjnamikrotomografia komputerowaregeneracja epimorficznapaliczka dystalnaregeneracja kościanaliza unaczynieniaobrazowanie sekwencyjne
Amputacja i regeneracja palców dorosłych myszy : prosty model do badania powstawania blastemy i kostnienia śródbłoniastego u ssaków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.