Pomiar aktywności transkrypcyjnej sterowanej przez niekodujący region kontrolny BK-poliomawirusa za pomocą cytometrii przepływowej

Summary

W tym manuskrypcie przedstawiono protokół do wykonywania pomiarów aktywności transkrypcyjnej BK-poliomawirusa opartego na FACS przy użyciu komórek HEK293T transfekowanych dwukierunkowym plazmidem reporterowym wykazującym ekspresję tdTomato i eGFP. Metoda ta pozwala ponadto na ilościowe określenie wpływu nowych związków na transkrypcję wirusa.

Abstract

Poliomawirusy, takie jak BK-poliomawirus (BKPyV), mogą powodować poważne patologie u pacjentów z obniżoną odpornością. Ponieważ jednak wysoce skuteczne leki przeciwwirusowe nie są obecnie dostępne, potrzebne są metody pomiaru wpływu potencjalnych środków przeciwwirusowych. W tym przypadku skonstruowano reporter z podwójną fluorescencją, który umożliwia analizę wczesnej i późnej aktywności promotora napędzanej przez niekodujący region kontrolny (NCCR) BKPyV, aby określić ilościowo wpływ potencjalnych leków przeciwwirusowych na ekspresję genów wirusa poprzez ekspresję tdTomato i eGFP. Ponadto, klonując amplikony BKPyV-NCCR, które w tym protokole zostały wzorcowo uzyskane z DNA pochodzącego z krwi pacjentów po przeszczepieniu nerki z obniżoną odpornością, można określić wpływ rearanżacji NCCR na ekspresję genów wirusa. Po sklonowaniu amplikonów pochodzących od pacjenta, HEK293T komórki transfekowano plazmidami reporterowymi i leczono potencjalnymi środkami przeciwwirusowymi. Następnie komórki poddano analizie FACS w celu pomiaru średniej intensywności fluorescencji 72 godziny po transfekcji. Do przetestowania również analizy leków, które mają potencjalne działanie hamujące cykl komórkowy, stosuje się tylko komórki transfekowane, a tym samym fluorescencyjne. Ponieważ test ten jest wykonywany w dużych komórkach z ekspresją antygenu T, wpływ wczesnej i późnej ekspresji może być analizowany w sposób wzajemnie niezależny.

Introduction

Poliomawirusy reprezentują niezależną rodzinę małych wirusów o dwuniciowym DNA (dsDNA) z wirusem Simian 40 (SV40) jako gatunkiem prototypowym. Pierwotne zakażenie występuje głównie w dzieciństwie, które zwykle przebiega bez objawów chorobowych i zwykle powoduje utajone infekcje u gospodarzy kompetentnych immunologicznie. Poliomawirus BK (BKPyV) utrzymuje się głównie w komórkach kanalików nerkowych, nie powodując nefropatologii, jednak w przypadku upośledzenia kompetencji immunologicznej po przeszczepieniu nerki wirus może się reaktywować i powodować poważne uszkodzenia i upośledzenie funkcji przeszczepu po osiągnięciu wysokiej wiremii (1 x 10⁴ kopie DNA BKPyV/ml)^1,2. U około 10% biorców przeszczepu nerki reaktywacja wirusa BK-polyomavirus (BKPyV) powoduje nefropatię związaną z poliomawirusem (PyVAN), która była do 80% związana z wysokim ryzykiem niewydolności alloprzeszczepu nerkowego^3,4. Ponieważ nie są dostępne żadne zatwierdzone leki przeciwwirusowe, obecna terapia opiera się na zmniejszeniu immunosupresji. Co ciekawe, inhibitory mTOR wydają się mieć działanie przeciwwirusowe; w związku z tym zmiana terapii immunosupresyjnej na immunosupresję opartą na mTOR może stanowić alternatywne podejście do zapobiegania progresji wiremii BKPyV^5,6,7. Jednak mechanizm przeciwwirusowy oparty na mTOR jest obecnie nadal nie w pełni poznany. W związku z tym potrzebne są metody mierzące wpływ potencjalnych środków przeciwwirusowych w klinicznie istotnych stężeniach.

Okrągły genom BKPyV składa się z około 5 kb, w którym znajduje się niekodujący region kontrolny (NCCR), który służy jako początek replikacji i jednocześnie dwukierunkowy promotor napędzający ekspresję transkryptów mRNA wczesnej i późnej fazy. Ponieważ spontanicznie występujące rearanżacje, delecje i duplikacje NCCR występują w patogennych BKPyV⁸ i znacząco kumulują się u pacjentów cierpiących na PVAN^5,9, porównanie archetypicznych (wt) i przeorganizowanych (rr) aktywności NCCR jest pomocne w scharakteryzowaniu replikacyjnej sprawności wirusa.

Jak podsumowano na rysunku 1, ten protokół opisuje powszechnie stosowaną metodę pomiaru aktywności transkrypcyjnej BKPyV NCCR poprzez ilościowe określenie fluorescencji dwóch fluoroforów tdTomato i eGFP wyrażonych z plazmidu reporterowego^5,9,10,11. Zabieg wykonywany jest w obecności dużego antygenu T SV40 (lTAg), co pozwala na analizę wpływu potencjalnych środków przeciwwirusowych na wczesną i późną aktywność NCCR oddzielnie⁵. Test ten dalej analizuje wpływ przegrupowań na aktywność NCCR i porównanie z wt-NCCRs^5,9. Plazmid reporterowy zawiera sygnał późnej poliadenylacji SV40 za każdą otwartą ramką odczytu fluoroforu, aby zapewnić porównywalne i wydajne przetwarzanie obu transkryptów odpowiednio dla tdTomato i eGFP. W porównaniu z metodami opartymi na qRT-PCR^5,12, to podejście oparte na FACS stanowi alternatywę o niskich kosztach i wysokiej przepustowości, ponieważ nie są potrzebne skomplikowane protokoły ekstrakcji dla hodowli zakażonych komórek ani drogie przeciwciała do barwienia fluorescencji immunologicznej. Ponadto, ponieważ określona liczba komórek fluorescencyjnych jest analizowana za pomocą cytometrii przepływowej, analiza środków hamujących cykl komórkowy jest również możliwa w sposób ilościowy.

Protocol

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi badań na ludziach, zatwierdzonymi przez komisję etyki wydziału medycznego Uniwersytetu Duisburg-Essen (14-6028-BO).

1. Pobieranie próbek krwi lub moczu i izolacja DNA poliomawirusa

1. Zbierz co najmniej 3 ml krwi do probówek EDTA lub mocz do probówek akwizycyjnych.
2. Odwirować próbkę o masie 2 500 x g przez 15 minut. W razie potrzeby należy pipetować osocze do nowej probówki i przechowywać próbki osocza w temperaturze 4 °C przez kilka dni lub zamrażać w temperaturze -20 °C w celu dłuższego przechowywania.
3. Przygotować 40 μl proteinazy K do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i dodać 400 μl osocza metodą pipetowania.
4. Poddać próbkę lizie przez dodanie 400 μl buforu do lizy, wirować przez 15 s i inkubować przez 10 minut w temperaturze 56 °C.
5. Wyizoluj DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji krwi DNA, zgodnie z opisem w instrukcjach producenta. Krótko dodaj alkohol i załaduj lizaty na kolumnę wirową zawierającą błonę na bazie krzemionki wiążącą DNA. Umyj kolumny kilka razy, aby uzyskać czyste DNA.
6. Eluować otrzymane DNA w 30-50 μl buforu TE.

2. Amplifikacja niekodującego regionu kontrolnego (NCCR)

1. Wykonaj poniższą procedurę w fizycznie oddzielonych pomieszczeniach. Użyj odizolowanego pomieszczenia do przygotowania odczynników i rozprowadzenia mieszaniny do probówek PCR.
2. Przygotować Master Mix do pre-PCR, używając pary starterów A (Tabela 1) w całkowitej objętości 50 μl i użyć wcześniej wyizolowanego DNA z kroku 1.6. Schemat pipetowania służący do przygotowania mieszanki wzorcowej do wstępnego i zagnieżdżonego PCR jest przedstawiony w Tabeli 2.
3. Rozprowadzić 45 μl mieszanki wzorcowej do probówek PCR.
4. Dodać 5 μl wyizolowanego DNA do probówek PCR.
   UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia, należy użyć innego pomieszczenia niż to, w którym przygotowywana jest mieszanka główna.
5. Przeprowadzić PCR w warunkach reakcji, jak pokazano w Tabeli 3. Powtórz denaturację, wyżarzanie i wydłużanie w 35 cyklach.
6. Do zagnieżdżonej amplifikacji należy użyć pary starterów B, w której znajdują się miejsca restrykcyjne dla AgeI i SpeI (Tabela 1).
7. Uruchom zagnieżdżony PCR z warunkami reakcji opisanymi w krokach od 2.2 do 2.5 przy użyciu 5 μl pre-PCR.
8. Wymieszaj 10 μl produktu PCR z 2 μl 6x barwnika ładującego żel. Załaduj 10 μl mieszanki na 1,5% żel agarozowy i uruchom żel na 30 minut w temperaturze 60 mA.
9. Wizualizacja żelu za pomocą odpowiedniego systemu dokumentacji UV.
   UWAGA: Oczekuje się, że rozmiar amplikonu będzie wynosił od 300 do 500 pz w zależności od tego, czy nastąpiły rearanżacje (delecje, insercje czy duplikacje) (Rysunek 2C).
10. Oczyść amplikony PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Eluować amplikony PCR w 30 μl buforu elucyjnego.
11. Wyślij amplikony do sekwencjonowania Sangera przy użyciu pary starterów B.

3. Klonowanie NCCR do reportera podwójnej fluorescencji

1. Trawić oczyszczone amplikony (etap 2.10) za pomocą AgeI i SpeI przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, jak opisano w tabeli 4.
2. Powtórzyć krok 2.10 i oczyścić strawione amplikony.
3. Równolegle trawić również szkielet plazmidowy (1,5 μg) za pomocą AgeI i SpeI przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, jak opisano w tabeli 5. Ten krok należy wykonać tylko raz. W przypadku kolejnych reakcji zamrozić trawienie w temperaturze -20 °C.
4. Przeanalizuj strawiony szkielet plazmidu na 0,8% niskotopliwym żelu agarozowym.
   UWAGA: Nie uruchamiaj żelu o prądzie wyższym niż 40 mA. Oczekiwana insercja obszaru dystansowego pierwotnie pochodzącego z plazmidu pEX-K4 2-LTR CD3¹³ wynosi 128 pz (Rysunek 2C).
5. Wizualizacja fragmentów DNA za pomocą długofalowego światła UV (320 nm) i wycięcie pasma kręgosłupa za pomocą czystego skalpela. Przenieś niskotopliwy fragment żelu do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Unikaj długich czasów ekspozycji na promieniowanie UV, aby zapobiec uszkodzeniu DNA.
   UWAGA: Ponieważ stosuje się agarozę o niskiej stopie, nie jest konieczne oczyszczanie DNA przed ligacją.
6. Podgrzewać szkielet zawierający kawałek niskotopliwej agarozy przez 10 minut w temperaturze 65 °C w celu stopienia kawałka żelu i mieszać co 2 minuty przez delikatne wirowanie. Stopiony żel może być bezpośrednio użyty do podwiązania.
7. Związać szkielet i strawiony amplikon za pomocą ligazy DNA T4 przez noc w temperaturze 16 °C, stosując schemat przedstawiony w Tabeli 6.
8. Przeprowadź transformację w E. coli metodą szoku cieplnego, płytki bakterii na płytkach LB-amp i hodowlę w temperaturze 37 °C przez noc.
9. Następnego dnia wybrać trzy dodatnie klony i przygotować przez noc kultury E. coli (5 ml LB-Amp) i hodowlę w temperaturze 37 °C.
10. Wyizoluj plazmid-DNA przy użyciu standardowych protokołów, jak opisano gdzie indziej¹⁴, przeprowadź trawienie AgeI i SpeI, aby sprawdzić, czy nie ma pozytywnych klonów i zwizualizuj wycięte fragmenty na 1% żelu agarozowym. Pasma dystansowa (128 pz) zostanie zastąpiona większą sekwencją NCCR (300-500 pz, patrz wyżej).
11. Wyślij plazmid do sekwencjonowania Sangera za pomocą startera EGFP-N lub pary starterów B (Tabela 1).
12. Ponieważ mutacje mogą wystąpić spontanicznie, należy porównać wyniki sekwencjonowania z wynikami sekwencjonowania uzyskanymi za pomocą amplikonu. Należy używać wyłącznie klonów zawierających identyczne sekwencje w porównaniu z amplikonem.
13. Użyj oprogramowania molekularnego środowiska pracy (np. darmowego GENtle 1.9.4 lub innych programów do edycji sekwencji), aby wyrównać i edytować uzyskane sekwencje (Rysunek 3).
14. Uruchom GENtle 1.9.4 i zaimportuj sekwencje DNA, klikając przycisk Importuj (zielona strzałka w dół).
15. Następnie kliknij Narzędzie i wybierz Wyrównanie z menu (użyj Ctrl + G jako skrótu) i wybierz sekwencje DNA do wyrównania.
16. Dodaj sekwencję do wyrównania, klikając Dodaj lub usuń sekwencję, klikając Usuń. Dołącz archetypiczną sekwencję konsensusu NCCR, taką jak JN192438¹⁵, nie używaj sekwencji NCCR z powszechnie używanej klasy Dunlop-strain16, ponieważ zawiera ona przegrupowania i duplikacje inne niż archetypiczne szczepy BKPyV.
    UWAGA: NCCR zawiera już translacyjny kodon start (Rysunek 3).
17. Wybierz metodę wyrównania, klikając Algorytm na pasku narzędzi i wybierz clustal W. Ustaw parametry wyrównania na 2; kara za wydłużenie odstępu -1; kara za odstęp -2 i kliknij OK, aby uruchomić wyrównanie.

4. Przejściowa transfekcja komórek HEK293T plazmidem reporterowym i leczenie potencjalnymi środkami przeciwwirusowymi

1. Aby przygotować wystarczającą ilość plazmidowego DNA do kolejnych eksperymentów transfekcyjnych, należy przygotować 150 ml kultury przez noc. Wyizoluj plazmidowe DNA za pomocą zestawu do izolacji plazmidu. Alternatywnie można zastosować inne zestawy do oczyszczania plazmidu.
2. Wysiew 1 x 10⁵ HEK293T komórek w DMEM zawierających 10% FCS, penicyliny i streptomycyny (1x) na basenik płytki 12-dołkowej 24 godziny przed transfekcją i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w celu utrzymania aktywnej proliferacji podczas transfekcji.
   UWAGA: Komórki powinny być w około 80% zlewające się podczas transfekcji.
3. Umieścić 250 μl zredukowanej pożywki surowicy w sterylnej probówce i dodać 1 μg każdego reporterowego plazmidowego DNA i delikatnie wymieszać przez pipetowanie.
4. Dodać 3 μl odczynnika do transfekcji do mieszaniny DNA, delikatnie wymieszać pipetując i inkubować przez 15 minut. Odczynnik do transfekcji należy wstępnie podgrzać do temperatury otoczenia 22 °C i delikatnie przemieszać przed użyciem.
5. Dodaj mieszaninę kroplami do studzienek i delikatnie rozprowadź do studzienki.
6. Po 4 godzinach zastąpić supernatant świeżą pożywką zawierającą czynniki testowe i kontrolę rozpuszczalnika. Inkubować w temperaturze 37 °C do czasu analizy. W tym przykładzie zastosowano inhibitory mTOR INK128 (100 ng/ml) i rapamycynę (100 ng/ml).

5. Mikroskopia fluorescencyjna i cytometria przepływowa

1. Sprawdź komórki pod kątem czerwonej i zielonej fluorescencji pod mikroskopem fluorescencyjnym (Rysunek 4).
   UWAGA: Czerwona i zielona fluorescencja odpowiadają odpowiednio wczesnej i późnej ekspresji genu BKPyV.
2. Po 72 godzinach od transfekcji odessać supernatant i dwukrotnie przemyć komórki 1 ml zimnego PBS.
3. Delikatnie dodaj 500 μl trypsyny i lekko obróć płytkę, aby uniknąć przedwczesnego oderwania komórek. Ten krok jest ważny, aby uniknąć dubletów komórek.
4. Po dodaniu usuń trypsynę bezpośrednio tą samą końcówką pipety.
5. Inkubować komórki przez co najmniej 5 minut w temperaturze 37 °C.
6. Ponownie zawiesić trypsynizowane komórki z 1 ml PBS zawierającego 3% FCS i przenieść zawiesinę do wstępnie znakowanych probówek FACS.
7. Dodać DAPI (1 μg/ml) przed analizą FACS.
8. Przeanalizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego. Dla każdej próbki zmierz co najmniej 10 000 żywych komórek, które są ujemne pod kątem barwienia DAPI.

6. Analiza danych

1. Zaimportuj dane do oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej i dodaj próbki, klikając i przeciągając do obszaru roboczego.
2. Kliknij dwukrotnie zaimportowany plik i utwórz wykres. Wybierz FSC-A lub SSC-A, klikając osie x i y. Bramkuj główną populację komórek, klikając Wielokąt na pasku narzędzi i obramowując populację komórek (Rysunek 5). Nazwij wybraną populację komórek zgodnie z wymaganiami (na przykład "pojedyncze komórki"). "Pojedyncze komórki" pojawią się jako nowy obszar roboczy.
3. Kontynuuj bramkowanie "pojedynczych komórek" dla ujemnych DAPI (tj. "żywych komórek"). Aby zidentyfikować żywe komórki, porównaj populację komórek z barwieniem DAPI i bez niego. Na obu wykresach wybierz FSC-A kontra pacific-blue-A.
4. Kliknij prostokąt i wybierz ujemną populację komórek DAPI, nazwij wybraną populację komórek "żywymi komórkami" i utwórz nowy wykres kropkowy przedstawiający FITC (eGFP) w porównaniu z PE (tdTomato), jak opisano wcześniej.
5. Dodaj ćwiartki w "żywych komórkach", wybierając Quad z paska narzędzi. Bramkowanie populacji odbywa się poprzez przeciągnięcie środka kwadrantu do krawędzi każdej populacji. Ćwiartki reprezentują 1) eGFP-tdTOM-, 2) eGFP-tdTOM+, 3) eGFP+tdTOM-, 4) eGFP+tdTOM+.
   UWAGA: Ze względu na nakładanie widmowe widm emisyjnych między FITC i PE, wstępna kompensacja jest niezbędna do rozróżnienia sygnałów czerwonych i zielonych oraz uzyskania dokładnych wyników.
6. Określ średnią intensywność fluorescencji (MIF), klikając prawym przyciskiem myszy kwadrant i wybierając Dodaj statystyki. Wybierz opcję Średnia i kliknij przycisk OK. Średnia MIF jest teraz wyświetlana poniżej populacji w sekcji "statystyki". Ćwiartki 2 i 4 odpowiadają wczesnej ekspresji, podczas gdy ćwiartki 3 i 4 reprezentują późną ekspresję.
7. Dodaj dodatkowe powtórzenia w ten sam sposób, aby uzyskać moc statystyczną.
8. W przypadku interpretacji danych wykreślić wartości MIF wczesnych i późnych na wykresie słupkowym:
9. Aby porównać aktywność NCCR uzyskaną od różnych dawców lub szczepów wirusa, dodaj archetypiczną kontrolę lub szczep Dunlop sup¹⁶ i ustaw jego względne MIF na 100%, a następnie oblicz względne wartości MIF. Powtórzyć te czynności dla każdej kontrpróby i wyznaczyć średnią oraz odchylenie standardowe.
10. Aby ocenić wpływ potencjalnych związków na aktywność transkrypcyjną, należy ustawić kontrolę rozpuszczalnika na 100% i wykreślić MFI leczonych komórek.

Results

W tym reprezentatywnym eksperymencie, aktywność transkrypcyjna sterowana przez niekodujący region kontrolny BK-polyomavirus została zmierzona za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto przetestowano inhibitor mTOR, który może być stosowany w leczeniu pacjentów po reaktywacji BKPyV, pod kątem hamowania wczesnej ekspresji genu wirusa. W tym celu zastosowano podwójny test reporterowy fluorescencji, jak opublikowano wcześniej⁵. Ogólny schemat przepływu pracy konfigurac...

Discussion

W artykule przedstawiono powszechnie stosowaną metodę, która pozwala na analizę wczesnej i późnej aktywności promotora BKPyV w niekodującym regionie kontrolnym (NCCR). Aktywność NCCR może być mierzona jednocześnie i nie wymaga lizy transfekowanych komórek. Ponadto można analizować stosunkowo dużą liczbę komórek i nie jest konieczna kotransfekcja dodatkowych markerów do normalizacji wartości fluorescencji.

Kluczową częścią tej metody jest to, że sklonowany NCCR powinien zawierać dokładnie te sa...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drabina 100 pz	NEB	N3231	Każda drabina o zasięgu do 1 kb może być zastąpiona
Drabina 2-kłodowa	NEB	N0550	Można zastąpić dowolną drabinę o zakresie do 10 kb
Agar-Agar, Kobe I	Carl Roth	5210.3
AgeHF	NEB	R3552
Ampicillin Natriumsalz Cellpure	Carl Roth	HP62.1
Aqua ad iniectabilia	Bbraun	2351744	może być zastąpiony przez dowolnego producenta
BD FACSCanto™ II	BD Biosciences
BD FACSDiva	BD Biosciences
DAPI	Sigma	10236276001
DFC450C moduł kamery	Leica		Można użyć dowolnej kamery
DMEM	Gibco	41966-029	może być zastąpiony przez dowolnego producenta
Mikroskop LED DMIL	Leica		Dowolny mikroskop fluorescencyjny może być używany
DNA Blood Mini Kit	Qiagen	51104	może być zastąpiony przez dowolnego producenta
E.coli DH5alpha Competent Cells	Thermo Scientific	18258012
FBS Superior	MerckMillipore	50615	Można użyć dowolnego FBS
FlowJo v10.5.3	FlowJo, LLC		Można użyć dowolnego oprogramowania do cytometrii przepływowej FBS
Barwnik ładujący żel, fioletowy (6X)	NEB	B7024	Dowolny barwnik o 6-krotnym obciążeniu może być podstawiony
HEK293T komórek	ATCC	11268	Komórki te konstytutywnie wyrażają duży antygen T wirusa małpiego 40 (SV40), a klon 17 został wybrany specjalnie ze względu na jego wysoką transfekcję.
Inkubator CO2 HERAcell® 240i	Thermo Scientific		może być zastąpiony przez dowolnego producenta
Zestaw HotStar PCR	Qiagen	203203
Intas System dokumentacji żelu	Intas		Można zastosować dowolny system wizualizacji barwionego DNA zawierającego żele agarozowe
Niskotopliwy 850081 Agaroza	może		być zastąpiony przez dowolnego producenta
Opti-MEM	Invitrogen	31985070	może być zastąpiony przez dowolnego producenta
pBKV (34-2)	ATCC	45025	Plazmid zawierający pełnowymiarowy genom BKPyV szczepu Dunlop; był stosowany jako kontrola pozytywna; Sekwencja DNA Uwagi: KP412983
PBS	Gibco	14190-136
PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler	Bio-Rad	produkt wycofany z produkcji	Można użyć dowolnego termocyklera
PCR Nucleotide Mix, 10 mM	Promega	#C1145	może być zastąpiony przez dowolnego producenta
PCR1 i PCR2 Primers	metabion	nie dotyczy	Odsolone. Rozcieńczyć do (10 &mikro; M) z wodą klasy PCR
PenStrep (100x)	Gibco	15140-122	może być zastąpiony przez dowolnego producenta
Roti®-GelStain	Carl Roth	3865	Barwnik na bazie fluorescencji do pomiaru stężenia dsDNA
SpeI-HF	NEB	R3133
Ligaza T4-DNA	NEB	M0202
TransIT LT1	Mirus	MIR2300
Trypsyna 0,05% - EDTA	Gibco	25300-054	może być zastąpiony przez dowolnego producenta
ZymoPURE II Plasmid Kit	Zymo	D4201	może być zastąpiony przez dowolnego producenta