Prezentujemy metodę przydatną do syntezy enzymatycznej na dużą skalę i oczyszczania specyficznych enancjomerów i regioizomerów epoksydów kwasu arachidonowego (AA), kwasu dokozaheksaenowego (DHA) i kwasu eikozapentaenowego (EPA) za pomocą bakteryjnego enzymu cytochromu P450 (BM3).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Enzymatyczna synteza epoksydowanych metabolitów kwasów dokozaheksaenowego, eikozapentaenowego i arachidonowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Epoksydowane metabolity różnych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA), określane jako epoksydowe kwasy tłuszczowe, pełnią szeroki zakres ról w fizjologii człowieka. Metabolity te są wytwarzane endogennie przez enzymy z klasy cytochromu P450. Ze względu na ich zróżnicowane i silne działanie biologiczne, istnieje duże zainteresowanie badaniem tych metabolitów. Określenie unikalnych ról tych metabolitów w organizmie jest trudnym zadaniem, ponieważ epoksydowe kwasy tłuszczowe muszą być najpierw pozyskiwane w znacznych ilościach i o wysokiej czystości. Pozyskiwanie związków ze źródeł naturalnych jest często pracochłonne, a rozpuszczalne hydrolazy epoksydowe (sEH) szybko hydrolizują metabolity. Z drugiej strony, otrzymywanie tych metabolitów w reakcjach chemicznych jest bardzo nieefektywne, ze względu na trudności w uzyskaniu czystych regioizomerów i enancjomerów, niskie plony oraz rozległe (i kosztowne) oczyszczanie. W tym miejscu przedstawiamy wydajną syntezę enzymatyczną kwasów 19(S),20(R)- i 16(S),17(R)-epoksydokozapentaenowych (EDP) z DHA poprzez epoksydację BM3, bakteryjnym enzymem CYP450 wyizolowanym pierwotnie z Bacillus megaterium (który łatwo ulega ekspresji w Escherichia coli). Charakterystykę i oznaczanie czystości przeprowadza się za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i spektrometrii mas (MS). Procedura ta ilustruje korzyści płynące z enzymatycznej syntezy metabolitów epoksydowych PUFA i ma zastosowanie do epoksydacji innych kwasów tłuszczowych, w tym kwasu arachidonowego (AA) i kwasu eikozapentaenowego (EPA) w celu wytworzenia analogicznych kwasów epoksyeikozatrienowych (EET) i kwasów epoksyeikozatetraenowych (EEQ).
Wprowadzenie
Ponieważ zainteresowanie rolą, jaką wielonienasycone kwasy tłuszczowe (szczególnie wielonienasycone kwasy tłuszczowe omega-3 i omega-6) odgrywają w biologii człowieka, w ostatnich latach wzrosło zainteresowanie badaczami, którzy wykazują szeroki zakres atrakcyjnych korzyści, jakie wykazują ich metabolity. W szczególności dużym zainteresowaniem zwrócono się na metabolity epoksydowych kwasów tłuszczowych wytwarzane przez enzymy z klasy cytochromu P450. Na przykład wiele epoksydów PUFA, w tym kwasy epoksyeikozatrienowe (EET), kwasy epoksydokozapentaenowe (EDP) i kwasy epoksyeikozatetraenowe (EEQ), odgrywa kluczową rolę w regulacji ciśnienia krwi i stanu zapalnego1,2,3,4,5. Co ciekawe, wiadomo, że specyficzne enancjomery i regioizomery epoksydów AA i EPA mają różny wpływ na zwężenie naczyń krwionośnych6,7. Podczas gdy fizjologiczne działanie enancjomerów i regioizomerów EET i EEQ zostało udokumentowane, niewiele wiadomo na temat wpływu analogicznych kwasów epoksydokozapentaenowych (EDP) utworzonych z DHA. Powszechne stosowanie oleju rybnego8, który jest bogaty zarówno w EPA, jak i DHA, również wzbudziło zainteresowanie EDPs9. Uważa się, że korzyści płynące z tych suplementów wynikają częściowo z metabolitów DHA (16,17-EDP i 19,20-EDP są najliczniejsze), ponieważ poziomy EDP in vivo bardzo dobrze współgrają z ilością DHA w diecie10,11.
Badanie mechanizmów i celów tych epoksydowych kwasów tłuszczowych za pomocą metabolomiki, biologii chemicznej i innych metod okazało się wyzwaniem, częściowo dlatego, że istnieją one jako mieszaniny regio- i stereo-izomerów, a metoda uzyskania czystych ilości enancjomerów i regioizomerów jest wymagana. Konwencjonalne środki do chemicznej syntezy tych związków okazały się nieskuteczne. Stosowanie nadtlenokwasów, takich jak kwas meta-chloroperoksybenzoesowy, do epoksydacji ma wiele wad, w szczególności brak selektywności epoksydowej, co wymaga kosztownego i żmudnego oczyszczania poszczególnych regioizomerów i enancjomerów. Całkowita synteza metabolitów DHA i EPA jest możliwa, ale ma również wady, które sprawiają, że jest niepraktyczna w przypadku syntezy na dużą skalę, takich jak wysokie koszty i niskie plony12,13. Wydajna ogólna produkcja może być osiągnięta dzięki syntezie enzymatycznej, ponieważ reakcje enzymatyczne są regio- i stereoselektywne14. Badania pokazują, że enzymatyczna epoksydacja AA i EPA (z BM3) jest zarówno regioselektywna, jak i enancjoselektywna15,16,17,18, ale ta procedura nie została przetestowana z DHA ani na dużą skalę. Ogólnym celem naszej metody było zwiększenie skali i optymalizacja tej chemoenzymatycznej epoksydacji w celu szybkiego wytworzenia znacznych ilości czystych epoksydowych kwasów tłuszczowych jako ich indywidualnych enancjomerów. Korzystając z przedstawionej tu metody, naukowcy mają dostęp do prostej i opłacalnej strategii syntezy EDP i innych metabolitów epoksydowych PUFA.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Proszę zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS) przed użyciem wymienionych chemikaliów.
1. Wyrażenie dzikiego typu BM3
- Zaszczepić transfekowane pBS-BM3 DH5α E. coli (hojna darowizna od dr F. Ann Walker) w 5 ml sterylnego bulionu LB z 0,5 mg ampicyliny dodanej do probówki hodowlanej o pojemności 20 ml.
- Inkubować kulturę komórkową w wytrząsarce w temperaturze 37 °C przez 24 godziny przy 200 obr./min. Dodać całonocną kulturę starterową (5 ml) i 100 mg ampicyliny do 1 l sterylnego bulionu LB w kolbie Fernbacha lub Erlenmeyera. Wytrząsać w temperaturze 37 °C przez 6 godzin przy 200 obr./min, a następnie w temperaturze 30 °C przez 18 godzin przy 200 obr./min.
- Zebrać i odwirować kulturę komórkową w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 1 000 x g. Odrzucić supernatant i przechowywać osad komórkowy w temperaturze -78 °C do czasu oczyszczenia enzymatycznego.
UWAGA: Supernatant może być sterylizowany chemicznie przez traktowanie wybielaczem lub sterylizowany za pomocą autoklawu, a następnie wylewany do odpływu.
2. Oczyszczanie BM3.
- Liza komórek
- Rozmrozić osad komórkowy na lodzie i ponownie zawiesić w 40 ml lodowatego (4 °C) buforu do rozpuszczania (10 mM Tris, 0,01 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF), 0,01 mM EDTA; pH 7,8).
UWAGA: PMSF jest toksyczny w kontakcie. - Będąc na lodzie, sonikuj komórki przez 1 minutę za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego (ustawienie mocy wyjściowej 10, obciążenie 100%), a następnie 1-minutową przerwę na lodzie w celu lizy komórek. Powtórz tę procedurę 6 razy. Odwirować lizat komórkowy w temperaturze 4 °C przez 30 minut w temperaturze 11 000 x g w celu osadzenia resztek komórek.
- Rozmrozić osad komórkowy na lodzie i ponownie zawiesić w 40 ml lodowatego (4 °C) buforu do rozpuszczania (10 mM Tris, 0,01 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF), 0,01 mM EDTA; pH 7,8).
- Chromatografia powinowactwa
- Przygotować kolumnę do chromatografii z silną anionowymiennością (patrz tabela materiałów; średnica: 2,8 cm x 6 cm, objętość kolumny: 37 ml) przez przemywanie 5 objętościami kolumny (CV) buforu A (10 mM Tris, pH 7,8) w temperaturze 4 °C.
- Dodać lizaty komórkowe do zrównoważonej kolumny i przemyć kolumnę 3 CV zimnego buforu A. Usunąć BM3, przemłukując kolumnę zimnym buforem B (10 mM Tris, 600 mM NaCl, 6 CV).
- Zebrać czerwonawo-brązową frakcję eluentu. Jeśli białko nie jest używane natychmiast, wymieszaj je z równą objętością glicerolu i błyskawicznie zamroź ciekłym azotem. Zamrożony roztwór przechowywać w temperaturze -78 °C.
3. Epoksydacja DHA przez BM3
- Przygotować reakcję, dodając 0,308 g (0,940 mmol) DHA w 18,8 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) do 2 l buforu reakcyjnego do mieszania (0,12 M fosforanu potasu, 5 mM MgCl2, pH 7,4) wraz z 20 nM rozmrożonego enzymu BM3. Stężenie enzymu można określić za pomocą metody testu spektralnego tlenku węgla/ditionitu19.
- Podczas mieszania roztworu należy rozpocząć reakcję od dodania 1 równoważnika NADPH (zredukowany fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego, sól tetrasodowa, 0,808 g, 0,940 mmol) rozpuszczony w buforze reakcyjnym. Mieszaj reakcję przez 30 minut, bulgocząc powietrzem przez mieszaninę reakcyjną za pomocą balonu wypełnionego powietrzem przymocowanego do strzykawki i igły.
- Za pomocą spektrofotometru (patrz tabela materiałów) sprawdzić absorbancję mieszaniny reakcyjnej przy długości fali 340 nm, aby określić, czy NADPH jest wyczerpany. Jeśli nie ma pozostałej absorbancji wskazującej na zużycie NADPH, reakcja jest zakończona.
UWAGA: Zazwyczaj reakcja kończy się po 30 minutach. - Mieszaninę reakcyjną ugasić przez powolne dodawanie 1 M kwasu szczawiowego kroplami, aż pH roztworu osiągnie 4.
4. Ekstrakcja EDP
- Ekstrahować spiekany roztwór buforowy 2 litrami eteru dietylowego (bezwodnego, bez nadtlenku) 3 razy. Zebrać warstwę eteru (6 l) i osuszyć bezwodnym siarczanem magnezu (MgSO4).
- PrzefiltrowaćMgSO4 z roztworu i skoncentrować wysuszoną warstwę eteru na wyparce obrotowej, aby uzyskać surową pozostałość EDP.
- Oczyścić pozostałość metodą chromatografii kolumnowej z błyskiem (wystarczy wkład z krzemionką o masie 40 g). Zacznij od 10% octanu etylu (EtOAc) w heksanach i zwiększaj do 60% EtOAc w heksanach w ciągu 22 minut
UWAGA: Trzy główne piki są uzyskiwane i zbierane, eluując w kolejności 1. nieprzereagowany DHA; 2. mieszanina izomerów EDP; oraz 3. dwuepoksyd (normalne produkty nadmiernego utleniania (patrz rysunek 1)). - Połącz frakcje i skoncentruj je na wyparce obrotowej. Z tego przykładu uzyskano 0,074 g (24%) nieprzereagowanego DHA, 0,151 g (47%) izomerów EDP i 0,076 g (22%) diepoksydu.
5. Estryfikacja EDP, separacja 16(S),17(R)- i 19(R),20(R)-EDP oraz zmydlanie estrów
UWAGA: Trimethylsilyldiazomethane (TMS-diazometan) jest bardzo toksyczny zarówno przez kontakt, jak i przez wdychanie. Stosować wyłącznie w dygestorium z odpowiednim wyposażeniem ochrony osobistej.
- Rozcieńczyć epoksydy (0,151 g, 0,435 mmol) w kolbie okrągłodennej lub małej fiolce z 2 ml bezwodnego metanolu (MeOH) i 3 ml bezwodnego toluenu, dodać mieszadło i dodać TMS-diazometan (1,2 ekwiwalentu molowego lub 0,26 ml 2 M roztworu 2 M w heksanach) pod wpływem argonu.
- Odczekaj 10 minut i dodaj dodatkowy TMS-diazometan (0,050 ml), aż pozostanie bladożółty kolor.
- Po 30 minutach ostrożnie zagęścić mieszaninę za pomocą wyparki obrotowej i oczyścić pozostałość metodą chromatografii kolumnowej z błyskiem. Eluować 4% EtOAc w heksanach (przy użyciu 40 g kolumny lub wkładu z żelem krzemionkowym) przez 22 minuty. W tym przykładzie ester metylowy 19,20-EDP (0,116 g, 74%) i ester metylowy 16,17-EDP (0,029 g, 19%) otrzymano jako klarowne oleje (całkowita wydajność, 93%).
- Zebrać frakcje zawierające oczyszczone regioizomery estrów metylowych EDP. Najpierw eluuje ester metylowy 19(S),20(R)-EDP, a następnie ester metylowy 16(S),17(R)-EDP.
- Jeśli pozostaną jakiekolwiek frakcje mieszane (zawierające oba izomery; można je ocenić za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) w heksanie/EtOAc 8:1 i zabarwić nadmanganianem potasu (KMnO4)), należy je ponownie schromatografować tym samym systemem rozpuszczalników, co poprzednio.
- Zagęścić frakcje zawierające poszczególne regioizomery.
UWAGA: W tym momencie tożsamość i czystość można ocenić za pomocą NMR (przy użyciu CDCl3 jako rozpuszczalnika; patrz legenda dla Rysunek 2). - Aby przekształcić poszczególne regioizomery estrów metylowych EDP do ich form kwasowych, należy rozcieńczyć ester EDP w THF:woda (około 0,7 ml/0,1 mmol estru). Dodać 2 M wodny roztwór LiOH (odpowiednik 3 molowców) i mieszać przez noc.
UWAGA: Kompletność reakcji można ocenić za pomocą TLC, przy użyciu heksanów 3:1/EtOAc, barwienia KMnO4; Produkt posiada współczynnik retencji ~0,3. - Powoli gasić reakcję kwasem mrówkowym, aż pH mieszaniny osiągnie 3-4. Dodaj wodę i octan etylu (1-2 ml / 0,100 mmol estru) i oddziel warstwy. Ekstrahować warstwę wody za pomocą EtOAc (3 x 5 ml), przemyć nasyconym roztworem solanki (NaCl) i wysuszyć warstwę EtOAc na bezwodnym siarczanie sodu (Na2SO4).
- Zagęścić roztwór octanu etylu za pomocą wyparki obrotowej, dodać heksany (10 ml) i ponownie zagęścić. Powtórz dwukrotnie, aby azeotropowo usunąć resztki kwasu mrówkowego. Oczyścić pozostałość metodą chromatografii kolumnowej z błyskiem, eluując 10-30% EtOAc przez 15 minut.
- Skoncentrować pożądane frakcje i wysuszyć w próżni, aby uzyskać oczyszczony kwas.
UWAGA: Na tym etapie można ocenić czystość enancjomeryczną (za pomocą chiralnego HPLC, patrz legendy dla Rysunek 3 - Rysunek 4 dla kolumny i warunków). Czystość chemiczną można ocenić za pomocą HPLC C18 (achiralnej) (patrz tabela materiałów i odniesienie 14).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Chromatogram z flash-chromatografii kolumnowej (wykonanej przy użyciu zautomatyzowanego systemu do oczyszczania metodą flash, opisanego poniżej), uzyskany podczas oczyszczania surowej mieszaniny z epoksydacji enzymatycznej, przedstawiono na Rysunku 1. Po estryfikacji i rozdziale regioizomerów otrzymano czyste estry metylowe 16(S),17(R)-EDP oraz 19(S),20(R)-EDP. Zazwyczaj występują one w przybliżonym stosunku od 1:4 do 1:5, ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiamy tutaj prostą operacyjnie i opłacalną metodę otrzymywania dwóch najobficiej występujących epoksydowych metabolitów DHA - 19,20 i 16,17-EDP. Te epoksydowe kwasy tłuszczowe można wytwarzać w wysoce enancjomerycznym (jako ich izomery S,R) przy użyciu enzymu BM3 typu dzikiego. Poniżej opisano kilka krytycznych punktów, które można wykorzystać do rozwiązywania problemów oraz rozszerzenia naszej metody o przygotowanie enancjoczystych metabolitów epoksydowych AA i EPA.
W...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca jest finansowana przez R00 ES024806 (National Institutes of Health), DMS-1761320 (National Science Foundation) oraz fundusze startowe z Michigan State University. Autorzy pragną podziękować dr Jun Yangowi (Uniwersytet Kalifornijski w Davis) i Lalithi Karchalla (Uniwersytet Stanowy Michigan) za pomoc w optymalizacji reakcji enzymatycznej oraz dr Tony'emu Schilmillerowi (MSU Mass Spectrometry and Metabolomics Facility) za pomoc w pozyskiwaniu danych HRMS.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wodorowęglan amonu | Sigma | 9830 | NA |
| Ampicillin | GoldBio | A30125 | NA |
| Bezwodny siarczan magnezu | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| Bezwodny metanol | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| Bezwodny siarczan sodu | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| Bezwodny toluen | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| NA Kwas arachidonowy (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | Wrażliwy na powietrze. |
| Eter dietylowy | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO (klasa biologii molekularnej) | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| Kwas dokozaheksaenowy (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | Wrażliwy na powietrze. |
| EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) | Invitrogen | 15576028 | NA |
| Kwas eikozapentaenowy (EPA) | Nu-Chek Prep | U-99A | Wrażliwy na powietrze. |
| Octan etylu | Sigma | 34858 | NA |
| Wkłady kolumnowe Flash o rozmiarach 25, 40, 4, 12 g | Fisher Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | Alternatywnie można zastosować konwencjonalną chromatografię kolumnową |
| Kwas mrówkowy (klasa HPLC) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| Glicerol | Sigma | G7757 | NA |
| Heksany | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Bulion | Sigma | L3022 | NA |
| Wodorotlenek litu | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| Chlorek magnezu | Fisher Scientific | 2444-01 | |
| NA Metanol (klasa HPLC) | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH Sól tetrasodowa | Sigma-Aldrich | 481973 | Wrażliwy na powietrze. |
| Kwas szczawiowy | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 transfekowany DH5&alfa; E. coli | NA | ||
| NA PMSF (fluorek fenylometanosulfonylu) | Sigma | P7626 | Toksyczny! |
| Nadmanganian potasu | Sigma-Aldrich | 223468 | do barwienia TLC. |
| Fosforan potasu dwuzasadowy | Sigma | 795496 | NA |
| Fosforan potasu jednozasadowy | Sigma | 795488 | NA |
| Q Sepharose Fast Flow żywica (GE Healthcare, nauki przyrodnicze) | Fisher Scientific | 17-0515-01 | Do oczyszczania enzymu z anionamitenitami |
| Chlorek sodu | Sigma | 71376 | NA |
| Tetrahydrofuran, bezwodny | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-Diazometan (2,0 M w heksanach) | Sigma-Aldrich | 362832 | Bardzo toksyczny. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| strong>Również niezbędne: | |||
| Automatyczny system oczyszczania flash (użyliśmy Buchi Reveleris X2) | Kolumna HPLC Buchi | ||
| C18 (Zorbax Eclipse XDB-C18) | Wirówka Agilent | ||
| zdolna do 10 000 x g | |||
| Chiralna kolumna HPLC (Lux celuloza-3), 250 x 4,6 mm, 5 i mikro; M, 1000 & Aring ;) | Zaopatrzenie Phenomenex | ||
| General chemistry: lejek separacyjny o pojemności 2 l, zlewki i kolby Erlenmeyera o pojemności 1000-2000 l, fiolki 20 ml, fiolki HPLC, małe kolby okrągłodenne i mieszadła. | |||
| HPLC (używamy pompy analitycznej Shimadzu Prominence LC-20AT i detektora UV-vis SPD-20A | Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo-Fisher Scientific | ||
| NMR | NMR: Spektrometr Agilent DD2 (500 MHz) | ||
| Parownik obrotowy | Buchi | ||
| Dysmembrator Sonic lub homogenizator ultradźwiękowy | Cole-Parmer |
Bibliografia
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circulation Research. 78, 415-423 (1996).
- Ulu, A., et al. An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).
- Ye, D., et al. Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).
- Imig, J. D. Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury. Hypertension. 65, 476-682 (2015).
- Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation. Scientific Reports. 6, 39211(2016).
- Zou, A. P., et al. Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity. American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).
- Lauterbach, B., et al. Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators. Hypertension. 39, 609-613 (2002).
- Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012. , National Center for Health Statistics. Hyattsville, MD. (2015).
- Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease. Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).
- Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters. Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).
- Ostermann, A. I., Schebb, N. H. Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids. Food & Function. 8, 2355-2367 (2017).
- Khan, M. A., Wood, P. L. Method for the synthesis of DHA. , WO2012126088A1 (2012).
- Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).
- Cinelli, M. A., et al. Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids. Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).
- Falck, J. R., et al. Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid). Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).
- Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium. Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).
- Capdevila, J. H., et al. The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3. Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).
- Lucas, D., et al. Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450. Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).
- Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase. Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).
- Cayman Chemical, 19,20-EpDPA. , https://www.caymanchem.com/product/10175 (2019).
- Graham-Lorence, S., et al. An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase. Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
