Prezentujemy metodę przydatną do syntezy enzymatycznej na dużą skalę i oczyszczania specyficznych enancjomerów i regioizomerów epoksydów kwasu arachidonowego (AA), kwasu dokozaheksaenowego (DHA) i kwasu eikozapentaenowego (EPA) za pomocą bakteryjnego enzymu cytochromu P450 (BM3).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Enzymatyczna synteza epoksydowanych metabolitów kwasów dokozaheksaenowego, eikozapentaenowego i arachidonowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Epoksydowane metabolity różnych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA), określane jako epoksydowe kwasy tłuszczowe, pełnią szeroki zakres ról w fizjologii człowieka. Metabolity te są wytwarzane endogennie przez enzymy z klasy cytochromu P450. Ze względu na ich zróżnicowane i silne działanie biologiczne, istnieje duże zainteresowanie badaniem tych metabolitów. Określenie unikalnych ról tych metabolitów w organizmie jest trudnym zadaniem, ponieważ epoksydowe kwasy tłuszczowe muszą być najpierw pozyskiwane w znacznych ilościach i o wysokiej czystości. Pozyskiwanie związków ze źródeł naturalnych jest często pracochłonne, a rozpuszczalne hydrolazy epoksydowe (sEH) szybko hydrolizują metabolity. Z drugiej strony, otrzymywanie tych metabolitów w reakcjach chemicznych jest bardzo nieefektywne, ze względu na trudności w uzyskaniu czystych regioizomerów i enancjomerów, niskie plony oraz rozległe (i kosztowne) oczyszczanie. W tym miejscu przedstawiamy wydajną syntezę enzymatyczną kwasów 19(S),20(R)- i 16(S),17(R)-epoksydokozapentaenowych (EDP) z DHA poprzez epoksydację BM3, bakteryjnym enzymem CYP450 wyizolowanym pierwotnie z Bacillus megaterium (który łatwo ulega ekspresji w Escherichia coli). Charakterystykę i oznaczanie czystości przeprowadza się za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i spektrometrii mas (MS). Procedura ta ilustruje korzyści płynące z enzymatycznej syntezy metabolitów epoksydowych PUFA i ma zastosowanie do epoksydacji innych kwasów tłuszczowych, w tym kwasu arachidonowego (AA) i kwasu eikozapentaenowego (EPA) w celu wytworzenia analogicznych kwasów epoksyeikozatrienowych (EET) i kwasów epoksyeikozatetraenowych (EEQ).
Wprowadzenie
Ponieważ zainteresowanie rolą, jaką wielonienasycone kwasy tłuszczowe (szczególnie wielonienasycone kwasy tłuszczowe omega-3 i omega-6) odgrywają w biologii człowieka, w ostatnich latach wzrosło zainteresowanie badaczami, którzy wykazują szeroki zakres atrakcyjnych korzyści, jakie wykazują ich metabolity. W szczególności dużym zainteresowaniem zwrócono się na metabolity epoksydowych kwasów tłuszczowych wytwarzane przez enzymy z klasy cytochromu P450. Na przykład wiele epoksydów PUFA, w tym kwasy epoksyeikozatrienowe (EET), kwasy epoksydokozapentaenowe (EDP) i kwasy epoksyeikozatetraenowe (EEQ), odgrywa kluczową rolę w regulacji ciśnienia krwi i stanu zapalnego
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Proszę zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS) przed użyciem wymienionych chemikaliów.
1. Wyrażenie dzikiego typu BM3
- Zaszczepić transfekowane pBS-BM3 DH5α E. coli (hojna darowizna od dr F. Ann Walker) w 5 ml sterylnego bulionu LB z 0,5 mg ampicyliny dodanej do probówki hodowlanej o pojemności 20 ml.
- Inkubować kulturę komórkową w wytrząsarce w temperaturze 37 °C przez 24 godziny przy 200 obr./min. Dodać całonocną kulturę starterową (5 ml) i 100 mg ampicyliny do 1 l sterylnego bulionu LB w kolbie Fernbacha lub Erlenmeyera. Wytrząsać w temperaturze....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Chromatogram z flash-chromatografii kolumnowej (wykonanej przy użyciu zautomatyzowanego systemu do oczyszczania metodą flash, opisanego poniżej), uzyskany podczas oczyszczania surowej mieszaniny z epoksydacji enzymatycznej, przedstawiono na Rysunku 1. Po estryfikacji i rozdziale regioizomerów otrzymano czyste estry metylowe 16(S),17(R)-EDP oraz 19(S),20(R)-EDP. Zazwyczaj występują one w przybliżonym stosunku od 1:4 do 1:5, .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiamy tutaj prostą operacyjnie i opłacalną metodę otrzymywania dwóch najobficiej występujących epoksydowych metabolitów DHA - 19,20 i 16,17-EDP. Te epoksydowe kwasy tłuszczowe można wytwarzać w wysoce enancjomerycznym (jako ich izomery S,R) przy użyciu enzymu BM3 typu dzikiego. Poniżej opisano kilka krytycznych punktów, które można wykorzystać do rozwiązywania problemów oraz rozszerzenia naszej metody o przygotowanie enancjoczystych metabolitów epoksydowych AA i EPA.
W.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca jest finansowana przez R00 ES024806 (National Institutes of Health), DMS-1761320 (National Science Foundation) oraz fundusze startowe z Michigan State University. Autorzy pragną podziękować dr Jun Yangowi (Uniwersytet Kalifornijski w Davis) i Lalithi Karchalla (Uniwersytet Stanowy Michigan) za pomoc w optymalizacji reakcji enzymatycznej oraz dr Tony'emu Schilmillerowi (MSU Mass Spectrometry and Metabolomics Facility) za pomoc w pozyskiwaniu danych HRMS.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wodorowęglan amonu | Sigma | 9830 | NA |
| Ampicillin | GoldBio | A30125 | NA |
| Bezwodny siarczan magnezu | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| Bezwodny metanol | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| Bezwodny siarczan sodu | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| Bezwodny toluen | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| NA Kwas arachidonowy (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | Wrażliwy na powietrze. |
| Eter dietylowy | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO (klasa biologii molekularnej) | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| Kwas dokozaheksaenowy (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | Wrażliwy na powietrze. |
| EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) | Invitrogen | 15576028 | NA |
| Kwas eikozapentaenowy (EPA) | Nu-Chek Prep | U-99A | Wrażliwy na powietrze. |
| Octan etylu | Sigma | 34858 | NA |
| Wkłady kolumnowe Flash o rozmiarach 25, 40, 4, 12 g | Fisher Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | Alternatywnie można zastosować konwencjonalną chromatografię kolumnową |
| Kwas mrówkowy (klasa HPLC) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| Glicerol | Sigma | G7757 | NA |
| Heksany | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Bulion | Sigma | L3022 | NA |
| Wodorotlenek litu | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| Chlorek magnezu | Fisher Scientific | 2444-01 | |
| NA Metanol (klasa HPLC) | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH Sól tetrasodowa | Sigma-Aldrich | 481973 | Wrażliwy na powietrze. |
| Kwas szczawiowy | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 transfekowany DH5&alfa; E. coli | NA | ||
| NA PMSF (fluorek fenylometanosulfonylu) | Sigma | P7626 | Toksyczny! |
| Nadmanganian potasu | Sigma-Aldrich | 223468 | do barwienia TLC. |
| Fosforan potasu dwuzasadowy | Sigma | 795496 | NA |
| Fosforan potasu jednozasadowy | Sigma | 795488 | NA |
| Q Sepharose Fast Flow żywica (GE Healthcare, nauki przyrodnicze) | Fisher Scientific | 17-0515-01 | Do oczyszczania enzymu z anionamitenitami |
| Chlorek sodu | Sigma | 71376 | NA |
| Tetrahydrofuran, bezwodny | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-Diazometan (2,0 M w heksanach) | Sigma-Aldrich | 362832 | Bardzo toksyczny. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| strong>Również niezbędne: | |||
| Automatyczny system oczyszczania flash (użyliśmy Buchi Reveleris X2) | Kolumna HPLC Buchi | ||
| C18 (Zorbax Eclipse XDB-C18) | Wirówka Agilent | ||
| zdolna do 10 000 x g | |||
| Chiralna kolumna HPLC (Lux celuloza-3), 250 x 4,6 mm, 5 i mikro; M, 1000 & Aring ;) | Zaopatrzenie Phenomenex | ||
| General chemistry: lejek separacyjny o pojemności 2 l, zlewki i kolby Erlenmeyera o pojemności 1000-2000 l, fiolki 20 ml, fiolki HPLC, małe kolby okrągłodenne i mieszadła. | |||
| HPLC (używamy pompy analitycznej Shimadzu Prominence LC-20AT i detektora UV-vis SPD-20A | Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo-Fisher Scientific | ||
| NMR | NMR: Spektrometr Agilent DD2 (500 MHz) | ||
| Parownik obrotowy | Buchi | ||
| Dysmembrator Sonic lub homogenizator ultradźwiękowy | Cole-Parmer |
Bibliografia
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circulation Research. 78, 415-423 (1996).
- Ulu, A., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
