Artykuł metodologiczny

Podwójnie humanizowany model myszy BLT ze stabilnym mikrobiomem jelitowym podobnym do ludzkiego i ludzkim układem odpornościowym

DOI:

10.3791/59773

⸱

30 sierpnia 2019

 ,  ,  , 
1Nebraska Center for Virology, 2School of Biological Sciences, University of Nebraska-Lincoln, 3Department of Food Science and Technology, University of Nebraska-Lincoln

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy nowatorską metodę generowania podwójnie humanizowanych myszy BLT, które posiadają funkcjonalny ludzki układ odpornościowy i stabilny, wszczepiony ludzki mikrobiom jelitowy. Protokół ten może być stosowany bez konieczności stosowania myszy wolnych od zarazków lub urządzeń gnotobiotycznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Humanizowane myszy (hu-myszy), które posiadają funkcjonalny ludzki układ odpornościowy, zasadniczo zmieniły podejście do badań nad ludzkimi patogenami i chorobami. Mogą być używane do modelowania chorób, które w innym przypadku są trudne lub niemożliwe do zbadania na ludziach lub innych modelach zwierzęcych. Mikrobiom jelitowy może mieć głęboki wpływ na zdrowie i choroby człowieka. Jednak mikrobiom jelitowy myszy bardzo różni się od tego, który występuje u ludzi. Istnieje zapotrzebowanie na ulepszone przedkliniczne modele myszy hu-myszowych, które mają wszczepiony ludzki mikrobiom jelitowy. Dlatego stworzyliśmy podwójne myszy, które charakteryzują się zarówno ludzkim układem odpornościowym, jak i stabilnym mikrobiomem jelitowym podobnym do ludzkiego. SKINIENIE. Myszy Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) są jednymi z najlepszych zwierząt do humanizacji ze względu na wysoki poziom niedoboru odporności. Jednak myszy NSG wolne od zarazków i różne inne ważne modele myszy wolnych od zarazków nie są obecnie dostępne na rynku. Co więcej, wiele ośrodków badawczych nie ma dostępu do obiektów gnotobiotycznych, a praca w warunkach gnotobiotycznych może być często kosztowna i czasochłonna. Co ważne, myszy wolne od zarazków mają kilka niedoborów odporności, które istnieją nawet po wszczepieniu drobnoustrojów. Dlatego opracowaliśmy protokół, który nie wymaga zwierząt wolnych od zarazków ani obiektów gnotobiotycznych. Aby wygenerować podwójne myszy hu-myszy, myszy NSG zostały poddane promieniowaniu przed operacją w celu stworzenia myszy humanizowanych szpikiem kostnym, wątrobą i grasicą (hu-BLT). Myszy były następnie leczone antybiotykami o szerokim spektrum działania, aby zubożyć istniejący wcześniej mysi mikrobiom jelitowy. Po leczeniu antybiotykami myszom podano przeszczepy kału ze zdrowymi próbkami ludzkich dawców za pomocą zgłębnika doustnego. Podwójne myszy hu-BLT miały unikalne profile genów 16S rRNA oparte na indywidualnej próbce ludzkiego dawcy, która została przeszczepiona. Co ważne, przeszczepiony mikrobiom podobny do ludzkiego był stabilny u myszy z podwójnym hu-BLT przez cały czas trwania badania do 14,5 tygodnia po przeszczepie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Humanizowane myszy (hu-mys) zmieniły sposób badania wielu aspektów ludzkiego zdrowia i chorób, w tym hematopoezy, odporności, raka, chorób autoimmunologicznych i chorób zakaźnych1,2,3,4,5,6,7,8,9. Te hu-myszy mają wyraźną przewagę nad innymi modelami myszy, ponieważ mają funkcjonalny ludzki układ odpornościowy i mogą być zarażone patogenami specyficznymi dla człowieka. Niemniej jednak znaczenie mikrobiomu jelitowego zostało wykazane przez jego rolę w wielu chorobach człowieka, takich jak otyłość, zespół metaboliczny, choroby zapalne i nowotwory10,11,12,13. Układ odpornościowy błony śluzowej i mikrobiom jelitowy są wzajemnie regulowane w celu utrzymania homeostazy jelitowej i ogólnoustrojowej. Układ odpornościowy jest kształtowany przez antygeny prezentowane przez mikrobiom jelitowy i odwrotnie, układ odpornościowy odgrywa ważną rolę regulacyjną w promowaniu komensalnych bakterii jelitowych i eliminowaniu patogenów14,15,16. Jednak mikrobiom jelitowy myszy hu-mysz nie został dobrze scharakteryzowany, a mikrobiom jelitowy myszy różni się znacznie składem i funkcją od ludzkiego17. Wynika to z ewolucyjnych, fizjologicznych i anatomicznych różnic między mysim a ludzkim jelitem, a także innych ważnych czynników, takich jak dieta, które mogą wpływać na wyniki eksperymentalne modeli choroby myszy hu-myszy18. Dlatego, poza klasyfikacją mysiego mikrobiomu jelitowego myszy hu-mysz, potrzebny jest model zwierzęcy obejmujący zarówno ludzki układ odpornościowy, jak i ludzki mikrobiom jelitowy, aby zbadać złożone interakcje chorób ludzkich in vivo.

Badanie chorób ludzkich bezpośrednio na ludziach jest często niepraktyczne lub nieetyczne. Wiele modeli zwierzęcych nie może być wykorzystywanych do badania ludzkich patogenów, takich jak ludzki wirus niedoboru odporności typu 1 (HIV-1). Modele naczelnych innych niż ludzie są genetycznie niekrewniacze, bardzo drogie i nie są podatne na wiele ludzkich patogenów. Myszy, które zostały uznane za wolne od zarazków (GF) i odtworzone z mikrobiomami jelitowymi podobnymi do ludzkich, były szeroko stosowane do badania ludzkiego zdrowia i chorób19,20. Jednak zwierzęta te nie mają ludzkiego układu odpornościowego, a praca ze zwierzętami GF wymaga specjalistycznych urządzeń, procedur i wiedzy specjalistycznej. W związku z tym istnieje potrzeba udoskonalenia modeli przedklinicznych w celu zbadania złożonych relacji między mikrobiomem jelitowym a ludzkim układem odpornościowym. Wiele szczepów myszy, takich jak NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), nie są dostępne na rynku jako GF. Zwierzęta GF mogą również cierpieć na długotrwałe niedobory odporności, które nie są całkowicie odwracane przez wszczepienie drobnoustrojów21. Dlatego stworzyliśmy podwójne myszy hu-mys, które mają zarówno funkcjonalny ludzki układ odpornościowy, jak i stabilny mikrobiom jelitowy podobny do ludzkiego w określonych warunkach wolnych od patogenów (SPF). Aby wygenerować podwójne myszy hu-myszy, przeprowadzono operację na myszach NSG w celu stworzenia humanizowanych myszy ze szpikiem kostnym, wątrobą i grasicą (hu-BLT). Myszy hu-BLT były następnie leczone antybiotykami o szerokim spektrum działania, a następnie przeszczepiono kał z próbką zdrowego ludzkiego dawcy. Scharakteryzowaliśmy bakteryjny mikrobiom jelitowy 173 próbek kału od 45 myszy z podwójnym hu-BLT i 4 próbek od ludzkich dawców kału. Myszy z podwójnym hu-BLT mają unikalne profile genów 16S rRNA oparte na indywidualnej próbce ludzkiego dawcy, która jest przeszczepiana. Co ważne, przeszczepiony mikrobiom podobny do ludzkiego był stabilny u myszy przez cały czas trwania badania do 14,5 tygodnia po przeszczepie. Ponadto przewidywane metagenomy wykazały, że myszy z podwójnym hu-BLT mają inną przewidywaną zdolność funkcjonalną niż myszy hu-myszy, która jest bardziej podobna do próbek od ludzkiego dawcy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi protokołami Institutional Animal Care and Research Committee (IACUC) na Uniwersytecie Nebraska-Lincoln (UNL). IACUC w UNL zatwierdził dwa protokoły związane z generowaniem i używaniem myszy hu-BLT, w tym myszy podwójnych. Ponadto Komitet Nadzoru Badań Naukowych (SROC) w UNL zatwierdził również wykorzystanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i tkanek płodowych, które są pozyskiwane z Advanced Bioscience Resources do badań na humanizowanych myszach (SROC# 2016-1-002).

1. Przechowywanie i konserwacja myszy

  1. Kup 6-8-tygodniowe myszy NSG (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ).
  2. Trzymaj myszy w warunkach SPF z wymianą powietrza, filtrami wstępnymi i filtrami HEPA (0,22 μm) w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze, wilgotności i ciśnieniu.
    1. Myszy należy przechowywać i przechowywać w autoklawowanych, indywidualnych klatkach z mikroizolatorami w systemie rack zdolnym do zarządzania wymianą powietrza z filtrami wstępnymi i filtrami HEPA (0,22 μm).
  3. Wykonuj wszystkie procedury i manipulacje na myszach w biologicznym dygestorii klasy II typu A2, który został wstępnie potraktowany 70% etanolem. Przed pracą w pomieszczeniu dla zwierząt weź prysznic i przebierz się w czyste fartuchy, kombinezon z tyveku, pokrowce na buty, czepek do włosów, maskę na twarz i rękawiczki. Podczas zabiegów chirurgicznych należy nosić fartuch chirurgiczny na kombinezonie z tworzywa sztucznego.
    UWAGA: Przed zabiegami preferowane jest również odkażanie światłem ultrafioletowym (UV).
    1. Jeśli to możliwe, wszystkie narzędzia i odczynniki należy sterylizować w autoklawie, a następnie zdezynfekować przed przeniesieniem do dygestorium.
    2. Podczas zabiegów należy wyjąć indywidualnie wentylowane klatki zwierząt ze stojaka i zdezynfekować je przed przeniesieniem do dygestorium.
  4. Nakarm myszy napromieniowaną dietą i podaj wodę z autoklawu. Dostarczyć napromieniony pokarm ab libitum i w razie potrzeby uzupełnić go dodatkowym napromieniowanym pokarmem. Zmieniaj wodę w autoklawie co tydzień lub w razie potrzeby.
    UWAGA: Można również użyć autoklalawowanej zakwaszonej wody. Dostarczona napromieniowana dieta miała okres przydatności do spożycia wynoszący 6 miesięcy po wyprodukowaniu.

2. Generacja humanizowanych myszy BLT

UWAGA: Generacja myszy hu-BLT została opisana wcześniej22,23,24.

  1. W dniu zabiegu należy podać myszom napromienianie całego ciała w dawce 12 cGy/g masy ciała.
  2. Przygotuj myszy do operacji.
    1. Każdej napromienianej myszy należy podać mieszaninę ketaminy w stężeniu roboczym 100 mg/kg i ksylazyny w stężeniu 12 mg/kg, które wahało się od 130 do 170 μl na mysz w przeliczeniu na masę ciała przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP) w celu znieczulenia. Aby przygotować 3 ml mieszaniny ketaminy i ksylazyny, dodaj 0,27 ml ketaminy o podstawowym stężeniu 100 mg/ml i 0,03 ml ksylazyny o stężeniu 100 mg/ml do 2,7 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej i dobrze wymieszaj. Przed wstrzyknięciem zdezynfekuj skórę 70% izopropanolem.
    2. Każdej napromienianej myszy należy podać buprenorfinę w dawce 1 mg/kg masy ciała (czas przeżycia 72 godziny, SR-LAB) we wstrzyknięciu podskórnym w celu długotrwałego leczenia bólu.
    3. Każdej napromieniowanej myszy należy podać 100 μl (858 μg) cefazoliny we wstrzyknięciu IP w celu przedoperacyjnej profilaktyki antybiotykowej.
    4. Ogol włosy myszy za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia włosów wokół lewej bocznej i przyśrodkowej strony myszy w późniejszym miejscu chirurgicznym używanym do odsłonięcia lewej nerki.
    5. Sprawdź prawidłowy poziom znieczulenia za pomocą odruchu pedałowania (mocne uszczypnięcie palca).
    6. Podaj izofluran w dawce 3-5%, jeśli w dowolnym momencie operacji potrzebne jest dodatkowe znieczulenie.
    7. Nałóż maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki. W razie potrzeby załóż kolczyk do uszu.
  3. Wykonaj operację wszczepienia tkanek wątroby i grasicy do lewej torebki nerkowej.
    1. Zdezynfekuj skórę w miejscu operacji, nakładając peeling jodowy zaczynając od środka pola operacyjnego i kierując się na zewnątrz w sposób okrężny. Powtórz ten proces z 70% izopropanolem i po raz trzeci z jodem.
    2. Za pomocą kleszczy najpierw załaduj jeden fragment tkanki wątroby ludzkiego płodu do trokaru. Następnie za pomocą kleszczy załaduj jeden fragment tkanki grasicy ludzkiego płodu do trokaru. Następnie za pomocą kleszczy załaduj do trokaru kolejny fragment tkanki wątroby ludzkiego płodu. Chusteczki należy przyciąć na 1-1,6 mm3 tak, aby pasowały do wewnętrznych wymiarów trokaru.
    3. Użyj kleszczy, aby podnieść skórę i użyj nożyczek, aby wykonać małe cięcie wzdłużnie. Przedłuż cięcie do 1,5-2 cm po lewej stronie myszy.
    4. Użyj kleszczy, aby podnieść warstwę mięśni i użyj nożyczek, aby wykonać małe cięcie wzdłużne. W razie potrzeby przedłuż nacięcie, aby odsłonić nerkę.
    5. Odsłoń nerkę, delikatnie chwytając tkankę tłuszczową otaczającą nerkę. Nie dotykać bezpośrednio miąższu nerki.
    6. Wykonaj nacięcie 1-2 mm na tylnym końcu torebki nerkowej za pomocą skalpela.
    7. Powoli wprowadzić wstępnie załadowany trokar przez nacięcie równoległe do długiej osi nerki i uwolnić tkanki między torebką nerkową a nerką.
    8. Ostrożnie przywróć nerkę i jelita do normalnej pozycji. Użyj wchłanialnych szwów 5/0 P-3 (P-13) z igłą o średnicy 13 mm 3/8, aby zamknąć warstwę mięśniową i zszywek chirurgicznych, aby zamknąć skórę.
  4. Po operacji umieść mysz w czystej, autoklawowanej klatce mikroizolatora w celu rekonwalescencji.
    1. Aby zminimalizować straty ciepła podczas rekonwalescencji pooperacyjnej, umieść klatkę zawierającą myszy na poduszce grzewczej, która jest podłączona do pompy wodnej, która ogrzewa i cyrkuluje wodę.
    2. Monitoruj myszy, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności, aby utrzymać leżący mostek.
  5. W ciągu 6 godzin od zakończenia zabiegu, przez żyłę ogonową, wstrzyknąć krwiotwórcze komórki macierzyste CD34+ wyizolowane z tkanki wątroby ludzkiego płodu.
    1. Rozgrzej myszy za pomocą lampy grzewczej. Zdezynfekuj ogon 70% izopropanolem, a następnie wstrzyknij 1,5 do 5 × 105 komórek macierzystych/200 μl do żyły ogonowej.
    2. Zatrzymać krwawienie po wstrzyknięciu i umieścić myszy z powrotem w klatce mikroizolatora, a klatkę mikroizolatora w stojaku na klatki.
      UWAGA: Myszy po operacji są zwykle trzymane razem, po pięć w klatce mikroizolatora, podczas rekonwalescencji i po jej zakończeniu. Jednak myszy są trzymane razem tylko wtedy, gdy wszystkie przeszły operację tego samego dnia.
  6. Sprawdzaj myszy codziennie. Uważnie monitoruj zszywki chirurgiczne i wymieniaj je w razie potrzeby. Uważnie monitoruj myszy pod kątem jakichkolwiek oznak infekcji lub dyskomfortu. Dostarczaj autoklawowaną żywność na podłogę klatki mikroizolatora przez kilka dni po operacji.
  7. Usuń zszywki chirurgiczne 7-10 dni po zabiegu. Podaj izofluran w stężeniu 3-5%, aby znieczulić myszy. Ostrożnie usuń zszywki, a następnie nałóż na miejsce antybiotyk i maść przeciwbólową.
  8. Odczekaj 9-12 tygodni na odtworzenie ludzkich komórek odpornościowych, a następnie zbierz krew obwodową z przyśrodkowej żyły odpiszczelowej od każdej z humanizowanych myszy.
    1. Unieruchomić przytomne myszy za pomocą odpowiedniej wielkości plastikowego pasa przytrzymującego stożek z otworem w pobliżu głowy myszy do oddychania i otworem w pobliżu tyłu myszy, aby odizolować jedną nogę. Najpierw umieść myszy w stożku przytrzymującym, a następnie delikatnie przeciągnij jedną nogę przez otwór nogi.
    2. Spryskaj przyśrodkową stronę izolowanej nogi 70% izopropanolem, a następnie rozprowadź antybiotyk i maść przeciwbólową w tym samym miejscu.
      UWAGA: Maść pomaga odsłonić położenie żyły bez konieczności usuwania włosów, a także pomaga w tworzeniu kropelek krwi.
    3. Za pomocą igły o rozmiarze 25 nachylonym pod kątem 90° nakłuć żyłę i pobrać 50-100 μl krwi za pomocą probówki do pobierania krwi pokrytej EDTA. Zatamować krwawienie, uciskając miejsce sterylną gazą. Gdy krwawienie ustanie, wróć do klatki.
      UWAGA: Maksymalne objętości krwi pobieranej to zazwyczaj 50 μl tygodniowo lub 100 μl co dwa tygodnie.
    4. Pobraną krew obwodową należy wykorzystać do zbadania poziomu rekonstytucji ludzkich komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej z przeciwciałami przeciwko hCD45, mCD45, hCD3, hCD4, hCD8, hCD19.

3. Antybiotykoterapia

  1. Przed antybiotykoterapią należy pobrać próbki kału przed leczeniem. Przenieś myszy do nowej autoklawizowanej klatki z mikroizolatorem.
  2. Codziennie przygotowuj świeży koktajl antybiotyków o szerokim spektrum działania.
    1. Przygotuj 250 ml wody zawierającej świeżo przygotowany metronidazol (1 g/l), neomycynę (1 g/l), wankomycynę (0,5 g/l) i ampicylinę (1 g/l) dla każdej klatki mikroizolatora myszy.
      UWAGA: Używaj wody autoklawowanej lub sterylnej do wody pitnej uzupełnionej antybiotykiem.
    2. Dodaj 9,2 g mieszanki napojów słodzonych cukrem winogronowym do 250 ml wody z dodatkiem antybiotyków.
      UWAGA: Stosowanie mieszanki napojów słodzonych cukrem winogronowym maskuje gorzki smak antybiotyków i pomaga zapobiegać odwodnieniu u myszy.
    3. Zmieniaj antybiotyk i napój słodzony cukrem winogronowym, mieszaj wodę uzupełnianą wodą i codziennie umieszczaj myszy w nowej klatce z autoklawem.
      UWAGA: Myszy są koprofagiczne, a codzienna zmiana klatek zapobiega ponownemu zaszczepieniu się myszy bakteriami jelitowymi.
    4. Aby uzyskać maksymalne wszczepienie mikrobiomu jelitowego podobnego do ludzkiego, podawaj antybiotyki przez 14 dni. Podczas antybiotykoterapii monitoruj myszy pod kątem utraty wagi i odwodnienia. Oczekuje się, że utrata masy ciała nastąpi w ciągu pierwszych 3-4 dni, a następnie ustabilizuje się na czas trwania kuracji. Jeśli dojdzie do odwodnienia, podaj myszom sól fizjologiczną lub roztwór Ringersa we wstrzyknięciu dootrzewnowym.
      UWAGA: Inne protokoły humanizacji mikrobiomu jelitowego wymagają doustnego podawania antybiotyków. Chociaż skutecznie usuwa mysie bakterie jelitowe, odkryliśmy, że mniej inwazyjna metoda dodawania antybiotyków do wody pitnej mniej stresowała nasze humanizowane myszy i prowadziła do lepszych wyników.

4. Próbki od dawców i przeszczep kału

  1. Przygotuj próbki kału od ludzkiego dawcy.
    1. Należy użyć odpowiednio przygotowanych źródeł materiału do przeszczepu mikrobioty kałowej (FMT) do przeszczepu kału humanizowanym myszom.
    2. Preparaty FMT rozmrozić i podwielokrotnić je w warunkach beztlenowych w komorze beztlenowej.
    3. W razie potrzeby na tym etapie wymieszaj ze sobą równe części próbek kału, aby uzyskać bezstronną "ludzką" próbkę.
    4. Zamrażanie i rozmrażanie materiału FMT należy ograniczyć do minimum, a jeśli porcjowanie lub mieszanie próbek nie jest konieczne, należy je rozmrozić bezpośrednio przed zabiegiem.
  2. Przeszczep kału ludzkiego
    1. Po zakończeniu 14-dniowej antybiotykoterapii zmień wodę pitną na wodę autoklawowaną i przenieś myszy do nowej autoklawowanej klatki. Przestań codziennie zmieniać klatkę i wdrażaj harmonogram wymiany klatek raz na 1-2 tygodnie.
    2. Wykonaj dwa przeszczepy kału po 24 i 48 godzinach od zaprzestania antybiotyków.
    3. 24 godziny po kuracji antybiotykami rozmrozić potrzebną ilość materiału FMT, podać każdej myszy 200 μl materiału FMT przez zgłębnik doustny. Powtórz procedurę ponownie po 48 godzinach od antybiotyków.
    4. Rozprowadź pozostały lub resztki rozmrożonego materiału FMT na futrze humanizowanych myszy lub na ściółce klatki.

5. Pobieranie świeżych próbek kału

  1. Autoklaw poszczególnych worków papierowych przed przeniesieniem do dygestorium.
  2. W dygestorii włóż jedną mysz do każdej papierowej torby z osobna i pozwól myszy się wypróżnić.
  3. Za pomocą sterylnych kleszczy zbierz próbkę kału do plastikowych probówek o pojemności 1,5 ml i zamroź w temperaturze -80 °C. Umieść myszy z powrotem w klatkach z mikroizolatorami.
    UWAGA: Ta metoda pobierania próbek kału pozwala na pobieranie świeżych próbek kału od pojedynczych myszy bez żadnych manipulacji wywołujących stres
    4. .

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 pokazuje zarys metod używanych do tworzenia myszy z podwójnym hu-BLT i krótko opisuje proces dodawania funkcjonalnego ludzkiego układu odpornościowego i stabilnego, podobnego do ludzkiego mikrobiomu jelitowego do myszy NSG. Rysunek 2 pokazuje przykład analizy metodą cytometrii przepływowej krwi obwodowej od humanizowanej myszy BLT 10 tygodni po operacji. Rysunek 3 pokazuje względną obfitość próbek ludzkiego dawcy kału używanych do t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół ma na celu stworzenie myszy z podwójnym hu-BLT, które mają zarówno funkcjonalny ludzki układ odpornościowy, jak i stabilny mikrobiom jelitowy podobny do ludzkiego. Protokół ten można dostosować do innych humanizowanych lub niehumanizowanych modeli myszy bez potrzeby stosowania zwierząt GF i obiektów gnotobiotycznych. Chociaż opisane tutaj metody są stosunkowo proste, istnieje kilka krytycznych szczegółów, które są ważne dla pomyślnego stworzenia myszy z podwójnym hu-BLT. Myszy NSG mają skrajny nied...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Yanmin Wan, Guobin Kang i Pallabi Kundu za pomoc w tworzeniu myszy humanizowanych przez BLT. Chcielibyśmy podziękować UNMC Genomics Core Facility, który otrzymuje częściowe wsparcie od Nebraska Research Network In Functional Genomics NE-INBRE P20GM103427-14, The Molecular Biology of Neurosensory Systems CoBRE P30GM110768, The Fred & Pamela Buffett Cancer Center - P30CA036727, The Center for Root and Rhizobiome Innovation (CRRI) 36-5150-2085-20 oraz Nebraska Research Initiative. Chcielibyśmy podziękować University of Nebraska - Lincoln Life Sciences Annex i ich pracownikom za pomoc. Badanie to jest częściowo wspierane przez National Institutes of Health (NIH) Grants R01AI124804, R21AI122377-01, P30 MH062261-16A1 Chronic HIV Infection and Aging in NeuroAIDS (CHAIN) Center, 1R01AI111862 do Q Li. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, przygotowaniu manuskryptu lub decyzji o publikacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igły do karmienia zwierząt 18GCadence Science9928B
Aktywator Clidox-sFarmaceutyczne Laboratoria Badawcze95120F
Clidox-s BasePharmacal Research Laboratories96125F
Stojak na klatkę DGM 108Techniplast
Płaska brązowa torba na zakupy 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L Grainger12R063
FMT Preparaty na mikrobiotę górnego porodu OpenBiomeFMP30
Winogrona Kool-AidKraft Foods Inc.
hCD19-PE/Cy5Biolegend302209
hCD3-PEBiolegend300408
hCD4-Alexa 700Biolegend300526
hCD45-FITCBiolegend304006
hCD8-APC/Cy7Biolegend301016
roztwór Ringera z buforem mleczanowym BostonBioProducts Inc PY-906-500 
mCD45-APCBiolegend103111
Microvette 100 K3EMicrovette20.1278.100
Neosporin First Aid Maść antybiotykowa/przeciwbólowaMyszy Neosporin
NSG (NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)The Jackson Laboratory005557
PrecisionGlide 25 G IgłaBD305127
RS200 Promiennik rentgenowskiRAD Source Technologies
Klatki mikroizolacyjne Sealsafe Plus GM500Techniplast
Sterylna gaza z włókninyFisherbrand22-028-558
Teklad global 16% napromieniowana białkowa karma dla myszyTeklad2916

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simpson-Abelson, M. R., et al. Long-term engraftment and expansion of tumor-derived memory T cells following the implantation of non-disrupted pieces of human lung tumor into NOD-scid IL2R gamma(null) mice. Journal of Immunology. 180 (10), 7009-7018 (2008).
  2. Bankert, R. B., et al. Humanized Mouse Model of Ovarian Cancer Recapitulates Patient Solid Tumor Progression, Ascites Formation, and Metastasis. PLoS One. 6 (9), (2011).
  3. Vudattu, N. K., et al. Humanized Mice as a Model for Aberrant Responses in Human T Cell Immunotherapy. Journal of Immunology. 193 (2), 587-596 (2014).
  4. Whitfield-Larry, F., et al. HLA-A2 Matched Peripheral Blood Mononuclear Cells From Type 1 Diabetic Patients, but Not Nondiabetic Donors, Transfer Insulitis to NOD-scid/gamma c(null)/HLA-A2 Transgenic Mice Concurrent With the Expansion of Islet-Specific CD8(+) T cells. Diabetes. 60 (6), 1726-1733 (2011).
  5. Yi, G. H., et al. A DNA Vaccine Protects Human Immune Cells against Zika Virus Infection in Humanized Mice. EBioMedicine. 25, 87-94 (2017).
  6. Stary, G., et al. A mucosal vaccine against Chlamydia trachomatis generates two waves of protective memory T cells. Science. 348 (6241), (2015).
  7. Sun, Z. F., et al. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4(+) T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1. Journal of Experimental Medicine. 204 (4), 705-714 (2007).
  8. Wang, L. X., et al. Humanized-BLT mouse model of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3146-3151 (2014).
  9. Ernst, W. Humanized mice in infectious diseases. Comparative Immunology Microbiology and Infectious Diseases. 49, 29-38 (2016).
  10. Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
  11. Gopalakrishnan, V., et al. Gut microbiome modulates response to anti-PD-1 immunotherapy in melanoma patients. Science. 359 (6371), 97-103 (2018).
  12. Routy, B., et al. Gut microbiome influences efficacy of PD-1-based immunotherapy against epithelial tumors. Science. 359 (6371), (2018).
  13. Clemente, J. C., Manasson, J., Scher, J. U. The role of the gut microbiome in systemic inflammatory disease. Bmj-British Medical Journal. 360, (2018).
  14. Kau, A. L., Ahern, P. P., Griffin, N. W., Goodman, A. L., Gordon, J. I. Human nutrition, the gut microbiome and the immune system. Nature. 474 (7351), 327-336 (2011).
  15. Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions Between the Microbiota and the Immune System. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).
  16. Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489 (7415), 231-241 (2012).
  17. Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature Biotechnology. 33 (10), 1103(2015).
  18. Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
  19. Turnbaugh, P. J., et al. The Effect of Diet on the Human Gut Microbiome: A Metagenomic Analysis in Humanized Gnotobiotic Mice. Science Translational Medicine. 1 (6), (2009).
  20. Hazenberg, M. P., Bakker, M., Verschoor-Burggraaf, A. Effects of the human intestinal flora on germ-free mice. Journal of Applied Bacteriology. 50 (1), 95-106 (1981).
  21. Hansen, C. H. F., et al. Patterns of Early Gut Colonization Shape Future Immune Responses of the Host. PLoS One. 7 (3), (2012).
  22. Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S. M., Yang, Y. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34(+) cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
  23. Li, Q. S., et al. Early Initiation of Antiretroviral Therapy Can Functionally Control Productive HIV-1 Infection in Humanized-BLT Mice. Jaids-Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 69 (5), 519-527 (2015).
  24. Brainard, D. M., et al. Induction of Robust Cellular and Humoral Virus-Specific Adaptive Immune Responses in Human Immunodeficiency Virus-Infected Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 83 (14), 7305-7321 (2009).
  25. Greenblatt, M. B., et al. Graft versus Host Disease in the Bone Marrow, Liver and Thymus Humanized Mouse Model. PLoS One. 7 (9), (2012).
  26. Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
  27. Ericsson, A. C., Personett, A. R., Turner, G., Dorfmeyer, R. A., Franklin, C. L. Variable Colonization after Reciprocal Fecal Microbiota Transfer between Mice with Low and High Richness Microbiota. Frontiers in Microbiology. 8, 1-13 (2017).
  28. Ellekilde, M., et al. Transfer of gut microbiota from lean and obese mice to antibiotic-treated mice. Scientific Reports. 4, (2014).
  29. Staley, C., et al. Stable engraftment of human microbiota into mice with a single oral gavage following antibiotic conditioning. Microbiome. 5, (2017).
  30. Zhou, W., Chow, K. H., Fleming, E., Oh, J. Selective colonization ability of human fecal microbes in different mouse gut environments. ISME J. , (2018).
  31. Lundberg, R., Toft, M. F., August, B., Hansen, A. K., Hansen, C. H. F. Antibiotic-treated versus germ-free rodents for microbiota transplantation studies. Gut Microbes. 7 (1), 68-74 (2016).
  32. Wos-Oxley, M., et al. Comparative evaluation of establishing a human gut microbial community within rodent models. Gut Microbes. 3 (3), 234-249 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

myszy humanizowaneprzeszczep ka owycytometria przep ywowamodel BLTterapia antybiotykowazg bnik doustnysekwencjonowanie 16S rRNAkrew obwodowa

Powiązane artykuły