Artykuł metodologiczny

Ocena umiejętnego chwytu u myszy za pomocą automatycznego trenażera

DOI:

10.3791/59784

⸱

12 września 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Johns Hopkins University, 2Step Analysis, LLC, 3Department of Neurology, Duke University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda oceny wpływu treningu na zdolności motoryczne jest użytecznym narzędziem. Niestety, większość ocen behawioralnych może być pracochłonna i/lub kosztowna. Opisujemy tutaj robotyczną metodę oceny umiejętności chwytania (sięgania do chwytania) u myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę wprowadzania naiwnych myszy do nowego zadania polegającego na chwytaniu (sięganie do uchwycenia). Myszy są trzymane pojedynczo w klatkach z przednią szczeliną, która pozwala myszy sięgnąć z klatki i pobrać granulki jedzenia. Stosuje się minimalne ograniczenia żywieniowe, aby zachęcić myszy do pobierania pokarmu z gniazda. Gdy myszy zaczynają kojarzyć się z przybyciem do szczeliny po jedzenie, granulki są ręcznie odciągane, aby stymulować wyprost i pronację łapy w celu uchwycenia i odzyskania wypluwki przez przednią szczelinę. Kiedy myszy zaczynają sięgać po granulki, gdy docierają do gniazda, test behawioralny można przeprowadzić, mierząc szybkość, z jaką skutecznie chwytają i pobierają pożądaną osadę. Następnie są wprowadzane do automatycznego trenażera, który automatyzuje zarówno proces dostarczania myszi granulek pokarmu do chwytania, jak i rejestrowanie udanych i nieudanych prób sięgania i chwytania. Pozwala to na gromadzenie danych docierających do wielu myszy przy minimalnym wysiłku, które można wykorzystać w analizie eksperymentalnej w razie potrzeby.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody eksperymentalnego testowania umiejętności motorycznych przed i po urazie neurologicznym, a także modulowania czasu, ilości i rodzaju treningu motorycznego są ważne dla badań translacyjnych. W ciągu ostatniej dekady myszy, ze względu na towarzyszącą im łatwość manipulacji genetycznych, stały się popularnym systemem modelowym, w którym wyjaśniano mechanizmy uczenia się motorycznego przed i po urazie. Jednak testy behawioralne u myszy nie zostały zoptymalizowane w taki sam sposób, jak takie testy dla innych ssaków (zwłaszcza szczurów). Co więcej, istnieją istotne różnice między zachowaniem myszy i szczura, które zdecydowanie sugerują szkolenie tych dwóch gatunków w różny sposób1,2.

Umiejętne ruchy chwytne używają ręki/łapy do umieszczania jedzenia w ustach, manipulowania obiektem lub używania narzędzia. Rzeczywiście, sięganie w celu chwytania różnych przedmiotów w życiu codziennym jest podstawową funkcją kończyn górnych, a akt sięgania po jedzenie jest formą chwytania, z której korzysta wiele ssaków. Wiele genetycznych, fizjologicznych i anatomicznych zmian leżących u podstaw nabywania umiejętności chwytnych zostało dobrze zdefiniowanych w field3. Aby przełożyć wyniki przedkliniczne na wyniki kliniczne, potrzebny jest odpowiedni test, który jest skuteczny i powtarzalny. Badania nad docieraniem gryzoni i ludzi pokazują, że zachowanie związane z chwytaniem jest podobne u ludzi i zwierząt4. W związku z tym podobieństwa te sugerują, że testy prehensyjne mogą służyć jako model translacyjny do badania uczenia się motorycznego, a także upośledzeń i leczenia chorób ludzkich. W związku z tym ocena prehensu u myszy może stanowić potężne narzędzie w badaniach translacyjnych badających zarówno stan zdrowia, jak i stan chorobowy4.

Niestety, zadanie prehensu u myszy, nawet w warunkach laboratoryjnych na małą skalę, może być pracochłonne i czasochłonne. Aby złagodzić ten problem, opisujemy tutaj zautomatyzowaną wersję zadania prehension. Opisane zadanie wymaga od myszy wyciągnięcia pojedynczej łapy przez przednią szczelinę w klatce domowej myszy, pronacji wyprostowanej łapy, uchwycenia nagrody w postaci granulki pokarmu i przyciągnięcia wypluwki z powrotem do wnętrza klatki w celu spożycia. Wynikowe dane są przedstawiane jako sukces lub niepowodzenie prehension. Ta automatyzacja z powodzeniem rejestruje dane i zmniejsza obciążenie oraz czas, z jakim badacze muszą zaangażować się w zadanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez ACUC (Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania) Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa.

1. Przygotowanie klatek dla myszy do użycia

  1. Utwórz otwór szczelinowy o wymiarach 0,8 cm szerokości i 7 cm wysokości od podstawy na przednim końcu każdej klatki, jak pokazano w Rysunek 1. Ta szczelina służy jako otwór, przez który zwierzę dotrze .
    UWAGA: Automatyczny trenażer został zaprojektowany do użytku ze standardowymi wymiarami klatki dla myszy (jak pokazano na Rysunek 1) dostarczanych przez większość dostawców materiałów do badań na zwierzętach. Co więcej, autotrenażer z łatwością obsłuży inne typy klatek.
  2. Wewnątrz każdej pojedynczej klatki dodaj platformę przylegającą do szczeliny, aby myszy mogły stać i dotrzeć do prezentowanych granulek. Upewnij się, że platforma znajduje się nad podłogą klatki, na wysokości około 3 cm. Użyj szalek Petriego przymocowanych klejem Superglue i przykrytych blachą o wymiarach około 10 cm x 15 cm, jednak wystarczy dowolna płaska powierzchnia wystarczająco duża, aby mogła się z niej oprzeć.
  3. Utwórz pionowe nacięcie przez środek przodu klatki o wymiarach 0,8 cm szerokości i 7 cm wysokości, które pozwoli myszy wyciągnąć łapę z klatki.
  4. Z cienkiego arkusza metalu (o grubości około 2 mm) należy pociąć bramę klatki na prostokąty o wymiarach 5 cm x 10 cm, które mają służyć jako jednolity otwór, przez który zwierzę ma dotrzeć.
    UWAGA: Myszy mogą gryźć plastikowe klatki, które zmieniłyby rozmiar otworu. Mysz dotrze przez tę szczelinę o długości 0,8 cm, gdy metalowa bramka klatki zostanie umieszczona nad szczelinowym otworem klatki podczas testowania za pomocą taśmy, zachowując efektywną szerokość szczeliny między klatkami.
  5. Zakryj szczelinę każdej klatki taśmą, gdy mysz nie jest testowana, aby zapobiec wydaleniu śmieci z klatki.

2. Wprowadzenie myszy do ruchu sięgania

  1. Zapisz początkową wagę każdej myszy i oblicz 85% tej wartości, aby znaleźć ich wagę docelową, zaokrąglając do 20 g, jeśli wynik jest mniejszy. Daj im reżim żywienia, do którego je przyprowadzą, a następnie utrzymuj tę docelową wagę.
    1. Pierwszego dnia należy podać każdej myszy 2,5 g granulatu, a zmiany w ich wadze zanotować 24 godziny później.
      UWAGA: Waż myszy raz dziennie i spodziewaj się spadku masy ciała o 0,25-1 g dziennie.
    2. Zmieniaj dzienną karmę każdej myszy zgodnie z wymaganiami, w oparciu o tę początkową zmianę i bieżące zmiany wagi każdej myszy, aby wywołać stopniową utratę wagi (mniej niż 0,8 g utraconej dziennie), a następnie utrzymać wynikową wagę docelową. Wahaj się od trzech do sześciu granulek 500 mg (1,5 do 3,0 g) dziennie, aby były skuteczne.
      UWAGA: Myszy pozostają na tej diecie, aby utrzymać swoją docelową wagę przez cały czas trwania protokołu.
  2. Kiedy mysz osiągnie swoją docelową wagę, zapoznaj każdą mysz z koncepcją zbliżania się do bramkowanego gniazda po dodatkową kulkę pokarmową. Rozpocznij sesję treningową, umieszczając granulkę 45 mg na powierzchni granulki, bezpośrednio przed gniazdem i pozwól każdej myszy ją odzyskać. Większość myszy przyzwyczai się do tego układu karmienia w ciągu 1-2 dni.
  3. Gdy mysz skojarzy otwartą szczelinę z karmieniem, zachęć ją do sięgania łapą, a nie ustami.
    UWAGA: Jest to najbardziej złożony krok, trwający 1-2 dni, a omyłkowe zaszczepienie myszom zachowań przynoszących efekt przeciwny do zamierzonego jest bardzo łatwe; Zapoznaj się z sekcją Dyskusja, aby uzyskać więcej informacji i porad.
    1. Za pomocą pęsety przytrzymaj śrut w tej samej pozycji, w której wcześniej mysz pobierała kulki. Gdy mysz zacznie gryźć śrut, odciągnij go na około pół centymetra, tak aby śrut był poza zasięgiem jej pyska.
      UWAGA: Mysz o docelowej wadze będzie próbowała odzyskać kulkę, która jest poza zasięgiem. Za każdym razem, gdy mysz wysuwa łapę przez szczelinę, wzmocnij to zachowanie, pozwalając jej zjeść granulkę. Niektóre myszy mogą preferować jedną łapę nad drugą, gdy wyciągają się po jedzenie.
    2. Chociaż nie jest to instrumentalne w eksperymentach, zapisz, czy preferowana jest lewa, czy prawa łapa. Może to potencjalnie pozwolić na wyższe ogólne wskaźniki sukcesu w teście behawioralnym; Alternatywnie, wyeliminuj zmienną, zmuszając każdą mysz do sięgania tą samą łapą.
      UWAGA: Lepsze wyniki uzyskuje się, jeśli myszy używają preferowanej łapy.
    3. Ponieważ każda mysz kojarzy wyciąganie łapy z jedzeniem wypluwki, dodatkowo wzmocnij to zachowanie, powstrzymując wypluwkę w odpowiedzi na próby odzyskania wypluwki ustami i językiem. Myszy zaczną przestrzegać tego układu w ciągu 2 do 3 dni.
    4. Zakończ wprowadzanie pożądanego zachowania sięgania łapą, umieszczając 45 mg granulki nieco poniżej 1 cm od zewnętrznej krawędzi bramki klatki, tak aby najbardziej wysunięty na lewo lub na prawo punkt śrutu (niezależnie od tego, czy znajduje się odpowiednio po prawej, czy po lewej stronie szczeliny klatki z perspektywy badacza) był styczny do linii wychodzącej prosto z krawędzi szczeliny bramki klatki. Pozwól myszy na próbę odzyskania kulki, zachowując czujność, aby usunąć kulkę i zapobiec jej spożyciu, jeśli mysz spróbuje użyć innej metody niż przedłużenie łapy.
      UWAGA: Gdy mysz konsekwentnie wysuwa łapę, aby ją złapać i jest w stanie dotknąć dostarczonej kulki, jest ona gotowa do testowania za pomocą opisanego poniżej automatycznego trenera i powiązanego testu behawioralnego. Czas od naiwnego wprowadzenia do przygotowania będzie różny u myszy; Jeśli są maruderzy, których zrozumienie zajmuje więcej niż dwa tygodnie, należy ich wykluczyć ze zbioru danych.

3. Korzystanie z auto-trenera

UWAGA: Zobacz Rysunek 1-3 oraz sekcję dyskusji, aby uzyskać pełny opis sprzętu, oprogramowania i fizycznych działań auto-trenażera.

  1. Przygotuj się do sesji treningowej.
    1. Skalibruj czujnik granulatu przynęty. Kliknij strzałkę Uruchom w interfejsie LabVIEW i zanotuj odczyt czujnika pelletu przynęty zarówno z założonym pelletem, jak i bez niego. Kliknij przycisk Stop, aby zatrzymać ten przebieg testowy i zmienić cel czujnika granulek przynęty na wartość między tymi dwoma odczytami (Rysunek 3 i Tabela 2). Większość warunków oświetleniowych zapewnia odczyt od 1 do 4.
    2. Umieść zmodyfikowaną klatkę myszy na autotrenażerze (Rysunek 2). Przymocuj bramkę klatki ( Rysunek 1) i wyrównaj granulkę do krawędzi szczeliny, jak w procedurze ręcznej.
  2. Uruchom sesję treningową myszy za pomocą interfejsu LabVIEW.
    1. Wprowadź informacje wymagane do zapisania danych o sesji treningowej (Rysunek 3 i Tabela 2).
      1. Kliknij pole Identyfikator myszy i wpisz nazwę pliku każdej sesji treningowej za pomocą klawiatury komputera.
      2. Kliknij pole Całkowita ilość granulek do dozowania podczas rutyny, aby kontrolować, ile granulek jest dozowanych w jednym eksperymencie (zwykle 20 - 30). Aby to zrobić, kliknij strzałki w górę i w dół lub wprowadź liczbę za pomocą klawiatury komputera.
      3. Kliknij pole Pauza po numerze kulki, aby ustawić 5-sekundową pauzę po usunięciu wskazanego pelletu z trampoliny. Aby to zrobić, kliknij strzałki w górę i w dół lub wprowadź liczbę za pomocą klawiatury komputera.
      4. Kliknij pole Długość pauzy, aby ustawić przerwę między momentem wyjęcia granulki z trampoliny a momentem wydania nowej kulki. Aby to zrobić, kliknij strzałki w górę i w dół lub wprowadź numer za pomocą klawiatury komputera
        UWAGA: Zwykle 1 s to odpowiedni czas pauzy. Jeśli myszy są niespokojne po wydaniu każdej granulki, zaleca się wydłużenie długości pauzy za pomocą pola Długość pauzy do 5 s.
      5. Ręcznie zapisz odległość, w której kulka jest umieszczana w polu Odległość zasięgu. Aby to zrobić, kliknij strzałki w górę i w dół lub wprowadź numer za pomocą klawiatury komputera
        UWAGA: Rozmiar tablic przyspieszenia i czasu jest uwidoczniony do celów debugowania i może zostać zignorowany.
      6. Kliknij pole Folder zawierający dzienniki, aby wybrać lokalizację pliku, w którym mają zostać zapisane zebrane dane.
      7. Po wypełnieniu pól informacyjnych kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć sesję treningową. Automatyczny trenażer będzie dozował pojedyncze granulki i śledził, czy wpadną one przez lejek, aż całkowita liczba granulek zostanie wydana, a ostatnia kulka zostanie pobrana lub upuszczona przez mysz. W tym momencie program zatrzyma się automatycznie. W razie potrzeby można go również zatrzymać przedwcześnie, klikając przycisk Zatrzymaj.
    2. Po skonfigurowaniu oprogramowania umieść klatkę domową myszy, która ma być testowana, na cokole i obserwuj mysz, aby móc ocenić, czy mysz rzeczywiście nauczyła się próbować wymaganego nowego zachowania sięgania. Po kliknięciu przycisku Uruchom pozwól myszce zbadać slot i jego nowe, nieznane otoczenie.
      UWAGA: Podobnie jak w przypadku wprowadzania myszy do koncepcji sięgania, spodziewaj się, że niektóre myszy będą bardziej posłuszne niż inne. Myszy, które zrozumiały tę koncepcję, powinny starać się dotrzeć w ciągu 5-10 minut i będą kojarzyć ruch autotrenażera z prezentowanym wypluwką, tak jak wtedy, gdy kojarzą odkrytą szczelinę z jedzeniem w początkowych etapach tego protokołu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólnie zaleca się, aby każda sesja treningowa składała się z około 20-30 prób, które mogą być ustawione przez użytkownika, uruchamiane automatycznie przez autotrenera i zapisywane w jednym pliku dziennika na sesję i mysz. Każda próba może być uruchamiana po kolei, zaraz po drugiej, z 2-5 sekundową przerwą. Myszy wytrenowane na autotrenażerze wykazują wzrost umiejętności w ciągu 10 sesji treningowych.

Aby porównać użyteczność au...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasz autotrener ocenia zasięg kończyn przednich (chwyt) w sposób zautomatyzowany. Aby osiągnąć ten punkt końcowy, wiele parametrów zaprojektowanych dla zadania chwytania myszy, w tym rozmieszczenie granulek, rozmiar granulki i kryteria treningu, były iterowane przez kilka lat i dostosowywane do poprzednich protokołów 2,5,6. Postępem jest tutaj automatyzacja zadania za pomocą robota, który umożliwia trzymanie w klatce domowej. Tr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dan Tasch i Uri Tasch z firmy Step Analysis, LLC wyprodukowali autotrenażer za opłatą od Richarda J. O'Briena i Stevena R. Zeilera.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Urządzenie do automatycznego trenowania zostało skonstruowane przez Jasona Dunthorna, Uriego Tascha i Dana Tascha z Step Analysis, LLC, z pomocą techniczną i instrukcjami dostarczonymi przez Roberta Hubbarda, Richarda O'Briena i Stevena Zeilera.

Teresa Duarte z Centrum Nieznanego w Champalimaud dostarczyła cennych spostrzeżeń i pomysłów na temat opisywania i kategoryzowania działań związanych z docieraniem myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Filament ABSNiestandardowy druk 3DNie dotyczy Używanydo uchwytu na pelety, ramy, ramienia i lejka
Arkusz ABSMcMaster-Carr8586K581o grubości 3/8 "; używany do elementów platformy, prowadnic stojaków pozycjonujących i podstawy
Adruino MiniAdruinoA000087wersja nano kompatybilna również z innymi podobnymi mikrokontrolerami
Regulowana wysokość blatu Stojak pozycjonującyMcMaster-Carr9967T4335 funtów Nośność
Przezroczysta akrylowa okrągła ruraMcMaster-Carr8532K14ID 3/8"
Niskowęglowa  Drut stalowyMcMaster-Carr8855K140,148"  średnica
Dozownik pelletuInstrument Lafayette: Neuroscience80209-45z wymiennym kołem o rozmiarze granulek 45 mg i opcjonalnym stojakiem
Tablica rozdzielająca Photointerrupter SparkFunBOB-09322 ROHSprzeznaczony do
czujnika obiektów odblaskowychFairchild SemiconductorQRD1113wyjście fototranzystora
Silnik serwoSparkFunS8213ogólna metalowa przekładnia (rozmiar mikro)
Transmisyjny fotorezystorOstraszczelina GP1A57HRJ00F: 10 mm, szczelina: 1,8 mm
Sharp GP1A57HRJ00F

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Whishaw, I. Q. An endpoint, descriptive, and kinematic comparison of skilled reaching in mice (mus musculus) with rats (rattus norvegicus). Behavior Brain Research. 78, 101-111 (1996).
  2. Farr, T. D., Whishaw, I. Q. Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (mus musculus) after a focal motor cortex stroke. Stroke. 33, 1869-1875 (2002).
  3. Zeiler, S. R., Krakauer, J. W. The interaction between training and plasticity in the poststroke brain. Current Opinion in Neurology. 26, 609-616 (2013).
  4. Klein, A., Sacrey, L. A., Whishaw, I. Q., Dunnett, S. B. The use of rodent skilled reaching as a translational model for investigating brain damage and disease. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 36, 1030-1042 (2012).
  5. Zeiler, S. R., et al. Medial premotor cortex shows a reduction in inhibitory markers and mediates recovery in a mouse model of focal stroke. Stroke. 44, 483-489 (2013).
  6. Becker, A. M., Meyers, E., Sloan, A., Rennaker, R., Kilgard, M., Goldberg, M. P. An automated task for the training and assessment of distal forelimb function in a mouse model of ischemic stroke. Journal of Neuroscience Methods. 258, 16-23 (2016).
  7. Bruinsma, B., et al. An automated home-cage-based 5-choice serial reaction time task for rapid assessment of attention and impulsivity in rats. Psychopharmacology. , 1-12 (2019).
  8. Francis, N. A., Kanold, P. O. Automated operant conditioning in the mouse home cage. Frontiers in Neural Circuits. 11 (10), (2017).
  9. Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43, 42-51 (2004).
  10. Fenrich, K. K., et al. Improved single pellet grasping using automated ad libitum full-time training robot. Behavior Brain Research. 281, 137-148 (2015).
  11. Ng, K. L., et al. Fluoxetine maintains a state of heightened responsiveness to motor training early after stroke in a mouse model. Stroke. 46 (10), 2951-2960 (2015).
  12. Whishaw, I. Q., Suchowersky, O., Davis, L., Sarna, J., Metz, G. A., Pellis, S. M. Impairment of pronation, supination, and body co-ordination in reach-to-grasp tasks in human parkinson's disease (pd) reveals homology to deficits in animal models. Behavior Brain Research. 133, 165-176 (2002).
  13. Dobrossy, M. D., Dunnett, S. B. The influence of environment and experience on neural grafts. Nature Review Neuroscience. 2, 871-879 (2001).
  14. Alaverdashvili, M., Foroud, A., Lim, D. H., Whishaw, I. Q. "Learned baduse" limits recovery of skilled reaching for food after forelimb motor cortex stroke in rats: A new analysis of the effect of gestures on success. Behavior Brain Research. 188, 281-290 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Prehension TaskAuto Trainer SystemMouse Motor SkillFood Pellet RetrievalReach Distance MeasurementLabVIEW InterfaceBait Pellet SensorTraining Session DataNeurological Injury ModelsMotor Learning Assessment

Powiązane artykuły