Aspiracja cienkoigłowa to technika, dzięki której komórki są uzyskiwane z uszkodzenia lub narządu za pomocą cienkiej igły. Odessany materiał jest rozmazywany, barwiony i badany pod mikroskopem w celu diagnozy lub wykorzystywany do biologii molekularnej, cytometrii lub analizy in vitro. Jest tani, prosty, szybki i powoduje minimalną traumę.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie pasożytów trypanosoma zewnątrznaczyniowego za pomocą aspiracji cienkoigłowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Aspiracja cienkoigłowa (FNA) jest rutynową procedurą diagnostyczną niezbędną zarówno w praktyce medycznej, jak i weterynaryjnej. Polega na przezskórnym zasysaniu komórek i/lub mikroorganizmów z wyczuwalnych palpacyjnie mas, narządów lub wysięków (nagromadzenie płynu w jamie ciała) za pomocą cienkiej igły podobnej do zwykłej igły używanej do nakłuwania żyły. Materiał zebrany przez FNA jest na ogół wysoce komórkowy, a pobrany aspirat jest następnie rozmazywany, suszony powietrzem, utrwalany na mokro, barwiony i obserwowany pod mikroskopem. W kontekście klinicznym FNA jest ważnym narzędziem diagnostycznym, które służy jako przewodnik do właściwego postępowania terapeutycznego. Ponieważ jest prosta, szybka, mało inwazyjna i wymaga ograniczonych inwestycji w laboratorium i zasoby ludzkie, jest szeroko stosowana przez lekarzy weterynarii, głównie u zwierząt domowych, ale także gospodarskich. W badaniach z wykorzystaniem modeli zwierzęcych FNA ma tę zaletę, że może być wykonywany wielokrotnie na tym samym zwierzęciu, co umożliwia badania podłużne poprzez pobieranie komórek z guzów i narządów/tkanek w trakcie choroby. Oprócz rutynowej mikroskopii, pobrany materiał może być również wykorzystany do immunocytochemii, mikroskopii elektronowej, analizy biochemicznej, cytometrii przepływowej, biologii molekularnej lub testów in vitro. FNA wykorzystano do identyfikacji pasożyta pierwotniaka Trypanosoma brucei w gonadach zakażonych myszy, otwierając możliwość przyszłej diagnozy u bydła.
Wprowadzenie
Aspiracja cienkoigłowa (FNA) jest szeroko stosowana w diagnostyce raka i chorób nienowotworowych, zarówno u ludzi, jak i zwierząt domowych. Technika ta została ustandaryzowana na przestrzeni lat i jest opisana w wielu podręcznikach1,2.
Składa się głównie z przezskórnego pobierania wyczuwalnych mas, organów lub wysięków za pomocą cienkiej igły umieszczonej na pustej strzykawce, wykorzystując podciśnienie do pobrania komórek lub płynu z masy1,3. Igły mają zazwyczaj od 22 do 25 G (rozstaw odpowiadający wewnętrznej średnicy igły), a użycie igły o większym otworze (duża średnica, np. 21 G) jest pomocne w zwiększeniu komórkowości, chociaż może to powodować nadmierne zanieczyszczenie krwi. Długość igły będzie zależeć od głębokości masy, ale 1 lub 11/2 cala jest powszechnie stosowana w przypadku mas powierzchownych. Strzykawki mają zwykle pojemność od 5 do 10 ml, przy czym większe strzykawki osiągają wyższe podciśnienie, co z kolei zwiększa wydajność aspiracji. Niewyczuwalne głęboko osadzone masy mogą być również odsysane, za pomocą dłuższych igieł i pod kontrolą obrazu (ultrasonografia). Pobrany aspirat można następnie rozmazać, wysuszyć na powietrzu, utrwalić na mokro, wybarwić i obserwować pod mikroskopem w celu uzyskania diagnozy3 (Rysunek 1).
To jest prosta, tania, bezbolesna i minimalnie inwazyjna technika stosowana głównie w warunkach przedoperacyjnych w celu uzyskania diagnozy na wyczuwalnych masach, a także na narządach, takich jak węzły chłonne, tarczyca, prostata czy nawet zewnętrzne męskie struktury rozrodcze1. Oprócz tego, że jest narzędziem diagnostycznym, technika ta może być wykorzystywana do zbierania komórek również do innych celów, a mianowicie cytogenetyki, mikroskopii elektronowej (Rysunek 1D), charakterystyka cytometrii przepływowej4,5,6,7, ustanowienie kultur komórkowych8. Typowym przykładem w praktyce klinicznej jest pobieranie plemników do zapłodnienia in vitro9.
Aspiracja może być powtórzona kilka razy w tej samej masie, aby uzyskać wiele rozmazów. W przypadku zmiany niejednorodnej, np. obszaru stałego i przestrzeni torbielowatej, ważne jest, aby komórki były odsysane z każdego regionu. Materiał pobrany przez FNA jest na ogół wysoce komórkowy, co w większości przypadków pozwala na rozpoznanie chorób bez konieczności wykonywania biopsji tkanki. Specjalne plamy, immunofluorescencja. immunocytochemia (Rysunek 1D), a techniki molekularne mogą być również wykonywane w rozmazach uzyskanych za pomocą FNA, np. w celu identyfikacji czynników zakaźnych, gdy nie są one rozpoznawalne na podstawie samej morfologii10. Krótki przegląd ogólnych zastosowań oraz sprzętu i materiałów eksploatacyjnych potrzebnych do FNA podsumowano odpowiednio w tabelach 1 i 2.
Pierwszy raport na temat użycia nakłucia igły do celów diagnostycznych jest opisany we wczesnych pismach medycyny arabskiej, ale dopiero na początku XX wieku zastosowano nowoczesne techniki aspiracji igły11. Warto zauważyć, że być może pierwszym raportem, który sugeruje zastosowanie FNA do diagnozowania chorób zakaźnych, było badanie z 1904 roku, w którym Grieg i Gray poinformowali, że aspiracje igieł węzłów chłonnych od pacjentów ze śpiączką ujawniły ruchliwe trypanosomy12. Autorzy stwierdzili obecność trypanosomów zarówno we wczesnych, jak i zaawansowanych przypadkach oraz w większej gęstości niż obserwowana w rozmazach krwi, gdzie są to często rzadkie zdarzenia12.
Obecna diagnoza trypanosomatozy u bydła opiera się na bezpośredniej obserwacji pasożytów we krwi, limfie lub w technikach immunodiagnostycznych13,14,15. Wcześniej wykazaliśmy, że w eksperymentalnych infekcjach Trypanosoma u myszy, Trypanosoma brucei (T. brucei) ma niezwykły tropizm w stosunku do tkanki tłuszczowej16, a także do niektórych zewnętrznych męskich struktur rozrodczych, a mianowicie epijąder17. Pasożyty gromadzą się w zrębie tych tkanek w dużych ilościach16.
Protokół przedstawiony poniżej opisuje szczegółową procedurę techniczną krok po kroku dla FNA u żywych myszy, mającą na celu aspirację trypanosomów obecnych w zewnętrznych męskich strukturach rozrodczych (jądra, najądrza i tłuszcz najądrza), a następnie konwencjonalną cytologię i barwienie immunologiczne dla specyficznych białek pasożyta (VSG)16,17. Aspirację przeprowadzono 6 dni po zakażeniu, a procedury bezpieczeństwa, które mają zastosowanie, są powszechnie ustanowione dla rutynowego obchodzenia się ze zwierzętami doświadczalnymi. W przypadku zwierząt z niedoborami odporności wymagane są dodatkowe środki (noszenie fartucha sterylizowanego parą, maska, czepek do włosów, sterylne rękawiczki i zapewnienie aseptyki przez cały czas) w celu złagodzenia przypadkowego narażenia na oportunistyczne patogeny.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach w tym protokole zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami UE i zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Instituto de Medicina Molecular (iMM), (AEC_2011_006_LF_TBrucei_IMM). Zakład hodowli zwierząt iMM jest zgodny z portugalskim prawem dotyczącym wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych (dekret z mocą ustawy 113/2013) i jest zgodny z dyrektywą europejską 2010/63/UE oraz wytycznymi i zaleceniami FELASA (Federacja Europejskich Stowarzyszeń Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych) dotyczącymi dobrostanu zwierząt laboratoryjnych.
1. Aspiracja pasożytów z zewnętrznych męskich narządów rozrodczych myszy
UWAGA: Aspiracja cienkoigłowa (FNA) została przeprowadzona u dzikich samców myszy C57BL/6J w wieku od 6 do 10 tygodni, zarażonych T. brucei poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie 200 μL soli fizjologicznej z 2 000 pasożytów, jak opisano wcześniej16.
- W przypadku FNA zewnętrznych męskich narządów rozrodczych umieścić mysz w kapturze z przepływem laminarnym, znieczulić zwierzę wstrzyknięciem dootrzewnowym 200 μl mieszaniny 75 mg/kg ketaminy + 1 mg/kg medetomidyny w soli fizjologicznej.
- Potwierdź znieczulenie metodą szczypania palców u stóp. Gdy odruch cofnięcia nogi jest nieobecny, ustaw mysz w pozycji leżącej grzbietowej (Rysunek 2A).
- Ostrożnie obmacuj jądro, oceniając rozmiar i odległość od leżącej nad nim skóry. Unieruchom, utrzymuj narząd między palcem wskazującym a środkowym lub między palcem wskazującym a kciukiem. Rozciągnij mocno przylegającą skórę w poprzek masy, aby jeszcze bardziej unieruchomić cel. Oczyść powierzchnię chusteczkami nasączonymi alkoholem (Rysunek 2A).
- Trzymaj zmontowaną igłę 22 G i strzykawkę 5 ml i włóż końcówkę igły do celu, zawsze z tłokiem w stanie spoczynku (Rysunek 2B-C).
- Zastosować ssanie, cofając tłok strzykawki do oznaczenia 4 ml do 5 ml 2-3 razy. Przekieruj igłę w narządzie w linii prostej lub wzdłuż kilku różnych stycznych, aby zwiększyć prawdopodobieństwo reprezentatywnej próbki i celowania w mniejsze struktury, takie jak najądrza. Upewnij się, że ta procedura jest delikatna, aby zminimalizować uszkodzenie tkanek (Rysunek 2C-D).
- Zwolnić ssanie, a następnie wyjąć igłę. Nie należy ponownie naciągać igły z cofniętym tłokiem, ponieważ doprowadzi to do zassania aspiratu do cylindra strzykawki i utrudni jego odzyskanie (Rysunek 2E). Po wyjęciu igły należy zatamować krwawienie, uciskając w miejscu wkłucia wysterylizowaną gąbką z gazy.
- Odłączyć strzykawkę od igły, napełnić ją powietrzem, ponownie podłączyć igłę i delikatnie wysunąć zawartość igły na szkiełko. Umieść końcówkę igły bardzo blisko lub nawet na szkiełku, aby uniknąć rozpryskiwania (Rysunek 2F-I).
- Przeprowadzić co najmniej jedną dodatkową aspirację dla każdego narządu/zwierzęcia, aby zapewnić powtórzone pobieranie próbek.
- Przywrócić znieczulenie za pomocą podskórnego wstrzyknięcia 200 μl 1 mg/kg Atipamezolu w roztworze soli fizjologicznej i zwrócić zwierzęta do ich klatki domowej w celu rekonwalescencji i obserwować aż do całkowitego wyzdrowienia.
2. Przygotowanie rozmazu z zasysanego materiału
UWAGA: Używaj rękawiczek podczas całego zabiegu i zapewnij bezpieczną pozbywanie się igieł i strzykawek.
- Dwuetapowa metoda ciągnięcia
- Podnieś szkiełko, na którym znajduje się kropla przydechu, za pomocą ręki niedominującej i ściśnij oszroniony koniec między kciukiem a palcem wskazującym (Rysunek 3A).
- Podnieś drugi czysty szkiełko, suwak rozsiewający, dominującą ręką i przesuń go przez pierwszy slajd z upuszczeniem aspiratu. Umieść gładką, czystą krawędź szkiełka na szkiełku z próbką tuż na górze kropli pod kątem około 30° (Rysunek 3B).
- Przesuwaj suwak do przodu jednym lekkim, ciągłym i stałym ruchem, aby uzyskać cienką warstwę (Rysunek 3C).
- Oprzyj szkiełko i pozwól na całkowite i szybkie wyschnięcie materiału na powietrzu (Rysunek 3D). Nie utrwalaj na gorąco. Oznacz oszronioną krawędź szkiełka ołówkiem.
nuta: Na tym etapie protokół można wstrzymać, a rozmazy można przechowywać w nieskończoność, aż będą gotowe do barwienia.
3. Barwienie rozmazów
UWAGA: Używaj rękawiczek podczas całej procedury i upewnij się, że kroki 3.1.4 i 3.2.9 są wykonywane wewnątrz dygestorium.
- Protokół barwienia Giemsy
- Napraw wysuszone na powietrzu smugi, zanurzając szkiełka w słoiku z kopliny zawierającym 100% metanolu na 5 minut (Rysunek 3E).
- Przenieś szkiełko do słoika Coplin zawierającego 20% roztwór Giemsa (rozcieńczony do 1/5 w wodzie destylowanej) na 30 minut lub 10% Giemsa przez 10 minut (Rysunek 3F).
- Spłucz w wodzie z kranu i dokładnie wysusz za pomocą bibuły.
- Trzymaj szkiełko poziomo i nałóż jedną kroplę niewodnego medium mocującego na rozmaz. Umieść krawędź szkła nakrywkowego na szkiełku, opuść je i delikatnie dociśnij, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
- Immunocytochemia w rozmazach FNA
- Wysuszone na powietrzu rozmazy utrwalić w 100% metanolu w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
- Myj szkiełko przez 5 minut w słoiku Coplin z 1x buforem fosforanowym (PBS), powtarzając ten krok 3 razy, używając za każdym razem świeżego 1x PBS.
- Wyjmij szkiełko ze słoika Coplin, wytrzyj nadmiar bufora bez dotykania rozmazu i narysuj okrąg wokół rozmazu za pomocą wodoodpornego pisaka (Tabela materiałów).
- Trzymać szkiełko poziomo i nanieść 150 μl rozcieńczonego roztworu przeciwciał pierwszorzędowych na każdy rozmaz i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
nuta: Podstawowym przeciwciałem stosowanym w tym przypadku jest nieoczyszczony antygen anty-T. brucei VSG13 w surowicy królika (reagujący krzyżowo z wieloma VSG T. brucei, produkowany we własnym zakresie), rozcieńczony w 1x PBS w stosunku 1:50 000. Przeprowadzić kontrole ujemne, zastępując odpowiednie przeciwciało pierwszorzędowe surowicą przedimmunologiczną (tabela materiałów), aby umożliwić ocenę nieswoistego wiązania przeciwciała drugorzędowego. - Myj szkiełko przez 5 minut w słoiku Coplin z 1x PBS, powtarzając ten krok 3 razy, używając za każdym razem świeżego 1x PBS.
- Trzymaj szkiełko poziomo i nałóż 150 μl dostępnego na rynku systemu wizualizacji peroksydazy chrzanowej/DAB na każdy rozmaz. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej (tabela materiałów).
- Prać przez 3x przez 5 min w 1x PBS.
- Przeciwplamić, zanurzając szkiełka w słoiku Coplin zawierającym hematoksylinę Harrisa. Spłucz w wodzie z kranu i dokładnie wysusz papierem do wtarcia.
- Trzymaj szkiełko poziomo i nałóż jedną kroplę niewodnego medium mocującego na rozmaz. Umieść krawędź szkła nakrywkowego na szkiełku, opuść je i delikatnie dociśnij, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
Wyniki
FNA przeprowadzono w zewnętrznych narządach rozrodczych samców myszy zainfekowanych T. brucei, używając igły 22 G połączonej z strzykawką 5 mL oraz szkiełek przedmiotowych do przygotowania rozmazów (Rycina 1A-C). Metoda jest prosta, ale optymalne wyniki zależą od kluczowych etapów: całkowitego unieruchomienia myszy uzyskanego dzięki znieczuleniu ogólnemu oraz stabilizacji narządów przez cały czas trwania procedury (Rycina 2A-B). Ssanie stosowano 2-3 razy, a igłę przekierowywano 1-2 razy, aby umożliwić reprezentatywne pobranie próbek z mniejszych narządów i tkanek: najądrza oraz tkanki tłuszczowej okołonajądrzowej. Ciśnienie ujemne zwalniano przed wyjęciem igły. Aspirat znajdujący się w świetle i nasadzie igły (około 20 µL) wykorzystano do przygotowania 2 rozmazów (Rycina 3A-C). W przypadkach, gdy igłę wycofano bez zwolnienia ssania, materiał został zaciągnięty do strzykawki i był nieodzyskiwalny. Proces powtórzono pomyślnie dwukrotnie, raz dla każdego z parzystych narządów. Po wysuszeniu rozmazy utrwalono metodą mokrą, a następnie przeprowadzono immunocytochemię w celu wykrycia białek powierzchniowych trypanosomów.
Wysokiej jakości rozmaz (Rysunek 4A-C) charakteryzował się monowarstwą komórek o dobrej gęstości komórkowej, w której komórki gospodarza zachowały cechy morfologiczne, umożliwiające identyfikację tkanki pochodzenia oraz określenie ich wzajemnych proporcji. Pasożyty zostały skutecznie zabarwione immunochemicznie, były możliwe do zidentyfikowania i przeliczenia (Rysunek 4B). Przedstawiono również jeden przypadek FNA z wysięku otrzewnej u zakażonej myszy, zabarwionego metodą Giemsy w celu bezpośredniej obserwacji i diagnozy (Rysunek 3D-F oraz Rysunek 4C).
Słaby lub negatywny wynik FNA może wynikać z różnych przyczyn: (1) na szkiełko przeniesiono zbyt mało materiału FNA, co sprawia, że próbka jest niereprezentatywna; (2) na jednym szkiełku przeniesiono zbyt dużo materiału FNA, co prowadzi do powstania zbyt grubych rozmazów i utrudnia ocenę cytologiczną; (3) podczas wykonywania rozmazu zastosowano zbyt dużą siłę, co doprowadziło do rozbicia komórek, w wyniku czego powstaje wiele gołych jąder i smugi DNA (artefakt zmiażdżenia); lub (4) podczas wykonywania rozmazu zastosowano zbyt małą siłę i komórki nie uległy rozdzieleniu, co skutkuje powstaniem warstwy warstwowej, która utrudnia ocenę cech morfologicznych komórek (Rycina 5).
Porównując cytopatologię FNA z histopatologią, czyli analizę komórek z analizą tkanek, pierwsza ma tę zaletę, że morfologia komórkowa jest lepiej zachowana, a proporcje względne oraz liczenie komórek mogą być dokładniej ocenione (Rysunek 6). Co więcej, immunocytochemia jest prostsza, szybsza i łatwiejsza do optymalizacji niż immunohistochemia, którą zazwyczaj wykonuje się na tkankach utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie.
| Cel | Zastosowania | Zalety | Ograniczenia |
| Wyczuwalny guzek | Rutynowa mikroskopia, diagnostyka | Proste, szybkie | Brak architektury tkankowej |
| Narząd | Immunohistochemia | Niski koszt | Aspiracja ślepa (igła może ominąć cel stycznie; aspiracja może objąć obszary martwicze, torbielowate lub krwotoczne) |
| Wysięki | Cytometria przepływowa | Pobieranie próbek z wielu miejsc | |
| Cytogenetyka | Dobrze zachowana morfologia komórkowa | ||
| Mikroskopia elektronowa | Bez powikłań | ||
| PCR, inne techniki molekularne | Wysoka dokładność diagnostyczna | ||
| Analiza biochemiczna | Znieczulenie (w celu unieruchomienia) | ||
| Testy in vitro, hodowla komórkowa | Procedura nieterminalna |
Tabela 1: Cel, ogólne zastosowania, zalety i ograniczenia biopsji aspiracyjnej cienkoigłowej.
| Zestaw do FNA | Schemat igły aspiracyjnej i strzykawki |
| Aspiracja: | Elementy igły: |
| 1. Jednorazowe strzykawki plastikowe (5 lub 10 ml) (Rysunek 1B) | Ścięcie. Końcówka trzpienia igły jest ścięta w celu utworzenia ostrza, a to ścięcie stanowi skos. Do aspiracji przezskórnych odpowiednie są wyłącznie igły skosowane. |
| 3. Igły o średnicy 22–25 G (gauge); długości 0,75, 1,0 i 1,5 cala, ze standardowym ściętym ostrzem igły (Rysunek 1A) | Wał. Kanalikowa, pusta część igły, której długość można dostosować do głębokości położenia zmiany. Rozmiar igły (gauge) odpowiada średnicy jej światła, czyli średnicy wewnętrznej trzpienia (igły o mniejszej średnicy mają wyższy numer G). Stosowanie igieł o większej średnicy światła (poniżej 22 G) pomaga zwiększyć komórkowość preparatu, choć może to prowadzić do nadmiernego jatrogennego zanieczyszczenia krwią. |
| 1. Znieczulenie (jeśli jest konieczne). Ból związany z cienkoigłową aspiracją (FNA) jest zbliżony do bólu przy punkcji żylnej, jednak prawidłowa aspiracja wymaga dobrej immobilizacji obiektu, co jest szczególnie istotne w przypadku zwierząt o małych rozmiarach oraz w odniesieniu do małych, fluktuacyjnych zmian i narządów. Szczury i myszy poddawane FNA powinny być odpowiednio unieruchomione pasywnie lub, w razie potrzeby, poddane sedacji bądź lekkiej narkozie ogólnej. | Centrum. Plastikowa część igły przymocowana do strzykawki; powinna być przezroczysta, aby umożliwić wizualizację aspirowanego materiału. Materiał aspiracyjny uzyskany podczas BAC powinien zostać zebrany w trzonie igły, a aspirację należy przerwać w momencie, gdy materiał zacznie wpływać do piasty. |
| Przygotowanie i interpretacja rozmazów z biopsji cienkoigłowej (FNA): | Elementy strzykawki: |
| 1. Przedmioty szkiełek mikroskopowych z matowym końcem (Rycina 1C) | Bęben/cylinder. Wnętrze strzykawki. Z wyjątkiem przypadków zmian torbielowatych lub wysięków, materiał aspirowany do cylindra zazwyczaj nie może zostać odzyskany. Idealna objętość aspiratu dla cytologii FNA wynosi około 5 μL, co odpowiada średniej objętości aspiratu wypełniającego trzpień i piastę igły. |
| 2. Barwniki typu Romanowsky’ego (np. Diff-Quik, Giemsa) | Wskazówka. Koniec cylindra, do którego przymocowany jest nasadnik igły. |
| 3. Mikroskop (pole jasne) | Tłok. Ruchoma część strzykawki, która posiada płaski dysk lub kołnierz na jednym końcu i gumową uszczelkę na drugim. Jest dopasowana do cylindra i wytwarza ciśnienie niezbędne do zassania komórek lub płynu do igły. Doskonale uszczelniony tłok, który tworzy odpowiednie podciśnienie, jest niezbędny do uzyskania wysokiej wydajności aspiracji. |
Tabela 2: Sprzęt i materiały potrzebne do aspiracji cienkoigłowej.
Rycina 1: Narzędzia i wyniki aspiracji cienkoigłowej.(A) Idealna średnica igły do FNA wynosi od 22 do 25 G. (B) Idealna objętość strzykawki w celu uzyskania dobrej wydajności aspiratu wynosi od 5 do 10 mL. (C) Czyste, suche, odtłuszczone szkiełko przedmiotowe z matowym polem do opisu ołówkiem i powlekane (jeśli przeznaczone do immunohistochemii). (D) Przykład Trypanosomes obserwowanych po barwieniu Giemsą (czarna grot strzałki), po barwieniu immunologicznym na białka powierzchniowe VSG (biała grot strzałki) oraz w transmisyjnej mikroskopii elektronowej (gruba strzałka). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Schematy przedstawiające aspirację cienkoigłową (FNA) zewnętrznych narządów rozrodczych samca (jądra, najądrza i tkanki tłuszczowej najądrza) u myszy. (A) Po unieruchomieniu zwierzęcia pobiera się wcześniej przygotowany instrument do aspiracji. (B-C) Wprowadza się końcówkę igły do docelowego narządu. (D) Wykonuje się ssanie poprzez cofnięcie tłoka strzykawki do oznaczenia 1 mL – 2 mL, powtarzając czynność 3-4 razy. Aby zebrać wystarczającą ilość materiału, końcówką igły można również poruszać w przód i w tył w obrębie narządu podczas ssania. (E) Należy zwolnić ssanie i dopiero wtedy wycofać igłę. (F) Odłącza się igłę od strzykawki i (G) odciąga tłok. (H) Ponownie mocuje się igłę. (I) Materiał nanosi się na szkiełko przedmiotowe, gwałtownie pchając tłok przez strzykawkę. Aby uniknąć rozpryskiwania, należy upewnić się, że końcówka igły znajduje się bardzo blisko lub bezpośrednio na szkiełku. Kroplę aspiratu umieszcza się w odległości około 1 cm od krawędzi matowego pola znacznikowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Przygotowanie i barwienie rozmazu. (A) Przytrzymaj jeden koniec szkiełka (pole matowe) kciukiem i palcem wskazującym. (B) Umieść gładką, czystą krawędź drugiego szkiełka (szkiełka rozcierającego) na szkiełku z preparatem tuż przed kroplą materiału. (C) Przesuń szkiełko rozcierające do przodu jednym, umiarkowanie szybkim ruchem, aby uzyskać cienką warstwę. (D) Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu i opisz pole matowe ołówkiem. (E) Po całkowitym wyschnięciu utrwal preparat w metanolu przez 5 min. (F) Barw 20% roztworem Giemsy przez 30 min (lub 10% roztworem Giemsy przez 10 min). Delikatnie wypłucz wodą, całkowicie wysusz, zanurz w ksylenie i zamknij za pomocą nierozpuszczalnego w wodzie medium montażowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Mikrofotografie rozmazów uzyskanych z FNA zewnętrznych struktur rozrodczych samców myszy zainfekowanych T. brucei. (A) Wygląd makroskopowy bezpośredniego rozmazu dobrej jakości: materiał został naniesiony na szkiełko w odległości około 1 cm od matowego brzegu (czarna kropka), rozmazany i zatrzymany 0,5 cm przed krawędzią szkiełka (linie równoległe). (B) Immunocytochemia w kierunku białek powierzchniowych pasożyta (VSG) została wykonana dla rozmazów uzyskanych z FNA zewnętrznych narządów rozrodczych samców w 6. dniu infekcji. Wykryto liczne pasożyty (grot strzałki) zmieszane z komórkami rozrodczymi myszy (strzałka). Barwienie DAB z kontrastowaniem hematoksyliną Harrisa. Powiększenie oryginalne: 40x (Pasek skali = 50 μm). (C) Barwienie Giemsą rozmazu uzyskanego po FNA wysięku otrzewnowego w 21. dniu infekcji wykazało liczne pasożyty (grot strzałki) zmieszane z komórkami gospodarza (myszy), w tym przypadku komórkami zapalnymi, makrofagami (strzałka) i limfocytami. Powiększenie oryginalne: 40x (Pasek skali = 50 μm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 5: Rozmazy FNA słabej jakości. (A) Rozmaz o niskiej komórkowości, niedostatecznie reprezentatywny dla masy lub narządu. (B) Rozmaz bardzo gruby. (C) Artefakt zmiażdżenia, z uszkodzonymi komórkami, nagimi jądrami i smugami DNA. (D) Agregaty i warstwy komórek ułożone warstwowo. Przeciwbarwienie DAB hematoksyliną Harrisa. Powiększenie oryginalne: 20x (Pasek skali = 100 μm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 6: Porównanie cytologii i histologii najądrza u myszy zainfekowanych T. brucei. (A) Mikrofotografie odpowiadające preparatowi z cienkiego rozmazu FNA oraz (B) przekrojowi parafinowemu o grubości 4 μm, przy tym samym powiększeniu (powiększenie oryginalne 20x, pasek skali = 100 μm), oba z barwieniem immunohistochemicznym na białka powierzchniowe pasożyta (VSG). Rozmaz wykazał dużą liczbę pasożytów (grot strzałki) z dobrze zachowaną morfologią komórkową, zmieszaną z umiarkowaną liczbą komórek zarodkowych i nielicznymi plemnikami (strzałka). Przekrój histologiczny wykazał dobrze zachowaną architekturę tkanki, składającą się z przewodów najądrza z wewnątrzświatłowymi plemnikami (strzałka) oraz obecność dużej liczby pasożytów rozszerzających zrąb najądrza (grot strzałki). DAB z kontraestacją hematoksyliną Harrisa. Powiększenie oryginalne: 20x (pasek skali = 100 μm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Aspiracja cienkoigłowa (FNA) jest metodą szeroko stosowaną do diagnozowania chorób u ludzi i zwierząt domowych. Technika ta została ustandaryzowana przez wiele lat 1,2, która wykorzystuje igłę o małym otworze do odsysania komórek lub płynu z wyczuwalnej masy lub narządu 1,3. Aspirat jest następnie zwykle rozmazywany na szkiełku podstawowym i barwiony w celu obserwacji mikroskopowej w celu postawienia diagnozy, ale technika ta może być również wykorzystana do pobierania komórek do innych celów 4,5,6,7,8,9.
Zabieg jest szybki (<5 minuty na mysz, dla doświadczonego badacza), a ryzyko powikłań jest minimalne, podobnie jak ryzyko ponoszone podczas prostego nakłucia żylnego. Z tego powodu w przypadku FNA wyczuwalnych mas znieczulenie jest wymagane tylko w przypadku wrażliwych lokalizacji anatomicznych lub gdy dobre unieruchomienie zwierzęcia i stabilizacja narządu lub masy, która ma zostać odessana, jest niezwykle istotna dla uzyskania optymalnych wyników. Jest to częste w przypadku małych zwierząt laboratoryjnych, ponieważ bezpieczne i skuteczne unieruchomienie małego gryzonia jedną ręką, przy jednoczesnym zapewnieniu najlepszego dostępu do obszaru aspiracji drugą ręką, jest trudne do osiągnięcia bez znieczulenia. Krótkotrwałe znieczulenie jest w większości przypadków wystarczające, niemniej jednak konieczne, dla dobrego FNA u myszy. Dobre unieruchomienie maksymalizuje szanse na uzyskanie aspiratu, który jest reprezentatywny dla składników komórkowych zmiany, a także minimalizuje szanse na eksternalizację końcówki igły podczas stosowania podciśnienia.
Chociaż sama procedura jest bardzo prosta, skoordynowana aplikacja i uwalnianie próżni są najbardziej krytycznymi krokami. Po wprowadzeniu igły tłok strzykawki jest cofany w celu uzyskania kontrolowanego podciśnienia (ssania), a igłę można wyjąć z masy dopiero po zwolnieniu podciśnienia poprzez puszczenie tłoka (ryc. 2); W przeciwnym razie aspirat jest zasysany do cylindra strzykawki i jest wtedy bardzo trudny do odzyskania. Kolejnym bardzo ważnym krokiem jest przygotowanie wysokiej jakości rozmazów. Istnieją różne metody wykonania rozmazu, ale niezależnie od metody, rozmazy należy przygotować natychmiast po nałożeniu materiału na szkło. Materiał biologiczny należy delikatnie rozprowadzić, aby uniknąć artefaktów zgniatania komórek. Użycie szkiełka nakrywkowego jako rozsiewacza może pomóc w zapobieganiu tym artefaktom. Jednak przyłożenie zbyt dużej siły podczas wykonywania rozmazu spowoduje pęknięcie szkiełka nakrywkowego. Dobrej jakości rozmaz zazwyczaj ma większość populacji komórek rozmieszczonych jako jednowarstwowe, dzięki czemu mogą one łatwo przepuszczać światło. Materiał komórkowy nie powinien być nadmiernie uwięziony w skrzepie krwi.
Celem FNA jest pobranie komórek z masy, tkanki lub narządu. Użycie igieł o większych otworach jest pomocne w zwiększeniu komórkowości, ale może wiązać się z nadmiernym zanieczyszczeniem krwi, podczas gdy pobieranie próbek za pomocą mniejszych igieł daje wyższą jakość, choć mniej obfity materiał. W naszym przypadku przezskórne aspiracje zewnętrznych męskich struktur rozrodczych u myszy eksperymentalnie zakażonych T. brucei przeprowadzono za pomocą igieł o rozmiarze 22 sprzężonych ze strzykawką o pojemności 5 ml. Myszy znieczulono, jądro stabilizowano jedną ręką, a drugą ręką prowadzono nakłucie i aspirację. Odzyskaliśmy liczne trypanosomy zmieszane z komórkami rozrodczymi, plemnikami, komórkami nabłonkowymi i komórkami zrębu, które zostały rozmazane i wybarwione immunologicznie na białka powierzchniowe pasożytów (VSG) (Figura 4).
W przypadku aspiracji zawsze istnieje potencjalny błąd pobierania próbek, który daje wyniki negatywne, ponieważ chociaż wiele obszarów danej zmiany może być wielokrotnie próbkowanych, jest to ślepa aspiracja, w której nie wizualizujemy końcówki igły i narządu docelowego lub masy. Jest to niezwykle istotne w warunkach klinicznych, gdzie ujemny FNA podejrzanej zmiany nie zapobiega dalszym badaniom, ale nie jest tak istotne w zwierzęcych modelach choroby. Tak więc ogólne ograniczenia obejmują głównie wyniki fałszywie ujemne, a rzadziej wyniki fałszywie dodatnie (np. z zanieczyszczenia krwi), ale najważniejszym ograniczeniem w kontekście doświadczeń na zwierzętach jest brak informacji na temat architektury tkanek17, podobnie jak w przypadku histopatologii, np. wzorca rozmieszczenia pasożytów, komórek odpornościowych i cech interakcji komórka-komórka. Niemniej jednak zaletą jest to, że FNA jest procedurą nieterminalną, pozwalającą na wielokrotne pobieranie próbek od tego samego zwierzęcia w czasie i zawsze pozwala na lepiej zachowaną morfologię komórkową (ryc. 5). Alternatywy dla FNA do pobierania komórek gospodarza, komórek odpornościowych lub mikroorganizmów od myszy zawsze polegają na eutanazji myszy w celu pobrania masy lub narządów będących przedmiotem zainteresowania.
O ile nam wiadomo, istnieje tylko kilka doniesień na temat stosowania FNA u małych zwierząt laboratoryjnych, jedno z 1949 roku odpowiada aspiracji szpiku kostnego za pomocą igły 22 G do badania hematopoezy18, a wszystkie inne w połączeniu z cytometrią przepływową w celu ilościowego określenia komórek zapalnych związanych z nowotworem lub komórek śródbłonka 7,19,20. Nasza praca pokazuje, że technika ta może być rozszerzona na diagnostykę i badanie modeli chorób zakaźnych i może łączyć cytologię z technikami takimi jak immunocytochemia czy mikroskopia elektronowa. Dwie z głównych zalet metody stosowanej na zwierzętach doświadczalnych to: (1) procedura ta nie jest terminalna, tj. może być wykonywana na żywych myszach; oraz (2) ze względu na łagodne nasilenie pozwala na seryjne aspiracje u tego samego zwierzęcia. W związku z tym do każdego badania potrzeba mniej myszy, a korelacja między postępem choroby klinicznej a ewolucją cech komórkowych i molekularnych choroby i/lub mikroorganizmu może być łatwo przeprowadzona, umożliwiając w ten sposób badania podłużne.
Być może pierwszym doniesieniem na temat stosowania FNA w diagnostyce chorób zakaźnych jest badanie przeprowadzone przez Griega i Graya w 1904 roku, które donosi o aspiracjach igłowych węzłów chłonnych u pacjentów ze śpiączką, które ujawniły ruchliwe trypanosomy12. Jeśli nasze odkrycia na myszach laboratoryjnych znajdą przełożenie na bydło, tj. jeśli Trypanosoma może być łatwo pobrana przez FNA z zewnętrznych męskich struktur rozrodczych, można oczekiwać, że ta technika będzie przydatna dla weterynarzy do diagnozowania trypanosomatozy zwierząt w gospodarstwie, u zwierząt gospodarskich.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ten projekt został sfinansowany przez Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) za pośrednictwem Fundos do Orçamento de Estado (ref.: ID/BIM/50005/2019). LMF jest badaczem w Fundação para a Ciência e Tecnologia (IF/01050/2014), a laboratorium jest finansowane przez ERBN (FatTryp, ref.771714). Publikacja tej pracy została również sfinansowana w ramach projektu UID/BIM/50005/2019 finansowanego przez Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) za pośrednictwem Fundos do Orçamento de Estado. Dziękujemy Andrei Pinto z Laboratorium Histologii i Patologii Porównawczej iMM za fachową pomoc w zakresie mikroskopii elektronowej oraz Sandrze Trindade, Tiago Rebelo i Henrique Machado (iMM) za udostępnienie tkanek zakażonych myszy.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Atipamezol (ANTISEDAN 10 mL) | Bio 2 | 7418046 | Odwrócenie znieczulenia |
| Szkiełka nakrywkowe (24 x 60 nr 1) | VWR | 631-0664 | Wykonywanie wymazu |
| DAB | Dako | K3468 | Immunocytochemia |
| Entellan (500 ml) | VWR | 1.07961.0500 | Podłoże montażowe |
| Rozcieńczalnik przeciwciał Envision Flex | Dako | 8006 | Immunocytochemia |
| EnVision Flex sprzężony z HRP (anty-króliczym) | Dako | K4010 | Immunocytochemia |
| Envision Flex Wash Buffer | Dako | K8007 | Immunocytochemia |
| Barwienie Giemsa | Atom Scientific Ltd | RRSPSS-A | Szkiełka witrażowe |
| Superfrost Plus) | VWR | 631-9483 | Wytwarzanie rozmazów |
| Harris Haematoxylin | Bio-optica | 05-06004E | Immunocytochemia |
| Roztwór peroksydazy wodorowej | Sigma | H1009-500ML | Immunocytochemia |
| Igły podskórne Microlance 3 (23 G) | Henry Schein | 902-8001 | Technika aspiracji |
| Ketamin (IMALGENE 1,000-10 mL) | Bio 2 | 7410928 | Znieczulenie |
| Medetomidine (DOMITOR 10 mL) | Bio 2 | 7418335 | Znieczulenie |
| Metanol | Merck | 1.06009.2511 | Utrwalacz wymazu |
| Pióro cytologiczne | Merck | Z377821-1EA | Immunocytochemia |
| Blok białkowy Surowica wolna Dako | X0909 | immunocytochemiczne | |
| (5 ml, 10 ml) | Henry Schein | 900-3311, 900-3304 | Technika aspiracji |
Bibliografia
- Leopold, G., Koss, M. R. M. Koss’ Diagnostic cytology and it’s histologic bases. , Lippincott Williams and Wilkins. (2006).
- Raskin, R. E., Meyer, D. J. Canine and Feline Cytology: a Color Atlas and Interpretation Guide. Canine and Feline Cytology. , (2016).
- Hopper, K. D., Abendroth, C. S., Sturtz, K. W., Matthews, Y. L., Shirk, S. J. Fine-needle aspiration biopsy for cytopathologic analysis: Utility of syringe handles, automated guns, and the nonsuction method. Radiology. 185 (3), 819-824 (1992).
- Saliba, A. E., et al. Microfluidic sorting and multimodal typing of cancer cells in self-assembled magnetic arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A. 107 (33), 14524-14529 (2010).
- Guzera, M., Cian, F., Leo, C., Winnicka, A., Archer, J. The use of flow cytometry for immunophenotyping lymphoproliferative disorders in cats: a retrospective study of 19 cases. Veterinary and Comparative Oncology. 14, 40-51 (2016).
- Young, N. A., Al-Saleem, T. I., Ehya, H., Smith, M. R. Utilization of fine-needle aspiration cytology and flow cytometry in the diagnosis and subclassification of primary and recurrent lymphoma. Cancer. 40 (4), 307-319 (1998).
- Carroll, C. S. E., Altin, J. G., Neeman, T., Fahrer, A. M. Repeated fine-needle aspiration of solid tumours in mice allows the identification of multiple infiltrating immune cell types. Journal of Immunological Methods. 425, 102-107 (2015).
- Araujo, R. W., Paiva, V., Gartner, F., Amendoeira, I., Martinez Oliveira, J., Schmitt, F. C. Fine needle aspiration as a tool to establish primary human breast cancer cultures in vitro. Acta Cytologica. 43 (6), 985-990 (1999).
- Craft, I., et al. Percutaneous epididymal sperm aspiration and intracytoplasmic sperm injection in the management of infertility due to obstructive azoospermia. Fertility and Sterility. 63 (5), 1038-1042 (1995).
- Powers, C. N. Diagnosis of infectious diseases: A cytopathologist’s perspective. Clinical Microbiology Reviews. 120 (3), 351-367 (1998).
- Diamantis, A., Magiorkinis, E., Koutselini, H. Fine-needle aspiration (FNA) biopsy: Historical aspects. Folia Histochemica et Cytobiologica. 47 (2), 191-197 (2009).
- Greig, E. D. W., Gray, A. C. H. Note on the lymphatic glands in sleeping sickness. British Medical Journal. 1 (2265), 1252(1904).
- Robson, J., Ashkar, T. S. Trypanosomiasis in domestic livestock in the Lambwe Valley area and a field evaluation of various diagnostic techniques. Bulletin of the World Health Organization. 47 (6), 727-734 (1972).
- Disease, T. African Animal Trypanosomiasis. In Vitro. , 1-15 (2009).
- Kennedy, P. G. E. Clinical features, diagnosis, and treatment of human African trypanosomiasis (sleeping sickness). Lancet Neurology. 12 (2), 186-194 (2012).
- Trindade, S., et al. Trypanosoma brucei parasites occupy and functionally adapt to the adipose tissue in mice. Cell Host and Microbe. 19 (6), 837-848 (2016).
- Carvalho, T., Trindade, S., Pimenta, S., Santos, A. B., Rijo-Ferreira, F., Figueiredo, L. M. Trypanosoma bruceitriggers a marked immune response in male reproductive organs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (8), 1-15 (2018).
- Sundberg, R. D., Hodgson, R. E. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4 (5), 557-561 (2013).
- Sottnik, J. L., Guth, A. M., Mitchell, L. A., Dow, S. W. Minimally invasive assessment of tumor angiogenesis by fine needle aspiration and flow cytometry. Angiogenesis. 13 (3), 251-258 (2010).
- Betka, J., Hovorka, O., Boucek, J., Ulbrich, K., Etrych, T., Rihova, B. Fine needle aspiration biopsy proves increased T-lymphocyte proliferation in tumor and decreased metastatic infiltration after treatment with doxorubicin bound to PHPMA copolymer carrier. Journal of Drug Targeting. 21 (7), 648-661 (2013).
Przedruki i uprawnienia
