Artykuł metodologiczny

Wykrywanie pasożytów trypanosoma zewnątrznaczyniowego za pomocą aspiracji cienkoigłowej

DOI:

10.3791/59798

⸱

7 sierpnia 2019

 ,  , 
1Comparative Pathology Unit, Instituto de Medicina Molecular – Faculdade de Medicina de Lisboa, 2Biology of Parasitism Laboratory, Instituto de Medicina Molecular – Faculdade de Medicina de Lisboa

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aspiracja cienkoigłowa to technika, dzięki której komórki są uzyskiwane z uszkodzenia lub narządu za pomocą cienkiej igły. Odessany materiał jest rozmazywany, barwiony i badany pod mikroskopem w celu diagnozy lub wykorzystywany do biologii molekularnej, cytometrii lub analizy in vitro. Jest tani, prosty, szybki i powoduje minimalną traumę.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aspiracja cienkoigłowa (FNA) jest rutynową procedurą diagnostyczną niezbędną zarówno w praktyce medycznej, jak i weterynaryjnej. Polega na przezskórnym zasysaniu komórek i/lub mikroorganizmów z wyczuwalnych palpacyjnie mas, narządów lub wysięków (nagromadzenie płynu w jamie ciała) za pomocą cienkiej igły podobnej do zwykłej igły używanej do nakłuwania żyły. Materiał zebrany przez FNA jest na ogół wysoce komórkowy, a pobrany aspirat jest następnie rozmazywany, suszony powietrzem, utrwalany na mokro, barwiony i obserwowany pod mikroskopem. W kontekście klinicznym FNA jest ważnym narzędziem diagnostycznym, które służy jako przewodnik do właściwego postępowania terapeutycznego. Ponieważ jest prosta, szybka, mało inwazyjna i wymaga ograniczonych inwestycji w laboratorium i zasoby ludzkie, jest szeroko stosowana przez lekarzy weterynarii, głównie u zwierząt domowych, ale także gospodarskich. W badaniach z wykorzystaniem modeli zwierzęcych FNA ma tę zaletę, że może być wykonywany wielokrotnie na tym samym zwierzęciu, co umożliwia badania podłużne poprzez pobieranie komórek z guzów i narządów/tkanek w trakcie choroby. Oprócz rutynowej mikroskopii, pobrany materiał może być również wykorzystany do immunocytochemii, mikroskopii elektronowej, analizy biochemicznej, cytometrii przepływowej, biologii molekularnej lub testów in vitro. FNA wykorzystano do identyfikacji pasożyta pierwotniaka Trypanosoma brucei w gonadach zakażonych myszy, otwierając możliwość przyszłej diagnozy u bydła.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aspiracja cienkoigłowa (FNA) jest szeroko stosowana w diagnostyce raka i chorób nienowotworowych, zarówno u ludzi, jak i zwierząt domowych. Technika ta została ustandaryzowana na przestrzeni lat i jest opisana w wielu podręcznikach1,2.

Składa się głównie z przezskórnego pobierania wyczuwalnych mas, organów lub wysięków za pomocą cienkiej igły umieszczonej na pustej strzykawce, wykorzystując podciśnienie do pobrania komórek lub płynu z masy1,3. Igły mają zazwyczaj od 22 do 25 G (rozstaw odpowiadający wewnętrznej średnicy igły), a użycie igły o większym otworze (duża średnica, np. 21 G) jest pomocne w zwiększeniu komórkowości, chociaż może to powodować nadmierne zanieczyszczenie krwi. Długość igły będzie zależeć od głębokości masy, ale 1 lub 11/2 cala jest powszechnie stosowana w przypadku mas powierzchownych. Strzykawki mają zwykle pojemność od 5 do 10 ml, przy czym większe strzykawki osiągają wyższe podciśnienie, co z kolei zwiększa wydajność aspiracji. Niewyczuwalne głęboko osadzone masy mogą być również odsysane, za pomocą dłuższych igieł i pod kontrolą obrazu (ultrasonografia). Pobrany aspirat można następnie rozmazać, wysuszyć na powietrzu, utrwalić na mokro, wybarwić i obserwować pod mikroskopem w celu uzyskania diagnozy3 (Rysunek 1).

To jest prosta, tania, bezbolesna i minimalnie inwazyjna technika stosowana głównie w warunkach przedoperacyjnych w celu uzyskania diagnozy na wyczuwalnych masach, a także na narządach, takich jak węzły chłonne, tarczyca, prostata czy nawet zewnętrzne męskie struktury rozrodcze1. Oprócz tego, że jest narzędziem diagnostycznym, technika ta może być wykorzystywana do zbierania komórek również do innych celów, a mianowicie cytogenetyki, mikroskopii elektronowej (Rysunek 1D), charakterystyka cytometrii przepływowej4,5,6,7, ustanowienie kultur komórkowych8. Typowym przykładem w praktyce klinicznej jest pobieranie plemników do zapłodnienia in vitro9.

Aspiracja może być powtórzona kilka razy w tej samej masie, aby uzyskać wiele rozmazów. W przypadku zmiany niejednorodnej, np. obszaru stałego i przestrzeni torbielowatej, ważne jest, aby komórki były odsysane z każdego regionu. Materiał pobrany przez FNA jest na ogół wysoce komórkowy, co w większości przypadków pozwala na rozpoznanie chorób bez konieczności wykonywania biopsji tkanki. Specjalne plamy, immunofluorescencja. immunocytochemia (Rysunek 1D), a techniki molekularne mogą być również wykonywane w rozmazach uzyskanych za pomocą FNA, np. w celu identyfikacji czynników zakaźnych, gdy nie są one rozpoznawalne na podstawie samej morfologii10. Krótki przegląd ogólnych zastosowań oraz sprzętu i materiałów eksploatacyjnych potrzebnych do FNA podsumowano odpowiednio w tabelach 1 i 2.

Pierwszy raport na temat użycia nakłucia igły do celów diagnostycznych jest opisany we wczesnych pismach medycyny arabskiej, ale dopiero na początku XX wieku zastosowano nowoczesne techniki aspiracji igły11. Warto zauważyć, że być może pierwszym raportem, który sugeruje zastosowanie FNA do diagnozowania chorób zakaźnych, było badanie z 1904 roku, w którym Grieg i Gray poinformowali, że aspiracje igieł węzłów chłonnych od pacjentów ze śpiączką ujawniły ruchliwe trypanosomy12. Autorzy stwierdzili obecność trypanosomów zarówno we wczesnych, jak i zaawansowanych przypadkach oraz w większej gęstości niż obserwowana w rozmazach krwi, gdzie są to często rzadkie zdarzenia12.

Obecna diagnoza trypanosomatozy u bydła opiera się na bezpośredniej obserwacji pasożytów we krwi, limfie lub w technikach immunodiagnostycznych13,14,15. Wcześniej wykazaliśmy, że w eksperymentalnych infekcjach Trypanosoma u myszy, Trypanosoma brucei (T. brucei) ma niezwykły tropizm w stosunku do tkanki tłuszczowej16, a także do niektórych zewnętrznych męskich struktur rozrodczych, a mianowicie epijąder17. Pasożyty gromadzą się w zrębie tych tkanek w dużych ilościach16.

Protokół przedstawiony poniżej opisuje szczegółową procedurę techniczną krok po kroku dla FNA u żywych myszy, mającą na celu aspirację trypanosomów obecnych w zewnętrznych męskich strukturach rozrodczych (jądra, najądrza i tłuszcz najądrza), a następnie konwencjonalną cytologię i barwienie immunologiczne dla specyficznych białek pasożyta (VSG)16,17. Aspirację przeprowadzono 6 dni po zakażeniu, a procedury bezpieczeństwa, które mają zastosowanie, są powszechnie ustanowione dla rutynowego obchodzenia się ze zwierzętami doświadczalnymi. W przypadku zwierząt z niedoborami odporności wymagane są dodatkowe środki (noszenie fartucha sterylizowanego parą, maska, czepek do włosów, sterylne rękawiczki i zapewnienie aseptyki przez cały czas) w celu złagodzenia przypadkowego narażenia na oportunistyczne patogeny.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach w tym protokole zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami UE i zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Instituto de Medicina Molecular (iMM), (AEC_2011_006_LF_TBrucei_IMM). Zakład hodowli zwierząt iMM jest zgodny z portugalskim prawem dotyczącym wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych (dekret z mocą ustawy 113/2013) i jest zgodny z dyrektywą europejską 2010/63/UE oraz wytycznymi i zaleceniami FELASA (Federacja Europejskich Stowarzyszeń Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych) dotyczącymi dobrostanu zwierząt laboratoryjnych.

1. Aspiracja pasożytów z zewnętrznych męskich narządów rozrodczych myszy

UWAGA: Aspiracja cienkoigłowa (FNA) została przeprowadzona u dzikich samców myszy C57BL/6J w wieku od 6 do 10 tygodni, zarażonych T. brucei poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie 200 μL soli fizjologicznej z 2 000 pasożytów, jak opisano wcześniej16.

  1. W przypadku FNA zewnętrznych męskich narządów rozrodczych umieścić mysz w kapturze z przepływem laminarnym, znieczulić zwierzę wstrzyknięciem dootrzewnowym 200 μl mieszaniny 75 mg/kg ketaminy + 1 mg/kg medetomidyny w soli fizjologicznej.
    1. Potwierdź znieczulenie metodą szczypania palców u stóp. Gdy odruch cofnięcia nogi jest nieobecny, ustaw mysz w pozycji leżącej grzbietowej (Rysunek 2A).
    2. Ostrożnie obmacuj jądro, oceniając rozmiar i odległość od leżącej nad nim skóry. Unieruchom, utrzymuj narząd między palcem wskazującym a środkowym lub między palcem wskazującym a kciukiem. Rozciągnij mocno przylegającą skórę w poprzek masy, aby jeszcze bardziej unieruchomić cel. Oczyść powierzchnię chusteczkami nasączonymi alkoholem (Rysunek 2A).
    3. Trzymaj zmontowaną igłę 22 G i strzykawkę 5 ml i włóż końcówkę igły do celu, zawsze z tłokiem w stanie spoczynku (Rysunek 2B-C).
    4. Zastosować ssanie, cofając tłok strzykawki do oznaczenia 4 ml do 5 ml 2-3 razy. Przekieruj igłę w narządzie w linii prostej lub wzdłuż kilku różnych stycznych, aby zwiększyć prawdopodobieństwo reprezentatywnej próbki i celowania w mniejsze struktury, takie jak najądrza. Upewnij się, że ta procedura jest delikatna, aby zminimalizować uszkodzenie tkanek (Rysunek 2C-D).
    5. Zwolnić ssanie, a następnie wyjąć igłę. Nie należy ponownie naciągać igły z cofniętym tłokiem, ponieważ doprowadzi to do zassania aspiratu do cylindra strzykawki i utrudni jego odzyskanie (Rysunek 2E). Po wyjęciu igły należy zatamować krwawienie, uciskając w miejscu wkłucia wysterylizowaną gąbką z gazy.
    6. Odłączyć strzykawkę od igły, napełnić ją powietrzem, ponownie podłączyć igłę i delikatnie wysunąć zawartość igły na szkiełko. Umieść końcówkę igły bardzo blisko lub nawet na szkiełku, aby uniknąć rozpryskiwania (Rysunek 2F-I).
    7. Przeprowadzić co najmniej jedną dodatkową aspirację dla każdego narządu/zwierzęcia, aby zapewnić powtórzone pobieranie próbek.
    8. Przywrócić znieczulenie za pomocą podskórnego wstrzyknięcia 200 μl 1 mg/kg Atipamezolu w roztworze soli fizjologicznej i zwrócić zwierzęta do ich klatki domowej w celu rekonwalescencji i obserwować aż do całkowitego wyzdrowienia.

2. Przygotowanie rozmazu z zasysanego materiału

UWAGA: Używaj rękawiczek podczas całego zabiegu i zapewnij bezpieczną pozbywanie się igieł i strzykawek.

  1. Dwuetapowa metoda ciągnięcia
    1. Podnieś szkiełko, na którym znajduje się kropla przydechu, za pomocą ręki niedominującej i ściśnij oszroniony koniec między kciukiem a palcem wskazującym (Rysunek 3A).
    2. Podnieś drugi czysty szkiełko, suwak rozsiewający, dominującą ręką i przesuń go przez pierwszy slajd z upuszczeniem aspiratu. Umieść gładką, czystą krawędź szkiełka na szkiełku z próbką tuż na górze kropli pod kątem około 30° (Rysunek 3B).
    3. Przesuwaj suwak do przodu jednym lekkim, ciągłym i stałym ruchem, aby uzyskać cienką warstwę (Rysunek 3C).
    4. Oprzyj szkiełko i pozwól na całkowite i szybkie wyschnięcie materiału na powietrzu (Rysunek 3D). Nie utrwalaj na gorąco. Oznacz oszronioną krawędź szkiełka ołówkiem.
      nuta: Na tym etapie protokół można wstrzymać, a rozmazy można przechowywać w nieskończoność, aż będą gotowe do barwienia.

3. Barwienie rozmazów

UWAGA: Używaj rękawiczek podczas całej procedury i upewnij się, że kroki 3.1.4 i 3.2.9 są wykonywane wewnątrz dygestorium.

  1. Protokół barwienia Giemsy
    1. Napraw wysuszone na powietrzu smugi, zanurzając szkiełka w słoiku z kopliny zawierającym 100% metanolu na 5 minut (Rysunek 3E).
    2. Przenieś szkiełko do słoika Coplin zawierającego 20% roztwór Giemsa (rozcieńczony do 1/5 w wodzie destylowanej) na 30 minut lub 10% Giemsa przez 10 minut (Rysunek 3F).
    3. Spłucz w wodzie z kranu i dokładnie wysusz za pomocą bibuły.
    4. Trzymaj szkiełko poziomo i nałóż jedną kroplę niewodnego medium mocującego na rozmaz. Umieść krawędź szkła nakrywkowego na szkiełku, opuść je i delikatnie dociśnij, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
  2. Immunocytochemia w rozmazach FNA
    1. Wysuszone na powietrzu rozmazy utrwalić w 100% metanolu w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    2. Myj szkiełko przez 5 minut w słoiku Coplin z 1x buforem fosforanowym (PBS), powtarzając ten krok 3 razy, używając za każdym razem świeżego 1x PBS.
    3. Wyjmij szkiełko ze słoika Coplin, wytrzyj nadmiar bufora bez dotykania rozmazu i narysuj okrąg wokół rozmazu za pomocą wodoodpornego pisaka (Tabela materiałów).
    4. Trzymać szkiełko poziomo i nanieść 150 μl rozcieńczonego roztworu przeciwciał pierwszorzędowych na każdy rozmaz i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      nuta: Podstawowym przeciwciałem stosowanym w tym przypadku jest nieoczyszczony antygen anty-T. brucei VSG13 w surowicy królika (reagujący krzyżowo z wieloma VSG T. brucei, produkowany we własnym zakresie), rozcieńczony w 1x PBS w stosunku 1:50 000. Przeprowadzić kontrole ujemne, zastępując odpowiednie przeciwciało pierwszorzędowe surowicą przedimmunologiczną (tabela materiałów), aby umożliwić ocenę nieswoistego wiązania przeciwciała drugorzędowego.
    5. Myj szkiełko przez 5 minut w słoiku Coplin z 1x PBS, powtarzając ten krok 3 razy, używając za każdym razem świeżego 1x PBS.
    6. Trzymaj szkiełko poziomo i nałóż 150 μl dostępnego na rynku systemu wizualizacji peroksydazy chrzanowej/DAB na każdy rozmaz. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej (tabela materiałów).
    7. Prać przez 3x przez 5 min w 1x PBS.
    8. Przeciwplamić, zanurzając szkiełka w słoiku Coplin zawierającym hematoksylinę Harrisa. Spłucz w wodzie z kranu i dokładnie wysusz papierem do wtarcia.
    9. Trzymaj szkiełko poziomo i nałóż jedną kroplę niewodnego medium mocującego na rozmaz. Umieść krawędź szkła nakrywkowego na szkiełku, opuść je i delikatnie dociśnij, aby usunąć pęcherzyki powietrza.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FNA przeprowadzono w zewnętrznych męskich narządach rozrodczych myszy zakażonych T. brucei przy użyciu igły 22 G połączonej ze strzykawką 5 ml i szklanych szkiełek do przygotowania wymazu (Rysunek 1A-C). Metoda jest prosta, ale optymalne wyniki zależą od krytycznych etapów: doskonałego unieruchomienia myszy osiągniętego poprzez znieczulenie ogólne i stabilizacji narządów podczas całej procedury (Rysunek 2A-B). Odsysanie stosowano 2-3 razy, a igłę przekierowywano 1-2 razy, aby umożliwić reprezentatywne pobranie próbek mniejszych narządów i tkanek: najądrza i tłuszczu najądrza. Podciśnienie zostało uwolnione przed eksternalizacji igły. Aspirat zawarty w świetle i piotle igły (około 20 μL) został użyty do wytworzenia 2 rozmazów (Rysunek 3A-C). W przypadkach, gdy igła została wyjęta bez zwolnienia ssania, materiał był zasysany do strzykawki i nie można go było odzyskać. Proces ten udało się powtórzyć dwukrotnie, po jednym dla każdego sparowanego narządu. Po wyschnięciu rozmazy utrwalono na mokro i przeprowadzono immunocytochemię białek powierzchniowych trypanosomów.

Dobrej jakości rozmaz (Rysunek 4A-C) charakteryzował się monowarstwą komórek o dobrej gęstości komórkowej, w której komórki gospodarza wykazują zachowane cechy morfologiczne, co pozwala na identyfikację ich tkanki pochodzenia i względnej proporcji między sobą. Pasożyty były skutecznie wybarwione immunologicznie, identyfikowalne i policzalne (Ryc. 4B). Pokazano również jeden przypadek FNA wysięku otrzewnowego u zakażonej myszy, zabarwionej preparatem Giemsa w celu bezpośredniej obserwacji i diagnozy (Ryc. 3D-F i Ryc. 4C).

Słaby lub ujemny wynik FNA może wynikać z różnych powodów: (1) zbyt mało materiału FNA jest wyrażone na szkiełku i jest niereprezentatywne dla próbki; (2) zbyt duża ilość materiału FNA ulega ekspresji na jednym szkiełku, co powoduje zbyt grube rozmazy i pogarsza ocenę cytologiczną; (3) podczas wykonywania rozmazu przykładana jest zbyt duża siła, a komórki są zakłócane, co skutkuje dużą ilością nagich jąder i smug DNA (artefakt zgniatania); lub (4) podczas wykonywania rozmazu nie przykłada się wystarczającej siły, a komórki nie ulegają dezagregacji, co powoduje powstanie warstwowej warstwy, która utrudnia ocenę cech morfologicznych komórek (Rysunek 5).

Gdy porównujemy cytopatologię FNA z histopatologią, tj. analizą komórek w porównaniu z tkankami, pierwsza ma tę przewagę, że morfologia komórkowa jest lepiej zachowana, a względne proporcje i liczenie komórek mogą być lepiej ocenione (Rysunek 6). Co więcej, immunocytochemia jest prostsza, szybsza i łatwiejsza do optymalizacji niż immunohistochemia, która jest zwykle wykonywana w tkance utrwalonej w formalinie i zatopionej w parafinie.

celAplikacjiZaletyOgraniczenia
Wyczuwalna masaRutynowa mikroskopia, diagnozaProsto, szybkoBrak architektury tkankowej
organyImmunohistochemiaNiski kosztŚlepa aspiracja (igła może nie trafić w cel stycznie; aspiracja może celować w obszary martwicze, torbielowate lub krwotoczne)
WysiękiCytometria przepływowaPobieranie próbek z wielu lokalizacji
CytogenetykaDobrze zachowana morfologia komórkowa
Mikroskopia elektronowaBez powikłań
PCR, inne techniki molekularneWysoka dokładność diagnostyczna
Analiza biochemicznaZnieczulenie (do unieruchomienia)
Testy in vitro, hodowle komórkoweProcedura nieterminalna

Tabela 1: Cel, ogólne zastosowania, zalety i ograniczenia aspiracji cienkiej igły.

Zestaw FNAArchetyp igły aspiracyjnej i strzykawki
dążenie:Części igły:
1. Jednorazowe strzykawki plastikowe (5 lub 10 ml) (rysunek 1B)skos. Końcówka trzonka igły jest nachylona, tworząc punkt, przy czym skos jest skosem. Tylko igły skośne nadają się do aspiracji przezskórnych.
3. Igły o średnicy od 22 do 25 cm; o długości 0,75, 1,0, 1,5 cala, ze standardową skośną krawędzią końcówki igły (rysunek 1A)wał. Wydrążona rurkowa część igły, której długość może być regulowana w zależności od głębokości masy. Rozstaw igły odpowiada średnicy jej otworu, która jest średnicą wnętrza trzonu (mniejsze igły mają większą średnicę). Stosowanie igieł o większych otworach (mniej niż 22 G) jest pomocne w zwiększaniu komórkowości, chociaż może to powodować nadmierne jatrogenne zanieczyszczenie krwi.
1. Znieczulenie (jeśli to konieczne). Ból związany z FNA jest podobny do bólu po punkcji żylnej, jednak dobre aspiracje wymaga dobrego unieruchomienia pacjenta, co jest szczególnie ważne u małych zwierząt i/lub w przypadku małych, zmiennych zmian i narządów. Szczury i myszy poddane FNA powinny być odpowiednio biernie unieruchomione lub, jeśli to konieczne, uspokojone lub w lekkim znieczuleniu ogólnym.koncentrator. Plastikowa część igły, która jest przymocowana do strzykawki; powinny być przezroczyste, aby umożliwić wizualizację zasysanego materiału. Materiał aspiracyjny uzyskany podczas FNA powinien zostać zebrany w trzonie igły, a aspiracja zatrzymana, gdy materiał jest widoczny wchodząc do piasty.
Sporządzanie i interpretacja rozmazów FNA:Części strzykawki:
1. Szkiełka mikroskopowe z matowego szkła końcowego (rysunek 1C)Baryłka/cylinder. Wydrążona część strzykawki. O ile nie mamy do czynienia ze zmianami torbielowatymi lub wysiękami, materiał zasysany do lufy na ogół nie może być odzyskany. Idealna objętość aspiratu do cytologii FNA wynosi około 5 μl, co odpowiada średniej objętości aspiratu, która zajmuje trzon i piastę igły.
2. Plamy typu Romanowsky (np. Diff-Quik, Giemsa)napiwek. Koniec lufy, do której przymocowana jest piasta igły.
3. Mikroskop (jasne pole)Tłok. Ruchoma część strzykawki, która ma płaski krążek lub wargę na jednym końcu i gumową uszczelkę na drugim końcu. Pasuje do lufy i zapewnia ciśnienie do wciągnięcia komórek, płynu do igły. Doskonale uszczelniony tłok, który wytwarza dobre podciśnienie, jest niezbędny do uzyskania dobrej wydajności zasysania.

Tabela 2: Sprzęt i materiały potrzebne do aspiracji cienkiej igły.

figure-results-1
Rysunek 1: Narzędzia i wyniki do aspiracji cienkoigłowej. (A) Idealna średnica igły dla FNA wynosi od 22 do 25 G. (B) Idealna objętość strzykawki do uzyskania dobrej wydajności ssania wynosi od 5 do 10 ml. (C) Czyste, suche, wolne od tłuszczu szkiełko szkiełkowe z matowym obszarem do pisania ołówkiem i wstępnie pokryte (jeśli do immunohistochemii). (D) Przykład trypanosomów obserwowanych z barwieniem Giemsy (grot strzały), wybarwionymi immunologicznie dla białek powierzchniowych VSG (biały grot strzałki) i pod transmisyjną mikroskopią elektronową (strzałka blokowa). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Schematy przedstawiające aspirację cienkoigłową (FNA) zewnętrznych męskich narządów rozrodczych (jądra, najądrza i tłuszczu najądrza) u myszy. (A) Gdy zwierzę jest już zabezpieczone, podnosi się wcześniej zmontowany instrument do aspiracji. (B-C) Wbić końcówkę igły do narządu docelowego. (D) Zastosować ssanie, cofając tłok strzykawki do oznaczenia od 1 ml do 2 ml, kilkakrotnie 3-4 razy. Końcówkę igły można również przesuwać do przodu i do tyłu w obrębie celu podczas stosowania ssania, aby zebrać wystarczającą ilość materiału. (E) Zwolnić ssanie i dopiero wtedy wyjąć igłę. (F) Wyjąć igłę ze strzykawki i (G) odciągnąć tłok do tyłu. (H) Ponownie założyć igłę. (I) Wylać materiał na szkiełko podstawowe poprzez szybkie przepchnięcie tłoka przez strzykawkę. Aby uniknąć rozpryskiwania się, upewnij się, że końcówka igły spoczywa bardzo blisko lub nawet na szkiełku. Kroplę aspiratu umieszcza się około 1 cm od krawędzi oszronionego obszaru znakowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Przygotowanie i barwienie rozmazu. (A) Przytrzymaj jeden koniec szkiełka (obszar oszroniony) między kciukiem a palcem wskazującym. (B) Umieść gładką, czystą krawędź drugiego szkiełka (rozsiewacza) na szkiełku do próbek tuż przed upuszczeniem materiału. (C) Przesuń spread raz do przodu z umiarkowaną prędkością, aby uzyskać cienką warstwę. (D) Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu i oznacz matową krawędź szkiełka ołówkiem. (E) Po całkowitym wyschnięciu utrwalić metanolem przez 5 minut. (F) Barwić 20% roztworem Giemsy przez 30 minut (lub 10% roztworem Giemsa przez 10 minut). Lekko spłucz wodą, całkowicie wysusz, zanurz w ksylenie i zalej nierozpuszczalnym w wodzie środkiem montażowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Mikrofotografie rozmazów uzyskanych z FNA zewnętrznych męskich struktur rozrodczych u myszy zakażonych T. brucei. (A) Rażący wygląd dobrej jakości bezpośredniego rozmazu: materiał został wyrażony na szkiełku w odległości około 1 cm od matowej krawędzi (kropka), rozmazany i zatrzymany 0,5 cm przed krawędzią szkiełka (równoległe linie). (B) Immunocytochemię białek powierzchniowych pasożyta (VSG) przeprowadzono dla rozmazów uzyskanych z FNA zewnętrznych męskich narządów rozrodczych w 6 dniu zakażenia. Wykryto liczne pasożyty (grot strzały) zmieszane z komórkami rozrodczymi myszy (strzałka). DAB barwiony przeciwwagowo hematoksyliną Harrisa. Oryginalne powiększenie: 40x (podziałka = 50 μm). (C) Barwienie metodą Giemsy rozmazu uzyskanego po FNA wysięku otrzewnowego w 21 dniu zakażenia wykazało liczne pasożyty (grot strzały) zmieszane z komórkami gospodarza (myszy), w tym przypadku komórkami zapalnymi, makrofagami (strzałka) i limfocytami. Oryginalne powiększenie: 40x (podziałka = 50 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Słaba jakość rozmazów FNA. (A) Słabo komórkowy rozmaz, niedostatecznie reprezentatywny dla masy lub narządu. (B) Bardzo gęsty rozmaz. (C) Zmiażdżony artefakt, z uszkodzonymi komórkami, nagimi jądrami i smugami DNA. (D) Agregacje i warstwowe warstwy komórek. DAB barwiony przeciwwagowo hematoksyliną Harrisa. Oryginalne powiększenie: 20x (podziałka = 100 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Porównanie cytologii i histologii najądrza u myszy zakażonych T. brucei. (A) Mikrofotografie odpowiadające rozmazowi FNA i (B) przekrój parafiny 4 μm, przy tym samym powiększeniu (20x oryginalne powiększenie, pasek skali = 100 μm), oba wybarwione immunologicznie dla białek powierzchniowych pasożyta (VSG). Rozmaz wykazał dużą liczbę pasożytów (grot strzały) o dobrze zachowanej morfologii komórkowej, z domieszką umiarkowanej liczby komórek rozrodczych i niewielkiej liczby plemników (strzałka). W przekroju histologicznym stwierdzono dobrze zachowaną architekturę tkankową, złożoną z przewodów najądrza z plemnikami wewnątrzświetlnymi (strzałka) oraz obecność dużej liczby pasożytów rozszerzających zrąb najądrza (grot strzałki). DAB barwiony przeciwwagowo hematoksyliną Harrisa. Oryginalne powiększenie: 20x (podziałka = 100 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aspiracja cienkoigłowa (FNA) jest metodą szeroko stosowaną do diagnozowania chorób u ludzi i zwierząt domowych. Technika ta została ustandaryzowana przez wiele lat 1,2, która wykorzystuje igłę o małym otworze do odsysania komórek lub płynu z wyczuwalnej masy lub narządu 1,3. Aspirat jest następnie zwykle rozmazywany na szkiełku podstawowym i barwiony w celu obserwacji mikroskopowej w celu postawienia diagnozy, ale technika ta może być również wykorzystana do pobierania komórek do innych celów 4,5,6,7,8,9.

Zabieg jest szybki (<5 minuty na mysz, dla doświadczonego badacza), a ryzyko powikłań jest minimalne, podobnie jak ryzyko ponoszone podczas prostego nakłucia żylnego. Z tego powodu w przypadku FNA wyczuwalnych mas znieczulenie jest wymagane tylko w przypadku wrażliwych lokalizacji anatomicznych lub gdy dobre unieruchomienie zwierzęcia i stabilizacja narządu lub masy, która ma zostać odessana, jest niezwykle istotna dla uzyskania optymalnych wyników. Jest to częste w przypadku małych zwierząt laboratoryjnych, ponieważ bezpieczne i skuteczne unieruchomienie małego gryzonia jedną ręką, przy jednoczesnym zapewnieniu najlepszego dostępu do obszaru aspiracji drugą ręką, jest trudne do osiągnięcia bez znieczulenia. Krótkotrwałe znieczulenie jest w większości przypadków wystarczające, niemniej jednak konieczne, dla dobrego FNA u myszy. Dobre unieruchomienie maksymalizuje szanse na uzyskanie aspiratu, który jest reprezentatywny dla składników komórkowych zmiany, a także minimalizuje szanse na eksternalizację końcówki igły podczas stosowania podciśnienia.

Chociaż sama procedura jest bardzo prosta, skoordynowana aplikacja i uwalnianie próżni są najbardziej krytycznymi krokami. Po wprowadzeniu igły tłok strzykawki jest cofany w celu uzyskania kontrolowanego podciśnienia (ssania), a igłę można wyjąć z masy dopiero po zwolnieniu podciśnienia poprzez puszczenie tłoka (ryc. 2); W przeciwnym razie aspirat jest zasysany do cylindra strzykawki i jest wtedy bardzo trudny do odzyskania. Kolejnym bardzo ważnym krokiem jest przygotowanie wysokiej jakości rozmazów. Istnieją różne metody wykonania rozmazu, ale niezależnie od metody, rozmazy należy przygotować natychmiast po nałożeniu materiału na szkło. Materiał biologiczny należy delikatnie rozprowadzić, aby uniknąć artefaktów zgniatania komórek. Użycie szkiełka nakrywkowego jako rozsiewacza może pomóc w zapobieganiu tym artefaktom. Jednak przyłożenie zbyt dużej siły podczas wykonywania rozmazu spowoduje pęknięcie szkiełka nakrywkowego. Dobrej jakości rozmaz zazwyczaj ma większość populacji komórek rozmieszczonych jako jednowarstwowe, dzięki czemu mogą one łatwo przepuszczać światło. Materiał komórkowy nie powinien być nadmiernie uwięziony w skrzepie krwi.

Celem FNA jest pobranie komórek z masy, tkanki lub narządu. Użycie igieł o większych otworach jest pomocne w zwiększeniu komórkowości, ale może wiązać się z nadmiernym zanieczyszczeniem krwi, podczas gdy pobieranie próbek za pomocą mniejszych igieł daje wyższą jakość, choć mniej obfity materiał. W naszym przypadku przezskórne aspiracje zewnętrznych męskich struktur rozrodczych u myszy eksperymentalnie zakażonych T. brucei przeprowadzono za pomocą igieł o rozmiarze 22 sprzężonych ze strzykawką o pojemności 5 ml. Myszy znieczulono, jądro stabilizowano jedną ręką, a drugą ręką prowadzono nakłucie i aspirację. Odzyskaliśmy liczne trypanosomy zmieszane z komórkami rozrodczymi, plemnikami, komórkami nabłonkowymi i komórkami zrębu, które zostały rozmazane i wybarwione immunologicznie na białka powierzchniowe pasożytów (VSG) (Figura 4).

W przypadku aspiracji zawsze istnieje potencjalny błąd pobierania próbek, który daje wyniki negatywne, ponieważ chociaż wiele obszarów danej zmiany może być wielokrotnie próbkowanych, jest to ślepa aspiracja, w której nie wizualizujemy końcówki igły i narządu docelowego lub masy. Jest to niezwykle istotne w warunkach klinicznych, gdzie ujemny FNA podejrzanej zmiany nie zapobiega dalszym badaniom, ale nie jest tak istotne w zwierzęcych modelach choroby. Tak więc ogólne ograniczenia obejmują głównie wyniki fałszywie ujemne, a rzadziej wyniki fałszywie dodatnie (np. z zanieczyszczenia krwi), ale najważniejszym ograniczeniem w kontekście doświadczeń na zwierzętach jest brak informacji na temat architektury tkanek17, podobnie jak w przypadku histopatologii, np. wzorca rozmieszczenia pasożytów, komórek odpornościowych i cech interakcji komórka-komórka. Niemniej jednak zaletą jest to, że FNA jest procedurą nieterminalną, pozwalającą na wielokrotne pobieranie próbek od tego samego zwierzęcia w czasie i zawsze pozwala na lepiej zachowaną morfologię komórkową (ryc. 5). Alternatywy dla FNA do pobierania komórek gospodarza, komórek odpornościowych lub mikroorganizmów od myszy zawsze polegają na eutanazji myszy w celu pobrania masy lub narządów będących przedmiotem zainteresowania.

O ile nam wiadomo, istnieje tylko kilka doniesień na temat stosowania FNA u małych zwierząt laboratoryjnych, jedno z 1949 roku odpowiada aspiracji szpiku kostnego za pomocą igły 22 G do badania hematopoezy18, a wszystkie inne w połączeniu z cytometrią przepływową w celu ilościowego określenia komórek zapalnych związanych z nowotworem lub komórek śródbłonka 7,19,20. Nasza praca pokazuje, że technika ta może być rozszerzona na diagnostykę i badanie modeli chorób zakaźnych i może łączyć cytologię z technikami takimi jak immunocytochemia czy mikroskopia elektronowa. Dwie z głównych zalet metody stosowanej na zwierzętach doświadczalnych to: (1) procedura ta nie jest terminalna, tj. może być wykonywana na żywych myszach; oraz (2) ze względu na łagodne nasilenie pozwala na seryjne aspiracje u tego samego zwierzęcia. W związku z tym do każdego badania potrzeba mniej myszy, a korelacja między postępem choroby klinicznej a ewolucją cech komórkowych i molekularnych choroby i/lub mikroorganizmu może być łatwo przeprowadzona, umożliwiając w ten sposób badania podłużne.

Być może pierwszym doniesieniem na temat stosowania FNA w diagnostyce chorób zakaźnych jest badanie przeprowadzone przez Griega i Graya w 1904 roku, które donosi o aspiracjach igłowych węzłów chłonnych u pacjentów ze śpiączką, które ujawniły ruchliwe trypanosomy12. Jeśli nasze odkrycia na myszach laboratoryjnych znajdą przełożenie na bydło, tj. jeśli Trypanosoma może być łatwo pobrana przez FNA z zewnętrznych męskich struktur rozrodczych, można oczekiwać, że ta technika będzie przydatna dla weterynarzy do diagnozowania trypanosomatozy zwierząt w gospodarstwie, u zwierząt gospodarskich.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten projekt został sfinansowany przez Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) za pośrednictwem Fundos do Orçamento de Estado (ref.: ID/BIM/50005/2019). LMF jest badaczem w Fundação para a Ciência e Tecnologia (IF/01050/2014), a laboratorium jest finansowane przez ERBN (FatTryp, ref.771714). Publikacja tej pracy została również sfinansowana w ramach projektu UID/BIM/50005/2019 finansowanego przez Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) za pośrednictwem Fundos do Orçamento de Estado. Dziękujemy Andrei Pinto z Laboratorium Histologii i Patologii Porównawczej iMM za fachową pomoc w zakresie mikroskopii elektronowej oraz Sandrze Trindade, Tiago Rebelo i Henrique Machado (iMM) za udostępnienie tkanek zakażonych myszy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Atipamezol (ANTISEDAN 10 mL)Bio 27418046Odwrócenie znieczulenia
Szkiełka nakrywkowe (24 x 60 nr 1)VWR631-0664Wykonywanie wymazu
DABDakoK3468Immunocytochemia
Entellan (500 ml)VWR1.07961.0500Podłoże montażowe
Rozcieńczalnik przeciwciał Envision Flex Dako8006Immunocytochemia
EnVision Flex sprzężony z HRP (anty-króliczym)DakoK4010Immunocytochemia
Envision Flex Wash Buffer DakoK8007Immunocytochemia
Barwienie Giemsa Atom Scientific LtdRRSPSS-ASzkiełka witrażowe
Superfrost Plus)VWR631-9483Wytwarzanie rozmazów
Harris Haematoxylin Bio-optica05-06004EImmunocytochemia
Roztwór peroksydazy wodorowej SigmaH1009-500MLImmunocytochemia
Igły podskórne Microlance 3 (23 G)Henry Schein902-8001Technika aspiracji
Ketamin (IMALGENE 1,000-10 mL)Bio 27410928Znieczulenie
Medetomidine (DOMITOR 10 mL) Bio 27418335Znieczulenie
MetanolMerck1.06009.2511Utrwalacz wymazu
Pióro cytologiczne MerckZ377821-1EAImmunocytochemia
Blok białkowy Surowica wolna Dako X0909immunocytochemiczne
(5 ml, 10 ml)Henry Schein900-3311, 900-3304Technika aspiracji
( Strzykawki

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Leopold, G., Koss, M. R. M. Koss’ Diagnostic cytology and it’s histologic bases. , Lippincott Williams and Wilkins. (2006).
  2. Raskin, R. E., Meyer, D. J. Canine and Feline Cytology: a Color Atlas and Interpretation Guide. Canine and Feline Cytology. , (2016).
  3. Hopper, K. D., Abendroth, C. S., Sturtz, K. W., Matthews, Y. L., Shirk, S. J. Fine-needle aspiration biopsy for cytopathologic analysis: Utility of syringe handles, automated guns, and the nonsuction method. Radiology. 185 (3), 819-824 (1992).
  4. Saliba, A. E., et al. Microfluidic sorting and multimodal typing of cancer cells in self-assembled magnetic arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A. 107 (33), 14524-14529 (2010).
  5. Guzera, M., Cian, F., Leo, C., Winnicka, A., Archer, J. The use of flow cytometry for immunophenotyping lymphoproliferative disorders in cats: a retrospective study of 19 cases. Veterinary and Comparative Oncology. 14, 40-51 (2016).
  6. Young, N. A., Al-Saleem, T. I., Ehya, H., Smith, M. R. Utilization of fine-needle aspiration cytology and flow cytometry in the diagnosis and subclassification of primary and recurrent lymphoma. Cancer. 40 (4), 307-319 (1998).
  7. Carroll, C. S. E., Altin, J. G., Neeman, T., Fahrer, A. M. Repeated fine-needle aspiration of solid tumours in mice allows the identification of multiple infiltrating immune cell types. Journal of Immunological Methods. 425, 102-107 (2015).
  8. Araujo, R. W., Paiva, V., Gartner, F., Amendoeira, I., Martinez Oliveira, J., Schmitt, F. C. Fine needle aspiration as a tool to establish primary human breast cancer cultures in vitro. Acta Cytologica. 43 (6), 985-990 (1999).
  9. Craft, I., et al. Percutaneous epididymal sperm aspiration and intracytoplasmic sperm injection in the management of infertility due to obstructive azoospermia. Fertility and Sterility. 63 (5), 1038-1042 (1995).
  10. Powers, C. N. Diagnosis of infectious diseases: A cytopathologist’s perspective. Clinical Microbiology Reviews. 120 (3), 351-367 (1998).
  11. Diamantis, A., Magiorkinis, E., Koutselini, H. Fine-needle aspiration (FNA) biopsy: Historical aspects. Folia Histochemica et Cytobiologica. 47 (2), 191-197 (2009).
  12. Greig, E. D. W., Gray, A. C. H. Note on the lymphatic glands in sleeping sickness. British Medical Journal. 1 (2265), 1252(1904).
  13. Robson, J., Ashkar, T. S. Trypanosomiasis in domestic livestock in the Lambwe Valley area and a field evaluation of various diagnostic techniques. Bulletin of the World Health Organization. 47 (6), 727-734 (1972).
  14. Disease, T. African Animal Trypanosomiasis. In Vitro. , 1-15 (2009).
  15. Kennedy, P. G. E. Clinical features, diagnosis, and treatment of human African trypanosomiasis (sleeping sickness). Lancet Neurology. 12 (2), 186-194 (2012).
  16. Trindade, S., et al. Trypanosoma brucei parasites occupy and functionally adapt to the adipose tissue in mice. Cell Host and Microbe. 19 (6), 837-848 (2016).
  17. Carvalho, T., Trindade, S., Pimenta, S., Santos, A. B., Rijo-Ferreira, F., Figueiredo, L. M. Trypanosoma bruceitriggers a marked immune response in male reproductive organs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (8), 1-15 (2018).
  18. Sundberg, R. D., Hodgson, R. E. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4 (5), 557-561 (2013).
  19. Sottnik, J. L., Guth, A. M., Mitchell, L. A., Dow, S. W. Minimally invasive assessment of tumor angiogenesis by fine needle aspiration and flow cytometry. Angiogenesis. 13 (3), 251-258 (2010).
  20. Betka, J., Hovorka, O., Boucek, J., Ulbrich, K., Etrych, T., Rihova, B. Fine needle aspiration biopsy proves increased T-lymphocyte proliferation in tumor and decreased metastatic infiltration after treatment with doxorubicin bound to PHPMA copolymer carrier. Journal of Drug Targeting. 21 (7), 648-661 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Procedura cytologicznabarwienie rozmaz wbarwienie metod Giemsyimmunocytochemiacytometria przep ywowamikroskopia elektronowabiologia molekularnatesty in vitro

Powiązane artykuły