Artykuł metodologiczny

Metoda przesiewowa pojedynczych komórek w celu selekcji i odzyskiwania przeciwciał o pożądanej swoistości ze wzbogaconych populacji komórek B ludzkiej pamięci

DOI:

10.3791/59809

⸱

22 sierpnia 2019

 ,  ,  ,  , 
1World Without Disease Accelerator, Janssen Pharmaceutical Companies of Johnson and Johnson, 2Janssen Prevention Center, Janssen Pharmaceutical Companies of Johnson and Johnson

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda BSelex do identyfikacji i odzyskiwania pojedynczych przeciwciał specyficznych dla antygenu z komórek jednojądrzastych ludzkiej krwi obwodowej łączy cytometrię przepływową z PCR pojedynczych komórek i klonowaniem.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Repertuar ludzkich przeciwciał stanowi w dużej mierze niewykorzystane źródło potencjalnych przeciwciał terapeutycznych i użytecznych biomarkerów. Podczas gdy obecne metody obliczeniowe, takie jak sekwencjonowanie nowej generacji (NGS), dostarczają ogromnych zestawów danych na temat repertuaru przeciwciał na poziomie sekwencji, dane funkcjonalne są wymagane do określenia, które sekwencje są istotne dla określonego antygenu lub zestawu antygenów. W tym miejscu opisujemy metodę identyfikacji i odzyskiwania pojedynczych przeciwciał specyficznych dla antygenu z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) od ludzkiego dawcy krwi. Metoda ta wykorzystuje wstępne wzbogacenie dojrzałych komórek B i wymaga połączenia fenotypowych markerów komórkowych i białka znakowanego fluorescencyjnie w celu wyizolowania komórek B pamięci IgG za pomocą cytometrii przepływowej. Regiony zmiennych łańcucha ciężkiego i lekkiego są następnie klonowane i ponownie sprawdzane. Chociaż metoda ta jest ograniczona do przedziału komórek B pamięci, wykorzystuje cytometrię przepływową do badania milionów komórek B i zwraca sparowane sekwencje łańcuchów ciężkich i lekkich z pojedynczej komórki w formacie gotowym do ekspresji i potwierdzenia swoistości. Przeciwciała odzyskane tą metodą mogą być brane pod uwagę pod kątem potencjału terapeutycznego, ale mogą również łączyć swoistość i funkcję z podejściami bioinformatycznymi do oceny repertuaru limfocytów B u osób.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeciwciała to rosnąca klasa cząsteczek terapeutycznych, a istniejący repertuar limfocytów B u każdego człowieka jest potencjalnym źródłem takich przeciwciał. Po odzyskaniu od ludzkiego dawcy nie wymagają adaptacji ani "humanizacji", czyli etapów, które są wymagane w przypadku przeciwciał wytwarzanych w innych układach zwierzęcych. Istnieje kilka metod identyfikacji i izolacji ludzkich przeciwciał, w tym aktywacja i proliferacja komórek B1, unieśmiertelnienie poprzez transformację EBV2,3, oraz generowanie linii komórkowych hybrydoma4,5. Jednak wszystkie te metody wymagają rozległej hodowli komórkowej w celu przeprowadzenia badań przesiewowych i odzyskania przeciwciał specyficznych dla antygenu. Informacje na temat repertuaru ludzkich przeciwciał zostały znacznie rozszerzone wraz z opracowaniem technologii sekwencjonowania nowej generacji (NGS), co pozwala na identyfikację ogromnych ilości pojedynczych sekwencji obecnych w próbkach dawców. Ponieważ jednak NGS daje agnostyczny pogląd na wszystkie obecne sekwencje, nie pozwala na identyfikację i izolację przeciwciał specyficznych dla antygenu, szczególnie w przypadku przeciwciał rzadkich lub o niskiej częstotliwości.

Celem metody "BSelex" jest identyfikacja przeciwciał specyficznych dla antygenu z krążących komórek jednojądrzastych krwi obwodowej u ludzkich dawców oraz wyizolowanie i odzyskanie sekwencji tych przeciwciał do dalszej analizy. Metoda ta wykorzystuje cytometrię przepływową i sortowanie komórek, aby wykorzystać receptor komórek B (BCR) wyrażony na powierzchni komórek B pamięci. Miliony limfocytów B można przebadać pod kątem swoistości antygenowej za pomocą cytometrii przepływowej, zanim zostaną zainicjowane bardziej niskoprzepustowe metody biologii molekularnej. Identyfikacja sparowanych łańcuchów ciężkich i lekkich nie jest możliwa w większości metod NGS, które analizują sekwencje komórek masowo. W opisywanej przez nas metodzie komórki są izolowane pojedynczo i możliwe jest sparowane odzyskiwanie zarówno ciężkich, jak i lekkich sekwencji łańcuchowych, co umożliwia bezpośrednie klonowanie i ekspresję pełnej IgG.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użycie próbek od ochotników przebiegało zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Institutional Review Board Instytutu Badawczego Scripps. Przed oddaniem krwi uzyskano świadomą zgodę od dawców.

1. Przygotowanie odczynnika

  1. Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC)
    1. Odzyskaj komórki jednojądrzaste krwi obwodowej od normalnych ludzkich dawców za pomocą izolacji Ficoll-Plaque Plus. Kriokonserwacja w ilości 50 milionów komórek/ml w 90% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 10% dimetylosulfotlenku (DMSO). Zamrozić komórki w temperaturze -80 °C i przenieść do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.
  2. Znakowanie docelowych peptydów antygenowych do sortowania
    1. Wytworzyć lub otrzymać peptydy specyficzne dla białka docelowego (o długości do 70 reszt) za pomocą końcowej biotyny.
    2. Oznaczyć 4 nmol każdego pojedynczego biotynylowanego peptydu streptawidyną kowalencyjnie przyłączoną do PE (R-fikoerytryny) lub APC (allofikocyjaniny) w oddzielnych probówkach. Przygotować przy użyciu stosunku molowego peptydu 9:1 do streptawidyny (SA), o końcowym stężeniu około 3,2 μM dla SA-PE i 5,7 μM SA-APC. Przygotuj tetramery biotyny jako kontrolę negatywną.
    3. Każdą mieszaninę peptydów inkubować przez noc, w ciemności, w temperaturze 4 °C, powoli mieszając.
    4. Usunąć niezwiązany fluorofor, przepuszczając znakowane peptydy przez mikrokolumny zawierające kulki poliakrylamidowe.
    5. Tetramery peptydowe należy przechowywać do 2 miesięcy w temperaturze 4 °C.

2. Sortowanie komórek

  1. Co najmniej 1 h do 16 h przed izolacją CD22+ rozmrozić PBMC dawcy i pozostawić do odpoczynku w temperaturze 37 °C.
    1. Wyjąć fiolki z zamrożonymi PBMC z zamrażarki i natychmiast przenieść do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Gdy fiolki są już prawie rozmrożone, przenieść do obszaru roboczego.
    2. Przenieść zawartość każdej fiolki do probówki o pojemności 50 ml zawierającej wstępnie podgrzane podłoże (trzymając dawców oddzielnie). Dodaj pożywkę do końcowej objętości 50 ml. Delikatnie wymieszaj zawartość.
    3. Wirować przy 370 x g przez 6 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w 15 ml kompletnej pożywki RPMI i przeprowadzić liczenie komórek.
    4. Dostosować stężenie komórek do 2,0 x 107 komórek/ml za pomocą kompletnej pożywki RPMI, przenieść komórki do kolby T75 lub większej i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę i do 16 godzin, aby umożliwić czas regeneracji rozmrożonych komórek.
    5. Zebrać komórki (w razie potrzeby połączyć je w kopulację) i odwirować przy 370 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml lodowatego buforu MACS (PBS, pH 7,6 zawierającego 0,5% BSA i 2 mM EDTA), doprowadzić do 50 ml za pomocą buforu MACS i przeprowadzić zliczanie komórek.
    6. Odwirować komórki przy 400 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Wyizoluj komórki B CD22 + przez pozytywną selekcję poprzez wychwytywanie na mikrogranulkach CD22. Użyj bufora MACS do wszystkich prań. Odliczyć i odwirować 400 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C. Oczekiwany powrót do zdrowia wynosi 5-10% całej populacji PBMC.
    8. Ponownie zawiesić komórki w ilości 40 milionów na ml buforu FACS (bufor Tris, pH 8,0 zawierający 0,5% BSA i 2 mM EDTA) i przystąpić do barwienia komórek dawców pojedynczo lub jako puli.
  2. Komórki barwiące do sortowania komórek B pamięci
    1. Usunąć podwielokrotność komórek do ustawienia cytometru i kompensacji dla każdego z użytych fluoroforów znakujących. Uwzględnij niebarwione komórki jako kontrolkę.
    2. Obliczyć końcową objętość barwienia dla liczby otrzymanych komórek CD22+ (barwienie 2 miliony na 100 μl).
    3. Dodaj markery zewnątrzkomórkowe dla komórek B (CD19-PerCP-Cy5.5), IgG (IgG-FITC) i komory pamięci (CD27-PECy7) zgodnie z zaleceniami producentów dotyczącymi rozcieńczania i delikatnie wymieszaj. Podaniec10-7 komórek do probówki o pojemności 1,5 ml w celu kontroli ujemnej, a pozostałe komórki przenieść do probówki o pojemności 15 ml.
    4. Dodać podwójnie znakowane tetramery biotyny-SA do probówki kontroli ujemnej o końcowym stężeniu 36 nM każdy dla PE i APC pomnożonym przez liczbę peptydów w probówce sortującej i doprowadzić objętość do 0,5 ml końcowego za pomocą buforu FACS (np. 10 peptydów x 36 nM = 360 nM).
    5. Dodać tetramery peptydowe do probówki sortującej o długości 36 nM każdy dla PE i APC i doprowadzić komórki do 2x106 na 100 μl za pomocą buforu TBS. Inkubować w temperaturze 4 °C w ciemności, delikatnie obracając przez 30-60 min.
    6. Prać 2x w 4 °C, 400 x g, 7 min, usuwając podwielokrotność do policzenia przed ostatnim praniem. Filtruj komórki za pomocą probówek z nasadką filtracyjną o pojemności 5 ml. Dodać barwienie DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindole) do końcowego stężenia 0,3 μM tuż przed sortowaniem jako marker integralności błony komórkowej.
  3. Sortowanie pojedynczych komórek za pomocą cytometrii przepływowej
    1. Przygotuj 48 dołków z 96-dołkowymi płytkami PCR do sortowania.
      1. Przygotować mieszankę wzorcową: (2 μl 10x buforu RT, 0,5 μl inhibitora RNazy, 7,5 μl sterylnej wody klasy PCR) na próbkę. Podwielokrotność 10 μl na studzienkę, przykryć i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do sortowania.
    2. Uruchom kontrolę ujemną w sortowniku komórek, analizując całą próbkę.
      1. Ustaw bramki cytometrii przepływowej, aby wyizolować odpowiednie populacje komórek do sortowania pojedynczych komórek.
        1. Wykreślić obszar FSC w stosunku do obszaru SSC i ustawić bramkę R1 w celu wyizolowania limfocytów.
        2. Wykreśl wysokość FSC w funkcji szerokości FSC i ustaw bramkę R3 tak, aby wykluczyć dublety FSC.
        3. Wykreśl wysokość SSC w funkcji szerokości SSC i ustaw bramkę R4 tak, aby wykluczyć dublety SSC.
        4. Wykreśl wysokość SSC w funkcji DAPI i ustaw bramkę R5 do izolowania żywych komórek (DAPI-).
        5. Wykreśl IgG vs CD19 i ustaw bramkę R6, aby wyizolować limfocyty IgG + B (CD19 + IgG +).
        6. Wykreśl IgG w porównaniu z CD27 i ustaw bramkę R7, aby wybrać komórki B pamięci (CD27 wysoki).
        7. Wykreśl antygen-PE (Ag-PE) vs antygen-APC (Ag-APC) i ustaw bramkę R8 jako kwadrant Ag-PE+/Ag-APC+ z małą liczbą zdarzeń w bramce podwójnie dodatniej.
    3. Zebrać równą liczbę komórek pamięci z próbki dodatniej pod względem antygenu (Ag+) w celu określenia sygnału do szumu.
    4. Sortuj pojedyncze komórki o fenotypie CD19 + CD27 + Ag-PE + Ag-APC + (bramka R8) na przygotowane 96-dołkowe płytki PCR.
    5. Przykryj płytki aluminiowymi podkładkami z taśmy, wiruj przez 1 minutę przy 400 x g i przechowuj w temperaturze -80 °C do przyszłego klonowania.

3. Klonowanie pojedynczych komórek

  1. Reakcje odwrotnej transkrypcji
    1. Wyjąć pojedynczą płytkę do sortowania komórek B z temperatury 80 °C. Rozmrażać na lodzie przez 2 minuty. Obracać płytkę przez 2 minuty w temperaturze 3 300 x g, aby zawartość zebrała się na dnie studzienek przed otwarciem.
    2. Przygotować główną mieszankę dNTP/bufor z 10% detergentem niejonowym i oligo(dT) jako podkładem odwrotnym. Dodaj mieszankę enzymów do każdej studzienki zawierającej pojedynczą komórkę i NIE MIX.
    3. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 65 °C. Dodać główną mieszaninę enzymów zawierającą 100 mM DTT, inhibitor RNazy i enzym odwrotnej transkryptazy, aby uzyskać całkowitą objętość do 20 μl. Inkubować 10 minut w temperaturze 50 °C, a następnie 10 minut w temperaturze 80 °C.
    4. Przenieś do lodu przed rozpoczęciem etapów PCR
  2. Wieloetapowe zagnieżdżone reakcje PCR
    1. Użyj oddzielnych zagnieżdżonych reakcji PCR, które są używane do amplifikacji łańcuchów ciężkich (HC) i łańcuchów lekkich (LC).
    2. W pierwszej rundzie amplifikacji PCR (etap I) użyj puli starterów do przodu i pojedynczego startera odwrotnego, aby amplifikować zmienne regiony HC i LC w oddzielnych reakcjach PCR (Figura 2). Z założenia pula starterów do przodu będzie wzmacniać duży procent sekwencji lidera linii zarodkowej (L), a starter odwrotny jest specyficzny dla dalszych regionów stałych każdego łańcucha, w tym zarówno kappa (κ), jak i lambda (λ) dla łańcuchów lekkich16.
      1. Użyj 2,5 μl produktu cDNA jako matrycy dla każdej reakcji PCR (Krok I). Dodać startery do końcowego stężenia reakcji wynoszącego 1 μM dla każdego. Podwojenie 10-krotnego buforu polimerazy do 2-krotnego stężenia, doprowadzenie końcowej objętości do 25 μl na reakcję. Przeprowadzić reakcje HC PCR przy użyciu [94 °C/4 min; 94 °C /15 s, 55 °C /20 s, 68 °C/60 s; 68 °C/3 min] przez 50 cykli. Uruchom reakcje LC PCR przy użyciu [98 °C/4 min; 98 °C /15 s, 72 °C /20 s, 72 °C/60 s; 72 °C/3 min] przez 50 cykli.
    3. Użyć 2,5 μl produktu z etapu I jako próbki dla każdej (etapu II) reakcji PCR. Dodać pulę starterów do przodu specyficznych dla regionu 1 struktury HC i LC (κ i λ) oraz pulę starterów odwrotnych specyficznych dla regionu połączenia każdego łańcucha przeciwciał. Podwojenie 10-krotnego stężenia buforu polimerazy do 2x i przeprowadzenie reakcji PCR po 50 cykli każdy, przy użyciu tych samych parametrów, co w Kroku I.
    4. Uruchom zakończone reakcje PCR na 1% żelu agarozowym, aby zwizualizować pozytywne trafienia amplifikacji. Odzyskaj sparowane amplikony (zarówno ciężkie, jak i lekkie łańcuchy z tej samej komórki) i wyizoluj przez ekstrakcję żelu. Określ stężenie fragmentu DNA za pomocą OD260, aby uzyskać dokładne obliczenia mieszanki ligacyjnej.
    5. Połącz odzyskane ciężkie i lekkie fragmenty łańcucha z fragmentem łącznika i szkieletem wektora ekspresji za pomocą reakcji ligacji 4-fragmentowej przy użyciu komercyjnego zestawu.
    6. Przekształć reakcje ligacji w chemicznie kompetentne bakterie za pomocą komercyjnego zestawu. Po umieszczeniu na płytkach z antybiotykiem dodać 4 ml pożywki wzrostowej (z antybiotykiem) do pozostałej kultury transformacyjnej i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc przy 250 obr./min. To jest "kultura mieszanki ligacji".
    7. Przygotuj miniprep DNA z kultur mieszankowych ligacji przez noc za pomocą komercyjnego zestawu i określ wynikowe stężenie plazmidowego DNA.

4. Test ELISA w celu potwierdzenia swoistości antygenu

  1. Transfekcję 10 μg miniprepu DNA za pomocą kationowego odczynnika na bazie lipidów w 10 ml zawiesiny 293 komórek i inkubować przez 3-4 dni w temperaturze 37 °C (8% CO2 ) obracając się z prędkością 125 obr./min. W przypadku zbiorów odwirować kulturę przez 10 minut przy 1 000 x g i odzyskać sklarowane podłoża.
    1. Zmierzyć stężenie IgG w supernatantach poprzez powinowactwo do białka A.
    2. Zbadać każdą IgG (w supernatancie) w stężeniu 20 μg/ml za pomocą testu adsorpcyjnego sprzężonego z enzymem (ELISA) w stosunku do poszczególnych peptydów użytych do sortowania, wychwyconych na płytce streptawidyny lub aktyny jako kontroli ujemnej. Użyj koziego przeciwciała drugorzędowego przeciwko ludzkiej peroksydazie przeciwko ludzkiej IgG Fab, aby wykryć rekombinowane klony. Po odjęciu tła, OD > 0,5 jest definiowany jako dodatni ekran.
    3. Potwierdzić dodatnie wyniki badania, wykonując dodatkowy test ELISA, używając rozcieńczeń supernatantu IgG w celu wygenerowania krzywej stężeń rozpoczynającej się od 20 μg na ml i wykreślając względem OD dla każdego antygenu wykazującego reaktywność w początkowym badaniu przesiewowym ELISA.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda obejmuje wieloetapowy proces izolowania przeciwciał specyficznych dla antygenu od ludzkich dawców. W reprezentatywnych danych pokazanych tutaj, komórki inkubowano z pulą znakowanych fluorescencyjnie peptydów reprezentujących kilka różnych domen białka tau, w tym fosforylowanych peptydów w celu naśladowania przypuszczalnych miejsc fosforylacji. Peptydy te zostały użyte jako "przynęta" do identyfikacji komórek, które reagują z epitopami tau będącymi przedmiotem zainteresowania. Przygotowując się do sortowania, wykorzystano panel znakowanych fluorescencyjnie markerów fenotypowych do identyfikacji różnych populacji komórek w obrębie wzbogaconej populacji komórek B. Opracowano szereg bramek cytometrycznych w celu wyizolowania docelowych komórek B pamięci (Rysunek 1). Limfocyty wyizolowano na podstawie ich wielkości i ziarnistości komórek przy użyciu wykresów rozpraszania do przodu (FSC) i rozpraszania bocznego (SSC) w cytometrii przepływowej6,7. Po wykluczeniu wielu komórek ("dubletów") i martwych komórek, markery fenotypowe umożliwiły segregację komórek B pamięci IgG + przez IgG, CD19 (komórka B) i CD27 (pamięć). W tym podejściu marker CD27 nie rozprowadza się na dwie odrębne populacje, więc 45% górnych komórek eksprymujących CD27 + jest uwzględnianych w końcowej bramce. Wreszcie, komórki podwójnie dodatnie zarówno dla fluoroforów APC, jak i PE rozprowadzają się w prawym górnym kwadrancie wykresu bramkowania, wskazując na reaktywność na obie znakowane wersje peptydów. Komórki, które wpadły w obrębie wyciągniętej bramy, zostały odizolowane i posortowane do indywidualnych studzienek na 96-dołkowej płytce. Zastosowanie antygenu z dwoma różnymi znacznikami zwiększa stosunek sygnału do szumu i zmniejsza liczbę wyników fałszywie dodatnich w późniejszym procesie biologii molekularnej. Posortowane komórki reprezentowały około 0,1% komórek B pamięci w końcowej bramce i 0,001% początkowej próbki komórki.

Pierwszy odczyt klonowania pojedynczej komórki jest potwierdzeniem amplifikacji odpowiednich łańcuchów zmiennych ciężkich i lekkich (Rysunek 2). Ponieważ pożądane jest sparowane odzyskiwanie obu amplikonów, reakcje PCR są oceniane obok siebie w żelu agarozowym, a dopasowane pary są wycinane z żelu i ekstrahowane fragmenty DNA. Typowa skuteczność wzmocnienia to 30-50% łańcucha ciężkiego i 50-70% łańcucha lekkiego (kappa). Odzysk sparowanych amplikonów wynosi zwykle od 25 do 40% wydajności. Wydajność ta różni się w zależności od puli dawców, a reprezentatywne dane (Rysunek 3) są przykładem bardzo wydajnej amplifikacji z 24 pojedynczych komórek (42% odzysku sparów). Po klonowaniu IgG wektor ekspresji IgG jest transfekowany do ludzkich embrionalnych komórek zawiesinowych nerki (HEK-293), które są wykorzystywane do maksymalizacji ekspresji. Zastosowanie pożywki bez surowicy zmniejsza ilość zanieczyszczających białek z preparatu przeciwciał rekombinowanych i pomaga zminimalizować szum w kolejnych testach wiązania. Odzyskane przeciwciała są badane pod kątem oryginalnego panelu peptydów tau i oceniane pod kątem reaktywności za pomocą testu ELISA (Figura 4). Początkowy próg OD = 0,5 powyżej tła służy do wskazania dodatniej reaktywności antygenu, a białko β-aktyny służy jako kontrola niespecyficznego wiązania. Jeśli etapy cytometrii przepływowej i sortowania wykorzystują mieszaną pulę peptydów, przesiewowy test ELISA jest pierwszym krokiem dekonwolucji specyficznych reaktywności odzyskanych IgG. Trzy z 10 badanych IgG wykazały reaktywność przeciwko fosforylowanemu peptydowi CBTAU22.1, a jeden był reaktywny na nieufosforylowany CBTAU27.1 (Figura 4A). Dodatkowe potwierdzenie uzyskano przy użyciu krzywej stężenia tych samych rekombinowanych próbek przeciwciał przeciwko peptydom zidentyfikowanym we wstępnym badaniu przesiewowym oraz dodatkowemu peptydowi jako kontroli ujemnej (Figura 4B). Dla każdego dodatniego trafienia pojedynczy klon plazmidu został wyizolowany z przekształconej puli i ponownie potwierdzony tą samą metodą ELISA. Tylko klon 34 jest pokazany w prezentowanych danych i chociaż potwierdzono reaktywność na niefosforylowane CBTAU27.1, zaobserwowano również mniejsze wiązanie powinowactwa z fosforylowanym peptydem 27.1 (Figura 4C).

figure-results-1
Rysunek 1: Izolacja pojedynczych komórek reagujących na antygen za pomocą cytometrii przepływowej. (A) Pokazano reprezentatywną powierzchnię, na której populacja limfocytów znajdowała się w obrębie narysowanej bramy. (B) Bramki oparte na rozrzucie przednim i bocznym (wysokość FSC v szerokość FSC (R3); SSC- wysokość v SSC- szerokość(R4)) użyto do wykluczenia dubletów. Na kolejnych wykresach oceniano tylko komórki w obrębie narysowanych bramek. Komórki DAPI+ uznano za martwe i wykluczone (R5). W tym eksperymencie przebadano 3,7 x 107 "żywych" komórek. Większość żywych komórek stanowiły limfocyty B (CD19+), a z tej populacji wyizolowano komórki IgG+ (4,66%) (R6). Górne 43,2% komórek pamięci wyrażających CD27 + zostało włączonych do bramki selekcyjnej (R7). (C) Kwadrant 2 (Q2) zawierał komórki reaktywne na oba znakowane antygeny (peptyd-APC v peptyd-PE), a komórki te zostały posortowane i odzyskane pojedynczo na 96-dołkową płytkę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Amplifikacja PCR odzyskuje ciężką i lekką sekwencję zmiennych IgG do klonowania. (A) Zarówno ciężkie (VH), jak i lekkie (Vk lub Vl) regiony zmienne łańcuchowe są odzyskiwane za pomocą zagnieżdżonych reakcji PCR. Startery kroku I wzmacniają się do przodu od natywnej sekwencji lidera i do tyłu z obszaru stałego. Wiele strzałek reprezentuje pulę od 7 do 12 starterów, które są używane w celu zapewnienia szerokiego pokrycia możliwych linii zarodkowych. Startery kroku II są zagnieżdżone, specyficzne dla skrajnych końców zmiennej otwartej ramki odczytu, i dodają sekwencję do końców amplikonów, które są homologiczne do sąsiedniej sekwencji w wektorze wyrażenia. (B) Łącznik składa się ze stałego łańcucha lekkiego (Ck lub Cl), po którym następuje promotor łańcucha ciężkiego i nienatywna sekwencja peptydów sygnałowych. Amplikony, łącznik i szkielet plazmidu są jednocześnie ligowane za pomocą nakładającej się sekwencji homologicznej generowanej podczas amplifikacji PCR etapu II i izolowane jako nienaruszony plazmid. Rekombinowane łańcuchy ciężkie i lekkie w końcowym wektorze ekspresji są napędzane przez niezależne (i identyczne) promotory CMV i ulegają translacji jako oddzielne białka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Ciężkie i lekkie amplikony o zmiennym łańcuchu IgG są odzyskiwane z pojedynczych komórek. Zagnieżdżone reakcje PCR (etap II) zostały bezpośrednio załadowane do 1% żelu agarozowego i zobrazowane. Reakcje PCR o ciężkim łańcuchu (H) i lekkim łańcuchu kappa (L) z tej samej komórki załadowano do sąsiednich studzienek, dzięki czemu łatwo było zaobserwować sparowane amplikony. Udane produkty o ciężkim i lekkim łańcuchu to odpowiednio około 400 i 350 punktów bazowych. Pomyślne odzyskanie sparowanych amplikonów są oznaczone symbolem (*). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Specyficzność antygenu została potwierdzona na podstawie rekombinowanych IgG. Plazmidy zawierające odzyskane sekwencje łańcuchów ciężkich i lekkich są transfekowane do komórek HEK w celu ekspresji. Po czterech dniach rekombinowane przeciwciała są oceniane pod kątem reaktywności za pomocą testu ELISA. (A) Zmierzono stężenie IgG w oczyszczonych pożywkach i rozcieńczono do 20 μg/ml. Pula peptydów użytych do sortowania została indywidualnie oceniona przy użyciu 40 pmol na studzienkę na płytkach streptawidyny. Wszystkie IgG przebadano w zduplikowanych studzienkach. (B) Klony, które wykazywały pomiar OD450 >0,5, zostały ponownie ocenione (Klony #32, #34, #35) przy użyciu kroków rozcieńczania 1:5 w stosunku do peptydów zidentyfikowanych na ekranie. (C) Po potwierdzeniu jako trafienie, pojedynczy klon plazmidu został wyizolowany z ligacji przekształconych klonu #34, transfekowany i ponownie potwierdzony przez ELISA. To samo zrobiono dla klonów #32 i #35 (dane nie pokazane). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tutaj metoda łączy cytometrię przepływową i klonowanie pojedynczych komórek, a metody, które tutaj opisujemy, oparliśmy na metodach opracowanych wcześniej przez Tillera i współpracowników11. Ich praca opisuje odzyskiwanie i klonowanie przeciwciał monoklonalnych w celu zbadania repertuaru limfocytów B u ludzi na poziomie pojedynczych komórek. Dostosowaliśmy główne elementy ich procesu, aby umożliwić odzyskanie przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla antygenu z populacji komórek B pamięci, w tym wieloetapową strategię startera amplifikacji. Główną modyfikacją jest dodanie znakowanej "przynęty" antygenowej. Do opublikowanego protokołu wprowadzono dodatkowe adaptacje, w tym (ale nie wyłącznie) modyfikację szkieletu wektora klonowania w plazmid o pojedynczej ekspresji, dodatkowe pokrycie starterem repertuaru linii zarodkowej (zarówno sekwencja liderowa, jak i szkielet 1), transfekcja zawiesiny komórek HEK293 w celu uzyskania wyższej ekspresji oraz zastosowanie polimeraz o wysokiej wierności podczas amplifikacji PCR.

W przypadku opisanych tutaj metod najbardziej krytyczne etapy znajdują się w pobliżu przejścia między cytometrią przepływową a klonowaniem pojedynczych komórek. Po pierwsze, niezbędne jest właściwe umieszczenie posortowanych pojedynczych komórek na płytce. Prawidłowe ustawienie opóźnienia upuszczania w sortowniku jest kluczowym krokiem. Należy również wziąć pod uwagę czynniki środowiskowe, takie jak niska wilgotność, ponieważ stwierdziliśmy, że nasza wydajność odzyskiwania znacznie spada, chyba że na płytach sortowania docelowego używa się pistoletu statycznego. Po umieszczeniu komórek płytki są odwirowywane, aby upewnić się, że komórki zetknęły się z 10 μl buforu na dnie studzienek. Wszystkie te środki mają kluczowe znaczenie dla powodzenia części biologii molekularnej. Jeśli warunki są nieoptymalne dla reakcji odwrotnej transkrypcji pojedynczej komórki, amplifikacja PCR nawet β-aktyny może być trudna. Mocną stroną przedstawionej metody jest możliwość przesłuchiwania milionów komórek i sortowania tylko tych, które spełniają kryteria reaktywności antygenu w stosunku do wybranego antygenu. Wymaga to, aby stosunek sygnału do szumu był jak najwyższy, co odbywa się poprzez optymalizację stężeń przynęty przed sortowaniem. Podwójnie znakowana przynęta służy do zmniejszenia odzysku komórek fałszywie dodatnich, co może wystąpić, jeśli jeden z fluoroforów ma wysokie tło. Użycie więcej niż jednej przynęty antygenowej może utrudnić optymalizację sygnału:szumu, ale możliwość jednoczesnego badania wielu peptydów jest kolejną zaletą tej metody.

Gdy wydajność odzyskiwania jest niska, stosuje się zestaw zagnieżdżonych starterów β-aktyny, aby potwierdzić, że matryca cDNA jest obecna. Wadą tego podejścia jest to, że trudno jest określić, czy w studzience nie było żadnej komórki, czy też reakcja odwrotnej transkrypcji nie powiodła się, co utrudnia rozwiązywanie problemów. Czasami zdarza się coś odwrotnego, a wydajność jest wyższa niż oczekiwano. Typowy odzysk dla łańcuchów ciężkich wynosi od 30 do 45%, a dla łańcuchów lekkich jest wyższy, od 40 do 60%. Każda reakcja PCR (etap I i II) wykorzystuje 50 cykli do amplifikacji z pojedynczej komórki. Duża liczba całkowitych cykli sprawia również, że metoda ta jest podatna na zanieczyszczenia. Analiza sekwencji amplikonów może być wykorzystana do określenia, czy wprowadzono zanieczyszczenie, czy też osiągnięto niezwykle wysoki wskaźnik odzysku.

Przydatność tej metody do odzyskiwania natywnych ludzkich przeciwciał przeciwko wybranemu antygenowi ma kilka istotnych ograniczeń. Po pierwsze, tylko rozpuszczalne białka, które można znakować, mogą być używane jako "przynęta" w cytometrii przepływowej. Do rodzajów przedstawionych w reprezentatywnych wynikach użyliśmy serii zsyntetyzowanych nakładających się peptydów z białka tau, ponieważ użycie całego białka okazało się trudne. Stosowanie peptydów liniowych prawdopodobnie nie jest optymalne, ponieważ może ograniczać identyfikację przeciwciał przeciwko epitopom nieliniowym lub strukturalnym. Udało nam się jednak zidentyfikować kilka unikalnych przeciwciał przeciwko tau, które są obecnie poddawane dalszej ocenie 8,9. Kolejnym ograniczeniem jest niska przepustowość odzyskiwania i klonowania IgG w ramach biologii molekularnej. Początkowa strategia sortowania pozwala na badania przesiewowe milionów komórek, ale późniejsze przetwarzanie biologii molekularnej składa się z wielu etapów. Ciągłe wysiłki optymalizacyjne mające na celu włączenie nowszych technologii, takich jak Gibson Assembly10, uprościły kilka kroków, ale wąskim gardłem pozostaje klonowanie poszczególnych par ciężkich i lekkich łańcuchów.

Metoda "BSelex" wykorzystuje BCR wyrażony na powierzchni komórek B pamięci w celu identyfikacji komórek, które wykazują reaktywność antygenu, a następnie odzyskania tych pojedynczych komórek za pomocą cytometrii przepływowej11,12. Ze względu na zależność od BCR, metoda jest ograniczona do przedziału komórek B pamięci i nie wychwytuje komórek wydzielających przeciwciała (ASC), takich jak plazmablasty. Jednak takie podejście może być korzystne dla odzyskania szerszego repertuaru immunoglobin specyficznych dla antygenu w porównaniu z ASC. Badania nad szczepieniami przeciw grypie pokazują, że podczas gdy reaktywne ASC mogą być zdominowane przez niewielką liczbę rozszerzonych klonów komórek B, populacja komórek B pamięci specyficzna dla antygenu rzadko jest klonalna12. Receptor limfocytów T (TCR) na powierzchni limfocytów T jest podobny do receptora komórek B pod względem ułożenia genów i rekombinacji w celu maksymalizacji różnorodności. Podejścia jednokomórkowe podobne do opisanych w przedstawionej tutaj metodzie zostały opracowane do oceny repertuaru limfocytów T, w tym odzyskiwania i klonowania pojedynczych komórek łańcuchów alfa i beta13. Jednak rozpoznanie TCR wymaga, aby peptydy były prezentowane przez cząsteczki MHC, co znacznie komplikuje podejście oparte na znakowanej przynętie w celu identyfikacji limfocytów T specyficznych dla peptydów. W przeciwieństwie do limfocytów B, limfocyty T nie przechodzą dojrzewania powinowactwa całego regionu zmiennego, więc identyfikacja krótkiego regionu CDR3 i pewnej sekwencji flankującej jest wszystkim, co jest potrzebne do identyfikacji i rekonstytucji. Wreszcie, metoda ta opisuje identyfikację cząsteczek IgG za pomocą cytometrii przepływowej, ale możliwe jest również użycie alternatywnych markerów fenotypowych do identyfikacji komórek B o różnych izotypach.

Obecnie opracowywane są metody łączące ogromną ilość danych zebranych z sekwencjonowania nowej generacji z funkcjonalną analizą swoistości antygenowej, ale metody te są nadal udoskonalane. Pomimo swoich ograniczeń, opisana tutaj metoda została wykorzystana do identyfikacji przeciwciał o potencjalnej wartości terapeutycznej zarówno w chorobach zakaźnych, jak i niezakaźnych 8,14,15 i stanowi wiarygodne podejście do odzyskiwania odpowiednich IgG specyficznych dla antygenu od ludzi, bez rozległej manipulacji limfocytami B lub rozległej hodowli komórkowej.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Lucy Chammas, Marcie Costa, Julie Kim, Nancy Heredii i Jeremy'emu Macedo za obszerne testowanie wielu modyfikacji metod i udoskonalanie obecnej platformy BSelex.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MoFlo Astrio EQ, Sorter komórek Sortowanie komórekMoFlo
Biotynylowane peptydyNowa Anglia PeptydSortowanie komórek "przynęta"
Kolumna żelowa Micro Bio-spin P30BioRad#7326223
Streptawidyna (R-PE)Thermo ScientificSA10041
Streptawidyna (APC)Thermo ScientificS32362
Mikrokulki CD22, ludzkie Miltenyi#130-046-401
Kolumny LSMiltenyi#130-042-401
Filtry wstępnej separacji Miltenyi#130-041-407
Mysz PerCp-Cy5.5 anty-ludzka CD19BD BiosciencesBD#340951
PE-Cy7 mysz anty-ludzka CD27 BD Biosciences#560609
Mysz FITC anty-ludzka IgGBD Biosciences#560952
DAPILife Technologies#D21490
RNaseOUTLife Technologies#10777-019
Albumina surowicy bydlęcej, Frakcja VSigma#A4503
Pożywka RPMIHyklon#SH30096.01
HI FBS (płodowa surowica bydlęca)Invitrogen#10082147
Mastercycler GradientEppendorfModel #6325Maszyna do PCR
PCR 96-dołkowe płytkiPhenixMPS-500
PCR Maty płytkowePhenixSMX-PCR96
Zaleta UltraPure PCR Deoxynucleotide MixClontech# 639125
Indeks górny IV System syntezy pierwszej niciInvitrogen#18091050
Phusion High Fidelity PolymeraseThermo ScientificF-531-L
Polimeraza platynowaInvitrogen#10966108
Woda wolna od nukleazQIAGEN#129114
Startery oligonukleotydoweIDTróżneStartery do wszystkich etapów PCR
Żel Zestaw do ekstrakcjiQIAGEN#28706
Zestaw do oczyszczania PCRQIAGEN#28106
Zestaw do minipreparacjiQIAGEN#27106
NEBuilder HiFi DNA Assembly Zestaw do klonowaniaNew England BiolabsE5520SMontaż Gibsona
Expi293 Expression MediaInvitrogen#A14351-01
ExpiFectamine 293 Zestaw do transfekcjiInvitrogen#A14525
Opti-MEM MediaInvitrogen#31985070
Inkubator CO2 (Multitron)
Octet  RED384 SystemPall / Forte Bio
Pierce Streptawidin Powlekane przezroczystą 96-dołkową płytką o wysokiej zdolności wiązaniaThermo Scientific#15500
Corning Costar 96-dołkowa płytka polistyrenowa o wysokim poziomie wiązania PółpowierzchniaCorning#3690
Kozie przeciwciało anty-ludzkie IgG FabLabs#109-036-097
Kozie przeciwciało wtórne HRP przeciwko myszomJackson Labs#115-035-072
SureBlueTM TMB Podłoże peroksydazy mikrodołkowej (1-składnikowe) KPL#52-00-03
Rozwiązanie zatrzymujące TMB KPL#50-85-06
Jackson

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Su, K. Y., Watanabe, A., Yeh, C. H., Kelsoe, G., Kuraoka, M. Efficient Culture of Human Naive and Memory B Cells for Use as APCs. Journal of Immunology. 197 (10), 4163-4176 (2016).
  2. Corti, D., Lanzavecchia, A. Broadly neutralizing antiviral antibodies. Annual Review of Immunology. 31, 705-742 (2013).
  3. Steinitz, M., Klein, G., Koskimies, S., Makel, O. EB virus-induced B lymphocyte cell lines producing specific antibody. Nature. 269 (5627), 420-422 (1977).
  4. Bloom, A. D., Nakamura, F. T. Establishment of a tetraploid, immunoglobulin-producing cell line from the hybridization of two human lymphocyte lines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (7), 2689-2692 (1974).
  5. Olsson, L., Kaplan, H. S. Human-human hybridomas producing monoclonal antibodies of predefined antigenic specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (9), 5429-5431 (1980).
  6. Lechner, J., et al. Alterations in Circulating Immune Cells in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. Scientific Reports. 5, 16754(2015).
  7. Loken, M. R., Brosnan, J. M., Bach, B. A., Ault, K. A. Establishing optimal lymphocyte gates for immunophenotyping by flow cytometry. Cytometry. 11 (4), 453-459 (1990).
  8. Pascual, G., et al. Immunological memory to hyperphosphorylated tau in asymptomatic individuals. Acta Neuropathologica. 133 (5), 767-783 (2017).
  9. van Ameijde, J., et al. Enhancement of therapeutic potential of a naturally occurring human antibody targeting a phosphorylated Ser(422) containing epitope on pathological tau. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 59(2018).
  10. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  11. Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. Journal of Immunological Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
  12. Wrammert, J., et al. Rapid cloning of high-affinity human monoclonal antibodies against influenza virus. Nature. 453 (7195), 667-671 (2008).
  13. Han, A., Glanville, J., Hansmann, L., Davis, M. M. Linking T-cell receptor sequence to functional phenotype at the single-cell level. Nature Biotechnology. 32 (7), 684-692 (2014).
  14. Apetri, A., et al. A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 43(2018).
  15. Jones, H. G., et al. Structural basis for recognition of the central conserved region of RSV G by neutralizing human antibodies. PLoS Pathogens. 14 (3), 1006935(2018).
  16. Janssen Vaccines & Prevention B.B. US patent. , U.S. Patent Application No. 20170210787, Published July 27, 2017 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wyb r przeciwciakom rki B pami cicytometria przep ywowaizolacja PBMCmarkery CD19 CD27klonowanie a cuch w ci kich i lekkichtestowanie swoisto ci metod ELISAsortowanie pojedynczych kom rekprodukcja przeciwcia rekombinowanych

Powiązane artykuły