Metoda lokalizacji immunofluorescencji in vivo (IVIL) może być użyta do badania in vivo biodystrybucji przeciwciał i koniugatów przeciwciał do celów onkologicznych w organizmach żywych przy użyciu kombinacji metod celowania w nowotwory in vivo i barwienia immunologicznego ex vivo.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Lokalizacja immunofluorescencji in vivo do oceny terapeutycznej i diagnostycznej biodystrybucji przeciwciał w badaniach nad rakiem
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przeciwciała monoklonalne (mAb) są ważnymi narzędziami w wykrywaniu, diagnozowaniu i leczeniu raka. Są one wykorzystywane do odkrywania roli białek w nowotworzeniu nowotworów, mogą być kierowane do biomarkerów nowotworowych umożliwiających wykrywanie i charakterystykę nowotworu oraz mogą być wykorzystywane w terapii nowotworów jako mAb lub koniugaty przeciwciało-lek w celu aktywacji komórek efektorowych układu odpornościowego, hamowania szlaków sygnałowych lub bezpośredniego zabijania komórek przenoszących specyficzny antygen. Pomimo postępów klinicznych w opracowywaniu i produkcji nowych i wysoce specyficznych przeciwciał monoklonalnych, zastosowania diagnostyczne i terapeutyczne mogą być osłabione przez złożoność i niejednorodność mikrośrodowiska guza. W związku z tym, dla opracowania skutecznych terapii i diagnostyki opartych na przeciwciałach, kluczowa jest ocena biodystrybucji i interakcji koniugatu opartego na przeciwciałach z żywym mikrośrodowiskiem guza. W tym miejscu opisujemy lokalizację immunofluorescencyjną in vivo (IVIL) jako nowe podejście do badania interakcji terapii i diagnostyki opartej na przeciwciałach w stanach fizjologicznych i patologicznych in vivo. W tej technice terapeutyczne lub diagnostyczne przeciwciało specyficzne dla antygenu jest wstrzykiwane dożylnie in vivo i lokalizowane ex vivo z przeciwciałem wtórnym w izolowanych guzach. IVIL odzwierciedla zatem biodystrybucję in vivo leków opartych na przeciwciałach i środków celujących. Opisano dwie aplikacje IVIL oceniające biodystrybucję i dostępność środków kontrastowych na bazie przeciwciał do obrazowania molekularnego raka piersi. Protokół ten pozwoli przyszłym użytkownikom dostosować metodę IVIL do własnych zastosowań badawczych opartych na przeciwciałach.
Wprowadzenie
Przeciwciała monoklonalne (mAb) to duże glikoproteiny (około 150 kDa) z nadrodziny immunoglobulin, które są wydzielane przez limfocyty B i pełnią podstawową funkcję w układzie odpornościowym do identyfikacji i albo hamowania funkcji biologicznej, albo oznaczania do zniszczenia, patogenów bakteryjnych lub wirusowych, i mogą rozpoznawać nieprawidłową ekspresję białka na komórkach rakowych1. Przeciwciała mogą mieć niezwykle wysokie powinowactwo do swoich specyficznych epitopów, aż do stężeń femtomolowych, co czyni je bardzo obiecującymi narzędziami w biomedycynie2. Wraz z opracowaniem technologii hybrydoma przez Milsteina i Köhlera (nagrodzonych Nagrodą Nobla w 1984 roku), produkcja mAb stała się możliwa3. Później ludzkie mAb zostały wygenerowane przy użyciu technologii wyświetlania fagów lub transgenicznych szczepów myszy i zrewolucjonizowały ich zastosowanie jako nowatorskich narzędzi badawczych i terapeutycznych4,5.
Rak jest ogólnoświatowym problemem zdrowotnym i główną przyczyną zgonów, co stwarza potrzebę nowatorskich podejść do zapobiegania, wykrywania i terapii6. Do tej pory przeciwciała monoklonalne pozwalały na wyjaśnienie roli genów i ich białek w procesie nowotworzenia, a gdy są skierowane przeciwko biomarkerom raka, mogą umożliwić wykrywanie i charakteryzowanie guza w celu stratyfikacji pacjentów. Do terapii przeciwnowotworowej opracowywane są bispecyficzne przeciwciała monoklonalne, koniugaty przeciwciało-lek i mniejsze fragmenty przeciwciał jako środki terapeutyczne, a także do celowanego dostarczania leków w celu zwiększenia skuteczności terapeutycznej7. Ponadto przeciwciała służą do celowania w biomarkery środków kontrastowych w modalnościach obrazowania molekularnego, takich jak chirurgia sterowana fluorescencją, obrazowanie fotoakustyczne (PA), obrazowanie molekularne ultrasonograficzne (US) oraz klinicznie stosowana pozytonowa tomografia emisyjna (PET) lub tomografia komputerowa z emisją pojedynczych fotonów (SPECT)8. Wreszcie, przeciwciała mogą być również stosowane jako środki teranostyczne umożliwiające stratyfikację pacjentów i monitorowanie odpowiedzi na terapie celowane9. Dlatego nowe przeciwciała monoklonalne zaczynają odgrywać kluczową rolę w wykrywaniu, diagnozowaniu i leczeniu raka.
Pomimo krytycznych postępów w rozwoju i produkcji nowych i wysoce specyficznych mAb, zastosowania diagnostyczne i terapeutyczne mogą okazać się nieskuteczne ze względu na złożoność środowiska nowotworowego. Interakcje przeciwciał są zależne od rodzaju epitopu, tj. od tego, czy jest on liniowy czy konformacyjny10. Oprócz rozpoznawania antygenów, przeciwciała muszą pokonać naturalne bariery, takie jak ściany naczyń, błony podstawne i zrąb guza, aby dotrzeć do komórek docelowych wyrażających antygen. Przeciwciała oddziałują z tkanką nie tylko poprzez domenę wiązania antygenu o zmiennym fragmencie (Fab), ale także poprzez stały fragment krystaliczny (Fc), co dalej prowadzi do interakcji poza miejscem11. Celowanie jest również skomplikowane ze względu na niejednorodną ekspresję markerów nowotworowych w całej masie guza oraz niejednorodność unaczynienia guza i układu limfatycznego12,13. Ponadto mikrośrodowisko guza składa się z fibroblastów związanych z rakiem, które wspierają komórki nowotworowe, komórek odpornościowych guza, które hamują przeciwnowotworowe reakcje immunologiczne, oraz śródbłonka guza, który wspomaga transport tlenu i składników odżywczych, z których wszystkie zakłócają penetrację, dystrybucję i dostępność terapii lub diagnostyki opartej na przeciwciałach. Ogólnie rzecz biorąc, rozważania te mogą ograniczać skuteczność terapeutyczną lub diagnostyczną, zmniejszać odpowiedź na leczenie i mogą skutkować opornością guza.
Dlatego, dla rozwoju skutecznych terapii i diagnostyki opartych na przeciwciałach, kluczowe jest oszacowanie biodystrybucji i interakcji koniugatu opartego na przeciwciałach w mikrośrodowisku guza. Obecnie, w badaniach przedklinicznych, ekspresja markerów w modelach badawczych nowotworów jest analizowana ex vivo za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego (IF) skrawków guza14. Standardowe barwienie IF przeprowadza się za pomocą pierwszorzędowych przeciwciał specyficznych dla markera, które są następnie podkreślane przez drugorzędowe przeciwciała znakowane fluorescencyjnie na wycinkach tkanki nowotworowej ex vivo, które zostały wyizolowane ze zwierzęcia. Technika ta podkreśla statyczne położenie markera w momencie utrwalenia tkanki i nie zapewnia wglądu w to, w jaki sposób terapie lub diagnostyka oparte na przeciwciałach mogą się rozprowadzać lub wchodzić w interakcje w warunkach fizjologicznych. Obrazowanie molekularne za pomocą PET, SPECT, US i PA może dostarczyć informacji na temat dystrybucji środka kontrastowego sprzężonego z przeciwciałami w żywych modelach przedklinicznych8,15. Ponieważ te metody obrazowania są nieinwazyjne, można przeprowadzać badania podłużne i gromadzić dane wrażliwe na czas przy minimalnej liczbie zwierząt w grupie. Jednak te nieinwazyjne podejścia do obrazowania molekularnego nie są wystarczająco czułe i nie mają wystarczającej rozdzielczości do lokalizacji dystrybucji przeciwciał na poziomie komórkowym. Dodatkowo, fizyczne i biologiczne cechy pierwszorzędowego przeciwciała mogą zostać drastycznie zmienione przez koniugację środka kontrastowego16.
Aby uwzględnić fizjologiczne i patologiczne warunki in vivo w jaki sposób terapie i diagnostyka oparte na przeciwciałach oddziałują w środowisku guza i uzyskać wysokorozdzielcze profile dystrybucji komórkowej, a nawet subkomórkowej przeciwciał niesprzężonych, proponujemy podejście IF, zwane In Vivo Immunofluorescence Localization (IVIL), w którym przeciwciało specyficzne dla antygenu jest wstrzykiwane dożylnie in vivo. Terapeutyczny lub diagnostyczny oparty na przeciwciałach, działający jako przeciwciało pierwszorzędowe, krąży w funkcjonalnych naczyniach krwionośnych i wiąże się z białkiem docelowym w bardzo dokładnym, żywym środowisku guza. Po wyizolowaniu guzów znakowanych in vivo z przeciwciałem pierwotnym, przeciwciało drugorzędowe stosuje się do lokalizacji nagromadzonych i zatrzymanych koniugatów przeciwciał. To podejście jest podobne do wcześniej opisanego podejścia histologicznego IF, polegającego na wstrzykiwaniu fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał17. Chociaż w tym przypadku zastosowanie przeciwciał niesprzężonych pozwala uniknąć potencjalnej zmiany charakterystyki biodystrybucji wywołanej modyfikacją przeciwciał. Ponadto zastosowanie ex vivo fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych pozwala uniknąć możliwej utraty sygnału fluorescencji podczas pobierania i przetwarzania tkanek oraz zapewnia wzmocnienie intensywności sygnału fluorescencji. Nasze podejście do znakowania odzwierciedla biodystrybucję in vivo leków opartych na przeciwciałach i środków celowanych i może dostarczyć ważnych informacji dla rozwoju nowych środków diagnostycznych i terapeutycznych.
Tutaj opisujemy dwa zastosowania metody IVIL stosowane w poprzednich badaniach badających biodystrybucję i dostępność środków kontrastowych na bazie przeciwciał do metod obrazowania molekularnego w wykrywaniu raka piersi. Po pierwsze, badana jest biodystrybucja koniugatu barwnika przeciwciało-bliska podczerwień (przeciwciało anty-B7-H3 związane z barwnikiem fluorescencyjnym bliskiej podczerwieni, zielenią indocyjaninową, B7-H3-ICG) i czynnikiem kontrolującym izotyp (Iso-ICG) do fluorescencji i fotoakustycznego obrazowania molekularnego18. Metoda tej aplikacji jest opisana w protokole. Następnie wyniki biodystrybucji konformacyjnie wrażliwego przeciwciała przeciwko netrynie-1, zwykle niewykrywalnego za pomocą tradycyjnego obrazowania IF, stosowanego w ultrasonograficznym obrazowaniu molekularnym, są określane ilościowo i prezentowane w reprezentatywnych wynikach19. Na zakończenie tego artykułu dotyczącego protokołu, czytelnicy powinni czuć się komfortowo, przyjmując metodę IVIL do własnych zastosowań badawczych opartych na przeciwciałach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Panel Administracyjny ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (APLAC) Uniwersytetu Stanforda.
1. Transgeniczny mysi model rozwoju raka piersi
- Przed kontynuowaniem obserwuj myszy z pożądanego modelu raka pod kątem odpowiedniego wzrostu guza za pomocą badania palpacyjnego lub pomiaru suwmiarką.
UWAGA: W tym przypadku zastosowano transgeniczny mysi model rozwoju raka piersi (FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT). U tych zwierząt spontanicznie rozwijają się inwazyjne raki piersi między 6 a 12 tygodniem życia w każdym gruczole sutkowym20. Normalne gruczoły sutkowe wykorzystano jako kontrolę od transgenicznie ujemnych, dopasowanych wiekowo rodzeństwa z miotu.
2. Dożylne wstrzyknięcie specyficznych i niespecyficznych przeciwciał
- Oczyść królicze przeciwciała kontrolne przeciwko myszemu B7-H3 i króliczemu izotypowi IgG na kolumnie odsalającej (np. PD-10) w celu usunięcia konserwantów i do przechowywania zgodnie z instrukcjami producenta.
UWAGA: Niektóre przeciwciała mogą wymagać dalszego oczyszczania za pomocą protokołu opartego na kulkach agarozowych Protein-A21. - Podwielokrotne dawki 33 μg każdego koniugatu przeciwciała w poszczególnych probówkach do mikrowirówek.
UWAGA: Dawkowanie podawanego środka może się różnić w zależności od zastosowania i odpowiada dawkom, w których koniugat przeciwciała jest rutynowo stosowany. Stężenie roztworów przeciwciał jest wymagane, jeśli objętość jest większa niż 100 μl ze względu na bezpieczeństwo zwierząt. - W pożądanym punkcie czasowym przed pobraniem tkanki, tutaj 96 godzin, znieczulić zwierzę z guzem za pomocą 2% izofluranu przepływającego w tlenie w tempie 2 l/min i umieścić na podgrzanym etapie w temperaturze 37 °C. Wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby upewnić się, że przed zabiegiem osiągnięto odpowiedni poziom znieczulenia.
- Aby przygotować się do inokulacji żyły ogonowej roztworami przeciwciał, należy zdezynfekować ogon zwierzęcia, przecierając go trzykrotnie wacikiem nasączonym alkoholem. Rozszerz żyły ogonowe, ogrzewając się poduszką rozgrzewającą przez około 30 s. Unikaj podgrzewania całego zwierzęcia. Po zdjęciu poduszki grzewczej ponownie przetrzyj ogon chusteczką nasączoną alkoholem.
- Za pomocą cewnika do żył ogonowych 27G włóż igłę motylkową do jednej z dwóch bocznych żył ogonowych i ostrożnie przymocuj ogon z włożoną igłą do etapu za pomocą kawałka taśmy chirurgicznej.
UWAGA: Widoczny przepływ wsteczny krwi do cewnika wskazuje na prawidłowe umiejscowienie igły w żyle ogonowej. - Przepłukać cewnik 25 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), a następnie wstrzyknąć roztwór przeciwciała do cewnika za pomocą strzykawek insulinowych. Ponownie przepłukać cewnik 25 μl sterylnego PBS.
- Wyjmij igłę z ogona i uciskaj, aby zatrzymać krwawienie.
- Wyłącz znieczulenie i obserwuj zwierzę, aż do całkowitego wybudzenia się nie pojawi się w poszukiwaniu jakichkolwiek oznak niepokoju.
3. Pobieranie i przygotowanie docelowych tkanek nowotworowych
- W pożądanym momencie humanitarnie poddać zwierzę eutanazji zgodnie z akceptowalną procedurą instytucjonalną, w tym przypadku poprzez stopniowe wdychanie 100% CO2 ze zbiornika sprężonego gazu o natężeniu przepływu w komorze 10-30% objętości / min.
UWAGA: Niektóre zastosowania techniki IVIL wymagają eutanazji przez perfuzję serca za pomocą PBS w celu usunięcia swobodnie krążącego przeciwciała19,22. - Po potwierdzeniu humanitarnej eutanazji poprzez zaprzestanie ruchów oddechowych i sercowych, brak reakcji na szczypanie palców u nóg i szarzenie błon śluzowych, należy wyciąć tkanki nowotworowe za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy w następujący sposób:
- Połóż mysz w pozycji leżącej na plecach i chwytając kleszczami tylko zewnętrzną warstwę skóry między zestawem gruczołów sutkowych najbliżej ogona (5ty), wykonaj małe nacięcie nożyczkami chirurgicznymi.
- Wprowadź zamknięte nożyczki do nacięcia i powoli otwórz końcówkę, aby ostrożnie oddzielić skórę od leżącej pod spodem błony ściany brzucha, utrzymując ją nienaruszoną.
- Wykonaj pionowe nacięcie w górę brzucha, kontynuując oddzielanie skóry od błony wewnętrznej. Pomiędzy3 a 4 gruczołemsutkowym wykonaj poziome cięcie w poprzek brzucha, aby umożliwić cofnięcie skóry i wizualizację gruczołów sutkowych.
UWAGA: Guzy i gruczoły sutka znajdują się powierzchownie pod skórą. - Chwytając każdy guz lub normalny gruczoł kleszczami, ostrożnie odetnij przyczepioną skórę za pomocą nożyczek chirurgicznych.
- Umieść wycięte tkanki w jednorazowych foremkach do tkanek, wstępnie oznaczonych i wypełnionych podłożem do osadzania o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i szybko zamroź formy, umieszczając je na suchym lodzie. W celu zbadania podawania poza celem należy wyciąć inne tkanki lub narządy będące przedmiotem zainteresowania (np. wątrobę lub płuca).
UWAGA: Aby wstrzymać protokół w tym momencie, przechowuj zamrożone bloki tkanek w temperaturze -80 °C, aż będą gotowe do kontynuowania. - Za pomocą kriostatu należy pokroić zamrożone bloki tkanek o grubości 10 μm i umieścić sąsiednie skrawki na wstępnie oznakowanych szkiełkach adhezyjnych.
UWAGA: Aby wstrzymać protokół w tym momencie, przechowuj slajdy w temperaturze -80 °C, aż będą gotowe do kontynuowania.
4. Protokół barwienia ex vivo
UWAGA: Dla porównania ilościowego obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej, wszystkie preparaty są barwione w tym samym czasie tymi samymi przygotowanymi roztworami.
- Płukać zamrożone szkiełka tkankowe PBS o temperaturze pokojowej przez 5 minut w celu usunięcia OCT.
- Odgranicz skrawki tkanek za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego, aby zmniejszyć objętość roztworów potrzebnych podczas barwienia.
UWAGA: Należy uważać, aby nie dopuścić do tego, aby wstrzykiwacz przesuwał się po próbkach tkanek, ponieważ może to spowodować usunięcie tkanki ze szkiełka lub uniemożliwić prawidłowe zabarwienie dotkniętej części tkanki. Nie pozwól, aby skrawki tkanki uległy odwodnieniu w żadnym momencie. - Utrwalić skrawki tkanki 4% roztworem paraformaldehydu na 5 minut.
- Płukać szkiełka w PBS przez 5 minut.
- Przepuszczalność skrawków tkanek 0,5% Triton-X 100 w PBS przez 15 min.
- Płukać szkiełka w PBS przez 5 minut.
- Zablokuj tkanki 3% w/v albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 5% v/v surowicy koziej, obie w PBS (roztwór blokujący) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Dopasuj surowicę roztworu blokującego do drugorzędowego zwierzęcia gospodarza z przeciwciałem. - Płukać szkiełka w PBS przez 5 minut.
- W razie potrzeby inkubować sekcje z pierwszorzędowymi przeciwciałami prowadzącymi rejestrację, ewentualnie powszechnym markerem jądrowym (np. DAPI), naczyniowym (np. CD31) lub cytoplazmatycznym (np. Aktyna). W tym przypadku zastosowano szczurzy CD31 (marker naczyniowy) przeciw myszom w rozcieńczeniu 1:100 zgodnie z instrukcjami producenta w roztworze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C, chronionym przed odwodnieniem na tacy na szkiełku.
UWAGA: Nie dodawaj dodatkowych przeciwciał pierwszorzędowych ani koniugatów przeciwciał. Koniugat, który został wstrzyknięty i pozwolił mu gromadzić się w tkankach in vivo, działa jako przeciwciało pierwszorzędowe. - Płukać szkiełka w PBS przez 5 minut trzy razy, za każdym razem zmieniając PBS.
- Inkubować szkiełka z przeciwciałami drugorzędowymi w celu oznaczenia przeciwciał pierwszorzędowych. W tym zastosowaniu należy uwidocznić przeciwciało anty-B7-H3 za pomocą sprzężonego koziego przeciwciała anty-króliczego AlexaFluor-546 (rozcieńczenie 1:200, zoptymalizowane zgodnie z instrukcjami producenta) i CD31 z kozim przeciwciałem wtórnym przeciwko szczurom AlexaFluor-488 (rozcieńczenie 1:200, zoptymalizowane zgodnie z instrukcjami producenta) w roztworze blokującym, chronionym przed światłem i odwodnieniem na szkiełkowej tacy, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Przeciwciała drugorzędowe pochodzą od tego samego zwierzęcia gospodarza, ale odpowiadają powinowactwu przeciwciał drugorzędowych do gatunku gospodarza odpowiedniego przeciwciała pierwszorzędowego. Od tego momentu zjeżdżalnie są chronione przed światłem. - Płukać szkiełka w PBS przez 5 minut trzy razy, za każdym razem zmieniając PBS.
- Nałóż jedną kroplę podłoża mocującego na środek wycinka chusteczki i ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe, unikając uwięzienia pęcherzyków powietrza.
- Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci i pozostaw do wyschnięcia.
UWAGA: Aby wstrzymać protokół na okres do tygodnia w tym momencie, przechowuj szkiełka w temperaturze -20 °C, aż będą gotowe do kontynuowania.
5. Obrazowanie mikroskopem konfokalnym i ilościowa analiza obrazu
UWAGA: Przygotowanie mikroskopu konfokalnego i parametry obrazowania będą zależały od użytego systemu konfokalnego. Zastosowany tutaj mikroskop został zakupiony na rynku (np. system Zeiss LSM 510 Meta) i wykorzystano związane z nim oprogramowanie do akwizycji (np. Zen 2009). Jednak wiele z tych kroków będzie miało zastosowanie do każdego mikroskopu konfokalnego i zakłada podstawową wiedzę z zakresu mikroskopii konfokalnej.
- Po włączeniu i rozgrzaniu systemu wybierz żądany obiektyw; w tym przypadku użyto obiektywu 20x (przysłona numeryczna = 0,8).
- Załaduj suwak kontroli dodatniej, szkiełko nakrywkowe w dół, aby umożliwić ustawienie optymalizacji dla najjaśniejszego sygnału. Obrazowanie w kanale czerwonym, ustaw ostrość systemu na próbce w trybie obrazowania na żywo.
- Dla każdego używanego kanału laserowego zoptymalizuj intensywność lasera, wzmocnienie główne i rozmiar otworu w następujący sposób:
- Przełącz na tryb ciągły do obrazowania.
- Zoptymalizuj suwaki intensywności lasera (która kontroluje moc lasera) i wzmocnienia (Master) (która kontroluje napięcie lampy fotopowielacza), jednocześnie monitorując histogram tabeli przeglądowej (LUT). Dostosuj te dwa ustawienia, aż zakres dynamiczny histogramu zostanie wypełniony bez nasycania pikseli.
UWAGA: Jeśli intensywność lasera jest zbyt wysoka, nastąpi fotowybielanie. Jeśli wzmocnienie (Master) jest zbyt wysokie, obraz stanie się zaszumiony. Idealnie byłoby, gdyby Gain (Master) znajdował się w środku swojego zakresu. - Ustaw otwór na 1 jednostkę przewiewną (AU), co daje najwyższą rozdzielczość i najcieńszy plasterek Z.
- Przesuń pasek przesunięcia cyfrowego, aby zminimalizować poziom szumów na histogramie LUT, aby uzyskać prawdziwe czarne tło.
UWAGA: Po zoptymalizowaniu ustawień mikroskopu dla każdego kanału lasera i obiektywu, utrzymuj je na stałym poziomie przez całą sesję obrazowania i podczas obrazowania wszystkich preparatów, aby umożliwić ilościowe porównanie szkiełek.
- Na karcie Tryb akwizycji, w obszarze Uśrednianie, wybierz żądaną liczbę i głębię bitową. Kliknij przycisk Optymalny, aby ustawić optymalny rozmiar w pikselach.
- Użyj przycisku Przyciąganie do akwizycji, aby zebrać obraz wysokiej jakości. W tym przypadku losowe pola widzenia zostały wybrane z wnętrza guza, ale inne obszary zainteresowania mogą mieć zastosowanie do różnych zastosowań (naczynia, brzegi guza, głębokość penetracji itp.)
- Zapisz pliki obrazów w formacie używanym przez oprogramowanie konfokalne (tutaj ".lsm") do przetwarzania i kwantyfikacji w trybie offline.
UWAGA: Jeśli nie wszystkie slajdy zostaną zobrazowane podczas tej samej sesji, zapisz ustawienia i załaduj je ponownie podczas kolejnych wizyt, chociaż ponowne obrazowanie tego samego slajdu nie jest zalecane ze względu na fotowybielanie. - Wykonaj ilościowe pomiary intensywności fluorescencji. Otwórz Fidżi (Fidżi to tylko oprogramowanie ImageJ)19,23 i załaduj plik obrazu .lsm, przeciągając go na pasek stanu.
- Podziel dane kanału koloru. Przejdź do Stosy obrazów > > Podziel kanały.
- W razie potrzeby wstępnie przetwórz obrazy fluorescencyjne, tj. odejmij sygnał tła (Przetwarzaj > odejmij tło) lub zmniejsz szum za pomocą metody filtrowania.
- Podziel kanał koloru odpowiadający białku referencyjnemu (barwienie naczyniowe, jądrowe, komórkowe), ustawiając próg intensywności sygnału (Obraz > Dostosuj próg >).
UWAGA: Ręczne progowanie wprowadza subiektywność do analizy obrazu, dlatego użycie automatycznego algorytmu progowania lub odniesienie do histogramów obrazu sprawia, że wyniki analizy obrazu są mniej stronnicze. - Użyj tego progu, aby utworzyć maskę binarną (Process > Binary > Convert to Mask (Przetwarzaj Konwertuj na maskę).
- Zmierz i oznacz zwrot z inwestycji w masce (Analizuj > Analizuj cząstki > Zaznacz opcję Dodaj do Menedżera > OK).
- Zastosuj zwrot z inwestycji do kanału koloru odpowiadającego interesującemu Cię przeciwciału (obraz kanału kliknięcia, narzędzia do analizy > > Menedżer zwrotu z inwestycji > pomiar). Spowoduje to zastosowanie zwrotu z inwestycji maski do obrazu przeciwciała i zapewnienie pomiarów obrazu dla sekcji etykiety w oknie Wyniki. Okno Zapisz wyniki (Plik > Zapisz).
- Oblicz żądaną interesującą Cię statystykę, taką jak średnia intensywność fluorescencji, jak opisano tutaj24.
- Wykonaj wszystkie kroki przetwarzania identycznie jak każdy obraz w zestawie slajdów. Utwórz makro, aby automatycznie to zrobić dla dużych partii obrazów23.
- W przypadku wyświetlania obrazu tylko po pomiarach ilościowych należy zastosować jakościowe korekty obrazu, aby zoptymalizować wizualizację wzorców biodystrybucji, dostosowując minimum, maksimum, jasność i kontrast do tych samych poziomów na wszystkich slajdach (Image > Adjust > Brightness/Contrast).
- Przekonwertuj typ obrazu (Typ obrazu > > Kolor RGB) i zapisz pliki w bezstratnym typie obrazu, takim jak .tiff (File > Save As > Tiff...) do wykorzystania w prezentacjach i publikacjach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Metodę IVIL zastosowano tutaj w celu zbadania biodystrybucji in vivo oraz interakcji tkankowej B7-H3-ICG i Iso-ICG, pozwalając tym czynnikom po wtryśnięciu dożylnym żywemu zwierzęciu na interakcję z tkanką docelową przez 96 h, a następnie, po pobraniu tkanek, na pełnienie roli przeciwciał pierwszorzędowych podczas immunobarwienia ex vivo. Metodę IVIL porównano również ze standardowym barwieniem IF tkanek ex vivo pod kątem markera B7-H3. Normalne gruczoły mlekowe myszy nie wykazują ekspres...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ta metoda składa się z kilku krytycznych etapów i wymaga potencjalnych modyfikacji, aby zapewnić pomyślne wdrożenie. Po pierwsze, dawkowanie i czas wstrzykiwania dożylnego przeciwciało/przeciwciało skoniugowane muszą być dostosowane do konkretnego zastosowania. Ogólnie rzecz biorąc, należy stosować dawki, które są zgodne z tym, jak zwykle będzie stosowany koniugat przeciwciała, tj. pasujące dawki przeciwciała terapeutycznego lub środka kontrastowego na bazie przeciwciał. Należy również dokładnie rozważyć czas pobrania tk...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Dr. Andrew Olsonowi (Stanford Neuroscience Microscopy Service) za dyskusje i korzystanie ze sprzętu. Dziękujemy dr Juergenowi K. Willmannowi za jego mentoring. Badanie to było wspierane przez NIH R21EB022214 grant (KEW), NIH R25CA118681 training grant (KEW) i NIH K99EB023279 (KEW). Stanford Neuroscience Microscopy Service był wspierany przez NIH NS069375.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Animal Model | |||
| FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | The Jackson Laboratory | 002374 | Samice, 4-6 tygodni |
| Animal Handling Supplies | |||
| 27G Cewnik | VisualSonics | Zadzwoń, aby złożyć zamówienie | Zestaw do kaniulacji Vevo MicroMarker Tail Vein Vein Access |
| Chusteczki nasączone alkoholem | Fisher Scientific | 22-246073 | |
| Gąbki z gazy (4 "x 4" 16 warstw) | Cardinal Health | 2913 | |
| Lampa grzewcza | Morganville Scientific | HL0100 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | |
| Maść okulistyczna | Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Taśma chirurgiczna | 3M | 1530-1 | |
| Tissue Collection | |||
| Jednorazowe formy bazowe | Fisher Scientific | 22-363-556 | |
| Optymalna temperatura cięcia (OCT) Średnia | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Chirurgiczne kleszcze londyńskie | Fine Science Tools | 11080-02 | |
| Nożyczki chirurgiczne | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Przeciwciała | |||
| AlexaFluor-488 koza anty-szczurza IgG | Life Technologies | A-11006 | |
| AlexaFluor-546 kozia anty-królicza IgG | Life Technologies | A-11010 | |
| AlexaFluor-594 kozła anty-ludzka IgG | Life Technologies | A11014 | |
| Kontrola izotypu ludzkiej IgG | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
| Humanizowane przeciwciało anty-netrin-1 | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
| Królik anty-mysz CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 Klon |
| szczura anty-mysi CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 |
| Klonodczynniki | |||
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Przezroczysty paznokieć Polskie | Dowolna lokalna apteka | ||
| Indocyjanina Zielona - NHS | Intrace Medical | ICG-NHS Ester | |
| Medium montażowe | ThermoFisher Scientific | TA-006-FM | |
| Normalna surowica kozia | Fisher Scientific | ICN19135680 | |
| Paraformaldehyd (PFA) | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Sterylny fosforan Buforowana sól fizjologiczna (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190250 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Supplies | |||
| adhezyjne Szkiełka szklane | VWR | 48311-703 | |
| Fisher | Scientific | 45-000-148 | |
| Szkiełka nakrywkowe | szklane Fisher Scientific | 12-544G | |
| Hydrofobowy długopis barierowy | Ted Pella | 22311 | |
| Probówki do mikrowirówek | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Taca do barwienia szkiełek | VWR | 87000-136 | |
| Software | |||
| FIJI LOCI, UW-Madison. | Wersja 4.0 | https://fiji.sc/ |
Bibliografia
- Forthal, D. N. Functions of Antibodies. Microbiology Spectrum. 2 (4), 1-17 (2014).
- Boder, E. T., Midelfort, K. S., Wittrup, K. D. Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10701-10705 (2000).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Lonberg, N., et al. Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature. 368 (6474), 856-859 (1994).
- McCafferty, J., Griffiths, A. D., Winter, G., Chiswell, D. J. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature. 348 (6301), 552-554 (1990).
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136 (5), E359-E386 (2015).
- Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).
- Kircher, M. F., Willmann, J. K. Molecular Body Imaging: MR Imaging, CT, and US. Part I. Principles. Radiology. 263 (3), 633-643 (2012).
- Fleuren, E. D. G., et al. Theranostic applications of antibodies in oncology. Molecular Oncology. 8 (4), 799-812 (2014).
- Forsström, B., Bisławska Axnäs, B., Rockberg, J., Danielsson, H., Bohlin, A., Uhlen, M. Dissecting Antibodies with Regards to Linear and Conformational Epitopes. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
- Woof, J. M., Burton, D. R. Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nature Reviews Immunology. 4 (2), 89-99 (2004).
- Brooks, J. D. Translational genomics: The challenge of developing cancer biomarkers. Genome Research. 22 (2), 183-187 (2012).
- Tabrizi, M., Bornstein, G. G., Suria, H. Biodistribution Mechanisms of Therapeutic Monoclonal Antibodies in Health and Disease. The AAPS Journal. 12 (1), 33-43 (2009).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (Suppl 2), S307-S309 (2012).
- Gambhir, S. S. Molecular imaging of cancer with positron emission tomography. Nature Reviews. Cancer. 2 (9), 683-693 (2002).
- Freise, A. C., Wu, A. M. In vivo Imaging with Antibodies and Engineered Fragments. Molecular Immunology. 67 (200), 142-152 (2015).
- Cilliers, C., Menezes, B., Nessler, I., Linderman, J., Thurber, G. M. Improved Tumor Penetration and Single-Cell Targeting of Antibody-Drug Conjugates Increases Anticancer Efficacy and Host Survival. Cancer Research. 78 (3), 758-768 (2018).
- Wilson, K. E., et al. Spectroscopic Photoacoustic Molecular Imaging of Breast Cancer using a B7-H3-targeted ICG Contrast Agent. Theranostics. 7 (6), 1463-1476 (2017).
- Wischhusen, J., et al. Ultrasound molecular imaging as a non-invasive companion diagnostic for netrin-1 interference therapy in breast cancer. Theranostics. 8 (18), 5126-5142 (2018).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B. 848 (1), 40-47 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments JoVE. (65), (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bachawal, S. V., et al. Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model. Cancer Research. 73, 1689-1698 (2013).
- Fitamant, J., et al. Netrin-1 expression confers a selective advantage for tumor cell survival in metastatic breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4850-4855 (2008).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Ryman, J. T., Meibohm, B. Pharmacokinetics of Monoclonal Antibodies. CPT: Pharmacometrics & Systems Pharmacology. 6 (9), 576-588 (2017).
- Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (1), 5-20 (2017).
- Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
- Chen, C. Y., et al. Blood flow reprograms lymphatic vessels to blood vessels. The Journal of Clinical Investigation. 122 (6), 2006-2017 (2012).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
- de Boer, E., et al. In Vivo Fluorescence Immunohistochemistry: Localization of Fluorescently Labeled Cetuximab in Squamous Cell Carcinomas. Scientific Reports. 5, (2015).
- Jenkins, R. W., Barbie, D. A., Flaherty, K. T. Mechanisms of resistance to immune checkpoint inhibitors. British Journal of Cancer. 118 (1), 9-16 (2018).
- Rexer, B. N., Arteaga, C. L. Intrinsic and acquired resistance to HER2-targeted therapies in HER2 gene-amplified breast cancer: mechanisms and clinical implications. Critical Reviews in Oncogenesis. 17 (1), 1-16 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
