Method Article

Wykorzystanie aktywności neuronów do wyzwalania bodźców w pętli zamkniętej w eksperymentach neurofizjologicznych

DOI:

10.3791/59812

⸱

November 12th, 2019

 ,  ,  , 
1Canadian Center for Behavioural Neuroscience, Department of Neuroscience, University of Lethbridge, 2Clinical Neurosciences, Cumming School of Medicine, University of Calgary

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół pokazuje, jak używać systemu elektrofizjologicznego do stymulacji w pętli zamkniętej wywołanej wzorcami aktywności neuronalnej. Dostępny jest również przykładowy kod Matlab, który można łatwo modyfikować dla różnych urządzeń stymulacyjnych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Systemy neurofizjologiczne o zamkniętej pętli wykorzystują wzorce aktywności neuronalnej do wyzwalania bodźców, które z kolei wpływają na aktywność mózgu. Takie systemy zamkniętej pętli są już stosowane w zastosowaniach klinicznych i są ważnymi narzędziami do podstawowych badań mózgu. Szczególnie interesującym niedawnym osiągnięciem jest integracja podejść opartych na pętli zamkniętej z optogenetyką, dzięki czemu określone wzorce aktywności neuronalnej mogą wyzwalać stymulację optyczną wybranych grup neuronów. Jednak stworzenie systemu elektrofizjologicznego do eksperymentów w pętli zamkniętej może być trudne. W tym przypadku dostarczany jest gotowy do zastosowania kod Matlab do wyzwalania bodźców na podstawie aktywności jednego lub wielu neuronów. Ten przykładowy kod można łatwo modyfikować w zależności od indywidualnych potrzeb. Na przykład pokazuje, jak wyzwalać bodźce dźwiękowe i jak je zmienić, aby wyzwolić urządzenie zewnętrzne podłączone do portu szeregowego komputera. Prezentowany protokół przeznaczony jest do współpracy z popularnym systemem rejestracji neuronalnej do badań na zwierzętach (Neuralynx). Implementacja stymulacji w pętli zamkniętej została zademonstrowana u obudzonego szczura.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak zastosować stymulację w pętli zamkniętej w eksperymentach neurofizjologicznych. Typowa konfiguracja eksperymentów w pętli zamkniętej w neurobiologii polega na wyzwalaniu bodźców na podstawie internetowego odczytu aktywności neuronalnej. To z kolei powoduje modyfikacje w aktywności mózgu, zamykając w ten sposób pętlę sprzężenia zwrotnego1,2. Takie eksperymenty w pętli zamkniętej zapewniają wiele korzyści w porównaniu ze standardowymi konfiguracjami w pętli otwartej, zwłaszcza w połączeniu z optogenetyką, która pozwala naukowcom celować w określony podzbiór neuronów. Na przykład Siegle i Wilson wykorzystali manipulacje w pętli zamkniętej do zbadania roli oscylacji theta w przetwarzaniu informacji3. Wykazali, że stymulacja neuronów hipokampa w fazie opadania oscylacji theta miała inny wpływ na zachowanie niż zastosowanie tej samej stymulacji w fazie narastania. Eksperymenty w pętli zamkniętej stają się również coraz ważniejsze w badaniach przedklinicznych. Na przykład wiele badań nad padaczką wykazało, że stymulacja neuronalna wyzwalana na początku napadu jest skutecznym podejściem do zmniejszenia nasilenia napadów4,5,6. Co więcej, systemy do automatycznego wykrywania napadów padaczkowych i warunkowego dostarczania terapii7,8 wykazały znaczące korzyści u pacjentów z padaczką9,10,11,12. Innym obszarem zastosowań, w którym nastąpił szybki postęp metodologii pętli zamkniętej, jest kontrola neuroprotez z interfejsami mózg-maszyna. Dzieje się tak dlatego, że dostarczanie natychmiastowej informacji zwrotnej użytkownikom urządzeń protetycznych znacznie poprawia dokładność i możliwości13.

W ostatnich latach kilka laboratoriów opracowało niestandardowe systemy do jednoczesnego elektrycznego rejestrowania aktywności neuronów i dostarczania bodźców w systemie zamkniętej pętli14,15,16,17,18. Chociaż wiele z tych konfiguracji ma imponujące cechy, nie zawsze łatwo jest je wdrożyć w innych laboratoriach. Dzieje się tak, ponieważ systemy często wymagają doświadczonych techników do montażu wymaganej elektroniki oraz innych niezbędnych komponentów sprzętowych i programowych.

Dlatego, aby ułatwić adaptację eksperymentów z pętlą zamkniętą w badaniach neurobiologicznych, ten artykuł zawiera protokół i kod Matlaba do konwersji konfiguracji zapisu elektrofizjologicznego w pętli otwartej19,20,21,22 do systemu zamkniętej pętli2,6,23. Ten protokół jest przeznaczony do współpracy ze sprzętem nagrywającym Digital Lynx, popularnym systemem laboratoryjnym do rejestracji populacji neuronów. Typowy eksperyment składa się z następujących elementów: 1) Rejestrowanie 5-20 minut danych skokowych; 2) Sortowanie kolców w celu stworzenia szablonów neuronalnych; 3) Używanie tych szablonów do wykrywania wzorców aktywności neuronalnej w trybie online; oraz 4) Wyzwalanie stymulacji lub zdarzeń eksperymentalnych po wykryciu wzorców określonych przez użytkownika.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj procedury zostały przeprowadzone zgodnie z Protokołem Badań na Zwierzętach zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Lethbridge.

1. Chirurgia

UWAGA: Procedury chirurgiczne używane do wszczepiania sond do zapisów neurofizjologicznych zostały przedstawione w innych publikacjach24,25,26. Dokładne szczegóły operacji stymulacji w pętli zamkniętej zależą od rodzaju użytych sond rejestrujących i obszarów mózgu, na które jest cel. Jednak w większości przypadków typowa operacja będzie składać się z następujących kroków.

  1. Przynieś na salę operacyjną klatkę ze szczurem, któremu należy wszczepić silikonową sondę lub zestaw elektrod w celu rejestrowania aktywności neuronalnej.
  2. Znieczulij gryzonia 2-2,5% izofluranem i zamocuj głowę w ramie stereotaktycznej. Upewnij się, że zwierzę jest nieprzytomne podczas operacji, obserwując wszelkie reakcje motoryczne na łagodne bodźce dotykowe25.
  3. Nałóż maść do oczu, aby zminimalizować suchość podczas zabiegu.
  4. Ogolić obszar operacyjny i zdezynfekować skórę 2% roztworem chlorheksydyny i 70% alkoholem izopropylowym.
  5. Lidokainę (5 mg/kg) należy wstrzyknąć pod skórę głowy w obszar mózgu, w którym zostaną wszczepione elektrody.
  6. Wykonaj nacięcie skóry głowy w obszarze przyszłego implantu i użyj skalpela i bawełnianego wacika, aby usunąć okostną z odsłoniętej czaszki25.
  7. Wywierć 4-8 otworów w czaszce do wszczepienia kotwiących (~0,5 mm) jako strukturalnego podparcia dla implantu25. Przymocuj do czaszki, wkładając je w otwory i upewnij się, że są mocno trzymane na miejscu.
  8. Wywierć kraniotomię w określonych współrzędnych i włóż implant mikronapędu/sondy.
    UWAGA: Opisany protokół stymulacji w pętli zamkniętej będzie działał dla każdego obszaru mózgu, w którym wprowadzane są elektrody.
  9. Przymocuj mikronapęd/sondę i wszelkie wymagane złącza interfejsu elektrycznego do czaszki za pomocą akrylu dentystycznego. Ilość akrylu dentystycznego powinna być wystarczająca do stabilnego przymocowania implantu, ale nie powinien on stykać się z otaczającymi tkankami miękkimi25.
  10. Po operacji należy uważnie obserwować zwierzę, dopóki nie odzyska przytomności na tyle, aby utrzymać pozycję leżącą mostka25. Przez kolejne 3 dni należy podawać podskórnie lek przeciwbólowy (np. Metacam, 1 mg/kg) oraz antybiotyk zapobiegający zakażeniu (np. enrofloksacyna, 10 mg/kg).
    UWAGA: Zwierzęta są zazwyczaj pozostawiane do rekonwalescencji po operacji przez tydzień przed jakimkolwiek badaniem lub nagraniem.

2. Instalacja oprogramowania

UWAGA: To zostało przetestowane na Windows 10, wersji 64-bitowej.

  1. Zainstaluj oprogramowanie do akwizycji i przetwarzania danych.
    1. Zainstaluj system akwizycji danych Cheetah 6.4 (https://neuralynx.com/software/category/sw-acquisition-control), który zawiera biblioteki do interakcji z systemem pozyskiwania Cheetah.
    2. Zainstaluj SpikeSort3D (https://neuralynx.com/software/spikesort-3d) lub inne oprogramowanie, które używa KlustaKwik27 do sortowania wartości szczytowych. Oprogramowanie do wykrywania online korzysta z definicji klastrów z silnika KlustaKwik. To oprogramowanie może działać na tym samym komputerze lub może działać na oddzielnych komputerach znajdujących się w tej samej sieci.
    3. Zainstaluj pakiet NetComDevelopmentPackage (https://github.com/leomol/cheetah-interface/blob/master/NetComDevelopmentPackage_v3.1.0), który można również pobrać z https://neuralynx.com/software/netcom-development-package.
  2. Zainstaluj Matlaba (https://www.mathworks.com/downloads/; kod został przetestowany na Matlabie w wersji R2018a). Upewnij się, że Matlab jest włączony w zaporze systemu Windows. Zwykle podczas pierwszego połączenia pojawi się wyskakujące okienko.
    1. Zaloguj się na konto Matlab. Wybierz licencję. Wybierz wersję. Wybierz system operacyjny.
  3. Pobierz następującą bibliotekę do wyzwalania zdarzeń online z: https://github.com/leomol/cheetah-interface i rozpakuj pliki do folderu "Dokumenty/Matlab" na komputerze. Kopia kodu znajduje się w dołączonych materiałach uzupełniających.

3. Początkowe pozyskiwanie danych

  1. Rozpocznij akwizycję danych za pomocą oprogramowania Cheetah.
  2. Nagraj kilka minut impulsowych danych, aby wypełnić przebiegi szablonu.
  3. Zatrzymaj pobieranie danych i wykonaj sortowanie wartości szczytowych zarejestrowanych danych.
    1. Otwórz SpikeSort3D, kliknij Plik | Zamknij menu | Załaduj plik Spike i wybierz plik spike z folderu z nagranymi danymi.
    2. Kliknij Menu klastra, a następnie Automatyczne grupowanie za pomocą KlustaKwik, pozostawiając ustawienia domyślne i kliknij Uruchom.

4. Eksperyment z zamkniętą pętlą

  1. Wznów zbieranie danych w Cheetah.
  2. Otwórz Matlaba.
    1. Otwórz ClosedLoop.m i kliknij Uruchom. Alternatywnie, w oknie poleceń Matlaba, wykonaj ClosedLoop(). Upewnij się, że plik ClosedLoop.m znajduje się w ścieżce Matlab. Jeśli użytkownik chce zastosować funkcję niestandardową do wywoływania każdego wyzwalacza, zamiast tego wykonaj ClosedLoop('-callback', customFunction), gdzie customFunction jest uchwytem tej funkcji.
    2. Załaduj informacje o spajkach zdefiniowane w początkowym nagraniu, klikając przycisk Załaduj, przechodząc do folderu nagrań i wybierając jeden z plików danych impulsowych (.ntt, .nse).
    3. Wybierz jeden lub wiele neuronów, które wyzwolą stymulację, klikając pole wyboru pod wykreślonymi przebiegami.
    4. Zdefiniuj minimalną liczbę neuronów, które wyzwolą stymulację, wpisując liczbę całkowitą w polu tekstowym "minimalne dopasowania"; i zdefiniuj okno czasowe, w którym skoki pasujące do różnych przebiegów są uważane za współaktywne, wpisując liczbę w polu tekstowym "okno".
    5. Kliknij przycisk Wyślij, aby rozpocząć. Spowoduje to rozpoczęcie wyzwalania zdarzeń online (domyślnie tonów) w oparciu o impulsową aktywność wybranych neuronów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczury norweskie Fisher-Brown, urodzone i wychowane na miejscu, były przyzwyczajone do kontaktu z nimi przez dwa tygodnie przed eksperymentem. Dysk nagrywający został wszczepiony chirurgicznie, podobnie jak metody opisane wcześniej28,29,30,31,32,33,34. Sygnały neuronalne zarejestrowano z cz...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół pokazuje, jak wykorzystać standardowy system rejestracji neurofizjologicznej do przeprowadzenia stymulacji w pętli zamkniętej. Protokół ten pozwala neuronaukowcom z ograniczoną wiedzą w dziedzinie informatyki na szybkie wdrażanie różnorodnych eksperymentów w pętli zamkniętej przy niewielkich kosztach. Takie eksperymenty są często konieczne do zbadania interakcji przyczynowych w mózgu.

Po przygotowaniu zwierzęcia i zainstalowaniu oprogramowania (kroki 1 i 2), eksperyment ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnego konfliktu interesów związanego z tą pracą.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty NSERC Discovery dla AL i AG.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BaytrilBayer, Mississauga, CADIN 02169428antybiotyk; 50 mg/ml
Cheetah 6.4NeuraLynx, Tucson, AZ6.4.0.betaInterfejsy programowe do akwizycji danych 
Cyfrowy Lynx 4SXNeuraLynx, Tucson, AZSprzęt nagrywający4SX
Nadajnik sceny czołowejTBSIB10-3163-GKprzesyła sygnał neuronowy do odbiornika
IsofluraneFresenius Kabi, Toronto, CADIN 02237518znieczulenie wziewne
Jet Denture Powder & LiqudLang Dental, Wheeling, US1230akryl dentystyczny
Lacri-LubeAllergan, Markham, CADIN 00210889maść do oczu
Lido-2Rafter 8, CalgaryDIN 00654639znieczulenia miejscowego; 20 mg/ml
MatlabMathworksR2018boprogramowanie do przetwarzania sygnałów i wyzwalania zdarzeń zewnętrznych
MetacamBoehringer, Ingelheim, DEDIN 02240463przeciwbólowy; 5 mg/ml
NetcomNeuraLynxv1Interfejs programowania aplikacji (API), który komunikuje się z sondą Cheetah
SiliconeWszczepione urządzenieCambridge NeurotechASSY-156-DBC2
SpikeSort 3D NeuraLynx, Tucson, AZNarzędzia do klasyfikacji przebiegów skokowychSS3D
do komórek Bezprzewodowy odbiornik radiowyTBSI911-1062-00przesyła sygnał neuronowy do Digital Lynx

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grosenick, L., Marshel, J. H., Deisseroth, K. Closed-loop and activity-guided optogenetic control. Neuron. 86 (1), 106-139 (2015).
  2. Armstrong, C., Krook-Magnuson, E., Oijala, M., Soltesz, I. Closed-loop optogenetic intervention in mice. Nature Protocols. 8 (8), 1475-1493 (2013).
  3. Siegle, J. H., Wilson, M. A. Enhancement of encoding and retrieval functions through theta phase-specific manipulation of hippocampus. Elife. 3, 03061(2014).
  4. Paz, J. T., et al. Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury. Nature neuroscience. 16 (1), 64-70 (2013).
  5. Krook-Magnuson, E., Armstrong, C., Oijala, M., Soltesz, I. On-demand optogenetic control of spontaneous seizures in temporal lobe epilepsy. Nature Communications. 4, 1376(2013).
  6. Berényi, A., Belluscio, M., Mao, D., Buzsáki, G. Closed-loop control of epilepsy by transcranial electrical stimulation. Science. 337 (6095), 735-737 (2012).
  7. Peters, T. E., Bhavaraju, N. C., Frei, M. G., Osorio, I. Network system for automated seizure detection and contingent delivery of therapy. Journal of Clinical Neurophysiology. 18 (6), 545-549 (2001).
  8. Fountas, K. N., Smith, J. Operative Neuromodulation. , Springer. 357-362 (2007).
  9. Heck, C. N., et al. Two-year seizure reduction in adults with medically intractable partial onset epilepsy treated with responsive neurostimulation: final results of the RNS System Pivotal trial. Epilepsia. 55 (3), 432-441 (2014).
  10. Osorio, I., et al. Automated seizure abatement in humans using electrical stimulation. Annals of Neurology. 57 (2), 258-268 (2005).
  11. Sun, F. T., Morrell, M. J., Wharen, R. E. Responsive cortical stimulation for the treatment of epilepsy. Neurotherapeutics. 5 (1), 68-74 (2008).
  12. Fountas, K. N., et al. Implantation of a closed-loop stimulation in the management of medically refractory focal epilepsy. Stereotactic and Functional Neurosurgery. 83 (4), 153-158 (2005).
  13. Abbott, A. Neuroprosthetics: In search of the sixth sense. Nature. 442, (2006).
  14. Venkatraman, S., Elkabany, K., Long, J. D., Yao, Y., Carmena, J. M. A system for neural recording and closed-loop intracortical microstimulation in awake rodents. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 56 (1), 15-22 (2009).
  15. Nguyen, T. K. T., et al. Closed-loop optical neural stimulation based on a 32-channel low-noise recording system with online spike sorting. Journal of Neural Engineering. 11 (4), 046005(2014).
  16. Laxpati, N. G., et al. Real-time in vivo optogenetic neuromodulation and multielectrode electrophysiologic recording with NeuroRighter. Frontiers in Neuroengineering. 7, 40(2014).
  17. Su, Y., et al. A wireless 32-channel implantable bidirectional brain machine interface. Sensors. 16 (10), 1582(2016).
  18. Ciliberti, D., Kloosterman, F. Falcon: a highly flexible open-source software for closed-loop neuroscience. Journal of Neural Engineering. 14 (4), 045004(2017).
  19. Luczak, A., Bartho, P., Harris, K. D. Gating of sensory input by spontaneous cortical activity. The Journal of Neuroscience. 33 (4), 1684-1695 (2013).
  20. Luczak, A., Barthó, P., Harris, K. D. Spontaneous events outline the realm of possible sensory responses in neocortical populations. Neuron. 62 (3), 413-425 (2009).
  21. Schjetnan, A. G., Luczak, A. Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
  22. Bermudez Contreras, E. J., et al. Formation and reverberation of sequential neural activity patterns evoked by sensory stimulation are enhanced during cortical desynchronization. Neuron. 79 (3), 555-566 (2013).
  23. Girardeau, G., Benchenane, K., Wiener, S. I., Buzsáki, G., Zugaro, M. B. Selective suppression of hippocampal ripples impairs spatial memory. Nature Neuroscience. 12 (10), 1222-1223 (2009).
  24. Schjetnan, A. G. P., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
  25. Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. Journal of Visualized Experiments. (61), e3568(2012).
  26. Sariev, A., et al. Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus. Journal of Visualized Experiments. (128), e56438(2017).
  27. Harris, K. D., Henze, D. A., Csicsvari, J., Hirase, H., Buzsáki, G. Accuracy of tetrode spike separation as determined by simultaneous intracellular and extracellular measurements. Journal of Neurophysiology. 84 (1), 401-414 (2000).
  28. Jiang, Z., et al. TaiNi: Maximizing research output whilst improving animals' welfare in neurophysiology experiments. Scientific Reports. 7 (1), 8086(2017).
  29. Gao, Z., et al. A cortico-cerebellar loop for motor planning. Nature. 563 (7729), 113(2018).
  30. Neumann, A. R., et al. Involvement of fast-spiking cells in ictal sequences during spontaneous seizures in rats with chronic temporal lobe epilepsy. Brain. 140 (9), 2355-2369 (2017).
  31. Gothard, K. M., Skaggs, W. E., Moore, K. M., McNaughton, B. L. Binding of hippocampal CA1 neural activity to multiple reference frames in a landmark-based navigation task. Journal of Neuroscience. 16 (2), 823-835 (1996).
  32. McNaughton, B. L. Google Patents. , (1999).
  33. Wilber, A. A., et al. Cortical connectivity maps reveal anatomically distinct areas in the parietal cortex of the rat. Frontiers in Neural Circuits. 8, 146(2015).
  34. Mashhoori, A., Hashemnia, S., McNaughton, B. L., Euston, D. R., Gruber, A. J. Rat anterior cingulate cortex recalls features of remote reward locations after disfavoured reinforcements. Elife. 7, 29793(2018).
  35. Luczak, A., McNaughton, B. L., Harris, K. D. Packet-based communication in the cortex. Nature Reviews Neuroscience. , (2015).
  36. Luczak, A. Analysis and Modeling of Coordinated Multi-neuronal Activity. , Springer. 163-182 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Closed Loop StimulationNeuron Spiking ActivityMATLAB CodeElectrophysiological RecordingSpikeSort 3DCheetah SoftwareOnline Event TriggeringAwake Rat ExperimentOptogenetics IntegrationExternal Device Triggering

Related Articles