Method Article

Charakterystyka na poziomie molekularnym przy użyciu solidnych podejść biochemicznych nowego białka kinazy

DOI:

10.3791/59820

⸱

June 30th, 2019

 ,  ,  , 
1Centre de Biophysique Moléculaire, CNRS, UPR 4301, University of Orléans and INSERM

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Scharakteryzowaliśmy nowe białko kinazy za pomocą solidnych podejść biochemicznych: analiza Western Blot z dedykowanym specyficznym przeciwciałem na różnych liniach komórkowych i tkankach, interakcje za pomocą eksperymentów z koimmunoprecypitacją, aktywność kinazy wykryta przez Western Blot przy użyciu przeciwciała specyficznego dla fosfy oraz znakowanie γ[32P] ATP.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obszerne sekwencjonowanie całego genomu zidentyfikowało wiele otwartych ramek odczytu (ORF), dostarczających wielu potencjalnych białek. Białka te mogą odgrywać ważną rolę w komórce i mogą zapoczątkowywać nowe procesy komórkowe. Wśród białek kinazy są głównymi aktorami, ponieważ należą do komórkowych szlaków sygnałowych i mają zdolność włączania lub wyłączania wielu procesów kluczowych dla losu komórki, takich jak wzrost, podział, różnicowanie, ruchliwość i śmierć komórki.

W tym badaniu skupiliśmy się na nowym potencjalnym białku kinazy, LIMK2-1. Wykazaliśmy jego istnienie za pomocą Western Blot przy użyciu specyficznego przeciwciała. Oceniliśmy jego interakcję z białkiem regulującym za pomocą eksperymentów z koimmunoprecypitacją. Koimmunoprecypitacja jest bardzo skuteczną techniką zdolną do wykrycia interakcji między dwoma białkami docelowymi. Może być również używany do wykrywania nowych partnerów białka przynęty. Białko przynęty może być oczyszczone za pomocą znacznika zmodyfikowanego do jego sekwencji lub za pomocą przeciwciała specjalnie na nie skierowanego. Te kompleksy białkowe można następnie rozdzielić za pomocą SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) i zidentyfikować za pomocą spektrometrii mas. Immunoprecypitowany LIMK2-1 wykorzystano również do zbadania jego aktywności kinazy in vitro poprzez znakowanie γ[32] P] ATP. Ten dobrze ugruntowany test może wykorzystywać wiele różnych substratów, a zmutowane wersje przynęty mogą być używane do oceny roli określonych pozostałości. Można również ocenić działanie środków farmakologicznych, ponieważ technika ta jest zarówno bardzo czuła, jak i ilościowa. Niemniej jednak obchodzenie się z promieniotwórczością wymaga szczególnej ostrożności. Aktywność kinazy można również ocenić za pomocą specyficznych przeciwciał skierowanych przeciwko grupie fosfo zmodyfikowanego aminokwasu. Tego rodzaju przeciwciała nie są dostępne w handlu dla wszystkich reszt modyfikowanych fosfo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przez wiele dziesięcioleci wyjaśniano liczne szlaki sygnałowe i wykazano ich udział w kluczowych procesach komórkowych, takich jak podział komórek, różnicowanie, ruchliwość, programowana śmierć komórki, odporność i neurobiologia. Kinazy odgrywają znaczącą rolę w tych szlakach sygnałowych, ponieważ często precyzyjnie regulują swoją aktywację lub inaktywację i są częścią przejściowych wszechstronnych kompleksów, które reagują na bodźce zewnętrzne1,2,3. Mutacje i rozregulowanie kinaz często prowadzą do chorób u ludzi, dlatego stały się one jednym z najważniejszych celów leków w ciągu ostatnich czterdziestu lat4.

W tym kontekście, ważne jest, aby móc wykrywać interakcje kinaz z ich regulatorami lub substratami i identyfikować nowych partnerów. Oczyszczanie powinowactwa i immunoprecypitacja są bardzo skutecznymi technikami izolacji kompleksów białkowych5. Białko przynęty lub kinaza mogą być oznaczone określoną sekwencją peptydową, co pozwala na użycie komercyjnych kulek kowalencyjnie sprzężonych z przeciwciałami skierowanymi przeciwko peptydowi. Materiał ten pozwala na wysoką odtwarzalność w eksperymentach6,7,8. Białka endogenne mogą być również immunoprecypitowane za pomocą przeciwciał skierowanych bezpośrednio na białko przynęty. Przeciwciała mogą być usieciowane z kulkami agarozy białka A lub białka G lub po prostu inkubowane z tymi kulkami przed dodaniem lizatu. Bufor do lizy musi być zoptymalizowany, aby umożliwić solubilizację białek bez utraty interakcji i uniknąć degradacji białek. Główną wadą tego podejścia jest to, że interakcja jest wykrywana podczas lizy komórek; W związku z tym przejściowe lub słabe interakcje, wraz z tymi wymagającymi kontekstu subkomórkowego, mogą zostać pominięte. Inne techniki mogą być używane do pracy bezpośrednio w komórce, takie jak test ligacji zbliżeniowej (PLA)9, oczyszczanie powinowactwa wspomagane sieciowaniem in vivo (XAP)10, transfer energii rezonansu bioluminescencji (BRET) lub transfer energii rezonansu Förster (FRET)11,12. Ponadto immunoprecypitacja nie jest odpowiednia do wyznaczenia stałych termodynamicznych wiązania, dla których wymagane są techniki fizyczne, takie jak powierzchniowy rezonans plazmonowy, kalorymetria miareczkowa izotermiczna lub termoforeza w mikroskali13,14.

Aktywność kinazy może być oceniana przy użyciu wielu technik. W tym miejscu skupiliśmy się na przeciwciałach specyficznych dla fosfon i znakowaniu in vitro γ [32P] ATP (adenozynotrójfosforanu). Przeciwciała swoiste dla fosfo są ukierunkowane na modyfikację fosforanową określonej reszty w białku. Mogą być stosowane w Western Blot lub ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) po lizie komórek, do immunohistochemii, a także na nieuszkodzonych komórkach za pomocą cytometrii przepływowej lub immunofluorescencji. Ich wadą może być brak swoistości, którą można ocenić za pomocą zmutowanej wersji białka docelowego, oraz to, że nie są one dostępne na rynku dla wszystkich białek. Znakowanie ATP in vitro γ[32P] jest bardzo solidną, dobrze ugruntowaną i bardzo czułą metodą15. Można stosować białka immunoprecypitowane lub rekombinowane, a także badać różne substraty. Działanie leków może być również oceniane, ponieważ ta metoda jest ilościowa. Jego główną wadą jest to, że radioaktywność związana z tym podejściem wymaga ostrożnego obchodzenia się z nim. Możliwe są również metody alternatywne oparte na pomiarze substratów peptydowych fluorescencyjnych lub luminescencyjnych i wykorzystaniu zmienionych właściwości fluorescencyjnych/luminescencyjnych po fosforylacji. Takie metody pozwalają również na wysoką przepustowość, co jest wymagane np. przy badaniach przesiewowych cząsteczek, które mogą być potencjalnymi inhibitorami kinazy docelowej. Rzeczywiście, kinazy reprezentują jedną z największych klas celów leków realizowanych przez firmy farmaceutyczne16.

W tym badaniu skupiliśmy się na białku LIMK2-1 (LIMK2-1 to skrót od Lin11, Isle1, Mec3 Kinase isoform 2-1). Białko kinazy LIMK2 zostało po raz pierwszy opisane w 1995 roku17. Trzy izoformy LIMK2 są wytwarzane przez alternatywne łączenie: LIMK2a, LIMK2b i LIMK2-1. Obecnie LIMK2-1 został opisany tylko na poziomie mRNA w jednym badaniu18. W niniejszym artykule scharakteryzowaliśmy to potencjalne nowe białko kinazy na poziomie molekularnym przy użyciu solidnych podejść biochemicznych. Po pierwsze, pokazujemy, że LIMK2-1 jest rzeczywiście zsyntetyzowany. Podobnie jak jego dwa odpowiedniki, LIMK2a i LIMK2b, oddziałuje z poprzedzającą go kinazą ROCK (kinaza białkowa związana z Rho). Pokazujemy, że LIMK2-1 ma aktywność kinazy na podstawowym białku mieliny (MBP), ale nie na kofilinie, kanonicznym substracie kinaz LIM.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie komórek do transfekcji

UWAGA: Wszystkie etapy hodowli komórkowej muszą być wykonywane w dedykowanym laboratorium, a komórki są manipulowane w komorze mikrobiologicznej klasy 2.

  1. Wysiew komórek HEK-293 (ludzka nerka embrionalna) na płytkach Ø 10 cm w 10 ml DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium) uzupełniony 10% płodową surowicą cielęcą. Hodowla przez 3 do 5 dni w temperaturze poniżej 5% CO2 , w temperaturze 37 °C, aż komórki osiągną ~90% konfluencji.
  2. Potraktuj płytki Ø 10 cm kolagenem R, aby zwiększyć przyczepność komórek do plastikowych płytek.
    1. Dodać 5 ml roztworu kolagenu R, 200-krotnie rozcieńczonego w buforze fosforanowym soli fizjologicznej (PBS) na płytce Ø 10 cm. Nałóż płyn na całą powierzchnię płytki.
    2. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    3. Usuń roztwór kolagenu i wyrzuć go. Dodaj 5 ml PBS, rozprowadź go na całej powierzchni płytki, wyjmij i wyrzuć. Powtórz to pranie raz.
    4. Dodaj 8 ml DMEM uzupełnionego 10% płodową surowicą cielęcą. Przygotowane płytki należy przechowywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  3. Weź płytki HEK-293 z kroku 1.1 w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Usuń podłoże z płytek i wyrzuć je do specjalnego kosza na wybielacz. Dodać 2 ml uzupełnionego DMEM i przepłukać komórki, aby je oderwać, używając przepływu mikropipety o pojemności 1 ml, uważając, aby nie tworzyć piany.
  4. Zbierz komórki do probówki o pojemności 15 ml i dodaj 4 ml uzupełnionego DMEM. Homogenizować za pomocą pipety o pojemności 10 ml, pipetując 3 razy w górę i w dół.
  5. Weź 2 ml tego roztworu komórkowego i dodaj je do płytek potraktowanych kolagenem zawierających uzupełniony DMEM z kroku 1.2.4.
  6. Rosnąć przez 24 godziny w inkubatorze w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C. Komórki powinny być w 50-80% zlewające się w momencie transfekcji.

2. Przejściowe transfekcje

  1. Usuń pożywkę z płytek, wyrzuć ją do specjalnego kosza na wybielacz i dodaj 10 ml świeżo uzupełnionego DMEM. Włożyć płytki z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C, przygotowując mieszaninę do transfekcji.
  2. W probówce o pojemności 15 ml dodaj 450 μl roztworu 10 mM Tris-HCl pH 7,5/1 mM EDTA (Tris oznacza tris(hydroksymetylo)aminometan, a EDTA - kwas etylenodinitrotetraoctowy) i 50 μl roztworu 2,5 M CaCl2. Wymieszaj przez odwrócenie.
  3. Dodać 10 μg plazmidowego DNA (kwasu dezoksyrybonukleinowego) przygotowanego z preparatu midi na płynnej kulturze bakterii przekształconej za pomocą dedykowanego plazmidu. Wymieszaj przez odwrócenie.
  4. Pod płynnym mieszaniem na wirze dodać 500 μL buforowanego koncentratu soli fizjologicznej BES 2x (skład: BES, 10,7 g/L, NaCl, 16,0 g/L, Na2HPO4, 0,27 g/L; BES oznacza kwas N,N-Bis(2-hydroksyetylo)-2-aminoetanosulfonowy, N,N-Bis(2-hydroksyetylo)tauryna) powoli kropla po kropli.
  5. Inkubować przez co najmniej 15 minut (do 45 minut) w temperaturze pokojowej w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Nie wirować, nie mieszać! Przesuwaj rurki bardzo ostrożnie, aby nie zakłócić złożonego tworzenia się między DNA a fosforanem wapnia.
  6. Zabierz tabliczki z kroku 2.1 do szafy bezpieczeństwa. Bardzo ostrożnie, kropla po kropli, dodawać kompleksy DNA do komórek na całej powierzchni płytki.
  7. Inkubować przez 24-72 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Zazwyczaj maksymalna ekspresja białka osiągana jest w ciągu 48 godzin.

3. Liza

UWAGA: Pracuj na lodzie i z zimnymi, aby zapobiec degradacji białek.

  1. Przygotuj bufor do lizy: 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50 mM NaF, 10 mM pirofosforan sodu, 1 mM Na3VO4, 20 mM fosforan p-nitrofenylu, 20 mM β-glicerofosforan, 10 μg/ml aprotyniny, 0,05 μg/ml kwas okaidynowy, 1 μg/ml leupeptyny i 1 mM PMSF (fluorek fenylometylosulfonylu). Na każdą transfekowaną płytkę wymagane jest około 4 ml buforu do lizy.
  2. Wyjąć z inkubatora płytki z transfekowanymi komórkami. Połóż je na lodzie.
    UWAGA: Od tego kroku możliwa jest praca na "normalnej" ławce.
  3. Wyjmij nośnik i wyrzuć go do specjalnego kosza na wybielacz.
  4. Przemyć dwukrotnie 3 ml zimnego PBS: dodawać 3 ml PBS z boku płytki kropla po kropli, aby uniknąć oderwania się transfekowanych komórek, rozprowadzić po całej powierzchni płytki, usunąć PBS i wyrzucić; powtórzyć ten krok jeszcze raz. Na koniec ostrożnie usuń resztę PBS, przechylając płytkę, aby zapobiec rozcieńczeniu buforu do lizy do następnego kroku.
  5. Dodać 500 μl zimnego buforu do lizy na transfekowane przemyte komórki. Rozprowadź go na całej powierzchni talerza.
  6. Inkubować przez 10 minut na lodzie. Od czasu do czasu (co najmniej dwukrotnie) ponownie rozprowadź bufor na całej powierzchni płytki.
  7. Złomuj komórki i zbieraj je w probówce do mikrowirówki.
  8. Wirować przez 10 minut przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C.
  9. Zebrać supernatant w nowej probówce do mikrowirówki. Frakcja ta odpowiada lizatowi (ekstraktowi z całych komórek). Wyrzuć osad, który odpowiada resztkom błony komórkowej.
  10. Pobrać podwielokrotność tej frakcji do nowej probówki do mikrowirówki (około 50 μl). Frakcja ta odpowiada "frakcji całkowitej" lub "lizatowi komórkowemu" lub "ekstraktowi z całych komórek", co pozwala na analizę, czy transfekowane białka ulegają ekspresji za pomocą Western Blot.
    UWAGA: W tym momencie próbki mogą być bezpośrednio wykorzystane do analiz Western Blot. Bufor Laemmli musi zostać dodany do próbki, którą następnie ogrzewa się w temperaturze 95 °C przez 5 minut, odwirowuje przy 10 000 x g przez 5 minut i umieszcza na odpowiedniej karcie charakterystyki. Próbki mogą być również przechowywane w temperaturze -80 °C.

4. Immunoprecypitacja

  1. Delikatnie ponownie wymieszaj kulki agarozy w połączeniu z odpowiednim przeciwciałem: HA (hemaglutynina grypy ludzkiej), Flag lub GFP (Zielone Białko Fluorescencyjne) przez płynną inwersję.
  2. Odetnij końcówkę końcówki o pojemności 200 μl z mikropipety, aby umożliwić wejście kulek do końcówki. Kilkakrotnie pipetuj koraliki w górę iw dół, aby nasycić końcówkę i upewnić się, że pobrano odpowiednią objętość koralików.
  3. Weź 40 μl kulek do probówki do mikrowirówki.
  4. Dodać 500 μl buforu TENET (30 mM Tris-HCl pH 7,5, 120 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100). Wymieszaj przez odwrócenie. Wirować przez 2 minuty przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć sklarowany osad i wyrzucić go. Dodać 500 μl TENET. Inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 4 °C na obracającym się kole.
    UWAGA: Ten etap wstępnej inkubacji w TENET pozwala na redukcję niespecyficznych interakcji, a tym samym na zmniejszenie sygnału tła.
  5. Przemyć kulki dwukrotnie 500 μl buforu do lizy.
    1. Wirować 2 minuty przy 1.000 x g w temperaturze 4°C.
    2. Ostrożnie usuń bufor sklarowany nad osadem i wyrzuć go.
      UWAGA: Uważaj, aby nie zasysać koralików podczas tych etapów prania.
    3. Dodać 500 μl buforu do lizy. Homogenizować przez odwrócenie probówki.
    4. Powtórz kroki 4.5.1-4.5.3.
  6. Wirować przez 2 minuty w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4°C. Ostrożnie usunąć bufor sklarowany nad osadem i wyrzucić go.
  7. Inkubować kulki z lizatem z etapu 3.9 przez 2 do 4 godzin w temperaturze 4 °C na obracającym się kole.
  8. Umyj koraliki immunoprecypitowane.
    UWAGA: W tym momencie immunoprecypitowane kulki można przemyć pięciokrotnie buforem do lizy, a następnie eluować buforem Laemmli. Eluat może być używany do analiz Western Blot lub przechowywany w temperaturze -80 °C. Alternatywnie, kulki mogą być dwukrotnie płukane buforem do lizy, a następnie trzykrotnie buforem kinazy w celu przeprowadzenia znakowania ATP γ[32] P.

5. Analizy koimmunoprecypitacji

  1. Przemyć kulki immunoprecypitowane z kroku 4.7 buforem do lizy.
    1. Wirować przez 2 minuty przy 1 000 x g w wirówce z chłodzeniem w temperaturze 4 °C.
    2. Ostrożnie usunąć supernatant i wyrzucić go.
    3. Dodać 500 μl buforu do lizy. Homogenizować przez odwrócenie probówki.
    4. Powtórz kroki 5.1.1-5.1.3 cztery razy.
  2. Elucji
    1. Wirować przez 2 minuty przy 1 000 x g w wirówce z chłodzeniem w temperaturze 4 °C.
    2. Ostrożnie usunąć supernatant i wyrzucić go. Usunąć ostatnie krople supernatantu za pomocą strzykawki Hamiltona, aby uniknąć aspiracji kulek i wyrzucić supernatant.
    3. Dodać 40 μl 4x buforu Laemmli (200 mM Tris/HCl pH 6,8, 4% SDS, 40% glicerolu, 0,5 M β-merkaptoetanolu, 0,02% błękitu bromofenolowego). Homogenizować, delikatnie stukając w probówkę.
    4. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Wirować przez 5 minut przy 10 000 x g w temperaturze pokojowej.
    6. Za pomocą strzykawki Hamilton usunąć supernatant i zebrać go w nowej probówce do mikrowirówki. Frakcja ta odpowiada "Eluatowi", który może być przechowywany w temperaturze -80 °C lub bezpośrednio analizowany za pomocą Western Blot.

6. Test kinazy

  1. Przygotuj bufor kinazy: 50 mM HEPES-NaOH pH 7,5 (HEPES oznacza kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM MnCl2, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 20 mM β-glicerofosforanu, 1 μg/ml leupeptyny i 1 mM PMSF. Około 2 ml buforu kinazy jest wymagane dla każdego warunku immunoprecypitacji.
  2. Przemyć dwukrotnie kulki immunoprecypitowane z kroku 4.7 500 μl buforu do lizy.
    1. Wirować przez 2 minuty przy 1 000 x g w wirówce z chłodzeniem w temperaturze 4 °C.
    2. Ostrożnie usunąć supernatant i wyrzucić go. Dodać 500 μl buforu do lizy. Homogenizacja przez inwersję.
    3. Powtórz kroki 6.2.1 i 6.2.2.
  3. Przemyć koraliki immunoprecypitowane trzykrotnie 500 μl buforu kinazy.
    1. Wirować przez 2 minuty przy 1 000 x g w wirówce z chłodzeniem w temperaturze 4 °C.
    2. Ostrożnie usunąć supernatant i wyrzucić go. Dodać 500 μl buforu kinazy. Homogenizacja przez inwersję.
    3. Powtórz kroki 6.3.1 i 6.3.2 dwukrotnie.
  4. Wirować przez 2 minuty przy 1 000 x g w wirówce z chłodzeniem w temperaturze 4 °C.
  5. Ostrożnie usunąć supernatant i wyrzucić go. Usunąć ostatnie krople supernatantu za pomocą strzykawki Hamiltona, aby uniknąć aspiracji kulek i wyrzucić supernatant.
  6. Dodać 40 μl buforu kinazy do immunoprecypitowanych kulek. Ponownie zawieś koraliki, delikatnie stukając w rurkę.
  7. Przygotuj mieszaninę do znakowania γ[32P] ATP (końcowa objętość to 22,5 μl, wraz z buforem kinazy) w bezpiecznej probówce.
    1. Dodać wymaganą objętość buforu kinazy, aby osiągnąć końcową objętość 22,5 μl.
    2. Odetnij końcówkę końcówki mikropipety o pojemności 20 μl. Zawiesić ponownie immunoprecypitowane kulki z kroku 6.6, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Zbierz 10 μl tych koralików do rurki z zamkiem bezpiecznym.
    3. Dodać ATP z roztworu podstawowego o stężeniu 10 μM, aby osiągnąć 50 mM końcowego stężenia. W zależności od liczby próbki poddanej działaniu substancji, sugeruje się rozcieńczenie roztworu podstawowego ATP w buforze kinazy, aby umożliwić pipetowanie od 1 do 2 μl, aby upewnić się, że objętość jest prawidłowa.
    4. Dodać 2,5 μg substratu (kofiliny lub podstawowego białka mieliny, MBP w niniejszym badanym przypadku).
  8. Dodać 5 μCi γ[32] P] ATP (3,000 Ci/mmol), aby rozpocząć reakcję. Mieszać powoli pipetując w górę i w dół.
    UWAGA: Od tego momentu prace muszą być wykonywane w bezpiecznym miejscu przeznaczonym do manipulacji radioaktywnością z zachowaniem ostrożnych środków ostrożności, dedykowanych zabezpieczeń i odpowiednich środków kontroli (osłony radioaktywne, licznik Geigera, specjalny pojemnik na odpady, osobiste plakietki na piersi i palcach do wykrywania narażenia radioaktywnego, końcówki filtrów).
  9. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 30 °C.
  10. Zatrzymać reakcję za pomocą 6 μl 5x buforu Laemmli.
  11. Podgrzewać w temperaturze 95°C przez 5 min.
  12. Wirować przy 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  13. Załaduj na SDS-PAGE. Przejdź do migration.
    UWAGA: Należy uważać, aby pierwsza linia wolnego γ[32P] ATP nie wychodziła z żelu, aby uniknąć zanieczyszczenia zbiornika migracyjnego.
  14. Żel należy zabarwić w temperaturze pokojowej.
    1. Usuń żel ze szklanych płytek.
    2. Kontynuuj trzy kąpiele w wodzie o temperaturze pokojowej.
    3. Żel należy zabarwić przez noc kolorem Coomassie Blue w temperaturze pokojowej.
    4. Odplamić żel kilkoma kąpielami myjącymi z wodą o temperaturze pokojowej.
  15. Owiń żel folią spożywczą.
  16. Wystaw na światło dzienne przez jedną noc lub dłużej na ekranie luminowizora.
  17. Odczytaj ekran na luminoimagerze, aby wykryć oznaczone pasma.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białko LIMK2-1 jest syntetyzowane
LIMK2-1 jest wymieniony w bazach danych, ale do tej pory tylko jeden artykuł wykazał istnienie jego mRNA18. W porównaniu do swoich dwóch homologów, LIMK2a i LIMK2b, LIMK2-1 ma dodatkową domenę C-końcową zidentyfikowaną jako domena hamująca fosfatazę białkową 1 (PP1i). Zaprojektowaliśmy przeciwciało, które jest ukierunkowane na peptyd tej domeny, aminokwasy 671-684 ( Rysunek 1A).
Badania ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule użyliśmy solidnych narzędzi biochemicznych, aby scharakteryzować na poziomie molekularnym nowe białko, LIMK2-1, uważane za kinazę opartą na jej sekwencji i homologach, LIMK2a i LIMK2b20.

Po pierwsze, wykazaliśmy istnienie LIMK2-1 na poziomie białka za pomocą analizy Western Blot ze specyficznym przeciwciałem. Następnie oceniliśmy jego interakcję z kinazą ROCK1, o której wiadomo, że reguluje LIMK2a i LIMK2b, homologi LIMK2-1. Na koniec oceniliśmy potencjal...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez La Ligue contre le Cancer, l'Association Neurofibromatoses et Recklinghausen, oraz la Région Centre Val de Loire. Wielkie podziękowania dla Aurélie Cosson i Déborah Casas za dane z cytometrii przepływowej oraz dla Keyrona Hickmana-Lewisa za dokładną korektę manuskryptu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Przeciwciało anty-aktynaSigma-AldrichA1978dla przeciwciała Western Blot
anty-c-MycInvitrogenMA1-21316dla przeciwciała Western Blot
antykofilinaTechnologia sygnalizacji komórkowej3312/5175dla przeciwciała Western Blot
anty-GFPSanta Cruzsc-9996dla przeciwciała Western Blot
anty-HARoche Nauki stosowane11687423001Western Blot
anty-fosfo-kofilinyTechnologia sygnalizacji komórkowej3313Western Blot
Anti-PP1iEurogenteczaprojektowany do tego badaniadla Western Blot
AprotininEuromedexA-162Bdla buforu do lizy
ATPInvitrogenPV3227dla γ[ 32P] etykietowanie
γ[ 32P] ATPPerkin ElmerNEG502Adla γ[ 32P] etykietowanie
BES buforowana sól fizjologicznaSigma-Aldrich14280do transfekcji
β-glicerofosforanSigma-AldrichG9422do lizy i buforu kinazy
β-merkaptoetanolSigma-AldrichM3148dla Laemmli
BSASigma-AldrichA3059do buforu blokującego
Błękit bromofenolowySigma-AldrichB0126dla Laemmli
CaCl2Sigma-AldrichC3881do wirówki transfekcyjnej
Sigma111-541
Kolagen RPan BiotechP06-20166do kontroli transfekcji
siRNAAmbionAM4611dla swoistości
przeciwciała PP1iCoomassie PageBlue Roztwór do barwienia białekThermo-Fisher24620do barwienia żelem
EDTASigma-Aldrich3690do buforu do lizy
Jednostka do elektroforezyBioradMini-Proteando Western Blot
EZview Czerwony żel o powinowactwie do anty-HASigma-AldrichE6779do immunoprecypitacji
Oprogramowanie GeneSysOzymena przejęcie Western Blot
Oprogramowanie GeneTollsOzymedo kwantyfikacji Western Blot
Koraliki pułapki GFPChromtekdo immunoprecypitacji
GlicynaEuromedex26-128-6405do buforu transferowego
GST-kofilinaSygnalizacja komórkowa Upstate12-556dla γ[ 32P] oznakowanie
Strzykawka Hamilton 100 mlHamilton710do ostrożnego usuwania supernatantu z kulek bez ich zasysania
HEPESSigma-AldrichH3375do buforu kinazy
Oprogramowanie ImageQuant TLHealthcaredo akwizycji i kwantyfikacji radioaktywności
LIMK2 siRNAAmbions8191dla PP1i specyficzność przeciwciała
LeupeptinSigma-AldrichSP-04-2217do lizy i buforu kinazy
MBPUpstate Cell sygnalizacja13-173dla γ[ 32P] znakowanie
MgCl2Sigma-AldrichM8266dla buforu kinazy
MnCl2Sigma-Aldrich244589dla buforu kinazy
NaClEuromedex1112do lizy i buforu kinazy
NaFSigma-AldrichS-1504do lizy i buforu kinazy
Okaidic kwasEuromedex0-2220do buforu do lizy
PMSFSigma-Aldrich78830do lizy i buforu kinazy
p-nitrofenylofosforanuEuromedex1026do buforu do lizy membrana
PVDF Immobillon-PMerck-MilliporeIPVH00010 wielkość porów 0,45 mmdla Western Blot
Koło obrotoweLabincodo inkubacji kulek
Zamek awaryjnyeppendorf Eppendorf0030120.086do testu kinazy
SDSSigma-Aldrich5030dla Laemmli i buforu migracyjnego
Ortowanadan soduLC LaboratoriesS8507do lizy i buforu kinazy
Pirofosforan soduFluka71501do buforu do lizy
Super Signal West DuraProtein Biology34075dla Western Blot
Syngene PxiOzymez tkanek Western Blot


 		Biołańcuch

 		P1234035 Mózg
P12345152 Płuca
P1234149 Wątroba
P1234188 Trzustka
P1234260 Jądra		do analizy Western Blot

 
Jednostka transferowaBioradMini-Trans-Blotdla Western Blot
TrisEuromedex26-128-3094 Bdo buforu do lizy
Tween-20Sigma-AldrichP7949do buforu blokującego
Typhoon FLA9500GE Healthcaredo odczytu autoradiografii
Typhoon TrioAmersham Biosciencedo odczytu autoradiografii
Papier WhatmanGE Healthcare3030-672dla Western Blot
dla przeciwciała dla przeciwciała GE dla ekstraktów

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. Evolution of protein kinase signaling from yeast to man. Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).
  2. Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. 298, Science. New York, N.Y. 1912-1934 (2002).
  3. Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling. Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).
  4. Bhullar, K. S., et al. Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions. Molecular Cancer. 17, 48(2018).
  5. Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, Clifton, N.J. 349-364 (2008).
  6. Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).
  7. Wood, D. W. New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).
  8. Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).
  9. Greenwood, C., et al. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
  10. Wang, X., Huang, L. Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1844, Clifton, N.J. 401-410 (2018).
  11. Raykova, D., et al. Let There Be Light! Proteomes. 4, (2016).
  12. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).
  13. Podobnik, M., et al. How to Study Protein-protein Interactions. Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).
  14. Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648(2014).
  15. Peck, S. C. Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).
  16. Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format. Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).
  17. Okano, I., et al. Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs. The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).
  18. Croft, D. R., et al. p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton. Cell Research. 21, 666-682 (2011).
  19. Tastet, J., et al. LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability. Neuroscience. 399, 199-210 (2019).
  20. Vallee, B., et al. LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b. The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).
  21. Lee, Y. C., et al. Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation. Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Kinase ProteinImmunoprecipitationWestern BlotCo immunoprecipitationKinase Activity AssaySDS PAGEGamma P32 ATP LabelingLIMK2 1ROCK InteractionCell Culture

Related Articles