Artykuł metodologiczny

Badanie dynamiki jądrowej drożdży rozszczepienia mitotycznego i mejotycznego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

11.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59822

⸱

24 czerwca 2019

 ,  ,  , 
1Program in Molecular and Computational Biology, University of Southern California, 2Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy obrazowanie żywych komórek, które jest nietoksyczną metodą mikroskopii, która pozwala badaczom badać zachowanie białek i dynamikę jądrową w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych podczas mitozy i mejozy.

Streszczenie

Obrazowanie żywych komórek to technika mikroskopowa używana do badania dynamiki komórek i białek w żywych komórkach. Ta metoda obrazowania nie jest toksyczna, na ogół nie ingeruje w fizjologię komórki i wymaga minimalnego postępowania eksperymentalnego. Niski poziom zakłóceń technicznych umożliwia naukowcom badanie komórek w wielu cyklach mitozy i obserwowanie mejozy od początku do końca. Korzystając ze znaczników fluorescencyjnych, takich jak zielone białko fluorescencyjne (GFP) i czerwone białko fluorescencyjne (RFP), naukowcy mogą analizować różne czynniki, których funkcje są ważne dla procesów takich jak transkrypcja, replikacja DNA, spójność i segregacja. W połączeniu z analizą danych przy użyciu Fidżi (bezpłatna, zoptymalizowana wersja ImageJ), obrazowanie żywych komórek oferuje różne sposoby oceny ruchu białek, lokalizacji, stabilności i czasu, a także dynamiki jądrowej i segregacji chromosomów. Jednak, podobnie jak w przypadku innych metod mikroskopowych, obrazowanie żywych komórek jest ograniczone przez wewnętrzne właściwości światła, które ograniczają moc rozdzielczości przy dużych powiększeniach, a także jest wrażliwe na fotowybielanie lub fototoksyczność przy wysokich częstotliwościach fal. Jednak przy pewnej ostrożności badacze mogą ominąć te fizyczne ograniczenia, starannie dobierając odpowiednie warunki, szczepy i markery fluorescencyjne, aby umożliwić odpowiednią wizualizację zdarzeń mitotycznych i mejotycznych.

Wprowadzenie

Mikroskopia żywych komórek pozwala badaczom badać dynamikę jądrową bez zabijania komórek drożdży rozszczepienia i eliminuje potrzebę stosowania śmiercionośnych utrwalaczy i barwień. Możliwe jest obserwowanie stabilności, ruchu, lokalizacji i czasu znakowanych fluorescencyjnie białek, które są zaangażowane w ważne zdarzenia, takie jak replikacja chromosomów, rekombinacja i segregacja, a także ruchy błony i cytoszkieletu. Utrzymując żywotność komórek i wykrywając nietoksyczne sygnały, ingerencja fizjologiczna jest minimalna. Przy prawidłowym wykonaniu ta metoda mikroskopowa może zmniejszyć efekty zakłócające, które wynikają z przedłużonej obsługi technicznej lub z fałszywej reaktywności chemicznej. Ponadto podczas eksperymentu badacze mogą dokonać trafnych obserwacji stanów odżywczych i stresu drożdży rozszczepialnych, wydajności proliferacyjnej i stanu apoptozy, które wskazują na niewłaściwe parametry obrazowania lub nieprawidłową fizjologię komórki1,2,3.

Mitoza i mejoza charakteryzują się podziałem jądrowym i komórkowym. W mejozy, w przeciwieństwie do mitozy, zawartość genetyczna zmniejsza się o połowę, ponieważ komórki rodzicielskie dają początek komórkom potomnym4. Ponieważ obrazowanie żywych komórek zapewnia wymiar czasowy oprócz relacji przestrzennej, można badać dużą liczbę komórek w czasie rzeczywistym. Mikroskopia żywych komórek umożliwiła naukowcom zbadanie dynamiki podziału jądra za pomocą znaczników fluorescencyjnych dla histonów5, podjednostki kohezyny6, mikrotubule7, centromery8, kinetochores9, komponenty korpusu wrzeciona (SPB)10, oraz składniki kompleksu pasażera chromosomu (CPC)11. Poza aparatem do segregacji chromosomów, obrazowanie żywych komórek uchwyciło również zachowanie białek niezbędnych, ale nie bezpośrednio zaangażowanych w segregację chromosomów. Wykazano, że funkcja tych białek wpływa na replikację, rekombinację chromosomów, ruch jądra i przyłączanie chromosomów do mikrotubul12,13,14. Obserwacje te przyczyniły się do lepszego zrozumienia zdarzeń komórkowych, których składniki funkcjonalne nie były podatne na badania biochemiczne lub genetyczne. Dzięki nowym postępom w technologii mikroskopii ograniczenia, takie jak niska rozdzielczość, fotowybielanie, fototoksyczność i stabilność ostrości, zmniejszą się, ułatwiając w ten sposób lepsze obserwacje mitotycznej i mejotycznej dynamiki jądrowej w czasie rzeczywistym1,2,3. Mejoza jest szczególnie trudna, ponieważ jest to końcowa ścieżka różnicowania, która wymaga szczególnej uwagi na czas.

Celem tego protokołu jest przedstawienie stosunkowo prostej metody badania dynamiki jądrowej drożdży w czasie rzeczywistym w mitozie i mejozy. Aby to osiągnąć, konieczne jest użycie komórek, które nie były narażone na stres środowiskowy, przygotowanie poduszek agarozowych, które mogą wytrzymać długotrwałe obrazowanie, oraz zamontowanie komórek w gęstościach ułatwiających wizualizację dynamiki pojedynczej komórki. Co więcej, protokół ten wykorzystuje komórki przenoszące znakowane fluorescencyjnie białka, które służą jako użyteczne markery kinetyki jądrowej (Hht1-mRFP lub Hht1-GFP), segregacji chromosomów (Sad1-DsRed), dynamiki cytoszkieletu (Atb2-mRFP), aktywacji transkrypcji w G1 / S (Tos4-GFP) i stabilności kohezji w mejozie (Rec8-GFP). Metoda ta wprowadza również dodatkowe markery jądrowe i cytozolowe (tabela I), które można wykorzystać w różnych kombinacjach do odpowiedzi na pytania dotyczące określonych procesów komórkowych. Ponadto dostępne są podstawowe narzędzia Fidżi, które pomagają naukowcom przetwarzać obrazy żywych komórek i analizować różne typy danych. Siła tego podejścia wynika z wykorzystania obserwacji w czasie rzeczywistym dynamiki białek, czasu i stabilności do opisania procesów, które są integralne dla prawidłowego przeprowadzenia mitozy i mejozy.

Protokół

1. Przygotowanie nośnika15,16

  1. Roztwory podstawowe
    1. Przygotować 50-krotny roztwór podstawowy soli, dodając 52,5 g MgCl2·6H20, 0,735 g CaCl2·2H20, 50 g KCl i 2 g Na2S04 w butelce zawierającej 1 l wody destylowanej. Dokładnie wymieszaj roztwór i wysterylizuj przez filtrację. Umieścić w temperaturze 4 °C do długotrwałego przechowywania.
    2. Przygotuj 1000-krotny roztwór podstawowy witaminy, mieszając 1 g kwasu pantotenowego, 10 g kwasu nikotynowego, 10 g inozytolu i 10 mg biotyny w butelce zawierającej 1 l wody destylowanej. Dobrze wymieszaj roztwór i wysterylizuj przez filtrację. Przechowywać w temperaturze 4 °C do długotrwałego przechowywania.
    3. Przygotuj 10 000 x mineralny roztwór podstawowy, dodając 5 g kwasu borowego, 4 g MnSO4, 4 g ZnSO4·7H2O, 2 g FeCl2·6H2O, 1 g KI, 0,4 g kwasu molibdenowego, 0,4 g CuSO4·5H20 i 10 g kwasu cytrynowego w butelce zawierającej 1 l wody destylowanej. Dokładnie wymieszaj roztwór i wysterylizuj przez filtrację. Umieścić w temperaturze 4 °C do długotrwałego przechowywania.
    4. Przygotować indywidualne roztwory podstawowe składników odżywczych, dodając 7,5 g adeniny, leucyny, histydyny lub lizyny do butelki zawierającej 1 l wody destylowanej. Użyj tylko 3,75 g do przygotowania roztworu uracylu. Sterylizuj roztwory przez autoklawowanie.
      nuta: Z biegiem czasu uracyl wytrąca się z roztworu. Aby ponownie wprowadzić do roztworu, podgrzej go w kuchence mikrofalowej z mocą 60% w odstępach co 10 sekund lub umieść w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C na 20 minut. Mieszaj ciepły roztwór, aż znikną wszystkie grudki uracylu.
  2. Ekstrakt drożdżowy plus suplementy (TAK)
    1. W kolbie o pojemności 2 l dodać 1 l wody destylowanej, 5 g bazy ekstraktu drożdżowego, 30 g glukozy i po 225 mg adeniny, uracylu, L-histydyny, L-leucyny i L-lizyny. Dodaj 20 g agaru, aby uzyskać stałe podłoże.
    2. Użyj magnetycznego mieszadła, aby całkowicie rozpuścić składniki w roztworze. Agar stopi się po wysterylizowaniu podłoża w autoklawie.
      nuta: Dla wygody w handlu dostępny jest również gotowy do użycia proszek YES.
  3. Pożywka minimalna z Edynburga (EMM) i pożywka z glutaminianu pombe (PMG)
    1. W kolbie o pojemności 2 l połączyć 1 l wody destylowanej z 3 g wodoroftalanu potasu, 2,2 g Na2HPO4, 5 g NH4Cl, 20 g glukozy, 20 ml podstawowego roztworu soli, 1 ml podstawowego roztworu witaminy i 0,1 ml podstawowego roztworu mineralnego. Zastąp NH4Cl 2,2 g soli monosodowej kwasu L-glutaminowego, aby przygotować PMG. Aby przygotować stałe podłoże, dodaj 20 g agaru.
    2. Za pomocą mieszadła magnetycznego dokładnie rozpuść składniki. Agar stopi się po wysterylizowaniu podłoża w autoklawie. Przed użyciem w razie potrzeby dodać roztwory podstawowe składników odżywczych. Na każdy 1 l pożywki dodaj po 15 ml adeniny, leucyny, histydyny i lizyny. Użyj 30 ml dla uracylu, ponieważ jest on mniej skoncentrowany niż inne pożywki.
      nuta: Dla wygody w handlu dostępne są również gotowe do użycia proszki EMM i PMG.
  4. Ekstrakt słodowy (ME)
    1. Za pomocą kolby o pojemności 2 litrów zmieszać 1 l wody destylowanej z 30 g ekstraktu słodowego i po 225 mg adeniny, uracylu, histydyny i leucyny. Dostosuj pH do 5,5. Dodać 20 g agaru, aby uzyskać stałe podłoże.
    2. Rozpuść składniki w roztworze za pomocą mieszadła magnetycznego. Agar stopi się po wysterylizowaniu podłoża w autoklawie.
  5. Agar zarodnikowy z suplementami (SPA)
    1. Do kolby o pojemności 2 l dodać 1 l wody destylowanej, 10 g glukozy, 1 g KH2PO4, 1 ml bulionu witaminowego, po 45 mg adeniny, uracylu, histydyny, leucyny i chlorowodorku lizyny. Dodaj 20 g agaru, aby uzyskać stałe podłoże.
    2. Użyj magnetycznego mieszadła, aby dokładnie połączyć składniki. Agar stopi się po wysterylizowaniu podłoża w autoklawie.

2. Kultura drożdży rozszczepieniowych15,16

  1. Użyj pożywki stałej YES, aby obudzić rozszczepialne szczepy drożdży z konserwacji kriogenicznej. W zależności od wymagań temperaturowych każdego szczepu, inkubować w temperaturze 25 °C lub 32 °C przez 3-5 dni.
  2. Gdy kolonie są widoczne, przygotuj starterową płynną kulturę. Weź komórki z poszczególnych kolonii i zaszczep je w probówkach zawierających 3 ml płynnego podłoża YES. Rosnąć w odpowiedniej temperaturze do środkowej lub późnej fazy logarytmicznej.
    nuta: Do prawidłowego napowietrzania należy używać probówek lub kolb o objętości co najmniej 5 razy większej niż zamierzona objętość płynnej hodowli. Prędkości wytrząsania w zakresie 150-220 obr./min są zwykle stosowane w rutynowym wzroście kultur.
  3. Dozować 250-500 μl kultury starterowej do kolby o pojemności 50 ml zawierającej 9,5-9,75 ml YES, EMM lub PMG oraz odpowiednie suplementy. Pozwól komórkom urosnąć do pożądanej gęstości i sprawdź pod mikroskopem prawidłową morfologię komórek i stan odżywienia.
    nuta: Aby przechowywać przebudzone szczepy przez okres do miesiąca, należy uszczelnić płytki YES taśmą parafinową i umieścić w temperaturze 4 °C.

3. Przygotowanie próbki2

  1. Konfiguracja szkiełek mikroskopowych
    1. Dodać 2 g agarozy do zlewki o pojemności 500 ml zawierającej 100 ml minimalnej pożywki plus suplementów (mitoza) lub płynnych SPAS (mejoza). Podgrzej roztwór agarozy w kuchence mikrofalowej do 60% mocy w odstępach co 10 sekund lub umieść w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C na 10 minut. Zakręć roztworem, aby zapewnić wydajne topienie. Przygotuj zestaw do robienia szkiełek agarozowych (Rysunek 1A), aby zapewnić szybkie przygotowanie podkładki i zapobiec przedwczesnemu krzepnięciu stopionej agarozy.
    2. Pozostaw stopioną agarozę do ostygnięcia przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i dozuj 50-100 μl plamek na szkiełka mikroskopowe za pomocą końcówek do pipet o szerokim otworze. Zanim agaroza ostygnie, umieść szkiełko mikroskopowe na górze, aby wytworzyć podkładkę do rozprowadzania o średnicy około 1,5-2 cm (ryc. 1B-C). Szerokość podkładki agarozowej jest zazwyczaj proporcjonalna do długości czasu obrazowania. Innymi słowy, grubsze elektrody wytrzymują dłuższe okresy obrazowania.
    3. Użyj mieszaniny węglowodorów jako szczeliwa, aby zapewnić prawidłowe pokrycie szkiełek grubymi podkładkami agarozowymi i zapobiec śmierci komórek w wyniku ekspozycji rozpuszczalnika na krawędziach szkiełka nakrywkowego. Wymieszaj równe części (w/w) wazeliny, lanoliny i parafiny w zlewce o pojemności 500 ml. Podgrzej składniki na płycie grzejnej w temperaturze 120 °C przez 5 minut. W miarę topnienia składników ostrożnie zawiruj stopiony roztwór, aby zapewnić odpowiednie wymieszanie.
  2. Przykładowa konfiguracja
    1. W celu zbadania zdarzeń mitotycznych hoduj komórki z kultur starterowych w płynnym EMM lub PMG plus suplementy do około środkowej fazy logarytmicznej (OD595 0,4). Odwirować 1 ml zawiesiny komórkowej o stężeniu 1,375 x g przez 1 minutę, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w minimalnej pożywce plus suplementy do końcowej objętości 100 μl.
    2. Aby zobrazować zdarzenia mejotyczne, hoduj komórki z kultur starterowych w minimalnej pożywce plus suplementy do późnej fazy logarytmicznej (OD595 0,7-1,0). Połączyć równe objętości przeciwległych komórek typu mate (h- i h+) w zawiesinie komórek o objętości 1 ml. Odwirować komórki przy 1,375 x g przez 1 minutę i ponownie zawiesić osad w płynnym ME. Powtórz ten krok trzy razy, aby zapewnić skuteczne usuwanie składników odżywczych.
    3. Po ostatnim przemyciu ME ponownie zawiesić komórki w 1 ml ME i dodać go do kolby o pojemności 50 ml zawierającej 9 ml ME. Inkubować przez 12-16 godzin w temperaturze 22-25 °C przy minimalnej prędkości obrotowej (50-100 obr./min). Obfita flokulacja komórek, która powoduje wiele okrągłych zbrylań drożdży rozszczepialnych i wskazuje na efektywne krycie.
    4. Pobrać 1 ml próbki z hodowli krzyżowej i odwirować przy 1,375 x g przez 1 min. Usunąć supernatant, ale pozostawić 250 μl w probówce w celu ponownego zawieszenia komórek. Przed umieszczeniem komórek na płatkach agarozowych energicznie wiruj przez 5 sekund, aby rozbić grudki.
      nuta: Pozostałe 250 μl ME używane do ponownego zawieszania komórek zawiera czynniki łączące, które pomagają komórkom wejść w mejozę.
    5. Umieść 20 μl mitotycznej lub mejotycznej zawiesiny komórek na 2% podkładce agarozowej. Usuń nadmiar nośnika, odwracając szkiełko i kładąc je na niestrzępiącym się ręczniku papierowym na 2-3 sekundy (Rysunek 1D). Ustaw ślizg stroną do góry i delikatnie umieść szklane szkiełko nakrywkowe, uważając, aby nie generować pęcherzyków powietrza (Rysunek 1F).
      nuta: Eliminacja nadmiaru podłoża za pomocą ręcznika papierowego jest bardziej efektywna czasowo niż absorpcja grawitacyjna, co jest szczególnie ważne w eksperymentach z mejozą.
    6. Aby utworzyć monowarstwę komórki, obróć szkiełko nakrywkowe palcem wskazującym zgodnie z ruchem wskazówek zegara przez jeden (mitoza) lub dwa pełne obroty (mejoza) (Rysunek 1F). Upewnij się, że materia komórkowa rozprasza się na podkładce agarozowej, co pozwala na lepsze oddzielenie pojedynczych komórek lub worka. Za pomocą małego drewnianego patyczka dozuj stopiony uszczelniacz wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego, aby uszczelnić każdą podkładkę agarozową (Rysunek 1G).
    7. Po uszczelnieniu podkładki agarozowej umieść ją na stoliku mikroskopu i pozwól jej zachować równowagę przez 10-15 minut w odpowiednich warunkach obrazowania (np. temperatura) (Rysunek 1H), aby umożliwić rozproszenie pęcherzyków powietrza i pozwolić na wystąpienie wszelkich przesunięć agarozy w ostatniej chwili. Rozpocznij obrazowanie, gdy szkiełko zostanie skutecznie zrównoważone i nie zdejmuj go ze stolika, dopóki nie zakończy się zbieranie danych.
      nuta: Kontrola temperatury i wilgotności jest określana przez zastosowany system mikroskopowy i specyficzne wymagania eksperymentalne. Jeśli jest obecna, zastosuj kontrolę temperatury i wilgotności do wszystkich eksperymentów obrazowania. W przypadku braku naukowcy muszą opracować sposób zapobiegania wahaniom temperatury, zwłaszcza podczas eksperymentów z mejozą.

4. Obrazowanie na żywo komórek2 i przetwarzanie

  1. Użyj obiektywu 40x, aby znaleźć odpowiednie pola widzenia dla obrazu. Przełącz się na obiektyw 60x, aby rozpocząć zbieranie danych. W zależności od zastosowanego systemu mikroskopowego, późniejsze ponowne ogniskowanie i cięcie na próbce w każdym punkcie czasowym będzie odbywać się ręcznie lub za pomocą procesu zautomatyzowanego pod mikroskopem lub oprogramowaniem.
    nuta: Obrazy przedstawione w tym protokole zostały zebrane za pomocą mikroskopu dekonwolucyjnego, fluorescencyjnego wyposażonego w Sedat, zestawy filtrów RFP i GFP, stolik nano-motion, obiektyw obiektywowy 60x NA 1.4 oraz 12-bitową kamerę CCD. Wbudowane żaluzje mechaniczne i zmotoryzowane koła filtrów pozwoliły na zmniejszenie ekspozycji na wzbudzenie i fotowybielanie próbek.
  2. Używaj odpowiedniego oprogramowania do pozyskiwania i przetwarzania obrazów. Aby zdekonwoluować obrazy, należy użyć funkcji transferu optycznego dostarczonych przez producenta.
    nuta: Szczegółowe informacje na temat sprzętu mikroskopowego i oprogramowania używanego w tym protokole znajdują się w Tabeli materiałów.
  3. Aby użyć konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego do pozyskiwania obrazów żywych komórek, upewnij się, że mikroskop zbiera dane cyfrowo, ma obiektywy 40x lub 60x z aperturami numerycznymi (NA) większymi niż 1,2 i jest w stanie wykonać sekcję optyczną.
    nuta: Bez tych wymagań obrazy będą miały zmniejszoną rozdzielczość, co pogorszy jakość pomiarów mikroskopowych i obserwacji jakościowych.
  4. Korzystaj z bezpłatnych programów typu plug-in (np. Fiji), aby zminimalizować systematyczne błędy rozmycia wynikające z utraty kontrastu podczas pozyskiwania obrazu17,18,19,20 oraz zapewnić prawidłową analizę ilościową intensywności fluorescencji oraz innych zdarzeń czasowych i dynamicznych w komórce.
    nuta: Inne dostępne komercyjne programy do dekonwolucji można znaleźć w Tabeli materiałów.
  5. Wybierz zestawy filtrów mikroskopowych, które najlepiej pasują do obserwowanych fluoroforów. Upewnij się, że filtry wzbudzenia i emisji mają odpowiednie przepusty pasmowe, które pozwalają na specyficzne wykrywanie białek fluorescencyjnych. Na przykład, aby wykryć sygnał CFP, odpowiednie jest pasmo wzbudzenia i emisji 430/25 i 470/30, ale nie dla fluorescencji RFP.
  6. Stosuj metodę minimalnych efektywnych ustawień (MESA) podczas obrazowania drożdży rozszczepialnych w wielu punktach czasowych. Innymi słowy, należy unikać długotrwałego stosowania długości fal wzbudzenia i stosować najniższą moc wzbudzenia i czas ekspozycji, które generują akceptowalne, a jednocześnie wymierne i odtwarzalne dane obrazowania.
  7. W przypadku przedłużonego obrazowania podczas mitozy lub mejozy należy ograniczyć odstęp między punktami czasowymi akwizycji do 5-10 minut. Chociaż 2% płatki agarozowe mogą wytrzymać od 12 do 16 godzin sesji obrazowania, prawdopodobne jest przesuwanie się komórek z powodu parowania agarozy. Dlatego wykonuj pełne eksperymenty mitozy lub mejozy odpowiednio w oknach 4-6 godzin lub 8-10 godzin.
  8. Zbieraj dane obrazowe przez 4-8 godzin, składające się odpowiednio z co najmniej 24-48 punktów czasowych akwizycji, jednego białka fluorescencyjnego i stosu z na punkt czasowy oraz kanału fluorescencyjnego składającego się z 13 sekcji w odstępach 0,5 μm przy użyciu obiektywu 60x. Wymaga to co najmniej 0,5-1 GB miejsca na dysku twardym. W ten sposób, oprócz wyeliminowania fotowybielania i przesuwania komórek, stwórz przepływ pracy, który uwzględnia możliwości obliczeniowe1,2,3.
    nuta: Te parametry akwizycji są zwykle ustawiane i modyfikowane w oprogramowaniu, które steruje funkcjami mikroskopu oraz które zbiera i przetwarza obrazy.
  9. Aby dokładniej zbadać konkretne procesy jądrowe, należy wykonywać akwizycję obrazu co 5-10 s, o ile emisja nie zmniejszy się znacznie po częstej ekspozycji. Przeprowadź wstępną analizę intensywności fluorescencji w różnych okresach czasu, aby określić punkt, po którym dokładność zebranych danych nie jest już wiarygodna1,3.
  10. W oprogramowaniu do akwizycji i przetwarzania obrazów użyj projekcji maksymalnej intensywności na stosach z-obrazów obrazu, aby obserwować wszystkie struktury o dużej gęstości fluorescencji na płaszczyźnie 2D, niezależnie od ich położenia w pionie1,2,3. Ułatwia to szybkie badanie procesów jądrowych zachodzących w różnych wokselach. Zbierz obraz w średnim ogniskowym jasnym polu, aby wygenerować obraz referencyjny obserwowanych komórek.

5. ImageAnalysis20,21

UWAGA: Analiza obrazu w tym protokole jest wykonywana przy użyciu Fidżi. Aby zapoznać się z innymi programami analitycznymi i wtyczkami Fiji, patrz tabela materiałów.

  1. Prześlij zdekonwoluowany obraz, wybierając funkcję Importer formatów biologicznych w menu Wtyczki. W wyskakującym oknie Opcje importu wybierz Hyperstack, Domyślny tryb kolorów i zaznacz opcję Autoskalowanie przed naciśnięciem przycisku OK.
  2. Upewnij się, że wyświetlane okno ma odpowiednią liczbę kanałów fluorescencyjnych i ram czasowych, przewijając w boki odpowiednie paski na dole. Zapisz jako plik Tiff, który nie kompresuje danych i zapobiega utracie informacji.
  3. Otwórz obraz, który zawiera podziałkę liniową wygenerowaną podczas przetwarzania danych przez oprogramowanie mikroskopu. Określ długość paska skali w pikselach za pomocą narzędzia Linia prosta, aby narysować równoległą linię o podobnym rozmiarze, a następnie wybierz opcję Zmierz z menu Analizuj. Dodaj pasek skali, ustawiając stosunek pikseli do μm obrazu, wybierając opcję Ustaw skalę z menu Analizuj.
    1. W wyskakującym oknie Ustaw skalę wprowadź obliczoną odległość w pikselach i znaną odległość w μm, ustaw proporcje pikseli na 1,0, wpisz mikron jako jednostkę długości i zaznacz pole Globalny przed kliknięciem przycisku OK.
  4. Użyj opcji Ustaw pomiary w menu Analizuj, aby wybrać różne parametry do ilościowego określenia podczas wybierania opcji Zmierz. Na potrzeby tego protokołu wybierz następujące metryki: Obszar, Obwód, Średnia wartość szarości, Mediana, Minimalna i maksymalna wartość szarości, Gęstość zintegrowana, Pozycja stosu i Etykieta wyświetlania.
  5. W zależności od precyzji zebranych danych wprowadź więcej niż 1 w polu Miejsca dziesiętne i w razie potrzeby zaznacz pole Notacja naukowa. Po zastosowaniu polecenia Zmierz w wyskakującym oknie Wyniki zostaną wyświetlone wartości dla każdego odpowiedniego parametru. Zapisz wyniki jako plik .csv do przyszłej analizy w programie statystycznym.
    nuta: Nie jest konieczne rozdzielanie obrazu na składowe kanały fluorescencyjne w celu określenia długości, chyba że występuje zakłócenie sygnału między różnymi kolorami, w którym to przypadku wykonaj krok opisany poniżej.
  6. W przypadku zakłóceń sygnału wybierz Narzędzie Kolor i kanały z menu Obraz i przeanalizuj każdy kolor osobno. Aby zmierzyć długość konstrukcji nieliniowych, kliknij prawym przyciskiem myszy narzędzie Linia i użyj opcji Linia segmentowa lub Linia odręczna, aby obrysować żądane obiekty.
    1. W przypadku konstrukcji liniowych lub w celu określenia odległości między dwoma punktami należy użyć funkcji Linia prosta i wybrać opcję Zmierz z menu Analizuj. Wartości długości w μm zostaną automatycznie dodane do parametrów wybranych wcześniej w opcji Ustaw pomiary.
  7. Aby zmierzyć zmiany wielkości sygnału i intensywności fluorescencji, najpierw utwórz bibliotekę obszarów zainteresowania (ROI), która zwiększa dokładność kwantyfikacji i ułatwia szybkie pomiary na stosie obrazów. Wybierz narzędzie Kolor i kanały w menu Obraz.
  8. W wyskakującym oknie Kanały zaznacz kanał koloru, dla którego będzie mierzona intensywność lub obszar. Wybierz funkcje Dostosuj i Próg w menu Obraz. Zaznacz pole Ciemne tło, wybierz metodę domyślną (chyba że zebrane dane stanowią inaczej) i wybierz czerwony, aby nałożyć interesujące sygnały.
    nuta: Pomiar stabilności, ruchu i lokalizacji białek jest ściśle zależny od progu koloru używanego do tworzenia bibliotek ROI. Ważne jest, aby wybrać odpowiednią metodę progowania dla typu sygnału znacznika fluorescencyjnego, który ma być wizualizowany17,18.
  9. Użyj narzędzia Różdżka, aby podświetlić każdą interesującą Cię strukturę i naciśnij literę T na klawiaturze, aby dodać wybrany ROI do wyskakującego okna menedżera ROI. Powtórz ten proces dla każdego wycinka (klatki czasowej) w stosie obrazów i zapisz wszystkie ROI, klikając przycisk Więcej i wybierając Zapisz.
  10. Otwórz spakowany folder ROI, aby załadować menedżera ROI i kliknij każdy identyfikator ROI na lewym panelu bocznym. Wybierz opcję Zmierz z menu Analizuj i powtórz to polecenie dla każdego identyfikatora ROI, aby określić ilościowo interesujące obiekty we wszystkich wycinkach stosu obrazów.
  11. Jeśli przesuwanie komórek nie stanowi problemu, a płaszczyzna ogniskowej pozostaje taka sama dla wszystkich wycinków stosu, kliknij opcję Wiele miar w menedżerze ROI. W oknie podręcznym wybierz opcję Zmierz wszystkie plasterki zamiast Po jednym wierszu na plasterek, aby iterować pomiary na stosie obrazów. Zapisz wyniki jako plik csv i analizuj pomiary w programie statystycznym.
  12. W przypadku wielu sygnałów jądrowych składających się na strukturę zainteresowania, naciśnij Shift podczas wybierania obiektów za pomocą narzędzia Różdżka, aby utworzyć pojedynczy zwrot akcji. Możesz też utworzyć ROI o stałej wielkości za pomocą narzędzia Owal, aby objąć wszystkie interesujące Cię sygnały.
    nuta: To owalne podejście może być konieczne do zmierzenia i opisania zachowania sygnału w obszarze, w którym sygnał fluorescencji zmienia się pod względem wielkości i intensywności w czasie. Natężenie sygnału w tym przypadku to średnia gęstość sygnału na danym obszarze.
  13. Jakościowo określ kolokalizację dwóch sygnałów fluorescencyjnych na podstawie zmiany koloru obszaru nakładania się sygnału. Jednak w miarę zawężania się strefy kolokalizacji coraz trudniej jest odróżnić nakładanie się sygnałów. W takim przypadku wykonaj czynności opisane poniżej.
  14. Korzystając z narzędzia Kanały, zgodnie z opisem w kroku 5.6, narysuj linię prostą nad każdym sygnałem, o którym mowa, a następnie wybierz polecenie Drukuj profil w menu Analizuj.
    1. Powtórz ten krok dla wszystkich kolorów, o których mowa, używając tej samej narysowanej linii.
    2. W wyskakującym oknie Wykres próbki, które pojawia się po każdym kroku profilowania, naciśnij przycisk Lista, aby wywołać okno Wartości wykresu i zapisz pomiary dla każdego sygnału jako plik csv.
    3. W programie statystycznym utwórz wykres, który przedstawia wartość szarości dla każdego sygnału w odniesieniu do odpowiadającego mu położenia (w μm) wzdłuż narysowanej linii. Brak nakładania się wykresów profilu sygnału ogólnie wskazuje na brak kolokalizacji.
      nuta: Użyj narzędzia Profil wydruku na wyświetlanych obrazach, aby sprawdzić kolokalizację sygnału. Jest to wiarygodne tylko wtedy, gdy takie nakładanie się jest również obserwowane przez stos z-stosu obrazu.
  15. Aby monitorować dynamiczne zachowanie białek fluorescencyjnych w czasie, należy użyć narzędzia Multi Kymograph znajdującego się w menu Analizuj. Uzyskany obraz pokazuje ruch sygnału fluorescencyjnego poprzez serię skondensowanych migawek w każdym wycinku stosu z, który reprezentuje poszczególne punkty czasowe.
    1. Użyj narzędzia Kanały zgodnie z opisem w kroku 5.6, aby wyizolować interesujący obiekt we właściwym kanale. Upewnij się, że wybrany obiekt lub struktura nie przesuwa się znacznie przez stos z. Umieść linię prostą lub prostokąt nad obiektem, wybierz narzędzie Multi Kymograph z menu Analizuj i wprowadź żądaną szerokość linii nakładającej się na obiekt.
  16. Panele obrazu, które pokazują dynamikę jądrową w określonym przedziale czasu, można tworzyć za pomocą narzędzia Kanały zgodnie z opisem w kroku 5.6 oraz wybierając narzędzia Stosy i Utwórz montaż z menu Obraz. W wyskakującym oknie Utwórz montaż wprowadź żądaną liczbę kolumn i wierszy, ustaw współczynnik skali na 1,0, wybierz pierwszy i ostatni plasterek (ramy czasowe) i zmień szerokość obramowania na co najmniej 5 przed naciśnięciem przycisku OK. Możliwe jest wybranie obrazów w stosie do wyświetlenia, zmieniając przyrosty w celu dopasowania do żądanej sekwencji.
    1. Aby wygenerować film, prześlij żądany hyperstack, wybierz Zapisz jako plik avi z menu Plik, wybierz brak dla Kompresja i wprowadź liczbę klatek na sekundę 2-8 kl./s. Wybierz polecenie Utwórz montaż podczas wybierania opcji Kompozyt w narzędziu Kanały, aby scalić lub rozdzielić wszystkie kolory składające się na obraz.
      nuta: W tym protokole znajdują się dwa pliki avi (Movie 1-2). Użyj ich na Fidżi, aby wypróbować różne funkcje wyróżnione w kroku 5.
    2. Aby wyświetlić pojedynczą, reprezentatywną komórkę, użyj polecenia Przekształć i Obróć z menu Obraz i wprowadź stopnie obrotu. Liczby ujemne obracają obiekty w lewo, a wartości dodatnie obracają obiekty w prawo. Gdy komórka znajdzie się we właściwej orientacji, narysuj prostokąt, który obejmuje całą komórkę przez stos z lub w interesujących Cię ramach czasowych i wybierz opcję Przytnij z menu Obraz. Postępuj zgodnie z opisem w krokach 5.16 i 5.16.1, aby wygenerować obraz, panel lub film.
  17. Dodaj pasek skali do panelu obrazu lub filmu, wybierając polecenie Narzędzia i Pasek skali z menu Analizuj. W wyskakującym oknie Podziałka liniowa wprowadź wartość 5–15 w polu Szerokość w mikronach dla pojedynczych komórek lub 100–250 dla całych pól widzenia, wybierz opcję biały lub w polu Kolor i wybierz odpowiednią lokalizację, w której ma zostać umieszczona podziałka liniowa.
    1. W przypadku filmów przydatne jest pokazanie postępu czasu podczas zdarzeń jądrowych. Aby pokazać zmianę czasu między klatkami, wybierz Obraz, kliknij Stosy, użyj narzędzia Znacznik czasu, wskaż klatkę początkową w szeregu czasowym i wybierz odpowiednie miejsce do wyświetlania czasu.

Wyniki

Niezależnie od tego, czy obrazowanie żywych komórek jest stosowane w badaniach mitozy czy mejozy, kluczowe jest wykorzystanie zdrowych komórek drożdży szczelinowych przed przystąpieniem do jakichkolwiek obserwacji. Jakość uzyskanych danych w dużym stopniu zależy od materiału wyjściowego. Jeśli komórki będą głodować z powodu ograniczenia składników odżywczych lub nadmiernego zagęszczenia, wykażą one nadmierną obecność wakuol oraz zmniejszenie rozmiaru komórek (Głodzenie, Rycina 2A). W eksperymentach dotyczących mitozy najlepiej unikać stosowania komórek wykazujących stres komórkowy (Głodzenie, Rycina 2A). W przeciwnym razie wyniki eksperymentalne będą niespójne i niepowtarzalne. Aby uniknąć tego ograniczenia, należy dobrać odpowiednie kontrole typu dzikiego i zapoznać się z różnymi fenotypami badanych mutantów. Na przykład komórki mitotyczne głodzone przez 12 h przestają aktywnie replikować DNA. Ponieważ ekspresja Tos4-GFP wiąże się z aktywnością w fazie G1/S22,23, komórki w fazie logarytmicznej niosące ten marker oraz marker podziału jądra (Sad1-DsRed10) wykazują pan-jądrową ekspresję Tos4-GFP, separację ognisk Sad1-DsRed oraz trwającą septację (co sugeruje aktywną replikację DNA i podział komórek) (Log, Rycina 2A), podczas gdy komórki głodzone nie wykazują takiej aktywności (Głodzenie, Rycina 2A). Wynik ten jest zgodny z efektami ograniczenia składników odżywczych u drożdży szczelinowych, co zmniejsza transkrypcję w fazie G1, aktywuje punkt kontrolny cyklu komórkowego G1/S i promuje wejście w fazę G05. W eksperymentach dotyczących mejozy komórki muszą urosnąć do wysokiej gęstości, ale bez osiągania fazy stacjonarnej. Następnie komórki obu typów kopulacyjnych są mieszane i inkubowane razem w pożywce o niskiej zawartości azotu. Brak kopulacji, co ma miejsce w sytuacji, gdy komórki nie są wystarczająco głodzone z azotu, uniemożliwi im wejście w mejozę (Nieefektywne, Rycina 2B). Silna flokulacja zawiesiny komórek kopulujących zwiększa interakcje międzykomórkowe, a tym samym wskazuje na udaną kopulację i efektywną indukcję mejozy (Efektywne, Rycina 2B).

Podkładki z agarozy oraz fizyczna dysrupcja skupisk komórek gwarantują prawidłową wizualizację pojedynczych komórek lub woreczników (Log, Rysunek 2A; Efficient, Rysunek 2B). Podkładki muszą stanowić sztywną, a jednocześnie wilgotną platformę, na której komórki są jednocześnie unieruchamiane i chronione przed wysychaniem. Ponadto podkładki muszą być wystarczająco grube, aby wytrzymać zmiany wynikające z parowania i zapewnić wyrównaną powierzchnię umożliwiającą prawidłowe ustawienie ostrości podczas akwizycji obrazów (Rysunek 1C). Rotacja szkiełka nakrywkowe jest niezbędna do rozdzielenia i rozprzestrzenienia komórek w obrębie agregatów kopulacyjnych (Rysunek 1F; Efficient, Rysunek 2B). Bez tego etapu obserwuje się niewiele woreczników, lecz liczne komórki haploidalne, ponieważ woreczniki zostają uwięzione w niedostępnych warstwach skupisk kopulacyjnych, podczas gdy komórki haploidalne mogą swobodnie zajmować wszystkie dostępne miejsca w monowarstwie (Rysunek 2B). Nawet w eksperymentach mitotycznych, gdzie agregacja komórek jest mniej problematyczna, rotacja szkiełka nakrywkowe przemieszcza komórki po podkładce w celu utworzenia pojedynczej warstwy z wystarczającym odstępem między komórkami, co redukuje efekty zatłoczenia i umożliwia duplikację komórek (Log, Rysunek 2A).

Atb2 jest komponentem α-tubuliny zaangażowanym w segregację chromosomów podczas mitozy i mejozy drożdży rozszczepiających7,14. Po oznaczeniu fluorescencyjnym ten komponent cytoszkieletu umożliwia badanie etapów charakteryzujących separację jąder w mitozie. Podczas profazy (0’-20’, Rysunek 3A), nukleacja wrzeciona mitotycznego zachodzi po stronie jądrowej ciałek bieguna wrzeciona (SPBs), co wykazują włókna Atb2-mRFP na tle pan-jądrowego sygnału Htt1-GFP5. Podczas przejścia z metafazy do anafazy (20’-40’, Rysunek 3A) wrzeciono mitotyczne rozciąga się na zewnątrz, a jądro dzieli się na dwa. Gdy komórka wchodzi w telofazę (60’-80’, Rysunek 3A), Atb2-mRFP rozszerza się dwukierunkowo, aż chromosomy zostaną całkowicie odseparowane. Po tym momencie włókna Atb2-mRFP regroupują się i rozprzestrzeniają po powierzchni komórki, aby powrócić do formy interfazowej w każdej z powstałych komórek potomnych. Cytokineza (>120’, Rysunek 3A) następuje dopiero po utworzeniu przegrody, która dzieli komórkę poprzez rozszczepienie. Śledzenie zmian natężenia sygnału Hht1-GFP w cyklu mitotycznym ujawnia trzy ważne etapy dynamiki jądra: metafaza-anafaza (średnie natężenie, kondensacja DNA: 20’-40’, Rysunek 3A-B), telofaza (niskie natężenie, separacja DNA: 60’-80’, Rysunek 3A-B) oraz faza G1 (rosnące natężenie, duplikacja DNA: 100’-120’, Rysunek 3A-B). Podobnie, stosując komórki posiadające jedynie Hht1-mRFP i wykorzystując narzędzie multi-kymograph (patrz krok 5.15) w programie Fiji, możliwe jest obserwowanie podziału mitotycznego od metafazy do telofazy oraz ocena ruchów jądrowych towarzyszących prawidłowej segregacji chromatyd siostrzanych (Normal, Rysunek 3C). Kymografy błędnej segregacji wykazują aktywność sygnału pomiędzy dwiema głównymi ścieżkami jądrowymi, co wskazuje na możliwą błędną segregację wynikającą z fragmentacji chromosomów lub nieprawidłowej separacji chromatyd (Lagging, Rysunek 3C).

Jak wspomniano wcześniej, u drożdży pączkujących i dzielących się Tos4 jest transkrybowany w fazie G1 i pełni swoją funkcję podczas replikacji DNA w fazie S22,23. Można to zaobserwować na kymografie, gdzie ekspresja Tos4-GFP w jądrze wzrasta po przesunięciu się ognisk Sad1-DsRed10 w przeciwnych kierunkach (co wskazuje na podział jądra), ale przed powstaniem przegrody, która poprzedza cytokinezę (39’, Rysunek 3D; 36’, Rysunek 3E). Faza wysokiej aktywności Tos4-GFP rozpoczyna się pod koniec przejścia M-G1/S (45’, Rysunek 3E) i kończy się w fazie G2 (>60’, Rysunek 3E), bezpośrednio po podziale komórki. Chociaż w fazie G1 sygnał Tos4-GFP jest silnie rozproszony, jego intensywność wzrasta po anafazie i w trakcie całej fazy S, ko-lokalizując się z rozdzielonymi ogniskami Sad1-DsRed (45’-60’, Rysunek 3E). Wynik ten ujawnia okres septacji u drożdży dzielących się, w którym w komórkach potomnych rozpoczęła się duplikacja genomu (G1/S), ale nie nastąpiła jeszcze cytokineza.

Hht1 to histona H3 u drożdży szczelinowych, która jest powszechnie modyfikowana znacznikami fluorescencyjnymi w celu wizualizacji jądrowego DNA5,14. W mitozie, gdy komórki przechodzą z metafazy do telofazy (20’-120’, Rysunek 3A), obserwuje się dwie wyraźne zmiany masy jądrowej. Pierwsza zmiana polega na skurczeniu się rozmiaru jądra w metafazie (20’, Rysunek 3A), natomiast druga pokazuje podział jądra podczas anafazy (40’, Rysunek 3A). Poza tymi zmianami wspólnymi z komórkami mitotycznymi, komórki mejotyczne wykazują oscylacje jądra (tzw. horse-tailing) (-100’ do -50’, Rysunek 4A-B) podczas rekombinacji homologicznej oraz dalszą redukcję rozmiaru jądra pod koniec anafazy II (70’-90’, Rysunek 4A). Hht1-mRFP jest wykorzystywane do badania fenotypów błędnej segregacji, takich jak chromosomy opóźnione lub pofragmentowane (Lagging, Rysunek 3C). Jest ono również stosowane do obserwacji i opisu dynamiki jądra w każdej z faz mejozy (Rysunek 4A-B). Masa jądrowa jest duża i jej rozmiar fluktuuje przez znaczną część procesu horse-tailing (HT: -100’ do -50’, Rysunek 4A-B)). Gdy komórki wchodzą w metafazę (MT: -40’ do 0’, Rysunek 4A-B), rozmiar jądra i jego oscylacje zmniejszają się, co jest zgodne ze zwiększoną aktywnością kondensacji na tym etapie. Początek zarówno anafazy I (MI: 10’-60’, Rysunek 4A-B), jak i II (MII: 70’-90’, Rysunek 4A-B) wiąże się z dalszą redukcją jądra i brakiem jego ruchu, co dobrze koreluje z dwoma podziałami jądra charakterystycznymi dla mejozy I i II (MI & MII). Zatem mejoza wiąże się z fluktuacjami rozmiaru jądra podczas ustawiania się i rekombinacji chromosomów homologicznych oraz z redukcjami rozmiaru jądra po dwóch rundach rozdzielania chromosomów. Allele zmieniające tę dynamikę jądrową są prawdopodobnie związane z regulacją stabilności genomu w mejozie12,13.

Rec8 jest podjednostką α-kleisyny meiotycznej kohezyny u drożdży szczelinowych. Jest on ładowany na chromatynę po replikacji DNA (mei-S) i utrzymuje siostrzane chromatydy w połączeniu aż do anafazy II. Po metafazie I Rec8 jest usuwany z ramion chromosomów przez separazę i chroniony w centromerze przez Sgo1-PP2A. Na koniec segregacji homologów Rec8 jest również eliminowany z centromeru, co umożliwia rozdzielenie siostrzanych chromatyd (Rysunek 5A)6,24. Rec8-GFP wraz z markerami segregacji chromosomów, takimi jak Sad1-DsRed lub Hht1-mRFP, umożliwiają wizualizację dynamiki kohezji podczas mejozy. Sygnał Rec8-GFP jest rozproszony w całym jądrze podczas mei-S (<<-90’, Rysunek 5A-B), profazy I (-90’ do -50’, Rysunek 5A-B) oraz metafazy I (-40’ do 0’, Rysunek 5A-B). Obserwacja ta ujawnia asocjację Rec8-GFP wzdłuż osi chromosomów następującą po duplikacji DNA. Gdy komórki wchodzą w anafazę I (10’, Rysunek 5A-B), intensywność Rec8-GFP spada w całym jądrze, lecz pozostaje silna w centromerze, gdzie tworzy ognisko w każdej masie jądrowej (20’-70’, Rysunek 5A-B). Wynik ten jest zgodny z degradacją Rec8-GFP wzdłuż ramion chromosomów, ale nie w centromerze, która następuje po segregacji homologów. Przed anafazą II ognisko Rec8 znika, uwalniając siostrzane chromatydy do rozdzielenia w MII (70’-80’, Rysunek 5A-B). Marker Rec8-GFP jest zatem użyteczny do badania warunków zaburzających ustanawianie, usuwanie i ogólną stabilność kohezji meiotycznej. W połączeniu z markerem podziału jądra, takim jak Hht1-mRFP5,13, Rec8-GFP może być wykorzystany do odpowiedzi na pytania o to, jak czas trwania i stabilność kohezji przed i w trakcie mejozy wpływają na prawidłową segregację chromosomów12,13. Niniejszy protokół nie odnosi się do białek, których dynamika zachodzi głównie w cytozolu. Jednak Tabela I przedstawia kilka białek cytozolowych powszechnie stosowanych do badania procesów cytoszkieletu i błon niezbędnych m.in. do endocytozy, egzocytozy i cytokinezy.

Schemat zestawu do statycznej chromatografii równowagowej; szkiełka przedmiotowe, zakraplacze, badanie absorpcji.
Rycina 1: Przygotowanie podkładek agarozowych do obrazowania żywych komórek. (A) Zestaw do przygotowania szkiełek złożony z uchwytu końcówki pipety, taśmy laboratoryjnej i szkiełek przedmiotowych. Umieszczenie szkiełek prostopadle do siebie tworzy kieszeń, w której formuje się podkładka agarozowa. Dodanie kawałków taśmy laboratoryjnej po bokach pozwala dostosować szerokość podkładki agarozowej do wymaganych specyfikacji. (B) Stopioną agarozę pozostawia się do ostygnięcia przed nałożeniem na szkiełka przedmiotowe w celu utworzenia podkładek. Na tym etapie konieczne jest powolne dozowanie objętości agarozy, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza. (C) Górne szkiełko kładzie się na naniesionej kropelce agarozy, aby utworzyć okrągłą podkładkę o gładkiej powierzchni, równych krawędziach i bez widocznych pęknięć agarozy. (D) Po naniesieniu próbki zawiesiny komórkowej na podkładkę agarozową, należy odwrócić szkiełko i położyć je na niepozostawiającym włókien ręczniku papierowym, aby usunąć nadmiar cieczy podłoża. (E) Ostrożnie nałożyć szkiełko nakrywkowe na podkładkę agarozową, upewniając się, że nie uwięziono pęcherzyków powietrza oraz sprawdzając, czy płaszczyzna ostrości jest płaska, aby uniknąć przesuwania się komórek i problemów z ustawieniem ostrości. (F) Powoli i ostrożnie obrócić szkiełko nakrywkowe zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby rozbić skupiska komórek i wytworzyć monowarstwę komórek, co umożliwia ich ekspansję i lepszą wizualizację. (G,H) Użyć podgrzanej mieszaniny węglowodorów do uszczelnienia podkładek agarozowych i pozwolić im wyrównać temperaturę do pożądanej wartości przed obrazowaniem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna komórek drożdży; znakowanie Tos4-GFP i Sad1-DsRed, analiza wydajności kojarzenia.
Rysunek 2: Wybór odpowiednich komórek. (A) Górne panele przedstawiają komórki drożdży szczelinowych pozostawione do głodzenia w pożywce EMM z dodatkami przez 72 h, a dolny panel przedstawia komórki w fazie wzrostu logarytmicznego. W komórkach pozostawionych do głodzenia widoczna jest niewielka morfologia komórek. Czerwona otwarta strzałka wskazuje granulacje wakuolarne charakterystyczne dla głodzenia. W kulturach logarytmicznych dominuje komórki o wydłużonej morfologii z widocznymi przegrodami (czerwona strzałka), co wskazuje na aktywną dynamikę cyklu komórkowego. Panele po prawej stronie przedstawiają komórki wykazujące sygnały Tos4-GFP i Sad1-DsRed podczas głodzenia i proliferacji. Ekspresja pan-jądrowa Tos4-GFP oraz sygnały Sad1-DsRed lokalizujące się na przeciwległych biegunach komórki są widoczne podczas aktywnej proliferacji, ale nie podczas głodzenia. (B) Górny panel przedstawia komórki tego samego typu kojarzenia (h+), które nie kojarzą się wydajnie. Czerwona otwarta strzałka wskazuje parę komórek wakuolarnych przechodzących kariogamię. Nie jest to zjawisko rzadkie w kulturach komórek h+, gdzie 10% komórek może zmienić typ kojarzenia na h-. Dolny panel przedstawia worki zarodnikowe powstałe w wyniku wydajnego kojarzenia. Zygotyczne worki zarodnikowe przyjmują różne formy, w tym kształty zygzakowate (czerwona strzałka) i bananowate (czerwona otwarta strzałka). Pasek skali = 5 µm długości. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces mitozy, segmentacja komórki; BF, Atb2-mRFP, Hht1-GFP; schemat, analiza microscopy time-lapse.
Rycina 3: Dynamika jądrowa podczas mitozy. (A) Śledzono białka histony H3 (Hht1-GFP) i mikrotubule (Atb2-mRFP) podczas jednego cyklu mitozy (120 min). Poszczególne sygnały dla Hht1-GFP i Atb2-mRFP przedstawiono na panelach czarno-białych, natomiast nakładka BF pokazuje je w ich odpowiednich kolorach. (B) Ilościowe określenie intensywności Hht1-mGFP w cyklu mitotycznym. Zmiana poziomu Hht1 wskazuje na podział jądra podczas mitozy oraz duplikację DNA w fazie G1. (C) Kymografy przedstawiające prawidłową lub nieprawidłową segregację w mitozie, w której wynikające z tego ścieżki jądrowe albo rozwidlają się i zachowują integralność DNA, albo odchylają i sprzyjają fragmentacji chromosomów lub przedwczesnej separacji chromatyd. (D,E) Panele kymograficzne i mikrograficzne pokazujące czas trwania przejścia z fazy M do G1/S, ujawniony przez segregację Sad1-DsRed i pojawienie się jądrowych sygnałów Tos4-GFP. Należy zwrócić uwagę na środkowe panele w E , które zostały wygenerowane przy użyciu funkcji FIRE LUT w programie Fiji w celu utworzenia gradientowej mapy termicznej intensywności, co ułatwia identyfikację punktów o wysokiej ekspresji Tos4-GFP; w tym przypadku zlokalizowanych w jądrze i nakładających się na sygnały Sad1-DsRed, zgodnie z oczekiwaniami. Pasek skali = 5 µm długości. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dynamika jądrowa w mejozie; schemat z powierzchnią jądra, długością osi w funkcji czasu; połączone obrazy mikroskopowe.
Rycina 4: Dynamika jądrowa w mejozie. (A) Seria paneli przedstawiająca ruch, kondensację i podział jądra (Hht1-mRFP) podczas mejozy. Ruch typu „horse-tailing” (HT) wykazuje rozległe oscylacje jądra na boki, po których następuje metafaza (MT), w której boczny ruch jądra maleje i całkowicie ustaje tuż przed anafazą I. W mejozie I (MI) główna masa jądrowa dzieli się na dwie, natomiast w mejozie II (MII) w procesie rozdzielania chromatyd siostrzanych powstają cztery jądra. (B) Ilościowa ocena zmian powierzchni jądra (Hht1-mRFP) w profazie, metafazie, MI i MII. Powierzchnia jądra jest dynamiczna podczas oscylacji HT, ulega kondensacji w MT i dalej zmniejsza się w MI i MII, gdzie obserwuje się niewielki ruch jądra (Long Nuclear Axis). Pomiar najdłuższej osi jądra (Long Nuclear Axis) opiera się na założeniu, że gdy okrąg się rozciąga, przestaje mieć stałą średnicę i generuje co najmniej dwie główne osie: długą i krótką. Zatem podczas monitorowania zmian w jądrze, zmiany w osi długiej lub krótkiej dostarczają informacji o ruchu jądra. Pasek skali = 5 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dynamika kohezyny meiotycznej; wykres; powierzchnia jądra, poziomy kohezyny w funkcji czasu podczas etapów mejozy, MI, MII.
Rycina 5: Dynamika kohezyny meiotycznej. (A) Seria paneli pokazująca, jak zmiana sygnału Rec8-GFP koreluje z dynamiką jądra meiotycznego. Podczas HT i MT sygnał Rec8-GFP jest rozproszony w całym jądrze i podąża za ruchem jądra (Hht1-mFRP). W MI sygnał Rec8-GFP zanika z jądra, pozostawiając jedynie parę ognisk, co jest zgodne z usuwaniem Rec8 z ramion chromosomów i ustanowieniem ochrony Sgo1-PP2A w centromerze. Gdy komórka zbliża się do MII, ogniska Rec8-GFP zaczynają znikać i nie są już widoczne bezpośrednio przed anafazą II. (B) Ilościowe określenie intensywności Rec8-GFP od HT do MII. Podobnie jak widać w panelu A, sygnał GFP jest wysoki przez HT i MT, ulega znacznemu zmniejszeniu podczas MI i całkowicie znika w MII. Wzorzec ten potwierdza dynamikę kohezyny w ramionach chromosomów i centromerze, gdzie utrzymuje ona połączenie chromatyd siostrzanych aż do momentu ich rozdzielenia w MII. Pasek skali = 5 µm długości. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

BiałkoFunkcjaUwagiZnacznikReferencje
Hht1Histona H3 uczestnicząca w upakowaniu DNAStosowana do badania dynamiki chromosomówHht1-mRFP5,14
Tos4Funkcja Tos4 występuje w fazie G1Wykorzystywana do badania czasu trwania fazy G1Tos4-GFP22,23
Rad21/ Rec8Podjednostki kohezyny uczestniczące w utrzymywaniu siostrzanych chromatyd razem po replikacjiStosowane do analizy stabilności kohezji podczas segregacji mitotycznej (Rad21) i meiotycznej (Rec8)Rad21-GFP/Rec8-GFP6,24
Rad11Aktywność RPA występuje podczas naprawy DNA w mitozie, rekombinacji meiotycznej i kończy się w metafazieWykorzystywana do badania naprawy DNA w mitozie i dynamiki rekombinacji w mejozieRad11-YFP5,13
Rad52Aktywność Rad52 odbywa się podczas naprawy DNA w mitozie i rekombinacji meiotycznejWykorzystywana do badania naprawy DNA w mitozie i dynamiki rekombinacji w mejozieRad52-CFP5,13
Cnp1Histona H3 CENP-A lokalizuje się specyficznie w centromerzeStosowana do śledzenia dynamiki segregacji chromosomów w mitozie i mejozieCnp1-mCherry13
Swi6Białko homologiczne do HP1 uczestniczące w tworzeniu heterochromatynyWykorzystywana do badania mobilizacji heterochromatyny w centromerach i telomerachSwi6-GFP13
Sad1Sad1 uczestniczy w lokalizacji ciała bieguna wrzeciona w otoczce jądrowejWykorzystywana do analizy segregacji chromosomów w mitozie i mejozieSad1-mCherry10
CYTOSOL I BŁONY
Atb2Tubulina alfa 2 uczestnicząca w organizacji cytoszkieletu mikrotubularnegoStosowana do badania segregacji chromosomów w mitozie i mejozieAtb2-mRFP7,14
Ync13Regulator egzocytozy i endocytozy uczestniczący w transporcie za pośrednictwem pęcherzykówWykorzystywana do badania integralności ściany komórkowej podczas cytokinezyYnc13-mECitrine25
Rlc1Podjednostka miozyny II uczestnicząca w kurczeniu pierścienia kontraktylnegoStosowana do badania dynamiki dojrzewania i kurczenia przegrodyRIc1-mCherry25
Ccr1Reduktaza NADPH-cytochrom p450 będąca częścią ER, błony plazmatycznej i zewnętrznej błony mitochondrialnejWykorzystywana do badania dynamiki związanej z błonami, takiej jak endocytoza, egzocytoza i cytokinezaCcr1N-GFP5
Gef1Czynnik wymiany guanilotydów Rho uczestniczący w ustanawianiu i utrzymywaniu polarności komórkiStosowany do badania globalnej dynamiki polarności komórki zależnej od mikrotubulGef1-mCherry-GBP26
Fus1Formina uczestnicząca w montażu ognisk fuzji aktyny podczas cytogamiiStosowana do badania dynamiki fuzji związanej z kopulacją drożdży rozszczepiającychFus1-sfGFP27
Mnn9Podjednostka mannozylotransferazy uczestnicząca w N-glikozylacji białek w aparacie GolgiegoWykorzystywana do badania dojrzewania ładunku w aparacie Golgiego podczas jego przemieszczania się z części cis-Golgiego do trans-GolgiegoMnn9-mCherry28
Num1Kortykalny czynnik kotwiczący dyneinę uczestniczący w ruchu „końskiego ogona” (horse-tailing)Stosowany do badania zależnego od mitochondriów kotwiczenia dyneiny podczas oscylacji jądra w profazie I mejozyNum1-yEGFP29

Tabela 1: Markery dynamiki jądrowej i cytozolowej.

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej komórki bakteryjnej z markerami DNA, podkreślający lokalizację genetyczną.
Film 1: Przejście M-do-G1/S pokazujące separację ciała bieguna wrzeciona (SPB; Sad1-DsRed) poprzedzającą septację i akumulację sygnału jądrowego Tos4-GFP. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej, struktura chromosomów, znakowanie centromerów, badanie lokalizacji genów.
Film 2: Zakończenie cyklu mitotycznego ukazujące wydłużanie się mikrotubul (Atb2-mRFP) korelujące z podziałem jądra (Hht1-GFP). Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Dyskusja

Obrazowanie żywych komórek podczas mitozy i mejozy daje możliwość zbadania dynamiki jądrowej bez znacznego zakłócania fizjologii drożdży rozszczepialnych podczas pozyskiwania danych. Należy jednak zachować ostrożność, aby komórki rosły do pożądanej gęstości wolnej od stresów środowiskowych; a w przypadku mejozy, że komórki są obrazowane w czasie końcowego różnicowania i nie za wcześnie ani późno. Nadmierne stłoczenie komórek, głód i nieodpowiednie temperatury wzrostu są częstymi czynnikami, które przyczyniają się do niepowtarzalnych obserwacji. Ponadto podczas budowy szczepu ważne jest, aby sprawdzić, czy znaczniki fluorescencyjne nie zakłócają funkcji genów docelowych ani nie wpływają na ogólną sprawność komórek. Brak dokładnego zbadania fenotypów szczepów zawierających markery fluorescencyjne może skutkować niespójnymi i nieporównywalnymi wynikami w przypadku podobnych genotypów.

Chociaż mikroskopowe podkładki agarozowe są proste w montażu, mogą również stanowić przeszkodę w uzyskaniu cennych danych obrazowych. Tworzenie wacików agarozowych jest tak proste, jak umieszczenie trzech szkiełek mikroskopowych równolegle do siebie, dozowanie stopionej agarozy na środkowym szkiełku i umieszczenie szkiełka, które przecina górną część pozostałych szkiełek. Przydatne jest jednak zmontowanie aparatu do tworzenia szkiełek, który pozwala na modyfikację szerokości w celu wytworzenia odpornych, specyficznych dla sytuacji wkładek agarozowych. Prosty preparat do tworzenia preparatów, który zapewnia elastyczność szerokości elektrod, składa się z platformy (uchwytu końcówek do pipet lub stołu), dwóch szkiełek mikroskopowych i taśmy laboratoryjnej działającej jako mechanizm regulacji szerokości pada (ilustracja 1A). Dokładna grubość podkładki będzie zależeć od wymagań dotyczących czasu obrazowania, marki agarozy, temperatury, uszczelniacza do szkiełek nakrywkowych, szybkości parowania itp. Dlatego ważne jest, aby skalibrować system obrazowania przed pozyskaniem danych, aby zwiększyć odtwarzalność techniczną i poprawić jakość obrazowania żywych komórek 1,2,3. Powierzchnia, sztywność i kompozycja padu są niezbędne podczas długotrwałej akwizycji obrazu. Agaroza ma niską fluorescencję tła, łatwo się formuje, a przy odpowiednim stężeniu wytrzymuje odkształcenia strukturalne spowodowane parowaniem. Co więcej, połączenie pożywek drożdżowych rozszczepialnych z agarozą nie wpływa negatywnie na jakość obrazu i pozwala na rozszerzoną obserwację wielu cykli mitoz i mejozy. Ważne jest również, aby unikać pęcherzyków powietrza w mikroskopii poklatkowej. Wewnątrz płatków agarozowych i w próbce kieszenie powietrzne rozszerzają się z czasem, powodując przesuwanie się komórek i zakłócając płaszczyzny ogniskowe. Pod warunkiem, że komórki są skutecznie rozprowadzane przez rotację szkiełka nakrywkowego, naukowcy mogą śledzić procesy mitotyczne na przestrzeni kilku pokoleń i zdarzenia mejotyczne od fuzji jądrowej do zarodnikowania. Wykonanie i wybór odpowiedniej podkładki do eksperymentów obrazowych wymaga czasu, ale raz osiągnięty, może przyczynić się do bardzo pouczających obserwacji mikroskopowych.

Podobnie jak w przypadku innych metod, mikroskopia żywych komórek nie jest wolna od ograniczeń technicznych. Stosowanie białek znakowanych fluorescencyjnie wprowadza granice do eksperymentów, które ograniczają zakres tego, co można badać. Fotowybielanie i fototoksyczność to problemy typowe dla długotrwałej akwizycji obrazu. Można im przeciwdziałać, nie wystawiając komórek na działanie krótkich fal zbyt długo lub zbyt często. W przypadku eksperymentów z udziałem GFP, CFP, YFP, mRFP i DsRed, typowych białek fluorescencyjnych stosowanych w obrazowaniu żywych komórek drożdży rozszczepialnych, do rutynowych eksperymentów stosuje się 5-15% światła wzbudzającego i czas ekspozycji 100-500 ms. Parametry te zmieniają się jednak w zależności od specyficznych wymagań eksperymentu badacza. Ponadto stosy Z składające się z 9-13 sekcji w odstępach 0,5 μm przy użyciu obiektywu 60x wystarczą, aby określić grubość rozszczepienia komórki drożdży. Ponadto ważne jest, aby potwierdzić, że markery fluorescencyjne nie zakłócają prawidłowej regulacji lub funkcji docelowych białek ani nie generują fałszywych fenotypów. W związku z tym wskazane jest konstruowanie szczepów zawierających różne znaczniki fluorescencyjne i powinowactwa do tego samego genu docelowego, aby potwierdzić obserwacje w różny sposób. Ponadto obowiązkiem badaczy jest zapewnienie, aby parametry eksperymentalne mogły być odtwarzane w różnych eksperymentach oraz aby zebrane dane nadawały się do dalszej analizy 1,3. Żadna technologia nie zastąpi sprawdzonej praktyki skrupulatnej walidacji systemów eksperymentalnych przez uważną obserwację i rygorystyczne badanie liniowości w wykrywaniu sygnałów fluorescencyjnych.

Wreszcie, ważne jest, aby analizować dane mikroskopowe w formatach, które nie modyfikują surowych obrazów. Fidżi zapewnia doskonałe narzędzia dokumentacyjne do śledzenia pomiarów surowych danych i umożliwia naukowcom badanie różnych parametrów komórek podczas jednej sesji. Te cechy, a także bogactwo samouczków online i obszerny zakres literatury, sprawiają, że Fidżi jest ważnym narzędziem do pomiaru, analizy i prezentacji danych obrazowania żywych komórek, które opisują dynamikę jądrową drożdży rozszczepialnych w mitozie i mejjozie.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Natalii La Fourcade i Mon LaFerte za uczynienie przygotowania tego rękopisu przyjemniejszym przedsięwzięciem. Podziękowania dla członków Laboratorium w Forsburgu, którzy przyczynili się do ukończenia tej pracy swoim wglądem, pomysłami na eksperymenty i wsparciem moralnym. Projekt ten był wspierany przez NIGMS R35 GM118109 SLF.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Soczewka obiektywowa Plan Apochromat 60xOlympusAMEP4694
AdenineSigmaA-8751
Agar7558BIB4917-10 kg
AgarozaSigmaA9539-500g
Rotator tancerki brzuchaStovallUS Patent #4.702.610
BiotynaSigmaB-4501
Kwas borowySigmaB-6768-5kg
CaCl2· 2H20,SigmaC3306-500G
Kwas cytrynowySigmaC-0759
Wtyczka oprogramowania Convolve 3DOptiNav, Inc.n/a
Kamera CCD CoolSnap HQRopern/a Szkiełko
nakrywkoweVWR16004-302
CuSO4· 5H20,ENDCX-2185-1
Dekonwoluacyjny mikroskop fluorescencyjny DeltaVisionGE Healthcare/Applied Precisionn/a
Wtyczka oprogramowania Diffraction PSF 3DOptiNav, Inc.n/a
Edinburgh minimal medium (EMM) NotrogenSunrise2023; 1kg
FeCl2· 6H2OENDFX9259-04
GlukozaSigmaG-7021
Płyta grzewczaBarnsteadThermo Lyne
HistidineSigmaH8125-100g
Oprogramowanie do dekonwolucji HuygensSVIn/a
Oprogramowanie do dekonwolucji ImarisBitplanen/a
InkubatorShell lab#3015
InositolSigmaI-5125
Iteracyjna wtyczka oprogramowania Deconvolve3D OptiNav, Inc.
KClMallinckvadt6858-04
LanolinaSigmaL7387-1kg
LeucineSigmaL8912-100g
LizynaSigmaL5626-500g
Ekstrakt słodowy (ME)MP4103-032
MgCl2· 6H20AMRESCO0288-500G
MetaMorphMolecular Devicesbrak
Szkiełka mikroskopoweVWR16004-422
MnSO4,Mallinckvadt6192-02
Kwas molibdowySigmaM-0878
Na2S04 Mallinckvadt8024-03
Kwas nikotynowy,SigmaN-4126
Kwas pantotenowySigmaP-5161
Wosk parafinowyFishers80119WX
Pomedium glutaminianu Pombe (PMG)Sunrise2060-250
softWorx v3.3 oprogramowanie do przetwarzania obrazuGE Healthcaren/a
Sporulacja Medium w proszkuSunrise1821-500
Wirówka z kontrolowaną temperaturąBeckmanAllwgra 6KR xentrifuge
UracilAMRESCO0847-500g
WazelinaEqualineF79658
Ekstrakt drożdżowyEMD1.03753.0500
Ekstrakt drożdżowy plus suplementy (TAK)Sunrise2011-1kg
ZnSO4· 7H2OJ.T.Baker4382-04
brak

Bibliografia

  1. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy–tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
  2. Green, M. D., Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Microscopy techniques to examine DNA replication in fission yeast. DNA Replication. (13-41), Humana Press. New York, NY. (2015).
  3. Lee, J. Y., Kitaoka, M. A beginner’s guide to rigor and reproducibility in fluorescence imaging experiments. Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1519-1525 (2018).
  4. Ohkura, H. Meiosis: an overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a015859(2015).
  5. Sabatinos, S. A., Ranatunga, N. S., Yuan, J. P., Green, M. D., Forsburg, S. L. Replication stress in early S phase generates apparent micronuclei and chromosome rearrangement in fission yeast. Molecular Biology of the Cell. 26 (19), 3439-3450 (2015).
  6. Ding, D. Q., Matsuda, A., Okamasa, K., Nagahama, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Meiotic cohesin-based chromosome structure is essential for homologous chromosome pairing in Schizosaccharomyces pombe. Chromosoma. 125 (2), 205-214 (2016).
  7. Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates. PloS One. 7 (1), e30622(2012).
  8. Klutstein, M., Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Cooper, J. P. The telomere bouquet regulates meiotic centromere assembly. Nature Cell Biology. 17 (4), 458-469 (2015).
  9. Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates. PloS One. 7 (1), e30622(2012).
  10. Cooper, J. P., Watanabe, Y., Nurse, P. Fission yeast Taz1 protein is required for meiotic telomere clustering and recombination. Nature. 392 (6678), 828-831 (1998).
  11. Reyes, C., Serrurier, C., Gauthier, T., Gachet, Y., Tournier, S. Aurora B prevents chromosome arm separation defects by promoting telomere dispersion and disjunction. Journal of Cell Biology. 208 (6), 713-727 (2015).
  12. Mastro, T. L., Forsburg, S. L. Increased meiotic crossovers and reduced genome stability in absence of Schizosaccharomyces pombe Rad16 (XPF). Genetics. 198 (4), 1457-1472 (2014).
  13. Escorcia, W., Forsburg, S. L. Destabilization of the replication fork protection complex disrupts meiotic chromosome segregation. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2978-2997 (2017).
  14. Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Tomita, K., Cooper, J. P. Telomeres and centromeres have interchangeable roles in promoting meiotic spindle formation. Journal of Cell Biology. 208 (4), 415-428 (2015).
  15. Forsburg, S. L., Rhind, N. Basic methods for fission yeast. Yeast. 23 (3), 173-183 (2006).
  16. Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe. Methods in enzymology. 470, Academic Press. 759-795 (2010).
  17. Diffraction PSF 3D. , Available from: http://www.optinav.info/Diffraction-PSF-3D.htm (2019).
  18. Optinav.info. Convolve ED. , Available from: http://www.optinav.info/Convolve_3D.htm (2019).
  19. Optinav.info. Iterative Deconvolve. , Available from: http://www.optinav.info/Iterative-Deconvolve-3D.htm (2019).
  20. Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide — IJ 1.46. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2019).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. De Oliveira, F. M. B., Harris, M. R., Brazauskas, P., De Bruin, R. A., Smolka, M. B. Linking DNA replication checkpoint to MBF cell‐cycle transcription reveals a distinct class of G1/S genes. The EMBO Journal. 31 (7), 1798-1810 (2012).
  23. Ostapenko, D., Burton, J. L., Solomon, M. J. Identification of anaphase promoting complex substrates in S. cerevisiae. PLoS One. 7 (9), e45895(2012).
  24. Watanabe, Y., Nurse, P. Cohesin Rec8 is required for reductional chromosome segregation at meiosis. Nature. 400 (6743), 461-464 (1999).
  25. Zhu, Y. H., Hyun, J., Pan, Y. Z., Hopper, J. E., Rizo, J., Wu, J. Q. Roles of the fission yeast UNC-13/Munc13 protein Ync13 in late stages of cytokinesis. Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2259-2279 (2018).
  26. Tay, Y. D., Leda, M., Goryachev, A. B., Sawin, K. E. Local and global Cdc42 guanine nucleotide exchange factors for fission yeast cell polarity are coordinated by microtubules and the Tea1–Tea4–Pom1 axis. Journal of Cell Science. 131 (14), jcs216580(2018).
  27. Dudin, O., Bendezú, F. O., Groux, R., Laroche, T., Seitz, A., Martin, S. G. A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast. Journal of Cell Biology. 208 (7), 897-911 (2015).
  28. Kurokawa, K., et al. Visualization of secretory cargo transport within the Golgi apparatus. Journal of Cell Biology. , jcb-201807194 (2019).
  29. Kraft, L. M., Lackner, L. L. A conserved mechanism for mitochondria-dependent dynein anchoring. Molecular Biology of the Cell. , mbc-E18 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mitoza Mejozaznakowanie fluorescencyjneprzygotowanie pod o a agarozowegosynchronizacja kom rekanaliza w programie Fijiobrazowanie Z stacksegregacja chromosom w
Badanie dynamiki jądrowej drożdży rozszczepienia mitotycznego i mejotycznego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.