Artykuł metodologiczny

Różnicowanie śródbłonka hemogennego od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w zdefiniowanym stanie wolnym od karmnika i ksenotypu

10.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59823

⸱

16 czerwca 2019

 ,  ,  , 
1Center for iPS cell research and application (CiRA)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół precyzyjnego tworzenia hemogennego śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w stanie wolnym od karmów i kseno. Metoda ta będzie miała szerokie zastosowanie w modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych pod kątem związków terapeutycznych.

Streszczenie

Pozyskiwanie funkcjonalnych hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) było nieuchwytnym celem dla autologicznych przeszczepów w leczeniu chorób hematologicznych i złośliwych. Śródbłonek hemogenny (HE) jest podatną platformą do wytwarzania funkcjonalnych HSPC przez czynniki transkrypcyjne lub do indukowania limfocytów w solidny sposób. Jednak obecne metody oznaczania HE są albo kosztowne, albo mają zmienną wydajność. W tym protokole ustaliliśmy opłacalną i precyzyjną metodę oznaczania HE w ciągu 4 dni w zdefiniowanych warunkach wolnych od feederu i kseno. Powstały w ten sposób HE przeszedł przemianę śródbłonkową do krwiotwórczej i wytworzył klonogenne komórki progenitorowe hematopoetyczne CD34 + CD45 +. Potencjalna zdolność naszej platformy do generowania funkcjonalnych HSPC będzie miała szerokie zastosowanie w modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych pod kątem związków terapeutycznych.

Wprowadzenie

Rozwój nowych metod leczenia zaburzeń hematologicznych i immunologicznych został utrudniony przez brak solidnych platform do modelowania chorób i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków z autologicznymi hematopoetycznymi komórkami macierzystymi (HSC) pochodzącymi z pacjentów z pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC). Przełom w technologii indukowanych (i)PSC daje nadzieję na modelowanie chorób na podstawie komórek pacjenta, ale ustanowienie funkcjonalnych HSC z iPSC pacjentów było nieuchwytne. Aby uzyskać HSC od ludzkich PSC, kluczowa jest prawidłowa indukcja embrionalnych wzorców i programów transkrypcyjnych1,2,3,4,5,6,7,8. Niedawny postęp w rozwoju układu krwiotwórczego wykazał rolę śródbłonka hemogennego (HE) w rozwoju HSC9. HE może być indukowany z PSC i jest podatny na dalsze interwencje, takie jak transfer genów10,11,12,13. Wykorzystując HE jako platformę, połączenie 5 czynników transkrypcyjnych (ERG, HOXA5, HOXA9, LCOR, RUNX1) z powodzeniem indukowało funkcjonalne HSC, które wszczepiają się długoterminowo i różnicują w wiele linii14. Jednak zmienne i nieefektywne wytwarzanie HE z PSC utrudnia systematyczną manipulację i analizę komórek, a także produkcję z półki i indukcję na dużą skalę komórek krwiotwórczych do użytku klinicznego.

Tutaj opisujemy opłacalną i precyzyjną metodę wyprowadzania HE w ciągu 4 dni ze zdefiniowanym warunkiem wolnym od feedera i kseno. W tej metodzie tworzenie sferoid i spontaniczne ponowne spłaszczanie na iMarix-511 zapewnia stałą gęstość kolonii PSC, co ma kluczowe znaczenie dla efektywnej indukcji komórek HE.

Protokół

1. Odczynniki

  1. Linie komórkowe (ludzkie PSC): uzyskuje się embrionalne komórki macierzyste (ESC) lub linie iPSC 409B2 i 201B7(317-9)) oraz CBA11.
  2. Przygotowanie odczynnika
    1. Pożywka galwaniczna PSC: zmieszać pożywkę konserwacyjną PSC z 10 μM Y-27632 i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Pożywka sferoidalna PSC: tuż przed użyciem zmieszać pożywkę konserwacyjną PSC z 625–1 250 ng/ml ludzkiego rekombinowanego fragmentu Lamininy-511 E8 (LM511-E8) (w zależności od linii komórkowej).
      nuta: LM511-E8 można mieszać w media15. Inne matryce, takie jak laminina o pełnej długości, muszą być wstępnie powlekane, a nawet jeśli to zrobią, nie utrzymują mezodermalnych organoidów przylegających podczas procesu różnicowania.
    3. Pożywka różnicująca dnia 0: zmieszać mezodermalną pożywkę podstawową z 2 μM CHIR99021, 80 ng/ml białka morfogenetycznego kości 4 (BMP4) i 80 ng/ml czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF).
    4. Pożywka różnicująca dnia 2: zmieszać hemogeniczne podłoże podstawowe z 1 μM SB431542, 80 ng/ml VEGF i 100 ng/ml czynnika komórek macierzystych (SCF).
    5. Przygotować bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS) bez wapnia i magnezu (patrz tabela materiałów).
    6. 1 mM bufor kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA): dodać 1 ml 0,5 M EDTA do 500 ml PBS.
    7. Pożywka EHT: zmieszać podstawowe podłoże hematopoetyczne z 50 ng / ml SCF, 20 ng / ml trombopoetyny (TPO), 50 ng / ml liganda kinazy tyrozynowej 3 związanej z FMS (Flt-3L), 20 ng / ml receptora alfa interleukiny-6 / interleukiny-6 (IL-6 / IL-6Rα), insuliny-transferyny-selenu-etanoloaminy, L-glutaminy i penicyliny/streptomycyny/amfoterycyny B.
    8. Bufor FACS: zmieszać PBS z 2% płodową surowicą cielęcą i 1 mM EDTA.
    9. Przygotować bufor do separacji magnetycznej (patrz tabela materiałów).
    10. Przygotować podłoża na bazie metylocelulozy (patrz tabela materiałów).

2. Formacja kolonii PSC

  1. Hoduj hPSC do 70 – 80% konfluencji na 6-dołkowej płytce pokrytej 0,5 μg cm-2 LM511-E8 w mTeSR1 w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  2. Dysocjacja PSC (dzień -4)
    1. Odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki PBS. Przepłucz komórki roztworem dysocjacyjnym. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut (w tym czasie komórki nie wysychają).
    2. Zawiesić komórki w pożywce konserwacyjnej PSC, przenieść zawiesinę do probówki o odpowiedniej wielkości i odwirować komórki przy 200 x g przez 3 minuty. Odessać supernatant i zawiesić komórki w pożywce do powlekania PSC.
  3. Zawiesinę PSC o gęstości 48 000 – 70 000 komórek cm-2 (w zależności od linii komórkowej) umieścić w mikroprefabrykowanym naczyniu z tworzywa sztucznego i inkubować przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2,
    nuta: Zalecamy 100 μl zawiesiny komórkowej w 96-dołkowym mikroprefabrykowanym naczyniu z tworzywa sztucznego. Zazwyczaj wysiewa się 20 000 komórek studzienki 1 w 96-dołkowej płytce, aby uzyskać około 100 sferoid.
  4. Kafelkowanie sferoid PSC na LM511-E8 (dzień -3)
    1. Zbierz sferoidy PSC do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, delikatnie pipetując za pomocą mikropipetera P1000 i pozostaw sferoidy w temperaturze pokojowej na 2 minuty, aby wytrąciły się grawitacyjnie. Odessać supernatant.
    2. Zawiesić w pożywce sferoidalnej, dozować zawiesinę do niepowlekanej 6-dołkowej płytki hodowlanej o gęstości 4-sferoid cm-2 i hodować w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez trzy dni.

3. Indukcja hemogenna (Dzień 0)

  1. Odessać pożywkę, dodać pożywkę różnicującą Day0 i posiew w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5%O2 i 5% CO2 (inkubator hipoksyjny).
  2. Po dwóch dniach hodowli w pożywce różnicującej Dzień 0 należy odessać pożywkę, a następnie dodać pożywkę różnicującą Dzień 2 i posiew w inkubatorze do niedotlenienia.

4. Izolacja śródbłonka hemogennego (Dzień 4)

  1. Dwa dni później odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki PBS. Przepłucz komórki roztworem dysocjacyjnym. Inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 30 minut.
  2. Delikatnie zawiesić komórki w 1 mM EDTA, aby dysocjować do poziomu pojedynczej komórki, przenieść zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować komórki przy 200 x g przez 3 minuty. Odessać supernatant i zawiesić osad komórkowy za pomocą 300 μl buforu do separacji magnetycznej.
  3. Dodaj 100 μl mikrogranulek CD34+ i delikatnie pipetuj. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Można użyć do 20 milionów komórek na 100 μl kulek CD34+.
  4. Przefiltrować zawiesinę przez sitko o wielkości 40 μm.
  5. Oddziel ogniwa CD34+ za pomocą separatora magnetycznego.

5. Indukcja przejścia śródbłonka do układu krwiotwórczego (EHT)

  1. Powłoka fibronektyny
    1. Przygotować wymaganą objętość 5 μg/ml roztworu powlekającego fibronektynę, rozcieńczając 1 mg/ml fibronektyny w PBS.
    2. Dozować 0,5 ml roztworu powlekającego do każdego dołka 24-dołkowej płytki hodowlanej. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  2. Odwirować posortowane komórki CD34+ przy 200 x g przez 3 minuty. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki EHT.
  3. Określ gęstość żywotnych komórek za pomocą licznika komórek. Dostosuj gęstość komórek do 200 000 komórek mL-1, dodając pożywkę EHT.
  4. Odessać i wyrzucić roztwór powlekający ze studzienki pokrytej fibronektyną. Dozuj 0,5 ml zawiesiny komórek CD34+ do każdej studzienki pokrytej fibronektyną.
  5. Inkubować w inkubatorze hipoksyjnym przez tydzień.

6. Analiza komórek krwiotwórczych metodą cytometrii przepływowej

  1. Pływające zbieranie komórek: Przenieść pożywkę hodowlaną do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować pożywkę o sile 200 x g przez 3 min. Odessać supernatant.
  2. Kolekcja komórek adherentnych
    1. Umyj komórki dwukrotnie 0,5 ml PBS.
    2. Przepłukać komórki roztworem dysocjacyjnym i odessać nadmiar płynu.
    3. Inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    4. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu FACS.
  3. Wymieszaj komórki pływające i komórki przylegające.
  4. Odwirować komórki przy 200 x g przez 3 minuty. Odessać supernatant. Zawiesić w 50 μl buforu FACS. Inkubować komórki z przeciwciałami anty-CD34 i anty-CD45 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
  5. Przemyć komórki dwukrotnie PBS i odwirować przy 200 x g przez 3 minuty. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 0,5 ml buforu FACS z 0,5 μg/ml 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu.
  6. Zmierz ekspresję CD34 i CD45 za pomocą cytometru przepływowego.

7. Test komórek krwiotwórczych (CFU)

  1. Pobieranie komórek krwiotwórczych: Przenieść pożywkę z hodowli do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Delikatnie spłucz studzienkę dwukrotnie PBS.
  2. Odwirować komórki przy 200 x g przez 3 minuty. Odessać supernatant. Zawiesić w 1 ml pożywki EHT. Określ numer komórki za pomocą licznika komórek.
  3. Dodać objętość zawiesiny odpowiadającą 10 000 komórek do 3 ml pożywki na bazie metylocelulozy uzupełnionej antybiotykami i dobrze wymieszać 5 razy za pomocą strzykawki 16 G lub 18 G.
  4. Dozować całą zawiesinę pożywki na bazie metylocelulozy do każdego dołka płytki 6-dołkowej.
  5. Inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez dwa tygodnie, utrzymując wilgotność. Nie przeszkadzaj w zmywaniu naczynia. Kolonie są wrażliwe na ruch.
  6. Po dwóch tygodniach policz kolonie pod mikroskopem.

Wyniki

Schemat tworzenia kolonii PSC przedstawiono na Ryc. 1A. Sferoidy PSC są formowane w mikrofabrykowanym naczyniu plastikowym przez jeden dzień. Jako reprezentacyjny wynik, w każdym dołku 96-dołkowego mikrofabrykowanego naczynia plastikowego można było obsłużyć 20 000 komórek 409B2, choć inne linie komórkowe mogą wymagać wyższej gęstości (30 000-40 000 komórek na dołek 96-dołkowego mikrofabrykowanego naczynia plastikowego). Sfery te spontanicznie spłaszczają się do kultury niemal dwuwymiarowej po wysianiu na szalkę hodowlaną w obecności LM511-E8.

Schemat indukcji hemogennej przedstawiono na Rysunku 1B. Gdy kolonie PSC osiągną średnicę 750 µm, pożywkę wymienia się sekwencyjnie, aby zindukować organoidy mezodermalne. W trakcie różnicowania w organoidy mezodermalne poprzez sekwencyjną zmianę pożywki do 4. dnia, kolonie PSC stopniowo przybierają strukturę typu „sunny side up”. W 4. dniu endotelium hemogenne jest wydzielane z organoidów mezodermalnych za pomocą sortowania magnetycznego, a następnie wysiewane na fibronektynę w pożywce EHT. Z sferoidów zawierających 1 milion PSC oczekuje się uzyskania 5-10 milionów komórek CD34+CD45- (Rysunek 1C).

Zaobserwowano, że komórki zmieniają swoją morfologię z komórek śródbłonkowych na komórki krwiotwórcze (Supplementary Video 1). Reprezentatywny obraz w kontraście fazowym progenitorów krwiotwórczych po stymulacji koktajlem krwiotwórczym w 7. dniu przedstawiono na Rysunku 2A. W hodowli pojawiły się kolonie komórek krwiotwórczych.

Reprezentatywny wykres z cytometrii przepływowej przedstawiono na Rysunku 2B. Całą hodowlę stymuluje się koktajlem hematopoetycznym, a w 7. dniu analizuje się ekspresję CD34 i CD45 za pomocą cytometrii przepływowej. Hematopoetyczne komórki progenitorowe wykazują ekspresję CD34 i CD45.

Analiza CFU wykazała powstawanie kolonii granulocytów/makrofagów z hematopoetycznych komórek progenitorowych CD34+ CD45+ (Rysunek 2C). Szacowana liczba kolonii wynosi 38 CFU-G/M na 10 000 komórek (Rysunek 2D)

Schemat różnicowania komórek macierzystych z wynikami cytometrii przepływowej i procesu indukcji chemicznej.
Rysunek 1: Schemat układania kolonii PSC oraz następującego po nim różnicowania krwiotwórczego poprzez endotelium hemogenne. (A) Schemat procesu tworzenia kolonii PSC. PSC są utrzymywane na płytce 6-dołkowej powlekanej LM511-E8 w medium do utrzymania PSC. W dniu -4 komórki są odrywane i dysocjowane do poziomu pojedynczych komórek przy użyciu roztworu dysocjującego, a następnie wysiewane do mikrofabrykowanego naczynia plastikowego w medium do utrzymania PSC z dodatkiem Y-27632 i hodowane przez noc w celu utworzenia sferoidów. W dniu -3 sferoidy są wysiewane w medium do utrzymania PSC z LM511-E8 i hodowane przez trzy dni. Do dnia 0 sferoidy spontanicznie spłaszczają się do niemal dwuwymiarowej hodowli. Paski skali = 200 µm. (B) W dniu 0 medium zostaje zastąpione medium do różnicowania Day0 i hodowane w inkubatorze hipoksyjnym. W 2. dniu różnicowania medium zostaje zastąpione medium do różnicowania Day2. W 4. dniu wzbogacania endotelium hemogennego komórki CD34+ są sortowane magnetycznie i hodowane na płytce 12-dołkowej powlekanej fibronektyną w medium EHT przez 6 dni. (C) Reprezentatywny wykres cytometrii przepływowej ekspresji CD45 i CD34 dla komórek z 4. dnia sortowanych według CD34. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obraz mikroskopowy hodowli komórkowej, wykres cytometrii przepływowej, eksperyment z koloniami komórkowymi, wyniki na wykresie słupkowym.
Rysunek 2: Analiza właściwości krwiotwórczych. (A) Reprezentatywny obraz w kontraście fazowym komórek progenitorowych krwiotwórczych po stymulacji koktajlem krwiotwórczym w dniu 7. Pasek skali = 200 µm. (B) Reprezentatywny wykres cytometrii przepływowej ekspresji CD45 i CD34 w całej hodowli po stymulacji koktajlem krwiotwórczym w dniu 7. (C) Reprezentatywny obraz w kontraście fazowym kolonii granulocytów/makrofagów wygenerowanej z komórek progenitorowych krwiotwórczych z dnia 11. Pasek skali = 500 µm. (D) Liczba CFU na 10 000 komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Mikroskopowy obraz hodowli komórkowej; wizualizacja struktur komórkowych do badań biologicznych.
Wideo uzupełniające 1: Wideo EHT. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Nasza metoda indukcji zdefiniowanej bez zasilaczy i ksenotypów oferuje precyzyjną i ekonomiczną platformę do indukcji komórek HE w skalowalny sposób. Wierne tworzenie śródbłonka hemogennego w konwencjonalnych protokołach 10,11,12,13,14 było utrudnione przez brak precyzyjnej kontroli gęstości i wielkości kolonii PSC, co wpływa na efektywność ukierunkowanego różnicowania opartego na morfogenie/cytokinie. Doświadczyliśmy niespójności indukcji śródbłonka hemogennego w każdej niezależnej partii z konwencjonalnych protokołów. Nowy protokół umożliwia ścisłą regulację gęstości i wielkości kolonii PSC, przezwyciężając w ten sposób niespójność indukcji śródbłonka hemogennego.

Wykorzystali umundurowane formowanie sferoid, a następnie przenieśliśmy zdefiniowany stan wolny od feederu i ksenozy, aby uformować HE w sumie w ciągu 4 dni. Potwierdziliśmy za pomocą trzech niezależnych linii komórkowych, że tworzenie sferoidów zapewnia spójne tworzenie komórek HE. W reprezentatywnym wyniku linie komórkowe 409B2 dały 12,7%-23,6% wydajności komórek CD34 + w oparciu o trzy niezależne eksperymenty. Krytycznym czynnikiem dla sferoid PSC jest LM511-E8. Z naszych doświadczeń wynika, że nie zalecamy zastępowania tego innym matrixem, takim jak Matrigel lub pełnowymiarowe produkty z lamininą. Doświadczyliśmy, że organoidy mezodermalne łatwo odłączały się od Matrigelu i traciły podczas procesu różnicowania. I ani Matrigel, ani pełnowymiarowa laminina nie zakotwiczają komórek bez wstępnego powlekania.

Potencjalnym ograniczeniem tego protokołu jest to, że jesteśmy zależni od pożywki konserwacyjnej PSC w celu utrzymania PSC. Przetestowaliśmy inne media, takie jak StemFit, ale ograniczyliśmy indukcję hemogenną. Przypuszczalnie komórki były odporne na wyjście ze stanu pluripotencjalnego w naszym krótkim czasie (4 dni) protokole indukcji. Jeśli utrzymuje się PSC w innych pożywkach, zalecamy adaptację komórek w pożywce podtrzymującej PSC i przeprowadzenie kilku pasaży przed różnicowaniem. Platforma ta pozwoli na systematyczną manipulację i analizę komórek, a także na produkcję i indukcję komórek krwiotwórczych na dużą skalę do potencjalnego zastosowania klinicznego. Długoterminowym celem tego systemu jest modelowanie chorób niedoboru odporności w humanizowanych modelach mysich w celu zbadania odpowiedzialnych mechanizmów komórkowych i molekularnych oraz przeprowadzenia badań przesiewowych leków.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni Alinie Li i Seiko Benno za ich pomoc techniczną. Chcielibyśmy również podziękować Pani Harumi Watanabe za pomoc administracyjną oraz dr Peterowi Karagiannisowi za redakcję artykułu. Praca ta była wspierana przez Core Center for iPS Cell Research of Research Center Network for Realization of Regenerative Medicine z Japońskiej Agencji Badań i Rozwoju Medycznego (AMED) [M.K.S.], Program Badań nad Chorobami Nieuleczalnymi. Specyficzne dla choroby komórki iPS AMED (17935423) [M.K.S.] i programu Center for Innovation Japońskiej Agencji Nauki i Technologii (JST) [R.O. i M.K.S.].

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5 m EDTAThermo Fisher Scientific155750,5 m EDTA
40 μ m sitko komórkoweCorning35234040μ Sitko do komórek M
Płytka 6-dołkowaCorning3530466-dołkowa płytka
antybiotykowo-przeciwgrzybiczaThermo Fisher Scientific15240-112Penicylina/Streptomycyna/Amfoterycyna B
anty-CD34Beckman CoulterA07776anty-CD34
anty-CD45Biolegend304012przeciwciało anty-CD45
BMP4R& D Systems314-BP-010BMP4
CD34 mikrogranulkiMiltenyi130-046-703Mikrokulki CD34
CHIR99021Wako038-23101CHIR99021
Essential 6Thermo Fisher ScientificA15165-01Hemogeniczne podłoże podstawowe
Essential 8Thermo Fisher ScientificA15169-01Mezodermalne podłoże
podstawowe Ezsphere SP Microplate 96wellAGC4860-900SPmikro-prefabrykowane naczynie z tworzywa sztucznego 
FCSBioseraFB-1365/500FCS
FibronektynaMiliporaFC010-100MGFibronektyna
Flt-3LR& D Systems308-FK-005FLT-3L
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050-061L-Glutamina
IL-6/IL-6R&alfa;R& D Systems8954-SRIL-6/IL-6Rα
iMatrix-511Matrixome892 001LM511-E8
ITS-XThermo Fisher Scientific51500-056Bufor MACS insuliny-transferyny-selenu-etanoloaminy
Miltenyi130-091-221bufor separacji magnetycznej
Methocult 4435MethoCult™ H4435 WzbogaconeTECHNOLOGIE STEMCELL04435Pożywki na bazie metylocelulozy
mTeSR1STEMCELL TECHNOLOGIES85850Pożywka konserwacyjna PSC
PBSnacalai tesque14249-24PBS
SB431542Wako031-24291SB431542
SCFR& D Systems255-SC-010SCF
Stemline II Pożywka do ekspansji hematopoetycznych komórek macierzystychSigma AldrichS0192-500MLHematopoetyczne podłoże
podstawowe TPOR& D Systems288-TPNTPO
TrypLE ExpressThermo Fisher Scientific12604-021roztwór dysocjacyjny
VEGFR& D Systems293-VE-010VEGF
Y-27632Wako253-00513Y-27632
przeciwciało przeciwciało przeciwciało

Bibliografia

  1. Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).
  2. Lancrin, C., et al. The haemangioblast generates haematopoietic cells through a haemogenic endothelium stage. Nature. 457, 892-895 (2009).
  3. Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. , 451-467 (2016).
  4. Ng, E. S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to HOXA+ hemogenic vasculature that resembles the aorta-gonad-mesonephros. Nature Biotechnology. 34, 1168-1179 (2016).
  5. Batta, K., et al. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9, 1871-1884 (2014).
  6. Sturgeon, C. M., et al. Defining the path to hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 31, 416-418 (2013).
  7. Ivanovs, A., et al. Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish. Development. 144, 2323-2337 (2017).
  8. Blaser, B. W., Zon, L. I. Making HSCs in vitro: don't forget the hemogenic endothelium. Blood. , (2018).
  9. Speck, N., Dzierzak, E. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nature imunology. , (2008).
  10. Niwa, A., et al. A novel serum-free monolayer culture for orderly hematopoietic differentiation of human pluripotent cells via mesodermal progenitors. PLoS One. 6, e22261(2011).
  11. Sturgeon, C. M., et al. Wnt signaling controls the specification of definitive and primitive hematopoiesis from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32, 554-561 (2014).
  12. Ditadi, A., et al. Human definitive haemogenic endothelium and arterial vascular endothelium represent distinct lineages. Nature Cell Biology. 17, 580-591 (2015).
  13. Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Reports. 2, 1722-1735 (2012).
  14. Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. 545, 432-438 (2017).
  15. Miyazaki, T., et al. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7, 41165(2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przejście śródbłonkowo-hematopoetycznekomórki CD34-dodatniecytometria przepływowatest kolonogennypowlekanie LM511-E8magnetyczna separacja komórekinkubator hipoksycznypożywka EHT
Różnicowanie śródbłonka hemogennego od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w zdefiniowanym stanie wolnym od karmnika i ksenotypu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.