Różnicowanie śródbłonka hemogennego od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w zdefiniowanym stanie wolnym od karmnika i ksenotypu

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół precyzyjnego tworzenia hemogennego śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w stanie wolnym od karmów i kseno. Metoda ta będzie miała szerokie zastosowanie w modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych pod kątem związków terapeutycznych.

Streszczenie

Pozyskiwanie funkcjonalnych hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) było nieuchwytnym celem dla autologicznych przeszczepów w leczeniu chorób hematologicznych i złośliwych. Śródbłonek hemogenny (HE) jest podatną platformą do wytwarzania funkcjonalnych HSPC przez czynniki transkrypcyjne lub do indukowania limfocytów w solidny sposób. Jednak obecne metody oznaczania HE są albo kosztowne, albo mają zmienną wydajność. W tym protokole ustaliliśmy opłacalną i precyzyjną metodę oznaczania HE w ciągu 4 dni w zdefiniowanych warunkach wolnych od feederu i kseno. Powstały w ten sposób HE przeszedł przemianę śródbłonkową do krwiotwórczej i wytworzył klonogenne komórki progenitorowe hematopoetyczne CD34 ⁺ CD45 ⁺. Potencjalna zdolność naszej platformy do generowania funkcjonalnych HSPC będzie miała szerokie zastosowanie w modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych pod kątem związków terapeutycznych.

Wprowadzenie

Rozwój nowych metod leczenia zaburzeń hematologicznych i immunologicznych został utrudniony przez brak solidnych platform do modelowania chorób i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków z autologicznymi hematopoetycznymi komórkami macierzystymi (HSC) pochodzącymi z pacjentów z pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC). Przełom w technologii indukowanych (i)PSC daje nadzieję na modelowanie chorób na podstawie komórek pacjenta, ale ustanowienie funkcjonalnych HSC z iPSC pacjentów było nieuchwytne. Aby uzyskać HSC od ludzkich PSC, kluczowa jest prawidłowa indukcja embrionalnych wzorców i programów transkrypcyjnych^{1,2,3,4,5,6,7,8}. Niedawny postęp w rozwoju układu krwiotwórczego wykazał rolę śródbłonka hemogennego (HE) w rozwoju HSC⁹. HE może być indukowany z PSC i jest podatny na dalsze interwencje, takie jak transfer genów^10,11,12,13. Wykorzystując HE jako platformę, połączenie 5 czynników transkrypcyjnych (ERG, HOXA5, HOXA9, LCOR, RUNX1) z powodzeniem indukowało funkcjonalne HSC, które wszczepiają się długoterminowo i różnicują w wiele linii¹⁴. Jednak zmienne i nieefektywne wytwarzanie HE z PSC utrudnia systematyczną manipulację i analizę komórek, a także produkcję z półki i indukcję na dużą skalę komórek krwiotwórczych do użytku klinicznego.

Tutaj opisujemy opłacalną i precyzyjną metodę wyprowadzania HE w ciągu 4 dni ze zdefiniowanym warunkiem wolnym od feedera i kseno. W tej metodzie tworzenie sferoid i spontaniczne ponowne spłaszczanie na iMarix-511 zapewnia stałą gęstość kolonii PSC, co ma kluczowe znaczenie dla efektywnej indukcji komórek HE.

Protokół

1. Odczynniki

1. Linie komórkowe (ludzkie PSC): uzyskuje się embrionalne komórki macierzyste (ESC) lub linie iPSC 409B2 i 201B7(317-9)) oraz CBA11.
2. Przygotowanie odczynnika
   1. Pożywka galwaniczna PSC: zmieszać pożywkę konserwacyjną PSC z 10 μM Y-27632 i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   2. Pożywka sferoidalna PSC: tuż przed użyciem zmieszać pożywkę konserwacyjną PSC z 625–1 250 ng/ml ludzkiego rekombinowanego fragmentu Lamininy-511 E8 (LM511-E8) (w zależności od linii komórkowej).
      nuta: LM511-E8 można mieszać w media¹⁵. Inne matryce, takie jak laminina o pełnej długości, muszą być wstępnie powlekane, a nawet jeśli to zrobią, nie utrzymują mezodermalnych organoidów przylegających podczas procesu różnicowania.
   3. Pożywka różnicująca dnia 0: zmieszać mezodermalną pożywkę podstawową z 2 μM CHIR99021, 80 ng/ml białka morfogenetycznego kości 4 (BMP4) i 80 ng/ml czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF).
   4. Pożywka różnicująca dnia 2: zmieszać hemogeniczne podłoże podstawowe z 1 μM SB431542, 80 ng/ml VEGF i 100 ng/ml czynnika komórek macierzystych (SCF).
   5. Przygotować bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS) bez wapnia i magnezu (patrz tabela materiałów).
   6. 1 mM bufor kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA): dodać 1 ml 0,5 M EDTA do 500 ml PBS.
   7. Pożywka EHT: zmieszać podstawowe podłoże hematopoetyczne z 50 ng / ml SCF, 20 ng / ml trombopoetyny (TPO), 50 ng / ml liganda kinazy tyrozynowej 3 związanej z FMS (Flt-3L), 20 ng / ml receptora alfa interleukiny-6 / interleukiny-6 (IL-6 / IL-6Rα), insuliny-transferyny-selenu-etanoloaminy, L-glutaminy i penicyliny/streptomycyny/amfoterycyny B.
   8. Bufor FACS: zmieszać PBS z 2% płodową surowicą cielęcą i 1 mM EDTA.
   9. Przygotować bufor do separacji magnetycznej (patrz tabela materiałów).
   10. Przygotować podłoża na bazie metylocelulozy (patrz tabela materiałów).

2. Formacja kolonii PSC

1. Hoduj hPSC do 70 – 80% konfluencji na 6-dołkowej płytce pokrytej 0,5 μg ^cm-2 LM511-E8 w mTeSR1 w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
2. Dysocjacja PSC (dzień -4)
   1. Odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki PBS. Przepłucz komórki roztworem dysocjacyjnym. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut (w tym czasie komórki nie wysychają).
   2. Zawiesić komórki w pożywce konserwacyjnej PSC, przenieść zawiesinę do probówki o odpowiedniej wielkości i odwirować komórki przy 200 x g przez 3 minuty. Odessać supernatant i zawiesić komórki w pożywce do powlekania PSC.
3. Zawiesinę PSC o gęstości 48 000 – 70 000 komórek ^cm-2 (w zależności od linii komórkowej) umieścić w mikroprefabrykowanym naczyniu z tworzywa sztucznego i inkubować przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂,
   nuta: Zalecamy 100 μl ^{zawiesiny komórkowej} w 96-dołkowym mikroprefabrykowanym naczyniu z tworzywa sztucznego. Zazwyczaj wysiewa się 20 000 komórek studzienki ¹ w 96-dołkowej płytce, aby uzyskać około 100 sferoid.
4. Kafelkowanie sferoid PSC na LM511-E8 (dzień -3)
   1. Zbierz sferoidy PSC do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, delikatnie pipetując za pomocą mikropipetera P1000 i pozostaw sferoidy w temperaturze pokojowej na 2 minuty, aby wytrąciły się grawitacyjnie. Odessać supernatant.
   2. Zawiesić w pożywce sferoidalnej, dozować zawiesinę do niepowlekanej 6-dołkowej płytki hodowlanej o gęstości 4-sferoid ^cm-2 i hodować w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez trzy dni.

3. Indukcja hemogenna (Dzień 0)

1. Odessać pożywkę, dodać pożywkę różnicującą Day0 i posiew w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5%_O2 i 5% CO₂ (inkubator hipoksyjny).
2. Po dwóch dniach hodowli w pożywce różnicującej Dzień 0 należy odessać pożywkę, a następnie dodać pożywkę różnicującą Dzień 2 i posiew w inkubatorze do niedotlenienia.

4. Izolacja śródbłonka hemogennego (Dzień 4)

1. Dwa dni później odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki PBS. Przepłucz komórki roztworem dysocjacyjnym. Inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 30 minut.
2. Delikatnie zawiesić komórki w 1 mM EDTA, aby dysocjować do poziomu pojedynczej komórki, przenieść zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować komórki przy 200 x g przez 3 minuty. Odessać supernatant i zawiesić osad komórkowy za pomocą 300 μl buforu do separacji magnetycznej.
3. Dodaj 100 μl mikrogranulek CD34⁺ i delikatnie pipetuj. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Można użyć do 20 milionów komórek na 100 μl kulek CD34⁺.
4. Przefiltrować zawiesinę przez sitko o wielkości 40 μm.
5. Oddziel ogniwa CD34⁺ za pomocą separatora magnetycznego.

5. Indukcja przejścia śródbłonka do układu krwiotwórczego (EHT)

1. Powłoka fibronektyny
   1. Przygotować wymaganą objętość 5 μg/ml roztworu powlekającego fibronektynę, rozcieńczając 1 mg/ml fibronektyny w PBS.
   2. Dozować 0,5 ml roztworu powlekającego do każdego dołka 24-dołkowej płytki hodowlanej. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
2. Odwirować posortowane komórki CD34⁺ przy 200 x g przez 3 minuty. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki EHT.
3. Określ gęstość żywotnych komórek za pomocą licznika komórek. Dostosuj gęstość komórek do 200 000 komórek ^mL-1, dodając pożywkę EHT.
4. Odessać i wyrzucić roztwór powlekający ze studzienki pokrytej fibronektyną. Dozuj 0,5 ml zawiesiny komórek CD34⁺ do każdej studzienki pokrytej fibronektyną.
5. Inkubować w inkubatorze hipoksyjnym przez tydzień.

6. Analiza komórek krwiotwórczych metodą cytometrii przepływowej

1. Pływające zbieranie komórek: Przenieść pożywkę hodowlaną do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować pożywkę o sile 200 x g przez 3 min. Odessać supernatant.
2. Kolekcja komórek adherentnych
   1. Umyj komórki dwukrotnie 0,5 ml PBS.
   2. Przepłukać komórki roztworem dysocjacyjnym i odessać nadmiar płynu.
   3. Inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
   4. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu FACS.
3. Wymieszaj komórki pływające i komórki przylegające.
4. Odwirować komórki przy 200 x g przez 3 minuty. Odessać supernatant. Zawiesić w 50 μl buforu FACS. Inkubować komórki z przeciwciałami anty-CD34 i anty-CD45 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
5. Przemyć komórki dwukrotnie PBS i odwirować przy 200 x g przez 3 minuty. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 0,5 ml buforu FACS z 0,5 μg/ml 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu.
6. Zmierz ekspresję CD34 i CD45 za pomocą cytometru przepływowego.

7. Test komórek krwiotwórczych (CFU)

1. Pobieranie komórek krwiotwórczych: Przenieść pożywkę z hodowli do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Delikatnie spłucz studzienkę dwukrotnie PBS.
2. Odwirować komórki przy 200 x g przez 3 minuty. Odessać supernatant. Zawiesić w 1 ml pożywki EHT. Określ numer komórki za pomocą licznika komórek.
3. Dodać objętość zawiesiny odpowiadającą 10 000 komórek do 3 ml pożywki na bazie metylocelulozy uzupełnionej antybiotykami i dobrze wymieszać 5 razy za pomocą strzykawki 16 G lub 18 G.
4. Dozować całą zawiesinę pożywki na bazie metylocelulozy do każdego dołka płytki 6-dołkowej.
5. Inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez dwa tygodnie, utrzymując wilgotność. Nie przeszkadzaj w zmywaniu naczynia. Kolonie są wrażliwe na ruch.
6. Po dwóch tygodniach policz kolonie pod mikroskopem.

Wyniki

Schemat tworzenia kolonii PSC jest przedstawiony w Rysunek 1A. Sferoidy PSC są formowane na mikroprefabrykowanym naczyniu z tworzywa sztucznego przez jeden dzień. W reprezentatywnym wyniku 20 000 komórek 409B2 można obsłużyć na 96 dołków mikrofabrykowanego plastikowego naczynia, chociaż inne linie komórkowe mogą wymagać większej gęstości (30 000-40 000 komórek na 96 dołków mikrofabrykowanego plastikowego naczynia). Sfery te są spontanicznie spłaszczane do prawie dwuwymiarowej kultury po posianiu na szalce hodowlanej w obecności LM511-E8.

Schemat indukcji hemogennej jest zilustrowany w Rysunek 1B. Gdy kolonie PSC osiągną średnicę 750 μm, podłoże jest sekwencyjnie zmieniane w celu indukowania organoidów mezodermalnych. Kolonie PSC będą stopniowo stawać się słoneczną strukturą boczną podczas różnicowania do organoidów mezodermalnych przez sekwencyjną zmianę pożywki aż do dnia 4. W dniu 4 śródbłonek hemogenny jest określany z organoidów mezodermalnych przez sortowanie magnetyczne, a następnie powlekany na fibronektynie w pożywce EHT. Oczekuje się, że 5-10 milionów komórek CD34 ⁺ CD45^- będzie dostępnych w sferoidach zawierających 1 milion PSC (Rysunek 1C).

Obserwuje się, że komórki morfologicznie zmieniają się z komórek śródbłonkowych na krwiotwórcze (Dodatkowe wideo 1). Reprezentatywny obraz kontrastu fazowego hematopoetycznych komórek progenitorowych po stymulacji koktajlem krwiotwórczym w 7 dniu pokazano na Rysunek 2A. W hodowli pojawiły się kolonie komórek krwiotwórczych.

Reprezentatywny wykres cytometrii przepływowej jest pokazany w Rysunek 2B. Cała hodowla jest stymulowana koktajlem krwiotwórczym, a w 7 dniu jest analizowana pod kątem ekspresji CD34 i CD45 za pomocą cytometrii przepływowej. Hematopoetyczne komórki progenitorowe wyrażają CD34 i CD45.

Test CFU wykazał generowanie granulocytów/kolonii makrofagów z hematopoetycznych komórek progenitorowych CD34⁺ CD45⁺ (Rysunek 2C). Szacowana liczba kolonii wynosi 38 CFU-G/M na 10 000 komórek (Rysunek 2D)

Rycina 1: Schemat kafelkowania kolonii PSC i późniejszego różnicowania układu krwiotwórczego przez śródbłonek hemogenny. (A) Schematyczny proces formowania kolonii PSC. PSC są utrzymywane na 6-dołkowej płytce pokrytej LM511-E8 w podłożu konserwacyjnym PSC. W dniu -4 komórki są odłączane i dysocjowane do poziomu pojedynczej komórki za pomocą roztworu dysocjującego, a następnie umieszczane na mikroprefabrykowanym plastikowym naczyniu w pożywce konserwacyjnej PSC z Y-27632 i hodowane przez noc w celu utworzenia sferoid. W dniu -3 sferoidy są siane w pożywce konserwacyjnej PSC z LM511-E8 i hodowane przez trzy dni. Do dnia 0 sferoidy są spontanicznie spłaszczane do prawie dwuwymiarowej kultury. Podziałka = 200 μm. (B) W dniu 0 pożywkę zastępuje się pożywką różnicującą Day0 i hoduje w inkubatorze hipoksyjnym. W 2 dniu różnicowania pożywkę zastępuje się pożywką różnicującą dnia 2. W 4 dniu hemogennego wzbogacenia śródbłonka komórki CD34 ⁺ są sortowane magnetycznie i hodowane na 12-dołkowej płytce pokrytej fibronektyną w pożywce EHT przez 6 dni. (C) Reprezentatywny wykres cytometrii przepływowej ekspresji CD45 i CD34 komórek dnia 4 posortowanych według CD34. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Analiza właściwości krwiotwórczych. (A) Reprezentatywny obraz kontrastu fazowego hematopoetycznych komórek progenitorowych po stymulacji koktajlem krwiotwórczym w 7 dniu. Pasek skali = 200 μm. (B) Reprezentatywny wykres cytometrii przepływowej ekspresji CD45 i CD34 całej kultury po stymulacji koktajlem krwiotwórczym w 7 dniu. (C) Reprezentatywny obraz z kontrastem fazowym kolonii granulocytów/makrofagów wygenerowanej z hematopoetycznych komórek progenitorowych dnia 11. Podziałka = 500 μm. (D) Liczba jtkowników na 10 000 komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Film uzupełniający 1: Film EHT. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Nasza metoda indukcji zdefiniowanej bez zasilaczy i ksenotypów oferuje precyzyjną i ekonomiczną platformę do indukcji komórek HE w skalowalny sposób. Wierne tworzenie śródbłonka hemogennego w konwencjonalnych protokołach 10,11,12,13,14 było utrudnione przez brak precyzyjnej kontroli gęstości i wielkości kolonii PSC, co wpływa na efektywność ukierunkowanego różnicowania opartego na morfogenie/cytokinie. Doświadczyliśmy niespójności indukcji śródbłonka hemogennego w każdej niezależnej partii z konwencjonalnych protokołów. Nowy protokół umożliwia ścisłą regulację gęstości i wielkości kolonii PSC, przezwyciężając w ten sposób niespójność indukcji śródbłonka hemogennego.

Wykorzystali umundurowane formowanie sferoid, a następnie przenieśliśmy zdefiniowany stan wolny od feederu i ksenozy, aby uformować HE w sumie w ciągu 4 dni. Potwierdziliśmy za pomocą trzech niezależnych linii komórkowych, że tworzenie sferoidów zapewnia spójne tworzenie komórek HE. W reprezentatywnym wyniku linie komórkowe 409B2 dały 12,7%-23,6% wydajności komórek CD34 ⁺ w oparciu o trzy niezależne eksperymenty. Krytycznym czynnikiem dla sferoid PSC jest LM511-E8. Z naszych doświadczeń wynika, że nie zalecamy zastępowania tego innym matrixem, takim jak Matrigel lub pełnowymiarowe produkty z lamininą. Doświadczyliśmy, że organoidy mezodermalne łatwo odłączały się od Matrigelu i traciły podczas procesu różnicowania. I ani Matrigel, ani pełnowymiarowa laminina nie zakotwiczają komórek bez wstępnego powlekania.

Potencjalnym ograniczeniem tego protokołu jest to, że jesteśmy zależni od pożywki konserwacyjnej PSC w celu utrzymania PSC. Przetestowaliśmy inne media, takie jak StemFit, ale ograniczyliśmy indukcję hemogenną. Przypuszczalnie komórki były odporne na wyjście ze stanu pluripotencjalnego w naszym krótkim czasie (4 dni) protokole indukcji. Jeśli utrzymuje się PSC w innych pożywkach, zalecamy adaptację komórek w pożywce podtrzymującej PSC i przeprowadzenie kilku pasaży przed różnicowaniem. Platforma ta pozwoli na systematyczną manipulację i analizę komórek, a także na produkcję i indukcję komórek krwiotwórczych na dużą skalę do potencjalnego zastosowania klinicznego. Długoterminowym celem tego systemu jest modelowanie chorób niedoboru odporności w humanizowanych modelach mysich w celu zbadania odpowiedzialnych mechanizmów komórkowych i molekularnych oraz przeprowadzenia badań przesiewowych leków.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,5 m EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575	0,5 m EDTA
40 μ m sitko komórkowe	Corning	352340	40μ Sitko do komórek M
Płytka 6-dołkowa	Corning	353046	6-dołkowa płytka
antybiotykowo-przeciwgrzybicza	Thermo Fisher Scientific	15240-112	Penicylina/Streptomycyna/Amfoterycyna B
anty-CD34	Beckman Coulter	A07776	anty-CD34
anty-CD45	Biolegend	304012	przeciwciało anty-CD45
BMP4	R& D Systems	314-BP-010	BMP4
CD34 mikrogranulki	Miltenyi	130-046-703	Mikrokulki CD34
CHIR99021	Wako	038-23101	CHIR99021
Essential 6	Thermo Fisher Scientific	A15165-01	Hemogeniczne podłoże podstawowe
Essential 8	Thermo Fisher Scientific	A15169-01	Mezodermalne podłoże
podstawowe Ezsphere SP Microplate 96well	AGC	4860-900SP	mikro-prefabrykowane naczynie z tworzywa sztucznego
FCS	Biosera	FB-1365/500	FCS
Fibronektyna	Milipora	FC010-100MG	Fibronektyna
Flt-3L	R& D Systems	308-FK-005	FLT-3L
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050-061	L-Glutamina
IL-6/IL-6R&alfa;	R& D Systems	8954-SR	IL-6/IL-6Rα
iMatrix-511	Matrixome	892 001	LM511-E8
ITS-X	Thermo Fisher Scientific	51500-056	Bufor MACS insuliny-transferyny-selenu-etanoloaminy
	Miltenyi	130-091-221	bufor separacji magnetycznej
Methocult 4435MethoCult™ H4435 Wzbogacone	TECHNOLOGIE STEMCELL	04435	Pożywki na bazie metylocelulozy
mTeSR1	STEMCELL TECHNOLOGIES	85850	Pożywka konserwacyjna PSC
PBS	nacalai tesque	14249-24	PBS
SB431542	Wako	031-24291	SB431542
SCF	R& D Systems	255-SC-010	SCF
Stemline II Pożywka do ekspansji hematopoetycznych komórek macierzystych	Sigma Aldrich	S0192-500ML	Hematopoetyczne podłoże
podstawowe TPO	R& D Systems	288-TPN	TPO
TrypLE Express	Thermo Fisher Scientific	12604-021	roztwór dysocjacyjny
VEGF	R& D Systems	293-VE-010	VEGF
Y-27632	Wako	253-00513	Y-27632