Manipulacja wzorami kolorystycznymi u skaczących pająków do wykorzystania w eksperymentach behawioralnych

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest manipulowanie wzorami kolorów skaczących pająków i innych bardzo małych stawonogów za pomocą farby, w celu zbadania zagadnień związanych z doborem płciowym, kanibalizmem seksualnym, drapieżnictwem, aposematyzmem lub jakąkolwiek inną dziedziną ubarwienia zwierząt.

Streszczenie

W dziedzinie ekologii behawioralnej, wiele eksperymentów ma na celu zbadanie ewolucyjnych celów cech kolorowych w kontekście doboru płciowego i drapieżnictwa. Metody są różne, ale głównie polegają na modyfikowaniu wzorów kolorystycznych osób za pomocą różnych barwników. Takie techniki były stosowane w odniesieniu do wielu taksonów kręgowców, szczególnie u ptaków, ale pozostały słabo rozwinięte w przypadku bezkręgowców ze względu na trudności w skutecznym manipulowaniu kolorem u małych organizmów. Zamiast tego, aby manipulować wyglądem bezkręgowców, naukowcy zwykle modyfikowali środowisko oświetleniowe, aby odfiltrować określone długości fal. Taka metoda wpływa jednak nie tylko na interesującą nas cechę fenotypową, ale na cały wygląd osobnika i jego otoczenia. Tutaj, zmniejszając techniki stosowane wcześniej na kolorowych ptakach, przedstawiamy sposoby manipulowania kolorami małych stawonogów, wykorzystując równie emblematyczne, ale niedostatecznie zbadane gatunki: kolorowe skaczące pająki.

Wprowadzenie

Zwierzęta często mają skomplikowane wzory kolorów, które wyświetlają podczas seksualnych spotkań, agonistycznych spotkań lub w celu odstraszenia drapieżników. Cechy te mogą przekazywać odbiorcom informacje, takie jak indywidualna cecha sygnalizatora jako mate¹, zdolność do walki jako konkurent², lub smakowitość jako przedmiot zdobyczy³. Aby zrozumieć adaptacyjne cele cech kolorowych, naukowcy zaprojektowali eksperymenty, które polegają na manipulowaniu kolorami na różne sposoby. Niektórzy badacze używali kolorowych bodźców wabiących, takich jak models^4,5,6,7,8, photographs^9, lub videos^10,11,12 które są prezentowane odbiorcom w eksperymentach behawioralnych. Inni, zwłaszcza podczas korzystania z bezkręgowców, manipulowali środowiskiem oświetleniowym, aby wpływać na wygląd kolorów żywych osobników^{13,14,15,16,17}. Wszystkie te manipulacje, choć pomysłowe, mają tę wadę, że usuwają potencjalnie ważne naturalne zachowanie i/lub wpływają na znacznie więcej niż cechę będącą przedmiotem zainteresowania. U dużych kręgowców, takich jak ptaki, badacze bardzo często manipulują kolorem bezpośrednio na żywych zwierzętach (recenzja w Hill and McGraw, 2006¹⁸). Poszczególne pióra lub dzioby zostały bezpośrednio pokolorowane markerami^{2,19,20,21,22,23,24}, barwniki zawierające nadtlenek wodoru często stosowane w rozjaśniaczach do włosów^25,26,27, lub różne farby, w tym lakier do paznokci²⁸. U bezkręgowców takie badania, które manipulują wzorcami kolorów bezpośrednio na żywych zwierzętach, są stosunkowo rzadkie, ale mimo to dostarczyły ogromnego wglądu w funkcję i ewolucję koloru^{29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39}. Nawet badania nad stawonogami wydają się być stronnicze w kierunku większych taksonów, które mogą być łatwiej obsługiwane i malowane, pozostawiając wzory kolorów u bardzo małych gatunków stosunkowo słabo zbadane.

Tutaj opisujemy delikatną technikę manipulacji kolorami, która została opracowana dla bardzo małych taksonów zwierząt. W szczególności metoda ta polega na manipulowaniu ubarwieniem twarzy samców skaczących pająków pod mikroskopem w celu zbadania znaczenia takich kolorowych cech w kontekście wyboru partnera i kanibalizmu seksualnego. W tym przypadku użyliśmy Habronattus pyrrithrix (zebranego z Phoenix, AZ, USA) jako gatunku modelowego (ryc. 1). Wyniki prac eksperymentalnych z wykorzystaniem niektórych z tych technik opublikowaliśmy w innym miejscu^38,39, ale tutaj opisujemy metody bardziej szczegółowo niż zostało to zrobione wcześniej, w sposób, który powinien uczynić je dostępnymi dla innych próbujących je powtórzyć lub dostosować do użycia na innych bardzo małych taksonach. Takie protokoły powinny otworzyć możliwości doświadczalne na zwierzętach, które mogą być tak kolorowe jak najbardziej charakterystyczne ptaki, ale które są zwykle niedostatecznie zbadane.

Protokół

1. Przygotowanie sprzętu

1. Wybierz odpowiednie farby.
   1. Aby aplikacja była udana, używaj farb, które są szybkoschnące i mają teksturę, którą można łatwo manipulować za pomocą rozcieńczalnika. Produkty, które są z powodzeniem stosowane, to niewodoodporne kredki do oczu, które można rozcieńczać wodą, oraz farby emaliowane, które można rozcieńczać rozcieńczalnikiem do emalii (tabela materiałów).
   2. Malując pająki, weź pod uwagę, że pancerz większości gatunków ma stwardniały egzoszkielet, podczas gdy miękki brzuch często rozciąga się i zwęża przy karmieniu⁴⁰.
      1. Farby emaliowane wytwarzają solidną, utwardzoną powłokę na malowanej powierzchni, dlatego należy je nakładać na twarde części naskórka (np. pancerz, nogi, pedipalps). Takie powłoki emaliowane są mniej skuteczne w przypadku odwłoka pająka, ponieważ odklejają się od pająka, gdy brzuch zmienia kształt podczas karmienia.
      2. W przeciwieństwie do tego, kredki do oczu nie wytwarzają utwardzonej powłoki, ale raczej przenikają do kolorowych łusek ciała; w związku z tym używaj ich zarówno na twardych, jak i miękkich częściach ciała (w tym na brzuchach pająków).
         UWAGA: W kolejnych krokach przedstawiona zostanie najdelikatniejsza technika, która polega na malowaniu twarzy i pedipalpów pająków; Stosuje się farbę emaliowaną, która jest najbardziej uogólnioną metodą ze względu na różnorodność kolorów dostępnych farb emaliowanych.
   3. Przed testowaniem farb na żywych zwierzętach, jeśli to możliwe, najpierw zmierz właściwości spektralne farby (po prostu nałożonej na papier lub inną powierzchnię) za pomocą spektrofotometru odbicia UV-VIS, aby upewnić się, że w widmie nie ma żadnych niepożądanych pików UV, które byłyby niewidoczne dla ludzi, ale być może widoczne dla badanych gatunków.
2. Użyj mikroskopu preparacyjnego podłączonego do kamery i komputera, aby łatwiej zrobić zdjęcia wyniku manipulacji w celu dokumentacji i zwiększenia możliwości powielania (Tabela materiałów).
   1. Włącz mikroskop, komputer i oprogramowanie, które przetwarza dane wejściowe z kamery.
   2. Wybierz odpowiedni zoom, przy którym zostanie zrobione końcowe zdjęcie.
   3. Wbij kołek montażowy na owady lub mały gwóźdź (z głową skierowaną na zewnątrz) w kulkę nietwardniejącej plasteliny (mniej więcej wielkości winogrona). (Żywy pająk, który ma zostać pomalowany, zostanie tymczasowo zamontowany na tego kołka w kroku 3.1 poniżej). Umieść modelinę i szpilkę pod mikroskopem, aby wyregulować obiektywy tak, aby z grubsza skupiały się na główce szpilki (miejscu, w którym ma być zamontowany pająk).
   4. Upewnij się, że obiektywy znajdują się w odpowiedniej odległości od oczu malarza, a aparat nie zasłania pola widzenia podczas malowania (jak ma to miejsce w przypadku, gdy aparat jest zamontowany w jednej z lornetek, utrudniając percepcję głębi).
3. Przenieś pająka do czystej plastikowej fiolki z zatrzaskiem (około 12 dram, bez żadnej taśmy lub martwej zdobyczy).
4. Przygotuj sprzęt montażowy i malarski.
   1. Umieść bardzo cienki kołek montażowy na owady w kulce z nietwardniejącej plasteliny (oprócz tej użytej w kroku 1.2.3) i umieść je po lewej stronie mikroskopu (dla osób praworęcznych). Szpilka ta posłuży do delikatnego dostosowania pozycji nóg i szypułek pająka (w razie potrzeby) podczas malowania.
   2. Zaopatrz się w mały kawałek chłonnego papieru (takiego jak ręcznik papierowy), kawałek białego papieru do drukarki, farby do nałożenia (w tym przypadku farba emaliowana), oddzielne pojemniki z rozcieńczalnikiem do farb (po jednym na każdy kolor plus jeden utrzymywany w przezroczystości i czystości), indywidualne mikropędzle dla każdego koloru (patrz Tabela materiałów) i jedna mikroszczotka do użytku tylko z czystym rozcieńczalnikiem, wszystkie umieszczone w zorganizowany sposób po prawej stronie mikroskopu (dla osób praworęcznych).
   3. Za pomocą wykałaczki dodaj kroplę farby do otwartego plastikowego naczynia (takiego jak mała szalka Petriego lub nakrętka fiolki) i dodaj rozcieńczalnik do farb, na przykład za pomocą małej strzykawki. Wymieszaj je wykałaczką do odpowiedniej konsystencji (gdy farba jest całkowicie homogenizowana, ale nie jest zbyt rzadka), testując ją na białym papierze do drukarki za pomocą mikropędzelka.
      UWAGA: W niektórych przypadkach, jeśli farba szybko wysycha, przygotuj ją z nieco większą ilością płynu niż jest to pożądane do aplikacji i pozwól pędzlom zanurzyć się w garnku z rozcieńczalnikiem do farb do późniejszego użycia (krok 4).
   4. Umieść kroplę kleju na bazie wody wielkości ziarnka grochu (patrz Tabela materiałów) na rogu papieru drukarki.
      UWAGA: Musi to być ostatni etap przygotowania, a następny krok musi nastąpić natychmiast po tym, aby klej nie wysechł.

2. Znieczulenie pająka

1. Z pająkiem w fiolce i dłonią zaciśniętą na otworze, aby zapobiec ucieczce, powoli dodawaj gaz CO₂, aż trzecia para nóg pająka wysunie się do 180 stopni.
2. Czas narażenia na CO₂ wynosi około 20 sekund do 1,5 minuty, w zależności od średniej wielkości gatunku i pojedynczego pająka. Odkryliśmy, że wydłużenie trzeciej pary nóg jest wiarygodnym wskaźnikiem prawidłowego poziomu znieczulenia u H. pyrrithrix, ale prawdopodobnie różni się to w zależności od gatunku. Jeśli po raz pierwszy używasz tych technik z innym gatunkiem, najpierw przetestuj znieczulenie na kilku próbkach, aby ocenić ich reakcję.
3. Podawaj pająkom jak najmniej CO₂ , aby osiągnąć wymagany poziom znieczulenia. Podczas gdy opisane tutaj krótkie okresy znieczulenia nie powodowały śmiertelności (i nie powodowały zauważalnych różnic w zachowaniu w stosunku do pająków nieznieczulonych), należy zapewnić wszystkim zwierzętom w eksperymencie równy poziom znieczulenia (w tym pozorowaną kontrolę).
4. Trzymaj fiolkę zamkniętą po dodaniu CO₂ , aby utrzymać pająka w znieczuleniu; dlatego uwzględnij ten czas przy obliczaniu, jak długo pająk jest wystawiony na działanie CO₂ .
5. Po wyjęciu pająka z fiolki w celu rozpoczęcia manipulacji kolorem, pozostanie on w pełni znieczulony przez około 1 do 2 minut; dlatego należy niezwłocznie wykonać następujące czynności (punkty 3-6). Ze względu na to ograniczone okno czasowe, wypróbuj następującą metodę malowania martwymi okazami najpierw (dla praktyki) przed próbą malowania żywych pająków.

3. Montaż pająka pod mikroskopem

1. Nałóż bardzo małą ilość kleju na główkę kołka montażowego lub gwoździa w plastelinie przygotowanej w polu widzenia mikroskopu.
   UWAGA: Użyj najmniejszej ilości kleju, która pozwala utrzymać pająka na miejscu, aby upewnić się, że i) pająk nie zsunie się z główki szpilki (jeśli zostanie użyty zbyt dużo kleju) oraz ii) pająkowi uda się uwolnić po przebudzeniu.
2. Delikatnie wsunąć znieczulonego pająka z fiolki na stół brzuszną stroną do góry.
   UWAGA: Ponieważ odwłoki pająków są miękkie, należy uważać, aby nie stukać ani nie upuszczać pająków na stół, ponieważ może to spowodować obrażenia.
3. Delikatnie dociśnij główkę szpilki (za pomocą kleju) do mostka pająka (centralny obszar, w którym nogi pająka przyczepiają się do ciała) tak, aby pająk lekko podskoczył i wyprostował nogi pod niewielkim naciskiem. Aby uzyskać dodatkową kontrolę nad wywieranym naciskiem, trzymaj modelinę obiema rękami, mocno opierając obie ręce o stół.
4. Umieść modelinę pod mikroskopem tak, aby obszar do malowania był skierowany do góry i ostry.

4. Malowanie pająka

1. Oceń konsystencję farby przed dotknięciem pędzla do pająka.
   1. Ponownie przetestuj konsystencję farby (użyj chłonnego papieru do wytarcia pędzli, jeśli były konserwowane w rozcieńczalniku), wyreguluj ponownie w razie potrzeby i zawsze najpierw spróbuj nałożyć farbę na papier drukarki, aby kontrolować ilość farby zawartą we włoskach pędzla.
   2. Prawą ręką i patrząc przez mikroskop umieść końcówkę pędzla w polu widzenia i upewnij się (po raz drugi), że włoska pędzla nie zawierają zbyt dużej ilości farby, w takim przypadku wytrzyj jej część na papier drukarki.
2. Przetestuj konsystencję farby na pająku.
   1. Dotknij pająka pędzlem na największym obszarze, który będzie musiał zostać pomalowany. Dzięki temu malarz będzie wiedział, czy konsystencja i ilość farby jest odpowiednia (np. kiedy farba lekko i powoli wsiąka we włosy/łuski pająka).
      1. Jeśli farba nie zostanie nałożona, zanurz pędzel w farbie i wróć do kroku 4.1, aby powtórzyć procedurę.
      2. Jeśli farba szybko wsiąknie i rozleje się na obszar, który nie powinien być pokryty farbą, i zakładając, że rozlanie jest minimalne i że dana osoba może nadal wziąć udział w eksperymencie, przetrzyj pędzel o papier chłonny i wróć do kroku 4.1, aby powtórzyć procedurę.
         UWAGA: Tego rodzaju rozlania płynu nie można naprawić. Jeśli wyciek dotrze do chelicerae lub oczu lub innych części, które mogą być śmiertelne lub toksyczne dla danej osoby, rozważ natychmiastowe umieszczenie pająka w zamrażarce, aby go uśpić, zanim się obudzi i wykluczyć pająka z eksperymentu.
3. Pomaluj wszystkie obszary, które wymagają kolorów, wykonując kroki 4.1 i 4.2.
   1. Jeśli malujesz twarz pająka, użyj dodatkowej cienkiej szpilki lewą ręką, aby przytrzymać przednie nogi i pedipalpy (tak, aby nie przeszkadzały pędzlowi). Najlepiej zrobić to podczas patrzenia przez mikroskop, aby uniknąć uszkodzenia przydatków pająka. Ponadto, jeśli malujesz twarz pająka i w zależności od pędzli użytych do malowania, rozważ pomalowanie obu stron twarzy przed próbą pomalowania środkowej części między oczami - oba pomalowane obszary można połączyć, trzymając pędzel równolegle do twarzy pająka i wywołując działanie kapilarne.
      UWAGA: Malując twarz pająka, najłatwiej jest najpierw pomalować stronę najbliższą dominującej ręce, a następnie obrócić kulkę gliny (z zamontowanym pająkiem) pod mikroskopem, aby pomalować drugą stronę, a następnie środek.
   2. Podczas malowania pedipalpów lub nóg należy uważać, aby nie dotykać żadnych połączeń, jeśli farba jest twardniejąca (taka jak farba emaliowana) i uważać, aby nie nakładać farby na narządy dostarczające spermę samca (na spodniej stronie dystalnego segmentu pedipalps).

5. Robienie zdjęcia pająka

1. Przełącz obiektyw w tryb aparatu.
2. Zrób zdjęcie za pomocą oprogramowania komputerowego, upewniając się, że wybrany zoom jest wybrany na mikroskopie, aby można było dodać podziałkę.

6. Uwalnianie pająka z kołka lub gwoździa

1. Kiedy pająk zacznie się poruszać, przytrzymaj szpilkę tak, aby przednie nogi pająka dotykały fiolki pająka.
2. Pozwól pająkowi się uwolnić, a jeśli to konieczne, delikatnie pochyl szpilkę, aby pomóc pająkowi oderwać się od wysuszonego kleju.
   1. Jeśli pająk obudzi się przed zakończeniem malowania, pozwól mu na co najmniej 15 minut na dojście do siebie, zanim zostanie ponownie znieczulony. Jeśli zostanie to zrobione, upewnij się, że wszystkie grupy otrzymują ten sam poziom znieczulenia (w tym osoby leczone pozorująco, jeśli dotyczy).
      UWAGA: Wydaje się, że pająki szybko wracają do normalnego zachowania po manipulacji (< 15 minut), ale zalecamy ustandaryzowany czas odpoczynku wynoszący 12 godzin przed użyciem pająka w teście behawioralnym.

7. Analiza zachowania pająków

1. Porównaj zachowanie osób niezmanipulowanych, pozorowanych i zmanipulowanych, aby ocenić potencjalną toksyczność aplikacji (która może się różnić w zależności od konkretnego rodzaju farby, koloru, obszaru aplikacji i badanego gatunku). Odpowiednie zachowanie do porównania może obejmować wskaźnik aktywności, rodzaj wykonywanej aktywności, sukces w wykonywaniu określonych czynności (np. chwytanie zdobyczy) itp.
   1. W ramach projektu eksperymentalnego należy wykorzystać pozorowane pająki (na przykład nałożenie farby na niewidoczny obszar lub nałożenie farb o neutralnym kolorze na te same obszary) w celu zmiany koloru tylko u danej osoby, przy jednoczesnym kontrolowaniu innych czynników (np. czasu obsługi, zapachu, tekstury powierzchni itp.).
      UWAGA: W przypadku malowania nóg lub pedipalpów należy wziąć pod uwagę możliwość, że może to kolidować z włoskami czuciowymi (powszechnymi na nogach pająków i pedipalpach, patrz Foelix 2010⁴⁰) i, w takich przypadkach, samce potraktowane pozorem powinny mieć nałożone farby o neutralnym kolorze na te same obszary jako kontrola.
   2. Opracowując nowe metody, porównaj pomalowane pająki z niezmanipulowanymi pająkami, aby ocenić, czy osobniki zmanipulowane kolorem nadal zachowują się normalnie.

8. Pomiar właściwości odbicia manipulacji kolorem na malowanym obiekcie

1. Po eutanazji (po tym, jak pająki zostały włączone do eksperymentu lub specjalnie uśpione w tym celu, patrz uwaga poniżej), zmierz właściwości spektralne manipulacji kolorem za pomocą standardowego przenośnego spektrofotometru UV-VIS (Tabela materiałów), szczególnie dla obszarów o średnicy większej niż 1 mm.
2. W przypadku mniejszych obszarów użyj specjalnie skonstruowanego mikrospektrofotometru (spektrofotometr UV-VIS kierowany przez mikroskop), aby uzyskać łatwiejsze i bardziej precyzyjne pomiary, chociaż optyka mikroskopu odcina światło UV, co oznacza, że pomiary są ograniczone do długości fal widzialnych dla człowieka (patrz Taylor i in. 2011⁴¹).
3. W przypadkach, gdy obszary z modyfikacją kolorów są bardzo małe i wymagane są dane dotyczące współczynnika odbicia UV, należy użyć dostępnych na rynku mikrospektrofotometrów UV-VIS, chociaż są one droższe (patrz Taylor et al. 2014⁴²).
   UWAGA: Źródło światła spektrofotometrów UV-VIS zawiera światło UV i może być niebezpieczne dla oczu zwierząt (w tym naszych), dlatego pomiary spektralne powinny być wykonywane dopiero po eutanazji zwierząt, a nie tylko znieczuleniu. W przypadku pająków pomalowanych emalią można to zrobić po użyciu pająków w eksperymentach, ponieważ farba nie się (patrz reprezentatywne wyniki poniżej). W przypadku farb na bazie wody, które czasami blakną po dniach lub tygodniach, zestaw pająków można poświęcić do pomiaru w czasie, gdy ich odpowiednik byłby zaangażowany w eksperyment (w celu uchwycenia danych, które odzwierciedlają rzeczywistą manipulację kolorami użytą w eksperymencie). Raportowanie właściwości spektralnych farb pozwoli na replikację przez innych badaczy, którzy mogą chcieć odtworzyć manipulację kolorem, ale nie mają dostępu do tych samych konkretnych produktów farbiarskich.

Wyniki

Skuteczność manipulacji kolorami

Korzystając z tych technik, skuteczne są różne stopnie manipulacji kolorami, w tym całkowite ukrycie kolorów lub zmniejszenie lub zwiększenie ich intensywności. Widać to zarówno na zdjęciach, jak i pomiarach spektralnego współczynnika odbicia (Rysunek 2, Rysunek 3 i Rysunek 4). Tutaj pokazujemy zmanipulowanego kolorem samca Habronattus pyrrithrix w porównaniu z naturalnymi samcami o czerwonej twarzy. Właściwości spektralne mierzono za pomocą spektrofotometru UV-VIS (patrz tabela materiałów), który może precyzyjnie mierzyć kolorowe obszary o średnicy zaledwie 1 mm. Pomiary wykonano w odniesieniu do białego wzorca odbicia rozproszonego (patrz tabela materiałów).

W rzadkich przypadkach (5 ze 108 mężczyzn pomalowanych czarnym eyelinerem 1 (patrz Tabela Materiałów) na twarzy), rozpuszczalny w wodzie eyeliner zaczął ścierać się z twarzy pająków po tygodniu lub dwóch. Nie zaobserwowano tego w przypadku kredki do oczu innej marki (eyeliner 2; patrz tabela materiałów). W obu przypadkach klatki pająków spryskano wodą trzy do pięciu razy w tygodniu. Różne warunki konserwacji mogą wpływać na zużycie farby na bazie wody. Farba emaliowana pozostała nienaruszona u wszystkich manipulowanych samców (n=221), nawet u tych, którzy pozostali przy życiu po 6 miesiącach.

Potencjalna toksyczność manipulacji kolorem

Należy unikać malowania oczu pająków, aby nie zasłaniać im widzenia, ani na ich chelicerae, częściach gębowych i innych otworach, a także ewentualnie innych miękkich częściach ciała, aby zapobiec ewentualnemu spożyciu i zatruciu. Należy również uważać z malowaniem stawów lub części, w których znajdują się włoski czuciowe (takie jak nogi i pedipalpy), aby nie ograniczać ich ruchomości lub układu sensorycznego. Jeśli jednak takie manipulacje kolorem na tych obszarach ciała są konieczne lub jeśli istnieją jakiekolwiek wątpliwości co do możliwości wystąpienia subtelnych negatywnych skutków, najlepiej jest zastosować farby u osób we wszystkich kategoriach leczenia. W ten sposób uniknie się niezamierzonego manipulowania systemami sensorycznymi osób w sposób, który może być stronniczy tylko wobec jednego z zabiegów. Na przykład w eksperymencie z wykorzystaniem manipulowanych samców, pokazanym na Rysunek 4, celem było zwiększenie i zmniejszenie liczby czerwonych plam wyświetlanych przez samce podczas zalotów. Ponieważ niektóre samce zakrywały swoje naturalne czerwone twarze szarą farbą emaliowaną (aby zmniejszyć ilość wyświetlanej czerwieni), inne samce, dla których chcieliśmy zachować czerwoną twarz, zostały pomalowane na czerwono na swojej naturalnie czerwonej twarzy tym samym produktem, co samce o szarej twarzy. Podobnie, ponieważ chcieliśmy dodać czerwone plamy do pedipalpu na niektórych samcach, aby zwiększyć ilość wyświetlanych czerwonych plam, szara farba została użyta do pokrycia pedipalpu innych samców, tak aby wszystkie samce zostały pomalowane na tym wrażliwym obszarze (patrz Rysunek 4). Chociaż jest to preferowane, ta strategia może nie zawsze być wykonalna. Na przykład w innym eksperymencie czerwone zabarwienie zostało usunięte za pomocą czarnego eyelinera, który dawał tę samą właściwość spektralną, co leżący pod spodem naskórek samca, pozostawiając inne męskie kolory nienaruszone i naturalne (Ryc. 2). W tym przypadku, w przypadku naturalnie wyglądających samców, taką samą ilość eyelinera nałożono na obszar na szczycie pancerza tuż za przednimi środkowymi oczami (obszar, który nie jest wyraźnie widoczny dla samic), aby kontrolować potencjalny zapach lub ogólną toksyczność produktu. Jednak miejsce, w którym nakładana jest farba, może w różny sposób wpływać na pająki. Dlatego, aby ocenić subtelne różnice w sposobie lub miejscu, w którym farba została nałożona, mogą mieć wpływ na integralność pająka, porównano zachowanie obu typów samców w kontekście, który był istotny dla naszych hipotez (w odniesieniu do wyboru partnera i kanibalizmu seksualnego). Samce zostały umieszczone dwa na dwóch w obecności samicy, a my porównaliśmy ich opóźnienie do uaktywnienia się, opóźnienie do zalotów i całkowity czas, jaki spędzili na zalotach z ogólnymi liniowymi modelami efektów mieszanych (używając funkcji lmer z pakietem R lme4⁴³ w wersji R 3.5.2⁴⁴ z żeńską tożsamością jako efektem losowym, oraz przy użyciu kryterium maksymalnego prawdopodobieństwa w celu uzyskania wartości p). W tym przypadku wszystkie porównania nie wykazują żadnych różnic między terapiami (patrz Tabela 1) i dlatego stwierdzono, że nie wprowadziliśmy stronniczości na korzyść jednej lub drugiej kategorii leczenia.

W obu przypadkach, gdy mają bardzo podobne kategorie leczenia (Rysunek 4), czy tylko osoby traktowane pozorowo (Rysunek 2 i Rysunek 3), badacze powinni ocenić, jak farba, której używają, wpływa na ich modelowe gatunki i upewnić się, że nadal zachowują się w podobny i ekologicznie odpowiedni sposób. Można rejestrować dane, aby w jak największym stopniu ocenić możliwe skutki toksyczności, na przykład porównując wskaźniki aktywności między osobami leczonymi i niepoddanymi manipulacji. Nasze pająki pomalowane farbą emaliowaną jak w Rysunek 4 zostały porównane z niezmanipulowanymi samcami w identycznym kontekście. W szczególności, samce były wprowadzane pojedynczo do klatki dla samic i porównywano ich opóźnienie w opuszczeniu fiolki, opóźnienie w zalotach i częstotliwość zalotów (przed kopulacją i przed atakiem lub kanibalizacją). Nie stwierdzono żadnych różnic (przy użyciu podobnych liniowych modeli efektów mieszanych, jak powyżej) i dlatego doszliśmy do wniosku, że nasze pomalowane samce zachowywały się naturalnie (Tabela 2).

Na koniec, ważne jest, aby zauważyć, że jakiekolwiek pająki w eksperymentach (zazwyczaj samice), które kanibalizowały samce manipulowane kolorem, nigdy nie wydawały się cierpieć z powodu negatywnych skutków. Pająki trawią swoją zdobycz na zewnątrz, zwykle pozostawiając pomalowane obszary naskórka. Jeśli jednak dostosowuje się tę metodę do innych systemów, w których będą spożywane zwierzęta z modyfikacją koloru, należy ocenić potencjalne ryzyko toksyczności.

Rysunek 1. Dorosły samiec Habronattus pyrrithrix ilustruje, jak małe są ich kolorowe obszary ciała. Sfotografowane przez Lyle'a Bussa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Eksperymentalna manipulacja kolorami stosowana w celu ukrycia czerwonego zabarwienia twarzy u Habronattus pyrrithrix. (A) Nienaruszone czerwone zabarwienie twarzy przed manipulacją kolorem. (B) Ubarwienie twarzy tego samego samca po ukryciu naturalnego czerwonego zabarwienia czarnym eyelinerem 1. (C) Reprezentatywne widma odbicia dla naturalnej czerwonej twarzy, naturalnego czarnego naskórka pod spodem i czerwonej twarzy pomalowanej czarnym eyelinerem 2. Zmodyfikowano z Taylor and McGraw 2013³⁹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Eksperymentalna manipulacja kolorami używana do zmniejszenia rozmiaru i zaczerwienienia czerwonej plamy na twarzy samca Habronattus pyrrithrix. (A) Nienaruszone czerwone zabarwienie twarzy przed manipulacją kolorem. (B) Ubarwienie twarzy tego samego mężczyzny po nałożeniu rozcieńczonego czarnego eyelinera (Urban Decay) na przednią część twarzy i nierozcieńczonego czarnego eyelinera wzdłuż krawędzi plamy na twarzy w celu zmniejszenia rozmiaru czerwonego obszaru. (C) Średnie krzywe spektralne samców kontrolnych traktowanych pozorowo (n = 21) i samców z manipulacją kolorem (n = 21), w porównaniu ze średnią populacyjną (n = 57) i 10 najbardziej szarymi samcami z poprzedniego badania41. Rysunek reprodukowany z Taylor et al. 2014³⁸. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4.Eksperymentalna manipulacja kolorem stosowana do modyfikacji koloru czerwonej plamy na twarzy samca Habronattus pyrrithrix. Samce Habronattus pyrrithrix pomalowane (A) czerwienią, (B) czerwienią i szarością oraz (C) szarą emalią pokrywają swoją naturalną czerwoną twarz i naturalnie kremowe pedipalpy. (D) Średnie krzywe widmowe dla niemanipulowanych samców (n = 9) i samców z twarzą pokrytą czerwoną farbą emaliowaną (n = 9). Nakładając jaśniejszą czerwień na pysk pająka, skutecznie wzmocniliśmy jego czerwony kolor twarzy. Ponieważ farba emaliowana całkowicie pokrywa leżące pod spodem łuski, kolor można również całkowicie zmienić, tak jak ma to miejsce w przypadku szarej emalii. (E) W tym eksperymencie wybrano czerwone i szare farby emaliowane, które miały być dopasowane pod względem całkowitej jasności (całkowitego odbicia w zakresie długości fal widocznych dla tych pająków). Różnice w skali osi Y w D i E wynikają z różnych technik (takich jak odległość od próbki i wielkość mierzonych obszarów) pomiaru próbek kolorów na papierze (E) w porównaniu z bezpośrednimi pomiarami kolorów na powierzchni pająka (D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt. szt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. szt. pkt. pkt. pkt. pkt. TGL pkt. pkt. pkt. punktu

N	Zmienna zależna	p	t	Czerwona twarz	±SE	twarz	±SE	Instrument nFID
202mld	Mężczyzna spóźnia się z wyjściem z naczynia	0,35	-0,93	140,0	23,9	109,8	23,9	Rozdział 102
179stopni Celsjusza	Mężczyzna spóźnia się do sądu	0,74	0,33	983,4	127,1	1031,0	126,5	95 Rozdział 95
204a	Męski wysiłek zalotów	0,52	0,63	181,2	Norma 24,4	203,0	Norma 24,4	Rozdział 102
204a	Męski wysiłek zalotów przed jakimkolwiek atakiem	0,41	0,68	89,0	Rozdział 15,7	97,5	Rozdział 15,7	Rozdział 102

Tabela 1. Wpływ manipulacji kolorem męskiej twarzy na zachowanie, gdy maluje się czarnym eyelinerem w porównaniu z pozorowanym traktowaniem (Rysunek 2). Podano strukturę każdego modelu, jak również średnie szacunki w sekundach (±SE) dla każdej grupy leczonej. N = liczba samców, p i t = wartość p i wartość t dla leczenia mężczyzn, nFID = liczba poziomów w tożsamości żeńskiej w efekcie losowym. ^ZASpośród 104 przeprowadzonych testów męskich, 102 zostały pomyślnie zarejestrowane, co doprowadziło do zaobserwowania 204 unikalnych samców. ^B2 Samce zostały kanibalizowane przez samicę przed opuszczeniem szalki Petriego. ²⁵samców zostało kanibalizowanych przez samicę przed rozpoczęciem zalotów do samicy.

pkt. pkt. pkt. szt. pkt. pkt. pkt. mm pkt. szt. pkt. pkt. jedn. pkt. pkt. pkt. szt. szt. pkt.

N	Zmienna zależna	p	t	Bez manipulacji	±SE	Malowane	±SE
32a	Mężczyzna spóźnia się z wyjściem z naczynia	0,87	-0,17	380,8	143,1	345,4 pkt.	152,4
31mld	Mężczyzna spóźnia się do sądu	0,93	-0,09	502,6	105,8	488,1	116,6
31mld	Męski wysiłek zalotów	0,74	-0,33	2324.3	455,0	2102.1	484,4 pkt.
31mld	Męski wysiłek zalotów przed jakimkolwiek atakiem	0,68	0,42	1495,1	450,8 pkt.	1770,1	479,9

Tabela 2. Wpływ manipulacji kolorem twarzy mężczyzny na zachowanie, gdy jest pomalowany czerwoną lub szarą farbą emaliowaną (n = 15, Ryc. 4) w porównaniu z niezmanipulowanymi samcami (n = 17). Podano strukturę każdego modelu, jak również średnie szacunki w sekundach (±SE) dla każdej grupy leczonej. N = liczba samców, p i t = wartość p i wartość t dla samców. ¹⁷niezmanipulowanych samców porównano z podzbiorem wszystkich pomalowanych samców w naszym eksperymencie (n = 221). W szczególności porównano je z 15 pomalowanymi samcami (5 czerwonych (Ryc. 2A), 5 czerwonych i szarych (Rycina 2B) i 5 szarych (Ryc. 2C)) testowanych w tym samym kontekście (w obecności samicy) i w tym samym konkretnym okresie czasu. Jest to o tyle istotne, że niezmanipulowane samce badano pod koniec eksperymentu (w sierpniu i wrześniu 2018 r.), co odpowiada końcowi ich naturalnego sezonu lęgowego, w którym samce są na ogół mniej aktywne. Utrzymanie wszystkich tych pozostałych zmiennych na równym poziomie pozwala nam porównać obróbkę malarską bez wprowadzania innych uprzedzeń. ^bJeden samiec (cały siwy) został kanibalizowany, zanim w ogóle zaczął zalecać się do samicy.

Dyskusja

Tutaj pokazujemy, że kolorami maleńkich części ciała stawonogów można skutecznie manipulować za pomocą barwników, takich jak farby do makijażu i emalii.

Pierwszym krytycznym krokiem do osiągnięcia tak delikatnej manipulacji jest możliwość unieruchomienia małych zwierząt, których zwykle nie można utrzymać w dłoni. Tutaj, aby móc pomalować wrażliwe miejsca, takie jak skacząca twarz pająka, znieczuliliśmy osoby za pomocą CO₂ i umieściliśmy je na główce szpilki. Pozwala to na pracę w pobliżu oczu pająka z mniejszym stresem, niż prawdopodobnie doświadczyłby pająk, gdyby nie spał (ze światłem z mikroskopu świecącym w ich twarze podczas procesu malowania).

Metoda wymaga również zaopatrzenia się w dobrej jakości mikropędzle i, co najważniejsze, odpowiednie substancje koloryzujące. Najtrudniejszym krokiem w nakładaniu farby bez rozlewania, ale z dobrym kryciem, jest uzyskanie odpowiedniej konsystencji. Dlatego substancje barwiące należy łatwo rozcieńczać rozcieńczalnikiem i łatwo suszyć w celu zagęszczenia. Można stosować różne rodzaje farb; Tutaj wyniki są prezentowane za pomocą rozpuszczalnych w wodzie (niewodoodpornych) eyelinerów i farb emaliowanych. Niewodoodporne kredki do oczu mają tę zaletę, że łatwo upłynniają się po zmieszaniu z wodą. Odbywa się to jednak w związku z rozcieńczeniem pigmentacji (co może nie być lub może być pożądane (patrz na przykład rysunek 3)). Farby emaliowane mają konsystencję, którą można łatwo kontrolować, dodając rozcieńczalnik do emalii, zapewniając jednocześnie pełne krycie. Jednak ta cecha idzie w parze z możliwością zachowania struktury włosów lub łusek pomalowanej części ciała. Ponadto farby emaliowane są trwałe. Minusem tego jest to, że farba emaliowana i rozcieńczalnik wydzielają silne zapachy podczas aplikacji i przed wyschnięciem. Dodatkową trudnością dotyczącą substancji barwiących może być znalezienie odpowiedniego odcienia, o odpowiednich właściwościach spektralnych. Na przykład trudno jest uzyskać czerwony eyeliner do stosowania równolegle z czarnym eyelinerem, ponieważ eyelinery są często bardziej różowe niż czerwone. Trudno też o puder do makijażu (lub pigmenty), które nie zawierają brokatu (który czasami może być widoczny tylko pod mikroskopem). Wiele produktów do makijażu odbija również światło UV, które, choć niewidoczne dla eksperymentatorów, może być widoczne dla badanych zwierząt.

Manipulowanie ubarwieniem stawonogów poprzez bezpośrednie nakładanie barwników na ich części ciała ma zalety i niedogodności w porównaniu z innymi metodami. Jego głównym ograniczeniem jest to, że nie można absolutnie odrzucić możliwości wystąpienia pewnych subtelnych skutków toksyczności. Można jednak upewnić się, że nie wprowadza się uprzedzeń wobec jednej grupy zabiegowej, nakładając farbę na wszystkie kategorie zabiegów i/lub można sprawdzić, czy nałożenie farby koliduje z zachowaniami będącymi przedmiotem zainteresowania. Dzięki przedstawionym tutaj metodom zebraliśmy wystarczającą ilość dowodów, aby sugerować, że nałożenie farby doprowadziło do znikomego lub żadnego negatywnego efektu (Tabela 1 i Tabela 2). Główną zaletą tej metody jest to, że maleńkie plamy koloru mogą być celowane, ich kolor "usuwany" (patrz Rysunek 2), matowy (Rysunek 3) lub jaśniejszy (Rysunek 4), w izolacji od reszty zabarwienia ciała i środowiska danej osoby. Kontrastuje to z najpowszechniejszą metodą alternatywną, która polega na manipulowaniu warunkami oświetleniowymi, a tym samym modyfikowaniu wyglądu wizualnego całej osoby i jej otoczenia. W rzeczywistości, nawet jeśli nie manipuluje się konkretnie warunkami oświetleniowymi, można z powodzeniem manipulować kolorem i zobaczyć ograniczone lub żadne efekty tej manipulacji, jeśli środowisko oświetleniowe nie jest odpowiednie³⁹. Dlatego ważne jest, aby zmierzyć i wziąć pod uwagę środowisko świetlne, w którym będą przeprowadzane wszelkie eksperymenty (tj. mierzyć natężenie promieniowania) i upewnić się, że ściśle dopasowujesz je do naturalnych warunków oświetleniowych (na przykład używając żarówek o pełnym spektrum, które naśladują naturalne światło w niewoli). Ogólnie rzecz biorąc, dzięki użyciu mikroszczoteczek i mikroskopu, protokół ten pozwala na bardziej precyzyjną manipulację małymi plamami kolorów niż większość innych bezpośrednich metod kolorowania, które były wcześniej stosowane na bezkręgowcach. W większości wcześniejszych badań wykorzystano zwierzęta z kolorowymi plamami, które są stosunkowo duże w porównaniu z twarzami skaczących pająków (np. manipulacja kolorami skrzydeł motyli^29,34,35, ciałami dorosłych pluskwiaków ("prawdziwych robaków")^30,36 i koników polnych³¹ lub nogami stosunkowo dużych pająków wilków 32,33,37). Przedstawione tu metody otwierają możliwości badania niesamowitej różnorodności plam barwnych na taksonach, które są niedostatecznie zbadane ze względu na ich niewielkie rozmiary.

Podobne techniki można zastosować do innych stawonogów, które można unieruchomić lub znieczulić, oraz do obszarów, w których farba nie wpłynęłaby na mobilność lub zdrowie osobnika (tj. z wyłączeniem obszarów takich jak stawy, struktury takie jak włosy lub arolia, które są potrzebne do prawidłowego poruszania się, części ust lub innych otworów, takich jak struktury oddechowe). Techniki te można również rozszerzyć, aby uwzględnić większą paletę barwników, farb i makijaży, które są powszechnie dostępne.

Wreszcie, te delikatne techniki mogą być używane nie tylko do manipulowania kolorem na małych organizmach, ale także do manipulowania wzorami (takimi jak paski) u stosunkowo większych organizmów. Powinno to być korzystne dla szerokiego grona badaczy, którzy mogą dostosować nasze metody do własnych badań nad doborem płciowym, komunikacją, aposematycznymi sygnałami ofiar i innymi kontekstami, w których zwierzęta używają kolorów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zbiornik CO2	AirGas (Radnor, PA)	#CD 50	do znieczulenia pająków
Rozcieńczalnik do farb emaliowanych	Testors (Vernon Hills, IL)	75611792569	do cienkiej farby emaliowanej
Emalia płaska	Testors (Vernon Hills, IL)	czerwony: 075611115009,: 075611114903, biały: 075611116808	można rozcieńczyć rozcieńczalnikiem do farb emaliowanych
świetlny	Zeiss (Jena, Niemcy)	stemi 508	do precyzyjnego malowania małych powierzchni
Aparat do mikroskopu świetlnego	Zeiss (Jena, Niemcy)	Axiocam 105 kolor	do robienia zdjęć przed i po manipulacji do dokumentacji
Oprogramowanie kamery mikroskopu świetlnego	Zeiss (Jena, Niemcy)	Zen 2 niebieska edycja	do obróbki zdjęć zrobionych przed i po manipulacji
Eyeliner w płynie, odcień " Perwersja"	Urban Decay (Costa Mesa, CA)	(wycofany)	niewodoodporny eyeliner, który można rozcieńczyć wodą; eyeliner 2
MegaLiner eyeliner w płynie,	WetnWild (Los Angeles, CA)	SKU# 871Niewodoodporny	eyeliner, który można rozcieńczyć wodą; eyeliner 1
Mikropędzle	MicroMark (Berkeley Heights, NJ)	#84648	umożliwiające precyzyjne malowanie małych powierzchni
Modelowanie nietwardniejące glina	Van Aken International Claytoon (North Charleston, SC)	18165	do wbijania małych gwoździ lub szpilek do owadów i elastycznego dostosowywania ich kątów
Małe kołki montażowe do gwoździ lub owadów	BioQuip (Rancho Dominguez, CA)	#1208B7	do przyklejania pająków, a także do usuwania pająków" s wyrostki przed obszarem do malowania
Małe plastikowe pojemniki, takie jak wieczka fiolek do zbierania owadów z zatrzaskową nakrętką	BioQuip (Rancho Dominguez, CA)	#8912	do mieszania farby i rozcieńczalnika do odpowiedniej konsystencji
Mała strzykawka	Fisher Scientific	1482910F	do przenoszenia niewielkiej ilości rozcieńczalnika do szkliwa
Spectralon biały standard	Labsphere Inc. (North Sutton, NH)	WS-1-SL	do pomiaru właściwości spektralnych kolorów
Spektrofotometr UV-VIS	Ocean Optics (Dunedin, FL)	USB 2000 (spektrofotometr) z PX-2 (źródło światła)	do pomiaru właściwości spektralnych kolorów
Rozpuszczalny w wodzie klej szkolny	Elmer's (High Point, NC)	#E304	do montażu pająków na gwoździu/szpilce
Wykałaczki drewniane	Up& W górę, Target Corporation (Minneapolis, MN)	#253-05-0125	do przenoszenia kropli farby emaliowanej