Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In Vesiculo Synteza prekursorów błony peptydowej do autonomicznego wzrostu pęcherzyków

5.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59831

⸱

28 czerwca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Physics of Synthetic Systems - E14, Physics-Department and ZNN, Technische Universität München, 2Departmant of Chemistry, Center for Integrated Protein Science (CIPSM), Technische Universität München, 3Nanosystems Initiative Munich

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawione tutaj są protokoły tworzenia małych jednopłytkowych pęcherzyków opartych na peptydach, zdolnych do wzrostu. Aby ułatwić produkcję pęcherzyków peptydu błonowego, pęcherzyki te są wyposażone w system transkrypcyjno-translacyjny i plazmid kodujący peptydy.

Streszczenie

Podział reakcji biochemicznych na kompartmenty jest centralnym aspektem komórek syntetycznych. W tym celu przedziały reakcyjne oparte na peptydach służą jako atrakcyjna alternatywa dla liposomów lub pęcherzyków na bazie kwasów tłuszczowych. Na zewnątrz lub wewnątrz pęcherzyków peptydy mogą ulegać łatwej ekspresji i upraszczać syntezę prekursorów błonowych. Poniżej przedstawiono protokół tworzenia pęcherzyków o średnicy ~200 nm w oparciu o amfifilowe polipeptydy podobne do elastyny (ELP) wykorzystujące odwodnienie-uwodnienie z kulek szklanych. Przedstawiono również protokoły ekspresji i oczyszczania bakteryjnego ELP poprzez odwrócone cykle temperatury, a także ich kowalencyjną funkcjonalizację barwnikami fluorescencyjnymi. Ponadto w niniejszym raporcie opisano protokół umożliwiający transkrypcję aptameru RNA dBrokuły wewnątrz pęcherzyków ELP jako mniej złożony przykład reakcji biochemicznej. Na koniec dostarczany jest protokół, który umożliwia ekspresję w pęcherzykach białek fluorescencyjnych i peptydu błonowego, podczas gdy synteza tego ostatniego powoduje wzrost pęcherzyków.

Wprowadzenie

Do tworzenia syntetycznych żywych systemów komórkowych zazwyczaj podchodzi się z dwóch różnych kierunków. W metodzie odgórnej genom bakterii jest redukowany do jej podstawowych składników, co ostatecznie prowadzi do minimalnej komórki. W podejściu oddolnym sztuczne komórki są składane de novo z komponentów molekularnych lub podsystemów komórkowych, które muszą być funkcjonalnie zintegrowane w spójny system podobny do komórki.

W podejściu de novo, podział niezbędnych składników biochemicznych jest zwykle osiągany za pomocą membran wykonanych z fosfolipidów lub kwasów tłuszczowych1,2,3,4. Dzieje się tak dlatego, że "nowoczesne" błony komórkowe składają się głównie z fosfolipidów, podczas gdy kwasy tłuszczowe są uważane za prawdopodobnych kandydatów do prebiotycznych obudów błonowych5,6. W celu utworzenia nowych błon lub ułatwienia wzrostu błony, amfifilowe bloki budulcowe muszą być dostarczone z zewnątrz7 lub najlepiej poprzez produkcję w przedziale błoniastym przy użyciu odpowiednich procesów anabolicznych4,8.

Podczas gdy synteza lipidów jest stosunkowo złożonym procesem metabolicznym, peptydy mogą być wytwarzane dość łatwo za pomocą bezkomórkowych reakcji ekspresji genów9,10. W związku z tym błony peptydowe utworzone przez peptydy amfifilowe stanowią interesującą alternatywę dla błon lipidowych jako obudowy dla sztucznych mimików komórek, które są w stanie rosnąć11.

Amfifilowe kopolimery di-blokowe (ELP) podobne do elastyny są atrakcyjną klasą peptydów, które mogą służyć jako budulec dla takich membran12. Podstawowym motywem sekwencji aminokwasów ELP jest (GaGVP)n, gdzie "a" może być dowolnym aminokwasem z wyjątkiem proliny, a "n" to liczba powtórzeń motywu13,14,15,16,17. ELP zostały stworzone z bloku hydrofobowego zawierającego głównie fora fenyloalaniny oraz bloku hydrofilowego składającego się głównie z kwasu glutaminowego11. W zależności od parametrów a i roztworu, takich jak pH i stężenie soli, ELP wykazują tzw. odwrotne przejście temperatury w temperaturze Tt, gdzie peptydy przechodzą w pełni odwracalne przejście fazowe ze stanu hydrofilowego do hydrofobowego. Syntezę peptydów można łatwo zaimplementować wewnątrz pęcherzyków za pomocą ekstraktu z komórek bakteryjnych "TX-TL"11,18,19,20,21, który dostarcza wszystkie niezbędne składniki do sprzężonych reakcji transkrypcji i translacji.

System TX-TL został zamknięty razem, z matrycą DNA kodującą ELP w pęcherzykach ELP, wykorzystując odwodnienie-rehydratację z kulek szklanych jako solidnego wsparcia. Powstawanie pęcherzyków następuje poprzez ponowne uwodnienie wysuszonych peptydów z powierzchni kulki11. Inne metody22 do tworzenia pęcherzyków mogą być użyte, które potencjalnie wykazują niższą polidyspersyjność i większe rozmiary pęcherzyków (np. elektroformacja, transfer fazowy emulsji lub metody oparte na mikrofluidyce). Aby przetestować wykonalność metody enkapsulacji, alternatywnie można zastosować transkrypcję aptamera fluorogenicznego dBroccoli2311, co jest mniej skomplikowane niż ekspresja genów w systemie TX-TL.

Ze względu na ekspresję elementów budulcowych błony w pęcherzykach i ich późniejsze włączenie do błony, pęcherzyki zaczynają rosnąć11. Włączenie ELP w błonę można wykazać za pomocą testu FRET. W tym celu ELP użyte do utworzenia początkowej populacji pęcherzyków są sprzężone z barwnikami fluorescencyjnymi w równych proporcjach, tworząc parę FRET. Po ekspresji nieznakowanych ELP w pęcherzykach i ich włączeniu do błony, znakowane ELP w membranie są rozcieńczane, w wyniku czego sygnał FRET maleje11. Jako wszechstronną i powszechną metodę koniugacji stosuje się katalizowaną miedzią cykloaddycję azydkowo-alkinową. Przy użyciu liganda stabilizującego, takiego jak tris(benzyltriazolylmethyl)-amina, reakcja może być prowadzona w roztworze wodnym o fizjologicznym pH bez hydrolizy reagentów11, co jest odpowiednie dla reakcji koniugacji z udziałem peptydów.

Poniższy protokół przedstawia szczegółowy opis przygotowania do hodowli peptydosomów na bazie ELP. Opisano ekspresję peptydów i tworzenie pęcherzyków metodą kulek szklanych. Ponadto opisano sposób realizacji transkrypcji fluorogennego aptameru dBrokułów oraz reakcji transkrypcja-translacja ekspresji białek wewnątrz pęcherzyków ELP. Na koniec podano procedurę koniugacji ELP z fluoroforami, którą można wykorzystać do udowodnienia wzrostu pęcherzyków za pomocą testu FRET11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Ekspresja polipeptydów podobnych do elastyny

  1. Dzień 1: Przygotowanie kultury starterowej i materiałów do ekspresji peptydów
    1. Przygotować i poddać autoklawu kolby hodowlane (4 x 2,5 l) i 3 l pożywki LB. Na 1 l podłoża LB dodaj 25 g proszku LB do 1 l ultraczystej wody.
    2. Przygotuj kulturę starterową ze 100 ml pożywki LB, 50 μl sterylnie przefiltrowanego (filtr 0,22 μm) roztworu chloramfenikolu (25 mg/ml w EtOH) i 50 μl sterylnie przefiltrowanego (filtr 0,22 μm) roztworu karbenicyliny (100 mg/ml w 50% EtOH i 50% ultraczystej wodzie).
    3. Dodać niewielką smugę z gotowego bulionu bakteryjnego zawierającego szczep E. coli BL21(DE3)pLysS z wektorem ekspresyjnym pET20b(+) kodującym sekwencję polipeptydową MGHGVGVP((GEGVP)4(GVGVP))4((GFGVP))3(GFGVP)3(GFGVP)4GWP (w skrócie EF) do wstępnie podgrzanej 100 ml kultury starterowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 16 godzin z prędkością 250 obr./min w inkubatorze z wytrząsaniem (szczepy i wektory E. coli są dostępne na życzenie).
    4. Kolby do sporządzania ekspresji i pożywkę LB należy wstępnie ogrzać w temperaturze 37 °C przez noc, aby były przygotowane na następny dzień.
  2. Dzień 2: Ekspresja białka
    1. Dodać 750 ml pożywki LB do każdej kolby hodowlanej, 375 μl sterylnie przefiltrowanego (filtr 0,22 μm) chloramfenikolu (25 mg/ml w EtOH) i 375 μl sterylnie przefiltrowanego (filtr 0,22 μm) bulionu karbenicyliny (100 mg/ml w 50% EtOH i 50% ultraczystej wodzie).
    2. Po wymieszaniu w celu rozprowadzenia antybiotyków należy pobrać 2 ml pożywki jako próbkę referencyjną do pomiaru gęstości optycznej przy długości fali 600 nm (OD600).
    3. Dodać 7,5 ml kultury wyjściowej do kolby ekspresyjnej i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z prędkością 250 obr./min.
    4. Po tym kroku OD600 każdej kolby będzie sprawdzany co 20 minut.
    5. Gdy gęstość optyczna osiągnie około 0,8, należy obniżyć temperaturę do 16 °C i indukować ekspresję peptydu poprzez dodanie 750 μl 1 M sterylnie przefiltrowanego β-izopropylotiogalaktozydu (IPTG) w ultraczystej wodzie do każdej kolby ekspresyjnej.
    6. Inkubować kolbę ekspresyjną z indukowanymi bakteriami w temperaturze 16 °C przez 16 godzin z prędkością 250 obr./min.
  3. Dzień 3: Ekstrakcja wyrażonego polipeptydu
    1. Wstępnie zważyć kolbę wirówkową, aby umożliwić określenie masy osadu komórkowego po zbiorach.
    2. Zebrać wszystkie bakterie z kolb ekspresyjnych przez odwirowanie przez 20 minut przy użyciu wstępnie schłodzonej wirówki o sile 4 000 x g i temperaturze 4 °C.
    3. Wylej supernatant i osusz butelki wirówki na sterylnym ręczniku papierowym.
    4. Zważyć kolby wirówkowe i obliczyć masę osadu komórkowego.
    5. Ponownie zawiesić komórki, które są granulowane z 750 ml oryginalnej hodowli komórkowej, w 15 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,4) przez pipetowanie i odwirowywać przy 4 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Wylać sklarowany osad i osuszyć butelki wirówki na sterylnym ręczniku papierowym.
    6. Zawiesić osad komórkowy na etapie lizy w 2 ml buforu na 1 gram osadu komórkowego przy użyciu PBS (pH 7,4) uzupełnionego lizozymem (1 mg / ml), 1 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF), 1 mM benzamidyny i 0,5 M DNazy I.
    7. Sonikować komórki do dalszej lizy na lodzie za pomocą sonikatora o mocy 8 W przez 9 minut z naprzemiennymi 10-sekundowymi krokami sonikacji i 20-sekundowej przerwy, po której następuje 9-minutowa przerwa, podczas której próbka powinna być schładzana na lodzie. Powtórz 9-minutowy krok sonikacji jeszcze raz.
    8. Dodać 2 ml 10% (w/v) polietylenoiminy (PEI) na 1 l oryginalnej hodowli komórkowej w celu wytrącenia kwasów nukleinowych.
    9. Rozprowadzić próbkę do probówek wirówkowych o pojemności 2 ml i inkubować w temperaturze 60 °C przez 10 minut, a następnie inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    10. Odwirować roztwór o stężeniu 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant zawierający ELP.
  4. Oczyszczanie białek poprzez odwrotne cykle temperatury:
    1. Dostosuj supernatant do pH 2, aby przełączyć hydrofilową część peptydu na hydrofobową i wywołać agregację. Aby dostosować pH, stosuje się kwas fosforowy i wodorotlenek sodu. Paski pH są wystarczające do określenia poziomu pH.
    2. Aby zwiększyć wydajność oczyszczania próbki, należy podgrzać próbkę do temperatury 60 °C i dodać chlorek sodu do 2 M.
    3. Następnie odwirować próbkę o masie 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    4. Odrzucić supernatant i ponownie rozpuścić osad w PBS (ale w porównaniu z poprzednim krokiem wykorzystuje się tylko połowę początkowej objętości).
    5. Dostosuj pH do 7 za pomocą kwasu fosforowego i wodorotlenku sodu. Paski pH są wystarczająco dokładne, aby określić pH.
    6. Następnie odwirować próbkę przy masie 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Zebrać sklarowany nad osadem i powtórzyć kroki 1.4.1–1.4.6 łącznie do 3 razy, z wyjątkiem tego, że w ostatnim powtórzeniu kroku 1.4.4 zamiast PBS dodaje się tylko wodę.
    8. Zmierzyć stężenie peptydów za pomocą spektrometru absorpcyjnego. Stosować współczynnik ekstynkcji 5500/M/cm przy 280 nm.
    9. Dostosować stężenie ELP do 700 μM.

2. Produkcja pęcherzyków metodą szklanych kulek

  1. Zagęścić roztwór ELP do 1,1 mM za pomocą odśrodkowego koncentratora próżni.
  2. Zmieszać 200 μl stężonego roztworu ELP z 1,250 μl mieszaniny chloroformu/metanolu w stosunku 2:1, a następnie przeprowadzić wirowanie.
  3. Dodać 1,5 g kulistych szklanych kulek (o wielkości 212–300 μm) do kolby okrągłodennej o pojemności 10 ml.
  4. Dodać roztwór zawierający ELP i mieszaninę chloroformu/metanolu do kolby okrągłodennej i wymieszać przez delikatne wstrząsanie.
  5. Podłączyć kolbę do wyparki obrotowej. Ustaw prędkość na 150 obr./min i reguluj ciśnienie na -0,2 x 105 Pa (-200 mbar) przez około 4 minuty, aż ciecz odparuje w temperaturze pokojowej.
  6. Umieścić kolbę okrągłodenną w eksykatorze na co najmniej 1 godzinę, aby upewnić się, że pozostały chloroform i metanol zostały odparowane. Aby uniknąć utraty szklanych kulek, luźno przymocowaną folię aluminiową należy owinąć wokół otworu kolby o okrągłym dnie.
  7. W pojedynczym eksperymencie wymieszaj 100 mg szklanych kulek pokrytych peptydami z 60 μl roztworu pęczniejącego, takiego jak PBS. Próbkę należy inkubować w temperaturze 25 °C przez 5 minut.
  8. Szybko odwirować próbkę za pomocą wirówki stołowej w celu osadzenia szklanych kulek.
  9. Za pomocą pipety zebrać sklarowany sklarat zawierający pęcherzyki.

3. Transkrypcja RNA Aptamer dBrokuły wewnątrz pęcherzyków

  1. Wyczyść stół laboratoryjny chusteczkami zawierającymi roztwór do odkażania RNazy, aby stworzyć środowisko pracy wolne od RNaz.
  2. Wymieszać ssDNA (5 μM) składającego się z promotora T7 i sekwencji dBrokułów (GAGACGGGGGGGTCCATCTGAGACGGTCGGGTGTCCAGATATTCGTATCTGTCGAGAGTGTGGGCTCAGATGTGGGCTCAGATGTCGAGTAGAGTGTGGGCTC), a także nici niekodującej (5 μM) w wodzie wolnej od nukleaz uzupełnionej buforem reakcyjnym RNAPol [40 mM Tris-HCl (pH = 7,9), 6 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT) i 2 mM spermidyna], aby przygotować matrycę DNA do reakcji transkrypcji.
  3. Inkubować roztwór w temperaturze 90 °C przez 5 minut, a następnie powoli zmniejszać temperaturę do 20 °C przez 30 minut.
  4. Przygotować roztwór 1 mM (5Z)-5-(3,5-difluoro-4-hydroksybenzylideno)-2,3-dimetylo-3,5-dihydro-4H-imidazol-4-onu (DFHBI), rozpuszczając 1,26 mg DFHBI w 5 ml DMSO.
  5. Przygotować reakcję transkrypcji przez zmieszanie buforu reakcyjnego RNAPol [40 mM Tris-HCl (pH = 7,9), 6 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT) i 2 mM spermidyna] ze 125 mM KCl, 15 mM MgCl2, 4 mM rNTP, 10 μM DFHBI, 200 nM matryca DNA, 0,5 U/μL mysi inhibitor RNazy, i woda.
  6. Tuż przed rozpoczęciem reakcji dodać 4 U/μL polimerazy T7.
  7. Użyć tej mieszaniny reakcyjnej jako roztworu pęczniejącego w kroku 2.7 i inkubować w temperaturze 37 °C przez czas trwania doświadczenia, który zwykle wynosi 1 godzinę.

4. Reakcja transkrypcji-tłumaczenia (TX-TL)

UWAGA: Do reakcji transkrypcji-translacji wymagany jest surowy ekstrakt komórkowy, a także bufor reakcyjny i DNA. Surowy ekstrakt komórkowy jest przygotowywany zgodnie z opisem w Sun et al.18. Do reakcji TX-TL należy użyć: 33% (v/v) surowego ekstraktu E. coli, 42% (v/v) buforu reakcyjnego i 25% (v/v) oczyszczonego fenolowo-chloroformowego DNA wraz z dodatkami. Końcowe stężenia to około 9 mg/ml białka, 50 mM HEPES (pH = 8), 1,5 mM ATP, 1,5 mM GTP, 0,9 mM CTP, 0,9 mM UTP, 0,2 mg/ml tRNA, 26 mM koenzym A, 0,33 mM NAD, 0,75 mM cAMP, 68 mM kwas folinowy, 1 mM spermidyna, 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000, 13,3 mM maltozy, 1 U polimerazy RNA T7 i 50 nM plazmidowego DNA w ultraczystej wodzie.

  1. Oczyszczanie fenolowo-chloroformowe matrycy DNA
    1. Przygotuj sześć nocnych kultur z 5 ml pożywki LB i 5 μl sterylnie przefiltrowanego (filtr 0,22 μm) roztworu karbenicyliny (100 mg/ml w 50% EtOH i 50% ultraczystej wodzie).
    2. Dodać małą smugę z gotowego bulionu bakteryjnego zawierającego DH5α E. coli z wektorem ekspresyjnym pET20b(+) do każdej wstępnie podgrzanej 5 ml kultury przez noc i inkubować w temperaturze 37 °C przez 16 godzin z prędkością 250 obr./min. W zależności od tego, który peptyd (EF) lub białko (YPet lub mVenus) ma ulec ekspresji, stosuje się specyficzny plazmid kodujący.
    3. Wyodrębnij plazmid za pomocą mini-zestawu przygotowawczego, zgodnie z opisem w instrukcji obsługi lub postępując zgodnie z protokołem dostarczonym przez Zhang et al.24.
    4. Przygotuj 100 μl wstępnie oczyszczonego plazmidowego DNA (stężenie może wahać się od 200–600 ng/μl) i wymieszaj ze 100 μl roti-fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (pH = 7,5–8,0) w probówce mikrowirówkowej, aby umożliwić lepszą separację faz.
    5. Delikatnie odwróć probówkę do 6x i odwiruj przez 5 minut przy 16 000 x g przy wilgotności względnej.
    6. Dodać 200 μl chloroformu do górnej fazy probówki i odwrócić probówkę do 6x.
    7. Odwirować próbkę o masie 16 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Odpipetować supernatant do oddzielnej probówki i dodać 10 μl 3 M octanu sodu w celu wytrącenia etanolu.
    9. Dodać 1 ml zimnego etanolu o temperaturze -80 °C i przechowywać próbkę w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę.
    10. Odwirować próbkę o masie 16 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    11. Zdekantować supernatant i dodać 1 ml zimnego 70% (v/v) etanolu o temperaturze -20 °C.
    12. Wirować przy 16 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    13. Usunąć płyn przez pipetowanie. Uważaj, aby nie naruszyć osadu DNA.
    14. Przechowywać próbkę w temperaturze pokojowej przez około 15 minut w celu odparowania pozostałego etanolu.
    15. Dodać ultraczystą wodę do próbki, aby dostosować stężenie próbki do około 300 nM, które mierzy się przez absorpcję przy 260 nm.
  2. Przygotowanie reakcji TX-TL
    1. Przygotowany surowy ekstrakt komórkowy i bufor reakcyjny rozmrozić na lodzie.
    2. W przypadku mieszaniny reakcyjnej o objętości 60 μl należy dodać plazmidowe DNA (oczyszczone z fenolu i chloroformu) do 37,5 μl buforu reakcyjnego [50 mM HEPES (pH = 8), 1,5 mM ATP, 1,5 mM GTP, 0,9 mM CTP, 0,9 mM UTP, 0,2 mg/ml tRNA, 26 mM koenzymu A, 0,33 mM NAD, 0,75 mM cAMP, 68 mM kwasu folinowego, 1 mM spermidyny, 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000 i 13,3 mM maltozy), a następnie dodano 28,7 μl surowego ekstraktu komórkowego. Napełnij do końcowej objętości ultraczystą wodą do 58,8 μl.
    3. Tuż przed rozpoczęciem reakcji dodać 1,2 μl roztworu polimerazy RNA T7 i wymieszać próbkę, pipetując w górę iw dół.
    4. Użyć tej mieszaniny reakcyjnej jako roztworu pęczniejącego w kroku 2.7 i inkubować w temperaturze 29 °C przez czas trwania eksperymentu, który zwykle wynosi 4–8 godzin.

5. Koniugacja elastynopodobnych polipeptydów z fluoroforami za pomocą katalizowanej miedzią cykloaddycji azydowo-alkinowej Huisgen

  1. Przygotować 20 mM roztwór łącznika azydku NHS (ester N-hydroksysukcynimidu kwasu γ azydomasłowego) o stężeniu 20 mM w DMSO.
  2. Zmieszać 250 μl roztworu ELP (600 μM) z PBS (8 g/l NaCl, 0,2 g/l KCl, 1,42 g/l Na2HPO4, 0,27 g/L K2HPO4, pH = 7,2) i azydkiem NHS (1,2 mM) i inkubować przez 12 godzin w temperaturze pokojowej.
  3. Załadować próbkę do kasety dializacyjnej o natężeniu 10 kDa i przechowywać ją w temperaturze 4 °C przez 12 godzin w 1 litrze ultraczystej wody w celu usunięcia soli i pozostałości azydku NHS.
  4. Zmieszać aktywowany ELP (500 μM) z barwnikiem sprzężonym z alkinami (500 μM), Cy5-alkinem lub Cy3-alkinem.
  5. Zmieszać tę próbkę z 1 mM TBTA (tris(benzylotriazolylometylometylo)aminy), 10 mM TCEP (chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)-fosfiny) i 10 mMCuSO4 i inkubować w temperaturze 4 °C przez 12 godzin.
  6. Załadować próbkę do kasety dializacyjnej o natężeniu 10 kDa i przechowywać ją w temperaturze 4 °C przez 12 godzin w 1 litrze ultraczystej wody, w celu usunięcia soli i pozostałości barwników sprzężonych z alkinami.
  7. Te zmodyfikowane barwnikiem ELP są stosowane w mieszaninie 1:1 ELP znakowanych Cy3 i ELP znakowanych Cy5 analogicznie do peptydów w części drugiej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Produkcja pęcherzyków
Rycina 1 przedstawia obrazy z transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) pęcherzyków przygotowanych z użyciem różnych roztworów pęczniejących oraz metody kulek szklanych (patrz również Vogele et al.11). Dla próbki na Rycini 1A jako roztwór pęczniejący zastosowano wyłącznie PBS, aby potwierdzić tworzenie się pęcherzyków i określić ich rozmiar. Pęcherzyki utworzyły się również w przypadku zastoso...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Uwodnienie filmu jest powszechną procedurą tworzenia małych pęcherzyków jednowarstwowych. Głównym źródłem niepowodzenia jest niewłaściwe obchodzenie się z materiałami użytymi w zabiegu.

Początkowo ELP są wytwarzane przez komórki E. coli . Wydajność po oczyszczeniu ELP może się znacznie różnić w zależności od tego, jak starannie protokół jest przeprowadzany podczas jego kluczowych etapów. Są to etap odwróconych cykli t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie finansowe za pośrednictwem DFG TRR 235 (Emergence of Life, projekt P15), Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (umowa o grant nr 694410 AEDNA) oraz TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (projekt nr 9.05). Dziękujemy E. Falgenhauer za pomoc w przygotowaniu próbki. Dziękujemy A. Dupinowi i M. Schwarzowi-Schillingowi za pomoc przy systemie TX-TL i przydatne dyskusje. Dziękujemy N. B. Hollandowi za użyteczne dyskusje.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2xYTMP biomedicals3012-032
3-PGASigma-AldrichP8877
5PRIME Phase Lock GelTM rurkaVWR733-2478
sprzężona z alkinami Cy3Sigma-Aldrich777331
sprzężona alkina Cy5Sigma-Aldrich777358
ATPSigma-AldrichA8937
BenzamidinCarl RothCN38.2
BL21 Rosetta 2 E. coli szczepNovagen71402
Bradford BSA Zestaw do oznaczania białekBio-rad500-0201
cAMPSigma-AldrichA9501
KarbenicylinaCarl Roth6344.2
ChloramfenikolSigma-AldrichC1919
ChloramfenikolCarl Roth3886.3
ChloroformCarl Roth4432.1
CoASigma-AldrichC4282
CTPUSB14121
CuSO4Carl RothP024.1
DFHBILucerna Technologies410
DMSOCarl RothA994.1
DNase INEBM0303S
DTTSigma-AldrichD0632
EtanolCarl Roth9065.2
Kwas folinowySigma-AldrichF7878
Koraliki szklane, płukane kwasemSigma-AldrichG1277
GTPUSB16800
HEPESSigma-AldrichH6147
IPTG (β-tiogalaktozyd izopropylu )Sigma-AldrichI6758
KClCarl RothP017.1
K-glutaminianSigma-AldrichG1149
LB RosółCarl RothX968.2
LizozymSigma-AldrichL6876
MetanolCarl Roth82,2
MgCl2Carl RothKK36.3
Mg-glutaminianSigma-Aldrich49605
Kolumny do chromatografii Micro Bio-SpinBio-Rad732-6204
NADSigma-AldrichN6522
NHS-azydek łącznik (ester oksysukcynimidu kwasu azydomasłowego)BaseclickBCL-033-5
PEG-8000Carl Roth263.2
Paski pHCarl Roth549.2
Fluorek fenylometylosulfonyluCarl Roth6367.2
Sól fizjologiczna buforowana fosforanemVWR76180-684
KwasfosforowySigma-AldrichW290017
PolietylenoiminaSigma-Aldrich408727
Dwuzasadowy roztwór fosforanu potasuSigma-AldrichP8584
Jednozasadowy roztwór fosforanu potasuSigma-AldrichP8709
Qiagen Miniprep KitQiagen27106
Bufor reakcyjny RNAPolNEBB9012
Inhibitor RNazy mysiNEBM0314S
Chusteczki RNaseZapThermoFisherAM9788
rNTPNEBN0466S
Alkohol roti-fenolowy/chloroformowy/izoamylowyCarlrothA156.1
RTS Amino Acid Sampler5 Prime2401530
Kasety dializacyjne Slide-A-Lyzer, 10k MWCO (zestaw)Thermo-Scientific66382
Chlorek soduCarl Roth9265.1
Wodorotlenek soduCarl Roth8655.1
SpermidynaSigma-Aldrich85558
Sterylnie filtrowany (0,22 &mikro; Filtr m)Carl RothXH76.1
T7 polimerazaNEBM0251S
TBTA (tris(benzylotriazolylo)amina)Sigma-Aldrich678937
TCEP (chlorowodorek tris(2-karboksetylo)-fosfiny)Sigma-AldrichC4706
Tris baseFischerBP1521
tRNA (z E. coli)Roche Applied Skrętkakomputerowa SME MRE600
USB23160

Bibliografia

  1. Chen, I. A., Szostak, J. W. A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles. Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).
  2. Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).
  3. Hardy, M. D., et al. Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).
  4. Scott, A., et al. Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes. PLoS ONE. 11 (10), e0163058(2016).
  5. Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions. Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).
  6. Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells. Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).
  7. Zhu, T. F., Szostak, J. W. Coupled growth and division of model protocell membranes. Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).
  8. Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).
  9. Chu, H. -S., et al. Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system. Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).
  10. Martino, C., et al. Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures. Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).
  11. Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862(2018).
  12. Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
  13. McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP. Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).
  14. Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).
  15. Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
  16. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
  17. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).
  18. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).
  19. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  20. Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., Mückl, A., Simmel, F. C. Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets. Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).
  21. Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).
  22. Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).
  23. Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
  24. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247(2007).
  25. Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

P cherzyki peptydoweekspresja ELPtworzenie p cherzyk wodwodnienie i nawodnieniemetoda szklanych kulekdynamiczne rozpraszanie wiat afluorescencyjny czytnik p ytektest FRETtranskrypcja RNA
In Vesiculo Synteza prekursorów błony peptydowej do autonomicznego wzrostu pęcherzyków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.