Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Uprawa osłonicy morskiej pelagicznej Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) do badań eksperymentalnych

12K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59832

⸱

9 sierpnia 2019

 ,  , 
1Skidaway Institute of Oceanography, University of Georgia, 2Hampton University

W tym artykule

Podsumowanie

Doliolidy, w tym gatunek Dolioletta gegenbauri, to mały, galaretowaty zooplankton morski o znaczeniu ekologicznym, występujący na produktywnych systemach szelfu subkontynentalnego na całym świecie. Trudność w hodowli tych delikatnych organizmów ogranicza ich badania. W tym badaniu opisujemy podejścia do uprawy w celu zbierania, hodowli i utrzymania doliolid Dolioletta gegenbauri.

Streszczenie

Galaretowate zooplanktony odgrywają kluczową rolę w ekosystemach oceanicznych. Jednak generalnie trudno jest zbadać ich fizjologię, wzrost, płodność i interakcje troficzne, głównie ze względu na wyzwania metodologiczne, w tym zdolność do ich hodowli. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku doliolid, Dolioletta gegenbauri. D. gegenbauri powszechnie występuje w produktywnych subtropikalnych systemach szelfu kontynentalnego na całym świecie, często w stężeniach zakwitów, które mogą pochłonąć dużą część dziennej produkcji pierwotnej. W tym badaniu opisujemy podejścia do uprawy w celu zbierania, hodowli i utrzymania D. gegenbauri w celu przeprowadzenia badań laboratoryjnych. D. gegenbauri i inne gatunki doliolidae mogą być chwytane żywe za pomocą ukośnie ciągniętych stożkowatych sieci planktonowych o oczkach 202 μm z dryfującego statku. Hodowle są najbardziej wiarygodne, gdy temperatura wody jest niższa niż 21 °C i są rozpoczynane od niedojrzałych gonozooidów, dojrzewających phorozooidów i dużych karmiąt. Kultury mogą być utrzymywane w zaokrąglonych naczyniach hodowlanych na wolno obracającym się kole planktonu i utrzymywane na diecie składającej się z hodowanych glonów w naturalnej wodzie morskiej przez wiele pokoleń. Oprócz możliwości tworzenia laboratoryjnych kultur D. gegenbauri, wykazaliśmy, że warunki zbierania, stężenie glonów, temperatura i ekspozycja na naturalnie kondycjonowaną wodę morską mają kluczowe znaczenie dla założenia kultury, wzrostu, przetrwania i rozmnażania D. gegenbauri.

Wprowadzenie

Zooplankton stanowi największą biomasę zwierzęcą w oceanie, jest kluczowym składnikiem morskich sieci pokarmowych i odgrywa ważną rolę w oceanicznych cyklach biogeochemicznych1,2. Zooplankton, choć składa się z ogromnej różnorodności organizmów, można z grubsza podzielić na dwie kategorie: galaretowaty i niegalaretowaty z kilkoma taksonami pośrednimi3,4. W porównaniu z niegalaretowatym zooplanktonem, galaretowaty zooplankton jest szczególnie trudny do zbadania ze względu na jego złożoną historię życia5, a jego delikatne tkanki łatwo ulegają uszkodzeniu podczas chwytania i obchodzenia się z nimi. Galaretowate gatunki zooplanktonu są zatem notorycznie trudne do hodowli w laboratorium i generalnie mniej zbadane w porównaniu z gatunkami niegalaretowatymi6.

Wśród galaretowatych grup zooplanktonu, jedną liczną i o znaczeniu ekologicznym w oceanie świata są Thaliaceans. Tajlandy to klasa osłonic pelagicznych, która obejmuje rzędy Salpida, Pyrosomida i Doliolida7. Doliolida, zbiorczo określane jako doliolidy, to małe, swobodnie pływające organizmy pelagiczne w kształcie beczki, które mogą osiągać duże obfitości w produktywnych regionach nerytycznych subtropikalnych oceanów. Doliolidy należą do najliczniejszych ze wszystkich grup zooplanktonu4,8. Jako żywiciele zawiesiny, doliolidy zbierają cząstki pokarmu ze słupa wody, tworząc prądy filtrujące i wychwytując je w sieciach śluzowych9. Taksonomicznie doliolidy są klasyfikowane w gromadzie Urochordata10. Przodkowie strunowców, a także ich znaczenie ekologiczne jako kluczowych składników morskich systemów pelagicznych, Thaliacees mają znaczenie dla zrozumienia początków kolonialnej historii życia10,11 i ewolucji strunowców 5,7,10,12,13,14.

Historia życia doliolidów jest złożona i przyczynia się do trudności w ich hodowli i utrzymaniu przez cały cykl życia. Przegląd cyklu życiowego i anatomii doliolidów można znaleźć w Godeaux et al.15. Cykl życiowy doliolidów, który obejmuje obowiązkową zmianę między płciowymi i bezpłciowymi etapami historii życia, jest przedstawiony w Rysunek 1. Jaja i plemniki są wytwarzane przez hermafrodytyczne gonozooidy, jedyny pojedynczy etap cyklu życiowego. Gonozooidy uwalniają plemniki do słupa wody, a jaja są wewnętrznie zapładniane i uwalniane, aby rozwinąć się w larwy. Larwy wylęgają się i przekształcają w oozooidy, które mogą osiągnąć 1-2 mm. Zakładając sprzyjające warunki środowiskowe i odżywianie, oozooidy stają się wczesnymi pielęgniarkami w ciągu 1-2 dni w temperaturze 20 °C i rozpoczynają kolonialne etapy cyklu życiowego. Oozooidy bezpłciowo wytwarzają pąki na brzusznych rozłogach. Pąki te opuszczają rozłog i migrują do kadoforu grzbietowego, gdzie ustawiają się w trzech sparowanych rzędach. Środkowe podwójne rzędy stają się phorozooidami, a dwa zewnętrzne podwójne rzędy stają się trofozooidami. Te ostatnie dostarczają pokarm zarówno pielęgniarce, jak i phorozooidom16,17. Trofozooidy zaopatrują pielęgniarkę w składniki odżywcze, gdy traci ona wszystkie narządy wewnętrzne. Wraz ze wzrostem liczebności trofozooidów wielkość pielęgniarki może osiągnąć 15 mm w laboratorium. W miarę wzrostu phorozooidy coraz częściej połykają zdobycz planktonową i osiągają rozmiar ~ 1,5 mm, zanim zostaną wypuszczone jako osobniki17. Jedna pielęgniarka może uwolnić > 100 fosforooidów w ciągu swojego życia18. Po uwolnieniu fosforooidów z kadoforu kontynuują one wzrost i są drugim kolonialnym etapem cyklu życiowego. Gdy osiągną rozmiar ~ 5 mm, każdy phorozooid rozwija skupisko gonozooidów na swojej brzusznej szypułce. Te gonozooidy mogą połykać cząstki, gdy osiągną ~1 mm długości. Po osiągnięciu przez gonozooidy wielkości ~ 2 do 3 mm są uwalniane z phorozooidu i stają się jedynym pojedynczym etapem cyklu życiowego. Gdy osiągną rozmiar ~ 6 mm, gonozooidy osiągają dojrzałość płciową17. Gonozooidy mogą osiągać 9 mm lub więcej długości. Gonozooidy są hermafrodytyczne, plemniki są uwalniane sporadycznie, podczas gdy zapłodnienie jaj następuje wewnętrznie16,17. Gdy gonozooid ma ≥ wielkości 6 mm, uwalnia do 6 zapłodnionych jaj. Skuteczna hodowla wymaga wspierania specyficznych potrzeb każdego z tych unikalnych etapów historii życia.

Ze względu na ekologiczne i ewolucyjne znaczenie Thaliaceans, w tym doliolidae, istnieje potrzeba opracowania metodologii uprawy, aby pogłębić zrozumienie unikalnej biologii, fizjologii, ekologii i historii ewolucji tego organizmu19. Doliolidy są bardzo obiecujące jako eksperymentalne organizmy modelowe w biologii rozwoju i genomice funkcjonalnej, ponieważ są przezroczyste i prawdopodobnie mają uproszczone genomy20,21. Brak wiarygodnych metod uprawy utrudnia jednak ich przydatność jako modeli laboratoryjnych. Chociaż kilka laboratoriów opublikowało wyniki oparte na hodowanych doliolidach, według naszej wiedzy podejścia do uprawy i szczegółowe protokoły nie zostały wcześniej opublikowane. Opierając się na wieloletnim doświadczeniu oraz próbach uprawy metodą prób i błędów, celem tego badania był przegląd doświadczeń i podzielenie się protokołami zbierania i hodowli dolioliwidów, w szczególności gatunku Dolioletta gegenbauri.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie pomieszczeń do hodowli D. gegenbauri

UWAGA: Wszystkie wymagane materiały i sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

  1. Przygotować 1 M roztwór wodorotlenku sodu (NaOH), 0,06 M nadmanganianu potasu (KMnO4). Aby przygotować ten roztwór, rozpuść 400 g NaOH w 10 l wody dejonizowanej. Dodać 100 g KMnO4 do roztworu NaOH i dobrze wymieszać.
  2. Przygotować 0,1 M roztwór wodorosiarczynu sodu (NaHSO3), rozpuszczając 100 g NaHSO3 w 10 l wody dejonizowanej i dobrze wymieszać.
    UWAGA: Te odczynniki są substancjami drażniącymi, które mogą powodować problemy z oddychaniem w przypadku wdychania. Umieść w dobrze wentylowanym miejscu, takim jak wyciąg. Unikać kontaktu ze skórą. Podczas obsługi należy nosić rękawice ochronne, odzież ochronną, ochronę oczu i ochronę twarzy.
  3. Przed założeniem i hodowlą kultur doliolidów w laboratorium należy oczyścić i wysterylizować słoiki z kulturami.
    1. Wypłucz słoiki hodowlane o pojemności 1,9 l i 3,8 l co najmniej 3 razy wodą dejonizowaną. Pozostaw nakrętki do wyschnięcia, ponieważ nakrętki nie są objęte poniższymi krokami czyszczenia.
    2. Wyczyść i wysterylizuj szklane słoiki hodowlane o pojemności 1,9 i 3,8 l, zanurzając je w roztworze NaOH/KMnO4. Pozostaw słoiki do namoczenia przez noc.
    3. Wyjąć słoiki z roztworu NaOH/KMnO4 i zanurzyć słoiki w roztworze wodorosiarczynu sodu (NaHSO3). Pozostaw słoiki do namoczenia przez noc.
    4. Wyjmij słoiki z roztworu NaHSO3 i dokładnie spłucz wodą dejonizowaną. Pozostaw słoiki do wyschnięcia.
  4. Umieść koło planktonowe (Rysunek 2) w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (komorze środowiskowej). Wyrównać temperaturę do 20 °C. Bardziej szczegółowy opis niestandardowego koła planktonowego znajduje się na rysunku uzupełniającym 1.

2. Kultura fitoplanktonu

  1. Kultury glonów należy pozyskać z Narodowego Centrum Glonów i Mikrobioty Morskiej (NCMA) lub z innych źródeł, które można wykorzystać jako pokarm dla D. gegenbauri. Mieszaniny dwóch gatunków wiciowców, w tym Isochrysis galbana (CCMP 1323), Rhodomonas sp (CCMP 740) i małej okrzemki, Thalassiosira weissflogii (CCMP 1051) uzyskano z NCMA i wykorzystano w poprzednich badaniach laboratoryjnych do pomyślnego wyhodowania doliolidów17.
  2. Przygotuj podłoża wzrostowe L1 i L1-Si22 zgodnie z zaleceniami NCMA.
  3. Postępuj zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez dostawcę, aby zainicjować nowe kultury glonów.
  4. Aby utrzymać kultury podstawowe, stosując rygorystyczne techniki hodowli aksonicznej, co dwa tygodnie przenoś 0,5 ml starej kultury starzejącej się do 25 ml świeżej pożywki wzrostowej w sterylnych szklanych probówkach hodowlanych o pojemności 55 ml.
    UWAGA: Nie jest możliwe przechowywanie żywych kultur glonów bez ich regularnego przenoszenia. Jeśli kultury nie będą używane przez długi czas i nie jest możliwe utrzymanie kultur przez okres nieużywania, zaleca się ponowne pozyskanie tych powszechnych kultur glonów z ich oryginalnych źródeł (np. NCMA).
  5. Przygotować większe ilości fitoplanktonu do karmienia doliolidów w czystych 500 ml plastikowych kolbach do hodowli tkankowych zawierających 200 ml pożywki wzrostowej.
    1. Zaszczepić fitoplankton z aksenów (4 ml) w 200 ml pożywki wzrostowej (rozcieńczenie 1:50).
    2. Inkubować w temperaturze 20 °C w cyklu światło:ciemność 12:12 h w chłodnym białym świetle oświetlonym 65-85 μE/m2. Połóż kolby hodowlane płasko, aby zmaksymalizować oświetlenie. Delikatnie mieszaj kulturę codziennie.
    3. Określić stężenie komórek za pomocą licznika cząstek lub mikroskopu w celu monitorowania wzrostu kultur.
      UWAGA: Po 7-10 dniach od inokulacji kultury wiciowców będą zawierać ~105-10 6 komórek/ml, a hodowla okrzemek będzie zawierać ~10 4-105 komórek/ml. Te stężenia są wystarczające do utrzymania kultur doliolidów.
    4. Inicjuj nowe stada żywieniowe co najmniej co dwa tygodnie, aby zapewnić wystarczającą ilość biomasy glonów do wspierania wszystkich działań związanych z hodowlą.

3. Kolekcja dzikich doliolidów i wody morskiej dla hodowli

UWAGA: Przegląd podejść do zbierania i uprawy jest opisany w Rysunek 3. Opis specjalistycznej sieci planktonowej i worka włoka znajduje się w Rysunek 4.

  1. Zlokalizuj doliolidy, wykrywając je za pomocą sieci planktonowych lub systemów obrazowania in situ23.
    UWAGA: Ponieważ doliolidy rzadko występują w wodach powierzchniowych i nie są wykrywalne za pomocą technologii teledetekcji, kierując się niezbędną wiedzą na temat warunków sprzyjających doliolidom (patrz Dyskusja), obecność doliolidów musi zostać określona przed pobraniem próbek.
  2. Zbierz bogatą w cząstki wodę morską przed zebraniem żywych doliolidów w ramach przygotowań do zainicjowania kultury D. gegenbauri.
    1. Rozmieszczenie butelek Niskin zamontowanych na rozecie CTD lub równoważnym sprzęcie w celu zbierania wody z miejsca, w którym znajdują się doliolidy, oraz z głębokości, na której znajdują się najwyższe szacunkowe stężenia chlorofilu, oszacowane za pomocą fluorometrii in situ.
      UWAGA: Stężenie chlorofilu A jest używane jako wskaźnik stężeń cząstek. Na środkowym szelfie kontynentalnym Zatoki Południowoatlantyckiej (SAB) podpowierzchniowy chlorofil a maksimum znajduje się zwykle blisko dna, ale w innych miejscach może nie być.
  3. Po zlokalizowaniu doliolidów odzyskaj nieuszkodzone zooidy doliolid za pomocą specjalistycznej sieci planktonowej i worka włoka. Przed rozłożeniem sieci napełnij worek włoka wodą morską.
    1. Z dryfującego statku opuścić i podnieść sieć przez słup wody, utrzymując ukośny kąt holowania ~15 - 25° oraz prędkość pionowego rozkładania i zwijania nie większą niż 15 m/min.
  4. Gdy sieć znajdzie się na pokładzie, delikatnie przenieś i podziel zawartość worka włoka na 3, 5-galonowe (~20 L) plastikowe wiadra, z których każde zawiera ~ 10 L powierzchniowej wody morskiej zebranej z terenu.
    UWAGA: Nowe plastikowe wiadra powinny być kondycjonowane przez dodanie wody morskiej na kilka dni przed pobraniem żywych doliolidów. Celem jest ograniczenie wypłukiwania chemikaliów z tworzyw sztucznych. Jeśli woda morska nie jest dostępna, użyj wody oczyszczonej (np. Milli Q) lub wody z kranu wolnej od toksycznych zanieczyszczeń, aby kondycjonować wiadra.
  5. Odizolować zooidy doliolid od innego planktonu.
    1. W małych partiach (~ 2 l) przenieś zmieszane planktony z pakuły netto (teraz w plastikowych wiadrach o pojemności 20 l) do szklanej zlewki o pojemności 2 l.
    2. Za pomocą szklanej pipety o szerokim otworze (średnica wewnętrzna 8 mm x długość 38 cm) ostrożnie zasysać i przenosić aktywnie pływające zooidy doliolid ze zlewki do czystych szklanych słoików hodowlanych zawierających bogatą w cząstki wodę morską zebraną za pomocą butelek Niskin, z których znajdowały się doliolidy.
    3. Delikatnie wypuść zooidy doliolidy pod powierzchnię wody morskiej.
      UWAGA: Zbieraj gonozooidy, phorozooidy zawierające przyczepione rozwijające się gonozooidy i stadia pielęgniarskie zawierające przyłączone trofozooidy (Rysunek 1).
  6. Po dodaniu doliolidów dodać kulturę Rhodomonas sp. do końcowego stężenia ~ 5 x 103 – 104 komórek/ml (~50 ml kultury zawierającej ~ 5 x 104 – 1 x 105 komórek/ml w słoiku o pojemności 3,8 l). Ma to na celu ustalenie, czy doliolidy aktywnie żerują. Kiedy doliolidy spożyją Rhodomonas sp., ich przewód pokarmowy będzie miał czerwony kolor. Usuń zooidy, które wydają się nie żerować.
  7. Aby zapobiec uwięzieniu doliolidów na granicy faz powietrze-woda, należy unikać przestrzeni nad powierzchnią w słoikach hodowlanych, całkowicie wypełniając słoiki niefiltrowaną, bogatą w cząstki wodą morską i umieszczając kawałek folii plastikowej nad otworem słoika (o szerokości 89 mm).
    1. Unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza, które mogą również uszkodzić zwierzęta. Ostrożnie przykręć nakrętkę do słoika i delikatnie odwróć słoik, aby ustalić, czy są obecne bąbelki. Jeśli obecne są bąbelki, usuń je.
    2. Po napełnieniu słoików wytrzyj nadmiar wody z zewnątrz słoika.
  8. Zamontuj każdy słoik na kole planktonowym (Rysunek 2), umieszczając słoik na pionowych metalowych prętach pokrytych gumową rurką i między zaciskiem węża ze stali nierdzewnej.
    1. Upewnij się, że tył słoika jest wyściełany gumową rurką. Dokręć wąż clamp wokół słoika, regulując.
    2. Sprawdź, czy słoik się nie porusza, gdy jest bezpiecznie zamocowany na miejscu. Pozwól słoikom obracać się z prędkością 0,3 obr./min, aby doliolidy pozostały w zawiesinie.
      UWAGA: Ważne jest, aby nie dokręcać słoika zbyt mocno, aby zapobiec pękaniu słoika.
  9. Na statku utrzymywać naczynia hodowlane na kole planktonowym w temperaturze 20 °C w słabym świetle do czasu, gdy będzie można je przenieść do laboratorium hodowli roślin.
  10. Po powrocie do laboratorium przenieś słoiki zawierające doliolidy do przygotowanego pomieszczenia do hodowli. Zamontuj słoiki na kole planktonowym (patrz krok 3.8) i pozwól słoikom nadal obracać się z prędkością 0.3 obr.
    UWAGA: Cała hodowla doliolidów w tym badaniu prowadzona była w temperaturze 20 °C.

4. Utrzymanie kultur D. gegenbauri

  1. Ze statku do laboratorium pozwól zwierzętom zaaklimatyzować się w oryginalnych słoikach do warunków laboratoryjnych przez 3 dni.
    1. W okresie aklimatyzacji należy codziennie przez 3 dni używać szklanej pipety o szerokim otworze, aby wymieniać 10% wody na niefiltrowaną, bogatą w cząstki wodę morską z miejsca zbiórki.
    2. Trzymaj kilka widłonogów w słoiku, ale usuń cały inny zooplankton, duże granulki kału i duże zagregowane cząstki, które mogą zatkać aparat filtrujący doliolidu (sieć śluzowa). Jeśli hodowla składa się z wczesnych pielęgniarek, trzymaj jeden duży gonozooid (≥ 6 mm) w słoiku.
      UWAGA: Nie jest ważne, które gatunki widłonogów są włączone do kultury, ale w tym eksperymencie wykorzystano najliczniejsze gatunki obecne w miejscu, w którym schwytano doliolidy.
  2. Po okresie aklimatyzacji przenieś zooidy i widłonogi doliolida z oryginalnego słoika do czystego słoika uprawowego zawierającego 80% przefiltrowanej wody morskiej z filtrem z włókna szklanego (GF/F) i 20% wody morskiej z oryginalnego słoika. Przygotuj przefiltrowaną wodę morską, filtrując wodę morską przez GF/F o nominalnej wielkości porów 0,7 μm bibuły filtracyjnej.
  3. Utrzymuj nową kulturę, wymieniając 10% wody na przefiltrowaną wodę morską GF/F co 3 dni oraz usuwając agregaty i granulki kału. Co tydzień przenoś zwierzęta do nowego słoika zgodnie z opisem w kroku 4.2.
  4. Karmić doliolidami, utrzymując stężenie fitoplanktonu w słoikach hodowlanych między 40 - 95 μg C/L.
    UWAGA: Stężenia te naśladują warunki środowiskowe, o których wiadomo, że sprzyjają warunkom zakwitu D. gegenbauri17. Mieszanka gatunków glonów różni się w zależności od etapu życia i liczby zooidów w każdym słoiku. We wczesnych stadiach życia należy dodawać mieszaninę 1:1 (według zawartości węgla) tylko z glonów kryptomonady (Isochrysis galbana i Rhodomonas sp.). Większe gatunki ofiar mogą łatwo zatkać aparat żywieniowy małych pielęgniarek i rozwijających się trofozooidów. Dodaj okrzemki Thalassiosira weissflogii do mieszanki glonów, również o równej zawartości węgla, podczas karmienia większych pielęgniarek, phorozooidów i gonozooidów.
    1. Monitoruj stężenie glonów przed i po karmieniu, aby podjąć decyzję o tym, jak często i ile glonów dodawać do kultur. Użyj licznika cząstek, aby określić stężenia glonów, ponieważ stężenia glonów w słoikach hodowlanych są stosunkowo rozcieńczone.
  5. Usuń wystarczającą ilość zooidów, aby utrzymać stężenie glonów na poziomie 40 – 95 μgC/L, aby pozostałe doliolidy miały wystarczająco dużo pożywienia do wzrostu.
    UWAGA: Najtrudniejszym etapem życiowym do pomyślnego utrzymania w warunkach laboratoryjnych jest rozwijanie się larw i oozooidów (wczesna pielęgniarka). W tej fazie hodowli trzymaj w słoiku jednego dużego gonozooida (≥ 6 mm) oprócz kilku widłonogów z rozwijającymi się larwami i oozooidami (~ 20 na słoik 3,8 L).
  6. Przenieś co najmniej 4 pielęgniarki do nowego słoika do hodowli, gdy co najmniej 8 trofozooidów będzie widocznych na kadoforze pielęgniarki (Rysunek 1B).
    UWAGA: Trofozooidy podwajają swoją liczebność co 1 – 2 dni w temperaturze 20 °C. Trofozooidy są na tyle duże, że są widoczne gołym okiem.
    1. Usuń dwie pielęgniarki, gdy pielęgniarki rozwiną 20 trofozooidów.
    2. Usuń jedną pielęgniarkę, gdy pielęgniarki rozwiną > 30 trofozooidów na swoich kadoforach. Pozwól pozostałej pielęgniarce rozwinąć phorozooidy na jego ogonie.
    3. Usuń pielęgniarkę, gdy pielęgniarka uwolni do 30 phorozooidów.
  7. Zmniejsz liczbę zwierząt w słoiku, gdy phorozooidy osiągną wielkość 3 mm.
    1. Usuń wszystkie phorozooidy z wyjątkiem czterech, gdy phorozooidy staną się większe (> 5 mm) i rozwiną skupiska gonozooidów.
    2. Zredukuj kulturę do dwóch phorozooidów, gdy liczba skupisk gonozooidów zwiększy swój rozmiar i zacznie żerować.
    3. Usuń phorozooidy, gdy phorozooidy uwolnią do 30 gonozooidów.
  8. Zmniejsz liczbę gonozooidów z 30 zooidów do 2 na słoik. Pozwól, aby zapłodnione jaja zostały uwolnione do słoika.
    1. Usuń jeden gonozooid, pozostawiając jednego gonozooida w słoiku, gdy oozooidy się rozwiną.
      UWAGA: Odrzucone pielęgniarki, phorozooidy i gonozooidy mogą być użyte do wysiewu dodatkowych kultur i przeprowadzania dalszych eksperymentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zastosowanie opisanych procedur zbierania i hodowli doliolida D. gegenbauri, przedstawionych na Rysunku 3, umożliwia utrzymanie kultury D. gegenbauri przez cały złożony cykl życiowy (Rysunek 1) oraz jej prowadzenie przez wiele pokoleń. Choć w niniejszym opisie skupiono się na hodowli D. gegenbauri, procedury te powinny być odpowiednie również dla hodowli innych gatunków doliolidów.

Pozyskiwanie zdrowych i ni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zdolność do hodowli doliolidów została ustalona w ciągu ostatnich kilku dziesięcioleci i została wykorzystana do wspierania badań w kilku obszarach. Badania eksperymentalne w naszych laboratoriach wsparły publikację co najmniej 15 badań naukowych dotyczących żywienia i wzrostu 18,26, rozrodu18,28, diety 6,29, fizjologii30, ekologii

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni wielu osobom, które przez lata gromadziły wiedzę do tego projektu, w tym G.-A. Paffenhöfer i D. Deibel, którzy jako pierwsi opracowali te protokoły. M. Köster i L. Lamboley również wnieśli znaczący wkład w rozwój tych procedur. N.B. López-Figueroa i Á.E. Rodríguez-Santiago opracowali szacunki liczebności doliolidów przedstawione w tabeli 1. Badanie to było częściowo wspierane przez amerykańską Narodową Fundację Nauki (National Science Foundation) przyznającą OCE 082599, 1031263 MEF, wspólne projekty OCE 1459293 i OCE 14595010 MEF i DMG oraz nagrodę National Oceanic and Atmospheric Administration NA16SEC4810007 dla DMG. Jesteśmy wdzięczni pracowitej i profesjonalnej załodze R/V Savannah. Lee Ann DeLeo przygotowała rysunki, Charles Y. Robertson dokonał korekty manuskryptu, a James (Jimmy) Williams wykonał koło planktonowe

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki do hodowli glonów (55 ml sterylne jednorazowe szklane probówkiDowolnaNIE Dokultur glonów
AutoklawDowolnaNADo sprzętu do sterylizacji i wody morskiej do hodowli glonów
Zlewki (szkło 2 L)DowolnaNADo sortowania rozcieńczonej zawartości pakuł planktonu netto
Wiadra (5 galonów, ~20L)DowolnaNADo rozcieńczania zawartości pakuły z babki lancetowatej - przed pierwszym użyciem należy ją kondycjonować w wodzie morskiej
Balony (20 L) DowolnaNADo przechowywania wody morskiej
Szklany słoik do hodowli Doliolid (szklany słoik 1,9 l z wąskim otworem i nakrętką)QorpakGLC-01882Pojemnik do hodowli
Szklany słoik do hodowli Doliolid (szklany słoik z wąską szyjką 3,8 l z nakrętką)QorpakGLC-01858Pojemnik do hodowli
Komora środowiskowa (komora środowiskowa o kontrolowanej temperaturze)DowolnyBRAK danychDo dostosowania koła planktonowego i konserwacji kultur
Aparatura filtracyjna do filtrów 47 mmDowolnabrak danychDo filtrowania wody morskiej do hodowli
Filtry z mikrowłókna szklanego, 47 mmWhatman1825-047Do filtrowania wody morskiej do hodowli
Pipeta szklana (pipeta ze szkła borokrzemianowego (rurka szklana), średnica zewnętrzna 10 mm, średnica wewnętrzna 8 mm, grubość ścianki 1 mm)Firma NaukowaNC-10894Niestandardowe cięcie i krawędzie polerowane
Opaski zaciskowe, stal nierdzewna, #104 (178 mm)DowolnaBRAK DANYCHDo przytrzymywania słoików do hodowli na kole planktonu
Isochrysis galbana szczep CCMP1323National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA)szczep CCMP1323Do karmienia kultur doliolilidów
L1 Media Kit, 50 LKrajowe Centrum Alg Morskich i Mikrobioty (NCMA)MKL150LDo hodowli glonów
Lampa (Fluorescencyjna lampa stołowa z regulowanym ramieniem)DowolnaBRAK DANYCHDo oświetlania doliolidów w słoikach i zlewkach
Inkubator z kontrolowaną temperaturąDowolnybrak danychDo hodowli glonów
Mikropipety i sterylne końcówki (0-20 i mikro; l, 20-200 i mikro; l, 200-1000  &mikro; l)Dowolnybrak danychDla kultur glonów
Plankton Net (202 &mikro; m 0,5 m, długość 5:1) z pierścieniem końcowym włoka i   4 L akwarium z workiem dorszowymSea-Gear Corporation90-50x5-200-4A/BBDo zbierania żywych doliolidów (patrz Rysunek 4)
Koło planktonoweNANA Wykonane na zamówienie (patrz Rysunek 2)
FoliaDowolnyBRAKDo przykrycia wnętrza pokrywki słoików z kulturami doliolidów
Nadmanganian potasuFisher ScientificP279-500Odczynnik do czyszczenia słoików i szkła
Rhodomonas sp. szczep CCMP740Narodowym Centrum Alg Morskich i Mikrobioty (NCMA)szczep CCMP740Do karmienia kultur doliolidów
Rurki gumoweNANADo przytrzymywania słoików do hodowli na kole planktonowym (mogą być wykonane z rurki tygonowej)
Wodorosiarczyn soduFisher ScientificS654-500Odczynnik do czyszczenia słoików i szkła
Wodorotlenek soduFisher ScientificBP359-212Odczynnik do czyszczenia słoików i naczyń szklanych
Sterylne pipety serologiczne (1 ml, 5 mL, 10 ml, 25 ml)DowolnaNADo hodowli glonów
Thalassiosira weissflogii szczep CCMP1051National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA)szczep CCMP1051Do karmienia kultur doliolidów
Kolby do hodowli tkankowych (250 ml)DowolnaNADo kultur glonów
hodowlane)

Bibliografia

  1. Banse, K. Zooplankton – Pivotal role in the control of ocean production. Ices Journal of Marine Science. 52 (3-4), 265-277 (1995).
  2. Wilson, S. E., Ruhl, H. A., Smith, K. L. Zooplankton fecal pellet flux in the abyssal northeast Pacific: A 15 year time-series study. Limnology and Oceanography. 58 (3), 881-892 (2013).
  3. Bode, A., Álvarez-Ossorio, M. T., Miranda, A., Ruiz-Villarreal, M. Shifts between gelatinous and crustacean plankton in a coastal upwelling region. Ices Journal of Marine Science. 70 (5), 934-942 (2013).
  4. Kiorboe, T. Zooplankton body composition. Limnology and Oceanography. 58 (5), 1843-1850 (2013).
  5. Holland, L. Z. Tunicates. Current Biology. 26 (4), R146-R152 (2016).
  6. Walters, T. L., et al. Diet and trophic interactions of a circumglobally significant gelatinous marine zooplankter, Dolioletta gegenbauri (Uljanin, 1884). Molecular Ecology. , Special Issue: Species Interactions, Ecological Networks and Community Dynamics (2018).
  7. Piette, J., Lemaire, P. Thaliaceans, the neglected pelagic relatives of ascidians: a developmental and evolutionay enigma. Quarterly Review of Biology. 90 (2), 117-145 (2015).
  8. Acuña, J. L. Pelagic tunicates: Why gelatinous? American Naturalist. 158 (1), 100-107 (2001).
  9. Alldredge, A. L., Madin, L. P. Pelagic tunicates – unique herivores in the marine plankton. Bioscience. 32 (8), 655-663 (1982).
  10. Wada, H. Evolutionary history of free-swimming and sessile lifestyles in urochordates as deduced from 18S rDNA molecular phylogeny. Molecular Biology and Evolution. 15 (9), 1189-1194 (1998).
  11. Zeng, L. Y., Jacobs, M. W., Swalla, B. J. Coloniality has evolved once in stolidobranch ascidians. Integrative and Comparative Biology. 46 (3), 255-268 (2006).
  12. Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
  13. Garstang, W. The morphology of the Tunicata, and its bearing on the phylogeny of the chordata. Quarterly Journal of Microscopical Science. 72 (285), 51-187 (1929).
  14. Govindarajan, A. F., Bucklin, A., Madin, L. P. A molecular phylogeny of the Thaliacea. Journal of Plankton Research. 33 (6), 843-853 (2011).
  15. Godeaux, D., Bone, Q., Braconnot, J. C. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 1-24 (1998).
  16. Deibel, D., Lowen, B. A review of the life cycles and life-history adaptations of pelagic tunicates to environmental conditions). Ices Journal of Marine Science. 69 (3), 358369(2012).
  17. Paffenhöfer, G., Köster, M. From one to many: on the life cycle of Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 33 (7), 1139-1145 (2011).
  18. Paffenhöfer, G. A., Gibson, D. M. Determination of generation time and asexual fecundity of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 21 (6), 1183-1189 (1999).
  19. Conley, K. R., Lombard, F., Sutherland, K. R. Mammoth grazers on the ocean's minuteness: a review of selective feeding using mucous meshes. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 285 (1878), (2018).
  20. Bouquet, J. M., et al. Culture optimization for the emergent zooplanktonic model organism Oikopleura dioica. Journal of Plankton Research. 31 (4), 359370(2009).
  21. Denoeud, F., et al. Plasticity of Animal Genome Architecture Unmasked by Rapid Evolution of a Pelagic Tunicate. Science. 330 (6009), 1381-1385 (2010).
  22. Harrison, P. J., Waters, R. E., Taylor, F. J. R. A broad-spectrum artificial seawater medium for coastal and open ocean phytoplankton. Journal of Phycology. 16 (1), 2835(1980).
  23. Ohman, M. D., et al. Zooglider: An autonomous vehicle for optical and acoustic sensing of zooplankton. Limnology and Oceanography-Methods. 17 (1), 69-86 (2019).
  24. Takahashi, K., et al. In situ observations of a doliolid bloom in a warm water filament using a video plankton recorder: Bloom development, fate, and effect on biogeochemical cycles and planktonic food webs. Limnology and Oceanography. 60 (5), 1763-1780 (2015).
  25. Deibel, D. The biology of pelagic tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 171-186 (1998).
  26. Gibson, D. M., Paffenhöfer, G. A. Feeding and growth rates of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 22 (8), 1485-1500 (2000).
  27. Haskell, A., Hofmann, E., Paffenhöfer, G., Verity, P. Modeling the effects of doliolids on the plankton community structure of the southeastern US continental shelf. Journal of Plankton Research. 21 (9), 1725-1752 (1999).
  28. Gibson, D. M., Paffenhöffer, G. A. Asexual reproduction of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 24 (7), 703-712 (2002).
  29. Frischer, M. E., et al. Reliability of qPCR for quantitative gut content estimation in the circumglobally abundant pelagic tunicate Dolioletta gegenbauri (Tunicata, Thaliacea). Food Webs. 1, 7(2014).
  30. Köster, M., Paffenhöfer, G., Baker, C., Williams, J. Oxygen consumption of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 32 (2), 171-180 (2010).
  31. Paffenhöfer, G. A hypothesis on the fate of blooms of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 35 (4), 919-924 (2013).
  32. Takahashi, K., et al. Sapphirinid copepods as predators of doliolids: Their role in doliolid mortality and sinking flux. Limnology and Oceanography. 58 (6), 1972-1984 (2013).
  33. Martí-Solans, J., et al. Oikopleura dioica Culturing Made Easy: A Low-Cost Facility for an Emerging Animal Model in EvoDevo. Genesis. 53 (1), 183-193 (2015).
  34. Nishida, H. Development of the appendicularian Oikopleura dioica: Culture, genome, and cell lineages. Development Growth & Differentiation. 50, S239-S256 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hodowla doliolidówprzeciąganie sieci planktonowejsterylizacja słoików szklanychprotokół karmienia algamihodowla w kole planktonowymstadia cyklu życiowegokontrola temperaturymonitorowanie stężenia algtechnika delikatnego obchodzenia się z materiałem
Uprawa osłonicy morskiej pelagicznej Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) do badań eksperymentalnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.