Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Różnicowanie szpikowe ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej

9.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59836

⸱

9 sierpnia 2019

 ,  , 
1Department of Basic Medical Sciences, College of Medicine-Phoenix, University of Arizona

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół charakterystyki immunofenotypowej i indukowanego cytokinami różnicowania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej do czterech linii szpikowych. Zastosowania tego protokołu obejmują badania nad wpływem mutacji choroby szpikowej lub małych cząsteczek na różnicowanie szpiku komórek CD34+.

Streszczenie

Wprowadzenie

Normalne różnicowanie hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) jest kluczowe dla utrzymania fizjologicznego poziomu wszystkich linii komórek krwi. Podczas różnicowania, w skoordynowanej odpowiedzi na sygnały zewnątrzkomórkowe, w tym czynniki wzrostu i cytokiny, HSC najpierw dają początek multipotencjalnym komórkom progenitorowym (MPP), które mają potencjał limfo-szpikowy1,2,3,4 (Rysunek 1). MPP powodują powstawanie wspólnych komórek progenitorowych szpiku (CMP) i wspólnych komórek progenitorowych limfoidalnych (CLP), które są ograniczone pod względem linii. CLP różnicują się w linie limfoidalne składające się z komórek B, T i komórek NK. CMP generują linie szpikowe przez dwie bardziej ograniczone populacje progenitorów, progenitory erytroidalne megakariocytów (MEP) i progenitory monocytów granulocytów (GMP). MEP dają początek megakariocytom i erytrocytom, podczas gdy GMP dają początek granulocytom i monocytom. Doniesiono, że megakariocyty powstają nie tylko przez CMP, ale także bezpośrednio z HSC lub wczesnych MPP za pośrednictwem szlaków niekanonicznych5,6.

Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) charakteryzują się markerem powierzchniowym CD34 i brakiem markerów specyficznych dla linii (Lin-). Inne markery powierzchniowe, które są powszechnie stosowane do rozróżniania HSC i populacji przodków szpiku, obejmują CD38, CD45RA i CD1232 (Rysunek 1). HSC i MPP to odpowiednio Lin-/CD34+/CD38- i Lin-/CD34+/CD38+. Populacje progenitorów zaangażowanych w szpik różnią się obecnością lub brakiem CD45RA i CD123. CMP to Lin-/CD34+/CD38+/CD45RA-/CD123lo, GMP to Lin-/CD34+/CD38+/CD45RA+/CD123lo, a MEP to Lin-/CD34+/CD38+/CD45RA-/CD123-.

Całkowita populacja komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ może być uzyskana z ludzkiej krwi pępowinowej (UCB), szpiku kostnego i krwi obwodowej. Komórki CD34+ stanowią od 0,02% do 1,46% wszystkich komórek jednojądrzastych (MNC) w ludzkim UCB, podczas gdy ich odsetek waha się od 0,5% do 5,3% w szpiku kostnym i jest znacznie niższy i wynosi ~0,01% we krwi obwodowej7,8,9. Zdolność proliferacyjna i potencjał różnicowania komórek CD34 + pochodzących z UCB jest znacznie wyższa niż w przypadku szpiku kostnego lub komórek krwi obwodowej1,10, oferując w ten sposób wyraźną przewagę w uzyskiwaniu wystarczającej ilości materiału do analiz molekularnych w połączeniu z przeprowadzaniem charakterystyki immunofenotypowej i morfologicznej komórek podczas różnicowania.

Różnicowanie ex vivo HSPC CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej jest szeroko stosowanym modelem do badania prawidłowych mechanizmów hematopoezy i chorób krwiotwórczych. Po wyhodowaniu z odpowiednimi cytokinami, HSPC UCB CD34+ można indukować do różnicowania wzdłuż linii szpikowej lub limfoidalnej11,12,13,14,15,16. W tym miejscu opisujemy protokoły izolacji i charakterystyki immunofenotypowej HSPC CD34 + z ludzkiego UCB oraz ich różnicowania do komórek linii szpikowej. Ten system hodowli opiera się na indukowanym cytokinami różnicowaniu HSPC w obecności komórek zrębu MS-5 w celu naśladowania mikrośrodowiska w szpiku kostnym. Warunki hodowli powodują początkową ekspansję komórek CD34 +, a następnie ich różnicowanie do komórek, które wyrażają markery dla czterech komórek linii szpikowej, a mianowicie granulocytów (CD66b), monocytów (CD14), megakariocytów (CD41) i erytrocytów (CD235a). Zastosowania protokołu różnicowania komórek CD34+ obejmują badania nad mechanizmami molekularnymi regulującymi hematopoezę oraz badania wpływu mutacji i małych cząsteczek związanych z chorobą szpikową na samoodnawianie i różnicowanie HSPC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ludzka krew pępowinowa do eksperymentów została oddana przez zdrowe osoby po świadomej zgodzie do Maricopa Integrated Health Systems (MIHS), Phoenix. Zdeidentyfikowane jednostki zostały pozyskane na mocy umowy o transferze materiałów między MIHS a Uniwersytetem Arizony.

1. Odczynniki i

UWAGA: Przygotuj wszystkie odczynniki i w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Przygotować sterylny bufor PBS-BSA-EDTA (PBE), dodając 7,2 ml sterylnej 35% albuminy surowicy bydlęcej (BSA; użyć sterylnej hodowli tkankowej klasy 35% BSA) i 5 ml sterylnego 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do 487,8 ml sterylnego soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco (DPBS). Przefiltrować, wysterylizować i odgazować bufor, pozostawiając filtr podłączony do próżni w komorze bezpieczeństwa biologicznego na co najmniej 2 godziny. Podwielokrotnić odgazowany bufor w mniejszych objętościach (250 ml) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotuj 1x zbilansowany roztwór soli Hanks (1x HBSS). Rozcieńczyć 100 ml 10x bulionu HBSS w 900 ml sterylnej wody destylowanej, aby uzyskać 1 l 1x HBSS i dostosować pH do 7,2. Filtr wysterylizuj 1x HBSS przed użyciem.
  3. Przygotować 2% roztwór kwasu octowego, dodając 2 ml lodowatego kwasu octowego do 98 ml wody destylowanej.
  4. Przygotować 20 ng/ml rekombinowanego roztworu fragmentu ludzkiej fibronektyny w 1x PBS. Przygotuj 10 ml na płytkę 48-dołkową.
  5. Przygotuj 2% BSA. Do 100 ml 1x PBS dodaj 2 gramy frakcji BSA V. Filtr wysterylizować przed użyciem.
  6. Przygotuj kompletną pożywkę Dulbecco's Modified Eagle (DMEM), dodając proszek DMEM, 3,7 g wodorowęglanu sodu, 100 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 5 ml penicyliny-streptomycyny (PS) do 800 ml sterylnej wody destylowanej. Wymieszać i uzupełnić objętość do 1 l, a przed użyciem przefiltrować wysterylizować.
  7. Przygotować pożywkę do zamrażania, mieszając 90 ml FBS i 10 ml sterylnego dimetylosulfotlenku (DMSO).
  8. Przygotuj podłoże stymulacyjne. Do pożywki wolnej od surowicy dodać L-glutaminę do 2 mM i cytokiny do końcowego stężenia 50 ng/ml dla czynnika komórek macierzystych (SCF), trombopoetyny (TPO) i liganda kinazy tyrozynowej 3 podobnej dla FMS (Flt3L) oraz 20 ng/ml dla interleukiny-3 (IL3) (patrz Tabela materiałów do przygotowania roztworów podstawowych cytokin). Przygotuj 5 ml na płytkę 48-dołkową.
  9. Przygotować 1x pożywkę do różnicowania szpiku. Aby ukończyć DMEM, dodaj cytokiny do końcowego stężenia 5 ng / ml dla SCF, Flt3L i IL3, 50 ng / ml dla TPO i 4 jednostki / ml dla erytropoetyny (EPO). Przygotuj 5 ml na płytkę 48-dołkową.
  10. Przygotuj 2x pożywkę do różnicowania szpiku. Aby ukończyć DMEM, dodaj cytokiny do końcowego stężenia 10 ng / ml dla SCF, Flt3L i IL3, 100 ng / ml dla TPO i 8 jednostek / ml dla EPO. Przygotuj 5 ml na płytkę 48-dołkową.
  11. Przygotować bufor do cytometrii przepływowej. Do 1 L 1x PBS dodać 10 g frakcji BSA V.
  12. Przygotuj 1% paraformaldehydu w 1x PBS (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli Materiałów).
  13. Przygotuj roztwór poli-L-lizyny, dodając 500 μl 10 mg/ml poli-L-lizyny do 49,5 ml 1x PBS.

2. Izolacja komórek jednojądrzastych z krwi pępowinowej

UWAGA: Dla opisanego poniżej protokołu, użyto objętości krwi pępowinowej od 90 do 100 ml. Izolacja komórek CD34+ musi być przeprowadzona w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Spryskaj worek zawierający UCB 70% etanolem, aby wysterylizować zewnętrzną powierzchnię przed wprowadzeniem jej do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Przenieś UCB do sterylnej plastikowej butelki o pojemności 250 ml i rozcieńcz ją w stosunku 1:1, dodając równą objętość temperatury pokojowej (RT) 1x HBSS.
  2. Dozować 15 ml pożywki do frakcjonowania MNC (MFM; patrz tabela materiałów) na probówkę do około sześciu sterylnych stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Przechylić probówkę z MFM i delikatnie wylać 30 ml rozcieńczonego UCB na warstwę MFM, nie naruszając jej.
  3. Odwirować probówki o masie 400 x g przez 30 minut przy temperaturze pokojowej przy wolnym przyspieszaniu i bez hamowania.
  4. Po odwirowaniu odessać od 15 do 20 ml osocza powyżej warstwy MNC. Delikatnie zebrać MNC za pomocą pipety i przenieść do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
    nuta: MNC osadzają się jako biała warstwa buffy na granicy plazmy i MFM, a osad czerwonych krwinek (RBC) na dnie stożkowej probówki.
  5. Pula MNC zebrana z 2-3 probówek razem. Uzupełnić objętość każdej probówki do 50 ml zimnym buforem PBE.
  6. Odwirować probówki o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, z włączonym hamulcem.
  7. Odessać supernatant i delikatnie postukać w rurkę, aby poluzować osad komórek.
  8. Ponownie zawieś granulowane komórki w 5 ml lodowatego bufora PBE. Użyj tych samych 5 ml ponownie zawieszonych komórek, aby zebrać komórki z innych probówek. Połącz komórki z 3 do 4 probówek w jednej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  9. Aby zebrać pozostałe komórki, umyj wszystkie probówki 5 ml zimnego buforu PBE i dodaj do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  10. Policz MNC, rozcieńczając 10 μl zawiesiny komórek w 490 μl roztworu kwasu octowego.
    nuta: Kwas octowy poddaje lizie wszelkie zanieczyszczające erytrocyty, aby umożliwić łatwiejsze liczenie MNC.
  11. Uzupełnić objętość zawiesiny ogniw do objętości 50 ml lodowatym buforem PBE. Odwirować komórki przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, z hamulcem na niskim poziomie
    nuta: Zawiesina MNC może być natychmiast przetworzona w celu wyizolowania komórek CD34+ lub zamrożona do późniejszych zastosowań.
  12. Aby zamrozić MNC, usuń supernatant i ponownie zawiesić przy gęstości 2 x 107 komórek/ml w pożywce zamrażającej w temperaturze pokojowej.
  13. Zamrozić komórki w temperaturze -80 °C przez noc w pojemniku do zamrażania komórek, a następnie przenieść je do ciekłego azotu.

3. Izolacja komórek CD34+ od komórek jednojądrzastych

  1. Jeśli używasz świeżo wyizolowanych MNC, przejdź bezpośrednio do kroku 3.3.
  2. W przypadku stosowania zamrożonych MNC należy szybko rozmrozić zamrożone komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Zebrać wszystkie pozostałe komórki w fiolkach za pomocą 1 ml lodowatego buforu PBE i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  3. Uzupełnić objętość zawiesiny MNC do 50 ml zimnym buforem PBE i odwirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Usuń supernatant i delikatnie postukaj w probówkę, aby poluzować osad komórkowy. Ponownie zawieś MNC na 1 x 108 ogniw w 300 μl lodowatego bufora PBE.
  5. Dodać 100 μl odczynnika blokującego FcR z zestawu mikrokulek CD34 do ludzkiego sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) na 1 x 108 MNC i delikatnie wymieszać.
    nuta: Blokuje to niespecyficzne wiązanie z mikrogranulkami CD34.
  6. Dodać 100 μl mikrogranulek CD34 na 1 x 108 komórek. Delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut w lodówce. Nie inkubować na lodzie.
  7. Podczas inkubacji komórek umieść kolumnę LS i filtr wstępnej separacji w polu magnetycznym separatora MACS. Zrównoważyć kolumnę lodowatym buforem PBE, dodając 2 ml bezpośrednio do kolumny i 1 ml do filtra wstępnej separacji. Pozostawić kolumnę do opróżnienia do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wylać przez nią przepływ.
  8. Usunąć MNC z 4 °C, dodać lodowaty bufor PBE, aby uzupełnić objętość do 15 ml i odwirować komórki przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, przy włączonym hamulcu.
  9. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml lodowatego buforu PBE.
  10. Dodaj zawiesinę komórek do filtra wstępnej separacji umieszczonego na kolumnie LS.
    nuta: Filtr wstępnej separacji usuwa wszelkie duże agregaty komórek, które mogą blokować kolumnę.
  11. Przepłucz probówkę 3 ml lodowatego buforu PBE i dodaj go do filtra wstępnej separacji umieszczonego na kolumnie LS. Następnie wyrzuć filtr wstępnej separacji.
  12. Umyj kolumnę LS cztery razy, dodając 3 ml lodowatego buforu PBE, pozwalając kolumnie na opróżnienie za każdym razem.
    nuta: Komórki CD34+ pozostaną powiązane z kolumną, a komórki bez etykiet będą przepływać przez kolumnę.
  13. Po ostatnim myciu wyjmij kolumnę z pola magnetycznego separatora MACS i umieść ją w nowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml, z dala od magnesu.
  14. Dodaj 5 ml lodowatego bufora PBE do kolumny i wyrzuć związane komórki CD34+, mocno wciskając tłok.
  15. Opcjonalnie przepuść komórki CD34 + wyizolowane z pierwszej kolumny przez inną kolumnę LS za pomocą filtra wstępnej separacji, jak opisano powyżej (kroki 3.10−3.13).
  16. Policzyć wyizolowane komórki CD34+ za pomocą błękitu trypanowego (10 μl komórek i 10 μl błękitu trypanowego), aby określić całkowitą liczbę żywych komórek.
    nuta: Na tym etapie wyizolowane komórki CD34 + mogą zostać zamrożone do późniejszego wykorzystania lub mogą być przetwarzane bezpośrednio do analizy HSPC za pomocą cytometrii przepływowej (sekcja 4) lub w celu różnicowania do komórek linii szpikowej (sekcja 5).
  17. Odwirować zawiesinę komórek o ciśnieniu 600 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, z hamulcem na niskim poziomie.
  18. Aby zamrozić komórki CD34+, odessać supernatant i ponownie zawiesić do 5 x 106 komórek w 1 ml pożywki zamrażającej i zamrozić, jak opisano powyżej (krok 2.13). W przeciwnym razie przejdź do sekcji 4 lub 5.

4. Oznaczanie populacji łodyg i progenitorów za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Aby określić frakcje populacji macierzystych i progenitorowych w świeżo wyizolowanych HSPC CD34+, należy je odwirować przy 600 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić 1 x 106 komórek w 50 μl buforu cytometrii przepływowej.
  2. Do 1 x 106 komórek CD34+ dodać przeciwciała (patrz tabela materiałów dla rozcieńczeń) do markerów linii (CD3, CD7, CD10, CD11b, CD19 i CD235a - wszystkie znakowane FITC), CD34 (APC-Cy7), CD38 (PE), CD45RA (PE-Cy7), CD123 (APC) i 7-aminoaktynomycyny D (7-AAD; jako żywa/martwa plama) i uzupełnić całkowitą objętość do 100 μl. Inkubować na lodzie w ciemności przez 20 min.
    nuta: Do analizy można zastosować mniej niż 1 x 106 komórek CD34 +. W przypadku barwienia mniejszej liczby komórek należy odpowiednio zmniejszyć całkowitą objętość i objętość dodanych przeciwciał. Do analizy cytometrii przepływowej należy stosować niebarwione i pojedynczo barwione MNC jako kontrole do ustawiania dodatnich i ujemnych bramek dla każdego fluoroforu.
  3. Po inkubacji przemyć komórki 1 ml buforu do cytometrii przepływowej i odwirować przy 600 x g przez 5 minut.
  4. Opcjonalnie utrwal wybarwione komórki w 0,5 ml 1% roztworu paraformaldehydu przez 10 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
  5. Wirować przy 600 x g przez 5 minut i odsysać supernatant.
  6. Przemyć utrwalone/wybarwione komórki 1 ml buforu do cytometrii przepływowej i odwirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Odessać supernatant, ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu cytometrii przepływowej i przeanalizować za pomocą cytometru przepływowego (tabela materiałów).

5. Różnicowanie szpikowe hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+

UWAGA: Aby zróżnicować HSPC CD34+ do komórek linii szpikowej, są one najpierw stymulowane na rekombinowanych płytkach pokrytych fragmentami ludzkiej fibronektyny, a następnie wysiewane na warstwie komórek zrębu MS-5 w pożywce różnicowania szpikowego. Różnicowanie można monitorować co tydzień przez 3 tygodnie w oparciu o ekspresję markerów powierzchniowych komórek specyficznych dla czterech linii szpikowych. Podczas stymulacji i różnicowania wszystkie inkubacje przeprowadza się w temperaturze 37 °C i 5%CO2 w wilgotnej komorze. Wszystkie czynności powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Pokryj studzienki sterylnej, niepowlekanej płytki 48-dołkowej, dodając 200 μl / studzienkę rekombinowanego roztworu ludzkiej fibronektyny w 1x PBS przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  2. Po 2 godzinach ostrożnie usunąć rekombinowany roztwór ludzkiej fibronektyny i wyrzucić.
  3. Zatkać studzienki 200 μl/studzienkę 2% BSA na 30 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Odessać roztwór BSA i umyć studzienki dwukrotnie 500 μl sterylnego 1x PBS.
    nuta: Płytki pokryte fragmentami fibronektyny można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
  5. Aby stymulować HSPC CD34+, ponownie zawiesić świeżo wyizolowane komórki (od kroku 3.17) w gęstości 1 x 105 komórek/200 μL lub 5 x 105 komórek/ml ciepłej pożywki stymulacyjnej 1x.
  6. Jeśli używasz zamrożonych komórek CD34 +, szybko rozmroź i przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej ciepły, kompletny DMEM. Wirować przy 600 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić komórki zgodnie z opisem w kroku 5.5.
  7. Umieścić 200 μl zawiesiny komórek CD34+ na basenie fragmentu fibronektyny pokrytej 48-dołkową płytką i inkubować przez 48 godzin.
  8. Następnego dnia wysiewać 15 000 komórek zrębu MS-5 w 200 μl kompletnego DMEM na dołek na 48-dołkowej płytce poddanej działaniu kultur tkankowych i inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
  9. Po 48 godzinach stymulacji zbierz komórki CD34+ za pomocą delikatnego pipetowania. Umyj studzienki 500 μl ciepłego DMEM i rozłóż basen z zawiesiną komórkową.
  10. Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego. Odwirować zawiesinę o stężeniu 600 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić przy gęstości 5 000 komórek/200 μl 1x pożywki różnicującej szpik
    11. .
  11. Z 48-dołkowej płytki do hodowli tkankowej wysianej komórkami zrębu MS-5 delikatnie odessać pożywkę, nie naruszając komórek. Ułóż warstwę 200 μl (5 000 komórek) zawiesiny komórek CD34+ na basenie płytki i inkubuj w temperaturze 37 °C.
    nuta: Hodowla komórek MS-5 może być utrzymywana w kompletnym DMEM. W dniu wysiewu komórek CD34+ komórki MS-5 muszą znajdować się w jednolitej warstwie (80-90% konfluencji). Zaleca się, aby komórki MS-5 były posiane co najmniej 24 godziny przed wysiewem komórek CD34+.  Jeśli komórki MS-5 mają być posiane 48 godzin lub 72 godziny przed wysiewem komórek CD34+, gęstość komórek należy odpowiednio dostosować. Zaleca się również, aby peryferyjne studzienki płytki 48-dołkowej pozostawić puste lub napełnić 200 μl sterylnej wody, aby uniknąć efektu krawędzi.
  12. Wykonuj połówkową zmianę pożywki co 3-4 dni, delikatnie usuwając 100 μl pożywki z górnej części każdej studzienki i zastępując ją 100 μl 2x pożywki do różnicowania szpiku na studzienkę.
  13. W 21 dniu zbierz komórki do analizy ekspresji markera linii szpikowej za pomocą cytometrii przepływowej. Nie naruszając warstwy MS-5, delikatnie odpipetować pożywkę i przenieść komórki do probówki o pojemności 5 ml.
    nuta: Do barwienia i analizy cytometrii przepływowej wystarczą komórki z 1-2 dołków. Różnicowanie można również monitorować w dniach 1, 7 i 14. W przypadku wykonywania immunofenotypowania przez wiele dni, należy odpowiednio obliczyć liczbę studzienek potrzebnych do analizy.
  14. Wybarwić 5 x 105 komórek przeciwciałami przeciwko CD34 (APC-Cy7), CD66b (PE-Cy7), CD14 (PE), CD41 (PerCP-Cy5.5) i CD235a (APC) w całkowitej objętości 50 μL. Inkubować na lodzie w ciemności przez 20 minut. Uwzględnić niebarwione i pojedynczo barwione MNC jako kontrole do ustawiania dodatnich i ujemnych bramek dla każdego fluoroforu oraz 7-AAD jako żywe/martwe barwienie w celu wyeliminowania martwych komórek z analizy.
  15. Umyj i utrwal (opcjonalnie) poplamione komórki, jak opisano powyżej (kroki 4.3-4.6).
  16. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu cytometrii przepływowej i przeanalizować za pomocą cytometru przepływowego.

6. Ocena morfologii komórkowej

  1. Wyczyść szkiełka mikroskopowe, rozpylając etanol i wycierając, aż zaczną skrzypieć.
  2. Zanurzyć czyste szkiełka w roztworze poli-L-lizyny na 5 minut w temperaturze pokojowej i wysuszyć na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Zawiesić HSPC z kroku 3.14 i zróżnicowane komórki z kroku 5.13 w 10 μl buforu cytometrii przepływowej.
  4. Przenieść zawiesinę komórek na powlekane szkiełka podstawowe i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.
    nuta: Preparaty z dnia 1 i dnia 21 mogą być przechowywane w RT i barwione jednocześnie.
  5. Wlej 0,5 ml barwnika Wright-Giemsa na szkiełko i odstaw na 3 minuty w temperaturze RT.
  6. Dodaj równą objętość wody dejonizowanej i odstaw na dodatkowe 10 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Umyj szkiełko w wodzie dejonizowanej.
  8. Wizualizuj wybarwione komórki w powiększeniu 60x lub 100x za pomocą mikroskopu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zastosowanie powyższych protokołów pozwala na uzyskanie 5,6 (± 0,5) x 108 MNC oraz 1 (± 0,3) x 106 komórek CD34+ z jednostki krwi pępowinowej o objętości ~10 mL. Procent całkowitej liczby komórek CD34+ mieści się w przedziale 80-90% (Rycina 2A,B). Analiza immunofenotypowa przeprowadzona według schematu opisanego przez Manza i wsp.5 wykazuje, że komórki CD34+ składają się zazwyczaj w ~20% z HSC i w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół jest odpowiedni do różnicowania ex vivo HSPC CD34 + pochodzących z UCB do czterech linii szpikowych. Wstępna inkubacja z mieszanką cytokin składającą się z SCF, TPO, Flt3L i IL3 stymuluje komórki CD34+. Następnie różnicowanie uzyskuje się za pomocą koktajlu SCF, IL3, Flt3L, EPO i TPO. W tej mieszance SCF, IL3 i Flt3L są ważne dla przeżycia i proliferacji HSC CD34 +. EPO i TPO promują różnicowanie odpowiednio w kierunku erytrocytów i megakariocytów, a IL3 promuje róż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Wendy Barrett, Rachel Caballero i Gabrielli Ruiz z Maricopa Integrated Health Systems za zidentyfikowane i oddane jednostki krwi pępowinowej, Mrinalini Kala za pomoc w cytometrii przepływowej oraz Gay Crooks i Christopher Seet za porady dotyczące różnicowania szpiku ex vivo. Prace te były wspierane przez fundusze dla S.S. z National Institutes of Health (R21CA170786 i R01GM127464) oraz American Cancer Society (Institutional Research Grant 74-001-34-IRG). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,4% roztwór błękitu trypanowegoThermo Fisher Scientific15250-061Rozcieńczyć materiał roboczy do 0,2% w sterylnym 1x PBS
0,5 M Ultraczysty kwas etylenodiaminotetraoctowy, pH 8,0Gibco 15575-038
10x Hanks Zrównoważony roztwór soli (HBSS)Invitrogen14185052Rozcieńczyć do 1x sterylną wodą destylowaną i pH do 7,2
2,5% Trypsyna, bez czerwieni fenolowejThermo Fisher Scientific15090046Rozcieńczyć materiał roboczy do 1x sterylnym 1x PBS
30 µ m Filtry wstępnejseparacji Miltenyi biotech130-041-407
35% sterylna albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA7979
7-AADBiolegend420404Stosowany jako żywa/martwa plama do eliminacji martwych komórek z analizy FACS
anty-ludzkie CD10-FITC (klon HI10a)Biolegend312207Użyj rozcieńczenia
1:20Przeciwciało anty-ludzkie CD11b-FITC (aktywowane) (klon CBRM1/5)Biolegend301403Użyj rozcieńczenia 1:5
Przeciwciało anty-ludzkie CD123-APC (klon 6H6)Biolegend306012Użyj rozcieńczenia 1:20
anty-ludzkie CD14-PE (Klon M5E2)Biolegend301806Użyj rozcieńczenia 1:20
Przeciwciało anty-ludzkie CD19-FITC (Klon 4G7)BD Biosciences347543Użyj rozcieńczenia 1:5
Przeciwciało anty-ludzkie CD235a-APC (klon GA-R2 (HIR2))BD Biosciences551336Użyj rozcieńczenia 1:20
Przeciwciało anty-ludzkie CD235a-FITC (klon HIR2)Biolegend306609Użyj rozcieńczenia 1:50
Przeciwciało anty-ludzkie CD34-APC-Cy7 (Klon 581)Biolegend343514Użyj rozcieńczenia 1:20 Przeciwciało
anty-ludzkie CD38-PE (Klon HIT2)Biolegend303506Stosować rozcieńczenie 1:20
Przeciwciało anty-ludzkie CD3-FITC (klon UCHT1)Zastosowanie 300405 Biolegend1:20 Rozcieńczenie
anty-ludzkie przeciwciało CD41a-PerCP-Cy5.5 (klon HIP8)Biolegend303720Użyj rozcieńczenia 1:20
Przeciwciało anty-ludzkie CD45Ra-PE-Cy7 (klon HI100)Biolegend304126zastosowanie 1:20 Przeciwciało
anty-ludzkie CD66b-PE-Cy7 (klon G10F5)Biolegend305116zastosowanie Rozcieńczenie 1:20
anty-ludzkie CD7-FITC (klon CD7-6B7)Biolegend343103Użyj rozcieńczenia 1:20
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Fisher ScientificBP231-100Filtr sterylizować przed użyciem
Dulbecco' s Modyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) w proszku z L-glutaminą Gibco12100046Rozpuść 1 opakowanie, aby uzyskać 1 L pożywki DMEM  z wodorowęglanem sodu, 10% FBS i 1% penicyliną i streptomycyną 
Płodowa surowica bydlęca, źródło australijskie, inaktywowana termicznieOmega ScientificFB-22 Lot #609716
Zestaw mikrokulek ludzkich CD34 Miltenyi biotech130-046-702
Ludzka trombopoetyna (TPO), klasa badawczaMiltenyi biotech130-094-011Zrób zapas 100 i mikro; g/ml w 1x PBS + 0,1% BSA. Użyj 50 ng/ml zarówno do różnicowania szpiku, jak i podłoże stymulacyjne
L-GlutaminaOmega ScientificGS-602 mM stężenie w podłożu stymulacyjnym
LS KolumnyMiltenyi biotech130-042-401
MACS Multi standMiltenyi biotech130-042-303
Separator magnetyczny MidiMACSMiltenyi biotech130-042-302
Media frakcjonujące MNC (Ficol-Paque PLUS)GE Healthcare Biosciences17-1440-03
MS-5Prezent z laboratorium Gay Crooks, UCLA
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148Podgrzej 800 ml 1x PBS w szklanej zlewce na płytce mieszającej w kapturze chemicznym do ~65 & stopni C. Dodaj 10 g proszku paraformaldehydu. Aby całkowicie rozpuścić paraformaldehyd, podnieś pH, dodając 1 N NaOH. Schłodzić i przefiltrować roztwór, a następnie uzupełnić objętość do objętości 1 l za pomocą 1x PBS. Dostosuj pH do 7.2. 
Penicylina & StreptomycynaSigma-AldrichP4458-100ml
Poli-L lizynaSigma-AldrichP2636Zrób zapas 10 mg / ml w 1x
PBS Rekombinowana ludzka erytropoetyna-alfa (rHu EPO-α)BioBasicRC213-15Zrób zapas 2,000 jednostek/ml w 1x PBS + 0,1% BSA. Użyj 4 jednostek/ml do różnicowania szpiku
Rekombinowany fragment ludzkiej fibronektyny (RetroNectin)Takara T100BUżyj 20 &mikro; g / ml rozcieńczony w sterylnym 1x PBS do pokrycia studzienek przed stymulacją CD34+ HSC.
Rekombinowany ludzki ligand Flt-3 (rHu Flt-3L)BioBasicRC214-16Zrób zapas 100 &mikro; g/ml w 1x PBS + 0,1% BSA. Użyj 5 ng/ml do różnicowania szpiku i 50 ng / ml w pożywce stymulacyjnej
Rekombinowana ludzka interleukina-3 (rHu IL-3)BioBasicRC212-14Zrób zapas 100 &mikro; g/ml w 1x PBS + 0,1% BSA. Użyj 5 ng/ml do różnicowania szpiku i 20 ng/ml w pożywce stymulacyjnej
Rekombinowany czynnik ludzkich komórek macierzystych (rHu SCF)BioBasicRC213-12Zrób zapas 100 &mikro; g/ml w 1x PBS + 0,1% BSA. Użyj 5 ng/ml do różnicowania szpiku i 50 ng/ml w pożywce stymulacyjnej
Pożywka wolna od surowicy (X-Vivo-15)Lonza 04-418Q
Wodorowęglan soduFisher ScientificBP328-500
Bejca Wright-Giemsa, modyfikowanaSigma-AldrichWG16-500Stosować zgodnie z instrukcją producenta
Equipment  Cytometr przepływowy
BD LSR IIBD Biosciences
Sorvall Legend RT
Mikroskop świetlnyOlympus
Przeciwciało Przeciwciało Przeciwciało Komórki Wirówka

Bibliografia

  1. Hao, Q. L., Shah, A. J., Thiemann, F. T., Smogorzewska, E. M., Crooks, G. M. A functional comparison of CD34 + CD38- cells in cord blood and bone marrow. Blood. 86 (10), 3745-3753 (1995).
  2. Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
  3. Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91 (5), 661-672 (1997).
  4. Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 2 (6), 640-653 (2010).
  5. Haas, S., et al. Inflammation-Induced Emergency Megakaryopoiesis Driven by Hematopoietic Stem Cell-like Megakaryocyte Progenitors. Cell Stem Cell. 17 (4), 422-434 (2015).
  6. Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
  7. Bender, J. G., et al. Phenotypic analysis and characterization of CD34+ cells from normal human bone marrow, cord blood, peripheral blood, and mobilized peripheral blood from patients undergoing autologous stem cell transplantation. Clinical Immunology and Immunopathology. 70 (1), 10-18 (1994).
  8. Fritsch, G., et al. The composition of CD34 subpopulations differs between bone marrow, blood and cord blood. Bone Marrow Transplantation. 17 (2), 169-178 (1996).
  9. Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem Cells. 13 (2), 158-166 (1995).
  10. Hordyjewska, A., Popiolek, L., Horecka, A. Characteristics of hematopoietic stem cells of umbilical cord blood. Cytotechnology. 67 (3), 387-396 (2015).
  11. Bapat, A., et al. Myeloid Disease Mutations of Splicing Factor SRSF2 Cause G2-M Arrest and Skewed Differentiation of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. Stem Cells. 36, 1-13 (2018).
  12. Yip, B. H., et al. The U2AF1S34F mutation induces lineage-specific splicing alterations in myelodysplastic syndromes. Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2206-2221 (2017).
  13. Yoo, E. S., et al. Myeloid differentiation of human cord blood CD34+ cells during ex vivo expansion using thrombopoietin, flt3-ligand and/or granulocyte-colony stimulating factor. British Journal of Haematology. 105 (4), 1034-1040 (1999).
  14. Hao, Q. L., Smogorzewska, E. M., Barsky, L. W., Crooks, G. M. In vitro identification of single CD34+CD38- cells with both lymphoid and myeloid potential. Blood. 91 (11), 4145-4151 (1998).
  15. Moretta, F., et al. The generation of human innate lymphoid cells is influenced by the source of hematopoietic stem cells and by the use of G-CSF. European Journal of Immunology. 46 (5), 1271-1278 (2016).
  16. Sanz, E., et al. Ordering human CD34+CD10-CD19+ pre/pro-B-cell and CD19- common lymphoid progenitor stages in two pro-B-cell development pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5925-5930 (2010).
  17. Egeland, T., et al. Myeloid differentiation of purified CD34+ cells after stimulation with recombinant human granulocyte-monocyte colony-stimulating factor (CSF), granulocyte-CSF, and interleukin-3. Blood. 78 (12), 3192-3199 (1991).
  18. Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81 (11), 2844-2853 (1993).
  19. Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56420(2017).
  20. Palii, C. G., Pasha, R., Brand, M. Lentiviral-mediated knockdown during ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (53), e2813(2011).
  21. Davies, C., et al. Silencing of ASXL1 impairs the granulomonocytic lineage potential of human CD34(+) progenitor cells. British Journal of Haematology. 160 (6), 842-850 (2013).
  22. Caceres, G., et al. TP53 suppression promotes erythropoiesis in del(5q) MDS, suggesting a targeted therapeutic strategy in lenalidomide-resistant patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16127-16132 (2013).
  23. Shi, H., et al. ASXL1 plays an important role in erythropoiesis. Scientific Reports. 6, 28789(2016).
  24. Mazumdar, C., et al. Leukemia-Associated Cohesin Mutants Dominantly Enforce Stem Cell Programs and Impair Human Hematopoietic Progenitor Differentiation. Cell Stem Cell. 17 (6), 675-688 (2015).
  25. Chung, K. Y., et al. Enforced expression of an Flt3 internal tandem duplication in human CD34+ cells confers properties of self-renewal and enhanced erythropoiesis. Blood. 105 (1), 77-84 (2005).
  26. Ambrosini, P., et al. IL-1beta inhibits ILC3 while favoring NK-cell maturation of umbilical cord blood CD34(+) precursors. European Journal of Immunology. 45 (7), 2061-2071 (2015).
  27. Batard, P., et al. TGF-(beta)1 maintains hematopoietic immaturity by a reversible negative control of cell cycle and induces CD34 antigen up-modulation. Journal of Cell Science. 113, Pt 3 383-390 (2000).
  28. Huang, N., Lou, M., Liu, H., Avila, C., Ma, Y. Identification of a potent small molecule capable of regulating polyploidization, megakaryocyte maturation, and platelet production. Journal of Hematology & Oncology. 9 (1), 136(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kom rki CD34 dodatnieizolacja z krwi p powinowejanaliza cytometrycznamagnetyczna aktywacja sortowania kom rekkokultura kom rek zr bowychcharakterystyka immunofenotypowahematopoetyczne kom rki macierzystemarkery linii mieloidalnej
Różnicowanie szpikowe ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.