Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza porównawcza zmian chorobowych za pomocą ukierunkowanego podejścia sekwencjonowania

6.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59844

⸱

5 listopada 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1ARC-Net Research Centre, University and Hospital Trust of Verona, 2Department of Diagnostics and Public Health, Section of Pathology, University and Hospital Trust of Verona, 3Department of Medicine (DIMED), Surgical Pathology and Cytopathology Unit, University of Padua

W tym artykule

Podsumowanie

W artykule opisano metodę identyfikacji zmian klonalnych i subklonalnych wśród różnych próbek od danego pacjenta. Chociaż opisane tutaj eksperymenty koncentrują się na określonym typie nowotworu, podejście to ma szerokie zastosowanie do innych guzów litych.

Streszczenie

Ocena heterogeniczności wewnątrznowotworowej (ITH) ma ogromne znaczenie dla przewidywania niepowodzenia terapii celowanych i projektowania odpowiednio skutecznych strategii przeciwnowotworowych. Chociaż często pojawiają się obawy ze względu na różnice w przetwarzaniu próbek i głębokości pokrycia, sekwencjonowanie nowej generacji guzów litych ujawniło bardzo zróżnicowany stopień ITH w różnych typach nowotworów. Uchwycenie pokrewieństwa genetycznego między zmianami pierwotnymi i przerzutowymi poprzez identyfikację populacji klonalnych i subklonalnych ma kluczowe znaczenie dla projektowania terapii chorób w zaawansowanym stadium. W tym miejscu przedstawiamy metodę porównawczej analizy zmian chorobowych, która pozwala na identyfikację populacji klonalnych i subklonalnych wśród różnych próbek pochodzących od tego samego pacjenta. Opisane tutaj podejście eksperymentalne integruje trzy dobrze ugruntowane podejścia: analizę histologiczną, sekwencjonowanie wielu zmian o wysokim zasięgu i analizy immunofenotypowe. W celu zminimalizowania wpływu na wykrywanie zdarzeń subklonalnych przez niewłaściwe przetwarzanie próbki, poddaliśmy tkanki starannemu badaniu patologicznemu i wzbogaceniu komórek nowotworowych. Kontrolowane jakościowo DNA ze zmian nowotworowych i zdrowych tkanek poddano następnie sekwencjonowaniu o wysokim pokryciu, ukierunkowanym na regiony kodujące 409 istotnych genów nowotworowych. Patrząc tylko na ograniczoną przestrzeń genomiczną, nasze podejście umożliwia ocenę stopnia heterogeniczności wśród zmian somatycznych (mutacje pojedynczego nukleotydu i zmiany liczby kopii) w różnych zmianach u danego pacjenta. Dzięki analizie porównawczej danych sekwencjonowania byliśmy w stanie odróżnić zmiany klonalne i subklonalne. Większość ITH jest często przypisywana mutacjom u pasażerów; W związku z tym wykorzystaliśmy również immunohistochemię do przewidywania funkcjonalnych konsekwencji mutacji. Chociaż protokół ten został zastosowany do określonego typu nowotworu, przewidujemy, że opisana tutaj metodologia ma szerokie zastosowanie do innych typów guzów litych.

Wprowadzenie

Pojawienie się sekwencjonowania nowej generacji (NGS) zrewolucjonizowało sposób diagnozowania i leczenia nowotworów1. NGS w połączeniu z sekwencjonowaniem wieloregionalnym ujawniły wysoki stopień heterogeniczności wewnątrznowotworowej (ITH) w guzach litych2, co częściowo wyjaśnia niepowodzenie terapii celowanej z powodu obecności subklonów o różnej wrażliwości na lek2. Ważnym wyzwaniem związanym z badaniami sekwencjonowania całego genomu jest konieczność rozróżnienia między mutacjami pasażerskimi (tj. neutralnymi) i napędzającymi w poszczególnych nowotworach3. Kilka badań rzeczywiście wykazało, że w niektórych nowotworach mutacje pasażerów stanowią większość ITH, podczas gdy zmiany w czynniku napędzającym mają tendencję do zachowania się wśród zmian tego samego osobnika4. Ważne jest również, aby zauważyć, że duże obciążenie mutacjami (obserwowane w przypadku raka płuc i czerniaka) niekoniecznie oznacza duże obciążenie mutacjami subklonalnymi2. Dlatego wysoki stopień ITH można znaleźć w nowotworach o niskim obciążeniu mutacyjnym.

Przerzuty są odpowiedzialne za ponad 90% zgonów związanych z rakiem na całym świecie5; W związku z tym uchwycenie heterogeniczności mutacji genów kierujących zmianami pierwotnymi i przerzutowymi ma kluczowe znaczenie dla projektowania skutecznych terapii chorób w zaawansowanym stadium. Sekwencjonowanie kliniczne jest zwykle wykonywane na kwasach nukleinowych z utrwalonych tkanek, co utrudnia eksplorację całego genomu ze względu na niską jakość DNA. Z drugiej strony, celem sekwencjonowania klinicznego jest zidentyfikowanie mutacji, które można zdziałać, i/lub mutacji, które mogą przewidywać reakcję/brak odpowiedzi na dany schemat terapeutyczny. W chwili obecnej sekwencjonowanie może być ograniczone do mniejszej części genomu w celu szybkiego wydobycia istotnych klinicznie informacji. Przejście od niskoprzepustowego profilowania DNA (np. sekwencjonowania Sangera) do NGS umożliwiło analizę setek genów istotnych dla raka na dużej głębokości pokrycia, co pozwala na wykrywanie zdarzeń subklonalnych. W tym miejscu przedstawiamy metodę porównawczej analizy zmian chorobowych, która pozwala na identyfikację populacji klonalnych i subklonalnych wśród różnych próbek od tego samego osobnika. Opisana tutaj metoda łączy w sobie trzy dobrze ugruntowane podejścia (analiza histologiczna, sekwencjonowanie wielozmianowe o dużym zasięgu i analizy immunofenotypowe) w celu przewidywania funkcjonalnych konsekwencji zidentyfikowanych zmian. Podejście to jest schematycznie opisane na rycinie 1 i zostało zastosowane do badania 5 przerzutowych przypadków litych nowotworów pseudobrodawkowatych (SPN) trzustki. Chociaż opisujemy przetwarzanie i analizę próbek tkanek zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie, tę samą procedurę można zastosować do materiału genetycznego ze świeżo zamrożonej tkanki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Materiał wykorzystany w badaniu został zebrany zgodnie ze specjalnym protokołem, który został zatwierdzony przez lokalną komisję etyczną. Dostępna była pisemna świadoma zgoda wszystkich pacjentów.

1. Rewizja histologiczna i immunofenotypowa próbek tkanek

UWAGA: Za czynności opisane poniżej odpowiada biegły patolog.

  1. Rewizja histopatologiczna wybranych przypadków według ustalonych kryteriów diagnostycznych.
    1. Za pomocą mikrotomu wyciąć skrawki tkanek o grubości 4−5 μm z reprezentatywnych bloków tkankowych FFPE i zamontować skrawki na standardowych szkiełkach histologicznych.
    2. Wykonać barwienie hematoksyliną i eozyną dla każdego szkiełka za pomocą automatycznego barwnika tkankowego (tabela materiałów).
    3. Przegląd rozpoznania histopatologicznego wybranych przypadków nowotworu zgodnie z kryteriami diagnostycznymi WHO.
      UWAGA: Na tym etapie patolog może zidentyfikować morfologicznie odrębne obszary guza w tym samym odcinku tkanki. Możliwe jest zbieranie plonów na tych obszarach oddzielnie (zob. sekcja 2). Histologiczne podobieństwo guza i normalnych komórek dla SPN przedstawiono na rycinie 2.
    4. Wykonaj barwienie immunohistochemiczne dla ustalonych markerów w celu uzupełnienia analizy histologicznej i oszacowania heterogeniczności immunofenotypowej.
      UWAGA: Patolog może zidentyfikować immunofenotypowo odrębne obszary guza w tym samym odcinku tkanki. Możliwe jest zbieranie plonów na tych obszarach oddzielnie (zob. sekcja 2).
  2. Oceń komórkowość nowotworową wycinka tkanki nowotworowej i odpowiednio zaplanuj ręczną mikrodysekcję.
    UWAGA: Jest to wygenerowane przez patologa oszacowanie komórkowości guza.
    1. Jeśli zawartość komórek nowotworowych w wycinku tkanki jest wyższa niż 70%, ręczna mikrodysekcja nie jest obowiązkowa; Przejdź bezpośrednio do kroku 3.1.
      UWAGA: Docelowe 70% zawartości komórek nowotworowych w celu (i) zapewnienia odpowiedniej czułości dla oszacowania częstości występowania zmutowanych alleli oraz (ii) możliwej walidacji mutacji klonalnych za pomocą mniej czułych metodologii (np. sekwencjonowanie naczyń włosowatych).
    2. Jeśli zawartość komórek nowotworowych w wycinku tkanki jest mniejsza niż 70%, konieczna jest mikrodysekcja i przejście do kroku 2.
  3. Oceń skrawki tkanki z bloku FFPE, z których pobrano próbki tkanki nienowotworowej. Tkanka ta jest wykorzystywana jako źródło DNA linii zarodkowej.
    UWAGA: Krew jest alternatywnym źródłem DNA linii zarodkowej. W takim przypadku należy przeprowadzić ekstrakcję DNA zgodnie z zaleceniami w notatce do kroku 4.1.
    1. Jeśli w przekroju tkanki widoczna jest tylko tkanka nienowotworowa (ryc. 2D), ręczna mikrodysekcja nie jest konieczna; Przejdź bezpośrednio do kroku 3.1.
    2. Jeśli w przekroju tkanki znajduje się znaczne zanieczyszczenie komórkami nowotworowymi, konieczna jest ręczna mikrodysekcja; Przejdź do sekcji 2.

2. Ręczna mikrodysekcja

UWAGA: Metoda ta ma zastosowanie do różnych typów guzów litych i ma na celu zwiększenie zawartości komórek nowotworowych w próbkach tkanek. Alternatywnie, metoda ta może być stosowana do pobierania morfologicznie i/lub immunofenotypowo odrębnych obszarów w obrębie tego samego odcinka tkanki.

  1. Za pomocą mikrotomu wytnij do dziesięciu skrawków tkanki nowotworowej FFPE o grubości 4-6 μm i zamontuj je na nienaładowanych szkiełkach.
    UWAGA: Jeżeli w próbce widoczne jest tylko jedno gniazdo komórek nowotworowych o wielkości 1mm2 , należy wyciąć 10 szkiełek tkankowych i poddać je ręcznej mikrodysekcji w celu uzyskania docelowej ilości DNA (40 ng); Zakłada się, że klaster 1 mm2 zawiera od 700 do 1000 jąder nowotworowych.
  2. Inkubować szkiełka podstawowe w temperaturze 60 °C przez 10 minut.
  3. Umieść szkiełka w stojaku i wykonaj następujące prania: ksylen przez 20 min, 100% etanol przez 10 min, 80% etanol przez 10 min, 70% etanol przez 10 min, woda destylowana przez 1 min, barwnik przeciwbarwiący hematoksyliną przez 10 s, woda z kranu przez 1 min.
  4. W standardowym mikroskopie odwróconym użyj igły 27 G na strzykawce jako narzędzia do mikrodysekcji i zbierz reprezentatywne skupiska komórek nowotworowych. Zebrać co najmniej dziesięć skupisk komórek o wielkości 1 mm2 , aby zapewnić wymaganą ilość DNA do sekwencjonowania.
    UWAGA: Jeśli morfologicznie odrębne obszary mają być analizowane jako różne jednostki, użyj narzędzia do mikropreparacji, aby zebrać te obszary osobno.
  5. Zebrane klastry umieścić w probówkach o pojemności 1,5 ml (tabela materiałów) uprzednio wypełnionych 20 μl proteazy K i 180 μl buforu do lizy (tabela materiałów, oba zawarte w zestawie do ekstrakcji DNA) i wymieszać przez wirowanie.

3. Przetwarzanie tkanek bez uprzedniej mikrodysekcji

UWAGA: Procedura ta jest stosowana w przypadku bloków tkankowych, które zawierają tylko komórki nienowotworowe (źródło DNA linii zarodkowej) lub zawierają co najmniej 70% morfologicznie jednorodnych komórek nowotworowych.

  1. Za pomocą mikrotomu wyciąć do sześciu skrawków tkanek o grubości 4−5 μm z wybranych bloków tkankowych FFPE. Umieść zwoje tkanek w probówkach o pojemności 1,5 ml zgodnie z opisem w kroku 2.5.

4. Ekstrakcja DNA z komórek prawidłowych i nowotworowych

  1. Oczyść DNA z tkanki prawidłowej i nowotworowej za pomocą zestawu do ekstrakcji tkanek DNA FFPE (tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Gdy krew jest używana jako źródło kwasu nukleinowego linii zarodkowej, oczyść DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji krwi DNA (tabela materiałów).
  2. Kwantyfikacja DNA i kontrola jakości
    1. Aby określić ilościowo ilość dwuniciowego (dsDNA), należy dodać podwielokrotność próbki DNA do roztworu zawierającego fluorescencyjne barwienie kwasem nukleinowym (tabela materiałów) i zmierzyć emitowaną fluorescencję za pomocą fluorometru laboratoryjnego (tabela materiałów).
      UWAGA: Test mierzy intensywność sygnału fluorescencyjnego emitowanego przez barwniki fluorescencyjne przyłączone do dsDNA i określa ilość DNA za pomocą krzywej wzorcowej.
    2. Użyć spektrofotometru mikroobjętościowego (tabela materiałów) do pomiaru proporcji 260/280 i 260/230 próbki w celu zakwalifikowania DNA. "Czyste" DNA powinno mieć 260/280 1,8 i 260/230 w zakresie 1,8−2,2.
      UWAGA: Ocena spektrofotometryczna próbki ma na celu wykazanie obecności zanieczyszczeń chemicznych (np. fenolu), które mają wpływ na dalsze reakcje. W przypadku zanieczyszczenia odczynnikami chemicznymi należy wykonać etap czyszczenia za pomocą zestawu opartego na kolumnie.

5. Przygotowanie i kwantyfikacja biblioteki

UWAGA: Schematyczny schemat blokowy etapów przygotowania biblioteki i kwantyfikacji przedstawiono na rysunku 3.

  1. Przygotowanie biblioteki DNA (4 pule starterów ustawione dla każdej próbki)
    UWAGA: 4 pule starterów należą do panelu raka opisanego w Tabeli materiałów. Każda pula zawiera pary starterów, które są zaprojektowane dla multipleksowanej selekcji docelowej 409 genów. Link do listy genów wchodzących w skład panelu NGS znajduje się w Tabeli Materiałów.
    1. Przygotować cztery reakcje amplifikacji docelowej DNA dla każdej próbki, po jednej na pulę starterów. Do każdej puli starterów (Tabela materiałów) dodaj probówkę o pojemności 0,2 ml (Tabela materiałów): 4 μl mieszanki wzorcowej (Tabela materiałów, zawarta w zestawie bibliotecznym), 10 μl mieszanki puli starterów o wysokiej wierności (Tabela materiałów, zawarta w bibliotece panelu onkologicznego) i 6 μl DNA (łącznie 10 ng).
    2. Amplifikować obszary docelowe każdej puli starterów oddzielnie w czterech probówkach o pojemności 1,5 ml, uruchamiając następujący program: utrzymywać w temperaturze 99 °C przez 2 minuty (aktywacja polimerazy gorącego startu), 16 cykli (denaturować w temperaturze 99 °C przez 15 s, wyżarzać i rozciągać w temperaturze 60 °C przez 8 minut), utrzymywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Punkt zatrzymania. Docelowe reakcje amplifikacji należy przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C lub w temperaturze -20 °C przez dłuższy czas.
    3. Częściowe trawienie końców amplikonów
      UWAGA: Instrukcja dostarczona przez producenta zestawu NGS przewiduje etap, w którym różne reakcje amplifikacji z każdej próbki są łączone przed częściowym roztwarzaniem. Unikaj tego kroku i kontynuuj przetwarzanie każdego trawienia amplifikacji oddzielnie.
      1. Dodać 2 μl specyficznej mieszanki do wytrawiania (tabela materiałów, dołączona do zestawu bibliotecznego) do każdej amplifikowanej puli każdej próbki (całkowita objętość każdej probówki 0,2 ml wynosi 22 μl). Dokładnie wymieszaj i odwiruj każdą probówkę, aby zebrać kropelki.
      2. Załaduj probówki do termocyklera i uruchom następujący program: 50 °C przez 10 min, 55 °C przez 10 min, 60 °C przez 20 min, 10 °C hold (do 1 h).
        UWAGA: Punkt zatrzymania. Przechowywać płytkę w temperaturze -20 °C przez dłuższy czas.
    4. Łączniki ligacyjne do amplikonów i oczyść.
      UWAGA: Użyj innego adaptera kodów kreskowych dla każdej próbki podczas sekwencjonowania wielu bibliotek na jednym chipie. Wszystkie cztery reakcje amplifikacji z tej samej próbki muszą otrzymać ten sam kod kreskowy.
      1. Przygotuj adaptery (tabela materiałów, zestaw adapterów z kodami kreskowymi). Dla każdego kodu kreskowego X przygotuj mieszankę adaptera P1 i unikalnych adapterów kodów kreskowych (tabela materiałów) w końcowym rozcieńczeniu 1:4. Wymieszaj 4 μl wody z 2 μl adaptera P1 i 2 μl unikalnych adapterów do kodów kreskowych. Użyj 2 μl tej mieszanki adapterów kodów kreskowych do dalszych przejść.
      2. Przeprowadzić reakcję ligacji, dodając do każdej amplifikowanej puli każdej próbki w następującej kolejności: 4 μl roztworu przełącznika (tabela materiałów, zawarta w zestawie bibliotecznym), 2 μl mieszanki adaptera kodu kreskowego i 2 μl ligazy DNA (tabela materiałów, zawarta w zestawie bibliotecznym) (całkowita objętość = 30 μl).
      3. Dokładnie i krótko odwirować, aby zebrać kropelki.
      4. Załaduj każdą rurkę do termocyklera i uruchom następujący program: 22 °C przez 30 min, 68 °C przez 5 min, 72 °C przez 5 min, 4 °C hold (do 24 h).
        UWAGA: Punkt zatrzymania. Przechowywać płytkę w temperaturze -20 °C przez dłuższy czas.
    5. Oczyszczanie i wzmacnianie biblioteki
      1. Odwirować każdą probówkę, a następnie przenieść każdą próbkę oznaczoną kodem kreskowym do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 45 μl odczynnika oczyszczającego na bazie kulek (tabela materiałów) do każdej puli każdej próbki. Pipetować w górę i w dół 5x, aby wymieszać zawiesinę kulek z DNA.
      2. Inkubować mieszaninę przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT), następnie umieścić każdą probówkę w stojaku magnetycznym i inkubować przez 2 minuty. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant, nie naruszając osadu.
      3. Dodaj do każdej probówki 150 μl świeżego 70% etanolu. Umyj koraliki, przesuwając każdą rurkę na boki w dwóch pozycjach magnesu. Wyrzucić supernatant i zwrócić uwagę, aby nie naruszyć osadu.
      4. Powtórz procedury opisane w kroku 5.1.5.3, a następnie trzymaj rurki w magnesie i susz kulki na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
      5. Wyjmij probówki z oczyszczonymi bibliotekami każdej puli starterów z magnesu i dodaj 50 μl mieszanki PCR o wysokiej wierności (tabela materiałów) i 2 μl mieszanki starterów do amplifikacji bibliotecznej (tabela materiałów, dołączona do zestawu bibliotecznego) do granulek kulek każdej probówki.
      6. Zmieszaj każdą probówkę o pojemności 1,5 ml i krótko odwiruj, aby zebrać kropelki.
      7. Umieść probówki o pojemności 1,5 ml w magnesie na 2 minuty i ostrożnie przenieś supernatant (~50 μl) z każdej probówki do nowej probówki o pojemności 0,2 ml, nie naruszając osadu.
      8. Amplifikować biblioteki każdej puli starterów, uruchamiając następujący program: utrzymywać w temperaturze 98 °C przez 2 minuty, aby aktywować enzym, 5 cykli (denaturacja w temperaturze 98 °C przez 15 s, wyżarzanie i rozciąganie w temperaturze 64 °C 1 min), utrzymywanie w temperaturze 4 °C. Przechowywać próbki w temperaturze -20 °C.
    6. Oczyszczanie wzmocnionej biblioteki
      1. Odwirować każdą probówkę, aby zebrać zawartość na dnie i przenieść każdą amplifikowaną próbkę z biblioteki do probówki o pojemności 1,5 ml.
      2. Dodać 25 μl odczynnika oczyszczającego na bazie kulek. Pipetować w górę i w dół 5x, aby wymieszać zawiesinę kulek z DNA.
      3. Inkubować mieszaninę przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie umieścić probówki w magnesie na 5 minut.
      4. Ostrożnie przenieść supernatant, który zawiera amplikony, z każdej probówki do nowych probówek, nie naruszając osadu.
      5. Dodać 60 μl odczynnika oczyszczającego na bazie kulek do supernatantu każdej probówki i pipetować w górę i w dół w celu wymieszania zawiesiny kulek i DNA.
      6. Inkubować mieszaninę przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie umieścić probówki w magnesie na 3 minuty.
      7. Wyrzuć supernatant z każdej probówki i zwróć uwagę, aby nie naruszyć osadu.
        UWAGA: Amplikony są związane z koralikami.
      8. Dodaj do każdej probówki 150 μl świeżego 70% etanolu. Umyj koraliki, przesuwając rurki na boki w dwóch pozycjach magnesu. Wyrzucić supernatant i zwrócić uwagę, aby nie naruszyć osadu.
      9. Powtórz procedurę opisaną w kroku 5.1.6.8 i susz kulki na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Unikaj nadmiernego wysuszania koralików.
      10. Wyjmij probówki z magnesu i dodaj 50 μl niskiego Tris EDTA (TE) (Tabela materiałów, dołączona do zestawu bibliotecznego) do granulki, aby rozproszyć kulki.
      11. Odpipetować mieszaninę w górę i w dół kilka razy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
      12. Umieść probówki w magnesie na co najmniej 2 minuty i ostrożnie przenieś supernatant, który zawiera amplikony, do nowych probówek, nie naruszając kulek.
  2. Kwantyfikacja biblioteki
    1. Użyj przyrządu do analizy fragmentów (Tabela materiałów), aby uruchomić chip DNA zgodnie z protokołem zestawu DNA o wysokiej czułości.

6. Uruchamianie puli i sekwencjonowania bibliotek

  1. Rozcieńczyć każdą bibliotekę do 100 pM wodą wolną od nukleaz. Połącz 10 μl z każdej biblioteki 100 pM w jednym przebiegu w jednej probówce. Wymieszaj połączone biblioteki przez pipetowanie i przejdź do tworzenia szablonów i sekwencjonowania.
  2. Planowane tworzenie przebiegów
    UWAGA: Typowy przebieg obejmuje cztery próbki, które można załadować na dwa różne typy chipów półprzewodnikowych (chip Ion PI lub chip Ion 540) w oparciu o sekwencer dostępny w laboratorium (Ion Proton System lub GeneStudio S5 System, Tabela materiałów). Systemy te zwykle generują 80 milionów odczytów na przebieg.
    1. Otwórz przeglądarkę Torrent na komputerze podłączonym do systemu sekwencjonowania (np. Ion Chef System) i zaplanuj nowy przebieg, korzystając z ogólnego szablonu dla wybranej aplikacji (AmpliSeqDNA).
    2. Przejdź do zakładki Zestawy w planie. Wybierz Ion Proton System lub Ion GeneStudio S5 System z listy rozwijanej instrumentu w oparciu o używany system sekwencjonowania.
    3. W zależności od systemu sekwencjonowania wybierz odpowiedni układ scalony (układ PI dla systemów Ion Proton; układ 540 dla systemów Ion GeneStudio S5) z listy rozwijanej Typ układu .
    4. Wybierz Ion AmpliSeq 2.0 Library Kit z listy rozwijanej Library Kit .
    5. Wybierz przycisk Ion Chef dla zestawu szablonów, a następnie wybierz odpowiedni zestaw szefa kuchni (Ion PI Hi-Q Chef Kit dla chipa PI lub Ion 540 Kit-Chef dla chipa 540) z listy rozwijanej Zestaw szablonów .
    6. Wybierz odpowiedni zestaw do sekwencjonowania (Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit for PI chip lub Ion S5 Sequencing Kit for 540 chip) z listy rozwijanej Sequencing Kit , a następnie wybierz IonXpress z listy rozwijanej Barcode Set (Zestaw kodów kreskowych).
    7. Przejdź do zakładki Wtyczka i wybierz wtyczkę Coverage Analysis .
    8. Przejdź do zakładki Plan. Wybierz genom GRCh37/hg19 z listy rozwijanej Biblioteka referencyjna. Z listy rozwijanej Regiony docelowe wybierz odpowiedni panel, który ma zostać sekwencjonowany.
    9. Ustaw liczbę kodów kreskowych do sekwencjonowania oraz etykietę probówek z próbkami biblioteki w odpowiednich polach.
    10. Ustaw nazwę kodu kreskowego i nazwę próbki dla każdej biblioteki.
  3. Rozcieńczanie i ładowanie przykładowych bibliotek.
    1. Rozcieńczyć bibliotekę papierów wartościowych wodą wolną od nukleaz do 25 pM dla układu PI lub 32 pM dla układu 540.
    2. Odpipetować 50 μl z każdej rozcieńczonej biblioteki na dno odpowiedniej probówki z próbką z biblioteki.
    3. Włącz system sekwencjonowania i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby załadować wszystkie wymagane odczynniki i zaimportować plan uruchamiania.
    4. Załaduj probówkę z próbkami biblioteki zawierającą biblioteki w puli i uruchom program do amplifikacji klonalnej.
      UWAGA: System Ion Chef wymaga przygotowania dwóch frytek na bieg.
  4. Sekwencjonowanie na protonie jonowym lub jonowym GeneStudio S5.
    1. Włącz system sekwencjonowania i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby zainicjować sekwencjonowanie i zaimportować plan uruchamiania.
    2. Załaduj chip sekwencjonujący po wyjęciu go z systemu sekwencjonowania.
      UWAGA: Być uziemionym przed podniesieniem wióra, aby uniknąć uszkodzenia wióra z powodu wyładowań elektrostatycznych. Przenoszenie/pozycjonowanie wiórów wraz z przykładami udanego/nieudanego załadunku przedstawiono na rysunku 4.
    3. Zamknij pokrywę komory na wióry i poczekaj, aż ikona stanu chipa wskaże "Gotowy".
    4. Opróżnij pojemnik na odpady po zakończeniu pierwszego cyklu, a następnie jak najszybciej ułóż pozostałe wióry.

7. Analiza mutacji i wariacji liczby kopii (CNV)

UWAGA: Dostosowanie danych sekwencjonowania do ludzkiego genomu referencyjnego GRCh37/hg19 jest wykonywane automatycznie po ustawieniu w Planie (krok 6.2.8).

  1. Użyj danych wyjściowych wtyczki Analiza pokrycia (tabela materiałów), aby zweryfikować głębokość pokrycia i jednorodność.
  2. Wykonaj wywołanie wariantu za pomocą wtyczki Torrent variant caller (Tabela materiałów), wybierając odpowiednio linię zarodkową lub somatyczny przepływ pracy.
  3. Pobierz przefiltrowane warianty plików Variant Call Format (VCF). Opisuj warianty za pomocą oprogramowania Variant Effect Predictor (VEP)6 i bazy danych NCBI RefSeq.
  4. Załaduj dane sekwencjonowania do oprogramowania Ion Reporter za pomocą wtyczki do przesyłania Ion Reporter i skorzystaj z przepływu pracy Comprehensive Cancer Panel tumor-normal pair do analizy danych w celu oszacowania CNV.
  5. Ręcznie filtruj mutacje i CNV na podstawie wyników przypisanych przez oprogramowanie i weryfikuj je wizualnie za pomocą przeglądarki Integrative Genomics Viewer (IGV)7.
    1. Sprawdź wzrokowo wyrównanie pod kątem nietypowych odczytów (spowodowanych na przykład nieprawidłowym torbowaniem, nadmiernym wzmocnieniem lub miękkim przycinaniem odczytów), które mogą generować wywołania artefaktów.
    2. Zweryfikuj CNV, sprawdzając znormalizowane pokrycie dla wszystkich amplikonów w danym genie w stosunku do znormalizowanego pokrycia linii podstawowej.
      UWAGA: Pomaga to korygować fałszywe wywołania spowodowane oprogramowaniem do segmentacji, które czasami wywołuje CNV na podstawie symetrycznie nieprawidłowego pokrycia kilku amplikonów na końcu jednego genu i na początku kolejnego genu.
  6. Indeksowanie mutacji somatycznych
    1. W każdym przypadku mutacja indeksowa wymaga sekwencjonowania prawidłowej tkanki/krwi, guza pierwotnego i przerzutów.
    2. Oznacz jako linię zarodkową i odrzuć wywołania, które są również widoczne w danych sekwencjonowania DNA linii zarodkowej.
    3. Oznacz jako klonalne/założycielskie mutacje, które są wspólne dla wszystkich zmian chorobowych danego pacjenta.
    4. Oznacz jako subklonalne/progresyjne mutacje, które zostały wykryte w niektórych, ale nie wszystkich zmianach u danego pacjenta.

8. Analiza immunofenotypowa: immunohistochemia dla odpowiedniej ekspresji białek

UWAGA: Immunohistochemia została wykorzystana do walidacji funkcjonalnych konsekwencji inaktywacji mutacji w genach supresorowych nowotworu.

  1. Za pomocą mikrotomu wyciąć skrawki tkanki FFPE o grubości 3−4 μm i zamontować je na naładowanych szkiełkach i inkubować szkiełka w temperaturze 60 °C przez 10 minut.
  2. Umieść szkiełka w stojaku i wykonaj następujące czynności: ksylen przez 10 min, ksylen przez 10 min, 95% etanol przez 4 min, 95% etanol przez 4 min, 70% etanol przez 4 min, 70% etanol przez 4 min, woda destylowana przez 4 min.
  3. Przeprowadzić pobieranie antygenu na podstawie wskazania producentów przeciwciał (Tabela Materiałów).
    1. Umieścić szkiełka w stojaku ze specyficznym roztworem do pobierania antygenu i zanurzyć w łaźni wodnej w temperaturze poniżej wrzenia.
    2. Zdejmij szkiełka z wanny i nalej wodę z kranu do ostygnięcia przez 10 minut.
  4. Umieść szkiełka w nowym stojaku z 3% H2O2 w 1x soli fizjologicznej buforowanej tris (TBS) na 20 minut w temperaturze pokojowej w celu dezaktywacji endogennych peroksydaz.
  5. Umieść szkiełka w nowym stojaku i umyj 3 razy za pomocą TBS i 0,1% Tween 20 (TBST).
  6. Użyj pisaka PAP (Table of Materials), aby narysować hydrofobowy okrąg wokół tkanki zamontowanej na szkiełku.
  7. Umieścić szkiełka w wilgotnej komorze i wykonywać blokowanie przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przy użyciu 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w TBST jako roztworu blokującego.
  8. Inkubować szkiełka podstawowe z przeciwciałami pierwszorzędowymi (tabela materiałów) w wilgotnej komorze przez noc w temperaturze 4 °C. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe roztworem blokującym zgodnie z zaleceniami.
  9. Umieść szkiełka w nowym koszu i umyj 3x łyżką stołową.
  10. Inkubować szkiełka ze specyficznymi przeciwciałami drugorzędowymi (anty-mysimi lub anty-króliczym) (4-5 kropli na 1 szkiełko) przez 30 minut w RT w wilgotnej komorze.
  11. Umieść szkiełka w nowym ruszcie i umyj 3x łyżką tłuszczową, a następnie w wodzie destylowanej.
  12. Przygotować roztwór 3,3'-diaminobenzydyny (DAB), rozcieńczając 1 kroplę w 1 ml buforu rozcieńczającego (tabela materiałów). Inkubuj szkiełka maksymalnie przez 5 minut, sprawdzając pod mikroskopem.
  13. Użyj kontroli dodatniej, aby obliczyć czas inkubacji, śledząc rozwój reakcji pod mikroskopem.
    UWAGA: Każde przeciwciało potrzebuje określonego czasu inkubacji.
  14. Nieaktywny DAB (stop chromogen precipitation) poprzez zanurzenie szkiełek w wodzie destylowanej.
  15. Przeciwplamić szkiełka, umieszczając je w nowym stojaku z hematoksyliną przez 10 s, a następnie spłukać wodą z kranu.
  16. Umieść szkiełka w stojaku i wykonaj następujące czynności: 70% etanol przez 4 min, 70% etanol przez 4 min, 95% etanol przez 4 min, 95% etanol przez 4 min, ksylen przez 10 min, ksylen przez 10 min.
  17. Uszczelnij szkiełka, nakładając kilka kropli podłoża montażowego (Tabela Materiałów) na każde szkiełko tkankowe i przykryj szkiełkiem nakrywkowym.
  18. Dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby usunąć nadmiar podłoża i pęcherzyków powietrza z tkanki i na zewnątrz z szkiełka nakrywkowego i wysuszyć na powietrzu.
  19. Oceń i oceń wyniki barwienia pod odwróconym mikroskopem z ekspertem patologiem.
    UWAGA: System punktacji będzie zależał od konkretnych antygenów, dla których informacje mogą już istnieć w literaturze. Jeśli informacje nie są dostępne w literaturze, należy opracować system punktacji, wykorzystując jako odniesienie ekspresję antygenu w normalnej tkance.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przebieg badania przedstawiono na rysunku 1. Sekwencjonowanie wielu zmian chorobowych (n = 13) 5 przypadków SPN ukierunkowanych na sekwencje kodujące 409 genów związanych z rakiem zidentyfikowało łącznie 27 mutacji somatycznych w 8 genach (CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1 i FGFR3). Mutacje zdefiniowano jako założycielskie/klonalne, gdy są wspólne dla wszystkich zmian u danego pacjenta, oraz progresyjne/subklo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Nasza metoda umożliwia identyfikację zmian molekularnych zaangażowanych w progresję guzów litych poprzez integrację danych pionowych (tj. morfologii, sekwencjonowania DNA i immunohistochemii) z różnych zmian chorobowych danego pacjenta. Wykazaliśmy zdolność naszej metody do wykrywania zdarzeń klonalnych i subklonalnych w mutacyjnym cichym typie guza (tj. SPN, licie pseudobrodawkowatym nowotworu trzustki) poprzez badanie sekwencji kodujących 409 genów istotnych dla raka8. Zaletą zastosowanego tutaj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badania były wspierane przez Italian Cancer Genome Project (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana Ricerca Cancro (AIRC; Grant nr 12182 dla AS i 18178 dla VC), Grant Wspólnoty Europejskiej 7PR (Cam-PAC nr 602783 dla AS). Agencje finansujące nie odgrywały żadnej roli w gromadzeniu, analizie i interpretacji danych ani w pisaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2100 Przyrząd do bioanalizowaniaTechnologie AgilentG2939BA  Zautomatyzowane narzędzie do elektroforezy
Zestaw Agencourt AMPure XPFisher NaukowyNC9959336Technologia perełek do oczyszczania produktów PCR; Odczynnik oczyszczający na bazie kulek
Zestaw Agilent DNA o wysokiej czułościTechnologie Agilent5067-4627Kwantyfikacja biblioteki
Anty-BAP1Biotechnologia Santa CruzSC-28383 powiedział:Przeciwciało
Anty-GLUT1Thermo ScientificRB-9052Przeciwciało
Anty-KDM6ASygnalizacja komórkowa#33510Przeciwciało
Anty-p53NowokastraNCL-L-p53-DO7Przeciwciało
Anty-β KateninaSigma-AldrichZobacz materiał C7207Przeciwciało
Rozwiązanie blokującedomowej roboty-5 % albumina surowicy bydlęcej (BSA) w TBST
Roztwór do inaktywacji endogennych peroksydazdomowej roboty-3% H2O2 w soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS) 1x
Leica CV ultraKsięga Leica70937891Entellan mountin media
Odzyskiwanie epitopów Rozwiązanie 1Leica BiosystemsZobacz materiał AR9961Roztwór do odzyskiwania epitopów pH 6,0 na bazie cytrynianu
Odzyskiwanie epitopów Rozwiązanie 2Leica BiosystemsZobacz materiał AR9640Roztwór do odzyskiwania epitopów pH 9,0 na bazie EDTA
Eppendorf 0,2 ml probówki do PCR, przezroczysteEppendorf powiedział:951010006Rury
Probówki Eppendorf DNA LoBind, 1,5 mlEppendorf powiedział:22431021Rury
EtanolDIAPATACertyfikat A0123Odczynnik do deparafinowania IHC
Pióro ImmEdge  Hydrofobowe  Bariera  PióroLaboratoria wektoroweH­ 4000Długopis hydrofobowy
ImmPACT DAB  PeroksydazyLaboratoria wektoroweSK&nieśmiały; 4105Podłoże HRP
ImmPRESS Anty&nieśmiały; Królik  Ig  Odczynnik  PeroksydazyLaboratoria wektoroweMP & nieśmiały; 7401&nieśmiały; 50Przeciwciało drugorzędowe
ImmPRESS Anty&nieśmiały; Mysz  Ig  Odczynnik  PeroksydazyLaboratoria wektoroweMP & nieśmiały; 7402&nieśmiały; 50Przeciwciało drugorzędowe
Przeglądarka genomiki integracyjnej (IGV)Szeroki Instytut-https://software.broadinstitute.org/software/igv/home
Ion AmpliSeq Kompleksowy panel onkologicznyThermofisher Naukowy4477685Multipleksowany wybór celu genu związanego z rakiem 409. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf
Zestaw biblioteki Ion AmpliSeq 2.0Thermofisher Naukowy4480441Przygotowanie bibliotek amplikonowych z wykorzystaniem paneli Ion AmpliSeq
Instrument Jonowego Szefa KuchniThermofisher Naukowy4484177Zautomatyzowane przygotowanie biblioteki, przygotowanie szablonów i ładowanie chipów
Zestaw chipów Ion PI v3 lub chip Ion 540Thermofisher NaukowyA26771 lub A27766Chipy z kodami kreskowymi do sekwencjonowania
Ion PI Hi-Q Chef Kit lub Ion 540 Kit-ChefThermofisher NaukowyA27198 lub A30011Przygotowanie szablonu
Zestaw do sekwencjonowania jonów PI Hi-Q 200 lub zestaw do sekwencjonowania jonów S5Thermofisher NaukowyA26433 lub A30011Sekwencjonowanie
System jonów protonowych lub jonowych GeneStudio S5Thermofisher Naukowy4476610 lub A38196System sekwencjonowania
Oprogramowanie Ion Reporter - AmpliSeq Kompleksowy panel onkologiczny Guz - normalna paraThermofisher Naukowy4487118Przepływ pracy
Ion Reporter Software - wtyczka do przesyłaniaThermofisher Naukowy4487118Narzędzie do analizy danych
Oprogramowanie Ion Torrent Suite - wtyczka Coverege AnalysisThermofisher Naukowy4483643Wtyczka opisująca poziom wyprodukowanego pokrycia sekwencyjnego
Oprogramowanie Ion Torrent Suite - wtyczka Variant CallerThermofisher Naukowy4483643Wtyczka zdolna do identyfikacji polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP), insercji i delecji w próbce w całym odniesieniu
Adaptery kodów kreskowych Ion Xpress 1-96 ZestawThermofisher Naukowy4474517Unikalne adaptery do kodów kreskowych
Spektrofotometry NanoDrop 2000/2000cThermofisher NaukowyZobacz materiał ND-2000Wykrywanie czystości DNA
Baza danych sekwencji referencyjnej NCBI (RefSeq)NCBI (Krajowa Sieć Informacji-https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/
Platynowy PCR SuperMix High FidelityFisher Naukowy12532-016 lub 12532-024SuperMix do amplifikacji PCR; mieszanka PCR o wysokiej wierności
Mini zestaw QIAamp DNA BloodQuiagen51106 0r 51104Zestaw do ekstrakcji krwi DNA
Tkanka QIAamp DNA FFPEQuiagen56404Zestaw do ekstrakcji tkanek DNA FFPE
Fluorometr Qubit 2.0Thermofisher NaukowyNumer katalogowy Q32866 powiedział:Kwantyfikacja DNA
Zestaw testowy Qubit dsDNA BRThermofisher NaukowyNumer katalogowy Q32850 powiedział:Zestaw do oznaczania ilościowego DNA na fluorometrze Qubit 2.0
TBST (Do ustalenia)domowej roboty-sól fizjologiczna buforowana trisem (TBS) i 0,1% Tween 20
Tissue-Tek Prisma Plus & Folia Tissue-TekSakura Europa6172Zautomatyzowany przyrząd do barwienia szkiełek tkankowych
Oprogramowanie Variant Effect Predictor (VEP)EMBI-EBI (Przedsiębiorstwo Kapitałowe i Inwestycyjne)-http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Narzędzia/VEP
Xilene, mieszanina izomerówCarlo Erba492306Odczynnik do deparafinowania IHC

Bibliografia

  1. Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
  2. McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168 (4), 613-628 (2017).
  3. Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
  4. Makohon-Moore, A. P., et al. Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer. Nature Genetics. 49 (3), 358-366 (2017).
  5. Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. On the origin of cancer metastasis. Critical reviews in oncogenesis. 18 (1-2), 43-73 (2013).
  6. McLaren, W., et al. Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor. Bioinformatics. 26 (16), 2069-2070 (2010).
  7. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).
  8. Amato, E., et al. Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas. The Journal of Pathology. 247 (1), 123-134 (2019).
  9. Mafficini, A., et al. Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis. PLoS One. 9 (8), e104979(2014).
  10. Shi, W., et al. Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity. Cell Reports. 25 (6), 1446-1457 (2018).
  11. Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692(2013).
  12. Connor, A. A., et al. Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases. Cancer Cell. 35 (2), 267-282 (2019).
  13. Priestley, P., et al. Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors. bioRxiv. , (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Heterogeniczność wewnątrzguzapopulacje klonalnepopulacje subklonalnewariacja liczby kopiiimmunohistochemiasekwencjonowanie o wysokim pokryciuguzy liteanaliza mutacji
Analiza porównawcza zmian chorobowych za pomocą ukierunkowanego podejścia sekwencjonowania
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.