Artykuł metodologiczny

Charakterystyka ładunku mutacyjnego i składu klonalnego krwi ludzkiej

9.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59846

⸱

11 lipca 2019

 ,  ,  , 
1Princess Máxima Center for Pediatric Oncology

W tym artykule

Podsumowanie

Wzorce mutacji somatycznych w komórkach odzwierciedlają wcześniejszą ekspozycję mutagenną i mogą ujawnić pokrewieństwo linii rozwojowej. Przedstawiono metodologię katalogowania i analizy mutacji somatycznych w poszczególnych krwiotwórczych komórkach macierzystych i progenitorowych.

Streszczenie

Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) stopniowo gromadzą mutacje DNA w ciągu życia, co może przyczyniać się do chorób związanych z wiekiem, takich jak białaczka. Scharakteryzowanie akumulacji mutacji może poprawić zrozumienie etiologii chorób związanych z wiekiem. Przedstawiono metodę katalogowania mutacji somatycznych w poszczególnych HSPC, która opiera się na sekwencjonowaniu całego genomu (WGS) klonalnych pierwotnych kultur komórkowych. Mutacje, które są obecne w oryginalnej komórce, są wspólne dla wszystkich komórek w hodowli klonalnej, podczas gdy mutacje nabyte in vitro po sortowaniu komórek są obecne w podzbiorze komórek. W związku z tym metoda ta pozwala na dokładne wykrycie mutacji somatycznych obecnych w genomach poszczególnych HSPC, które kumulują się w ciągu życia. Te katalogi mutacji somatycznych mogą dostarczyć cennych informacji na temat procesów mutacyjnych aktywnych w tkance krwiotwórczej oraz tego, jak procesy te przyczyniają się do białaczki. Ponadto, oceniając mutacje somatyczne, które są wspólne dla wielu HSPC tego samego osobnika, można określić pokrewieństwo linii klonalnej i dynamikę populacji krwi. Ponieważ podejście to opiera się na ekspansji pojedynczych komórek in vitro, metoda ogranicza się do komórek krwiotwórczych o wystarczającym potencjale replikacyjnym.

Wprowadzenie

Narażenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) na endogenne lub zewnętrzne źródła mutagenne przyczynia się do stopniowej akumulacji mutacji w DNA w ciągu całego życia1. Stopniowa akumulacja mutacji w HSPCs1 może skutkować hematopoezą klonalną (ARCH) związaną z wiekiem (ARCH)2,3, która jest bezobjawowym stanem napędzanym przez HSPC przenoszące mutacje powodujące białaczkę. Początkowo sądzono, że osoby z ARCH mają zwiększone ryzyko zachorowania na białaczkę2,3. Jednak ostatnie badania wykazały częstość występowania 95% ARCH u osób starszych4, co sprawia, że związek z nowotworami złośliwymi jest mniej jasny i rodzi pytanie, dlaczego u niektórych osób z ARCH ostatecznie rozwijają się lub nie rozwijają nowotwory złośliwe. Niemniej jednak mutacje somatyczne w HSPC mogą stanowić poważne zagrożenie dla zdrowia, ponieważ zaburzenia mielodysplastyczne i białaczka charakteryzują się obecnością specyficznych mutacji powodujących raka.

Aby zidentyfikować procesy mutacyjne i zbadać klonalność krwi, należy scharakteryzować akumulację mutacji w poszczególnych HSPC. Procesy mutacyjne pozostawiają charakterystyczne wzorce w genomie, tak zwane sygnatury mutacyjne, które można zidentyfikować i określić ilościowo w zbiorach mutacji obejmujących cały genom5. Na przykład ekspozycja na światło UV, czynniki alkilujące i defekty w szlakach naprawy DNA były związane z inną sygnaturą mutacji6,7. Ponadto, ze względu na stochastyczny charakter akumulacji mutacji, większość (jeśli nie wszystkie) nabytych mutacji jest unikalna między komórkami. Jeśli mutacje są wspólne dla wielu komórek tego samego osobnika, oznacza to, że komórki te mają wspólnego przodka8. W związku z tym, oceniając wspólne mutacje, można określić relacje rodowe między komórkami i zbudować drzewo linii rozwojowej gałąź po gałęzi. Jednak katalogowanie rzadkich mutacji somatycznych w fizjologicznie prawidłowych komórkach jest technicznie trudne ze względu na poliklonalny charakter zdrowych tkanek.

Przedstawiona tutaj jest metoda dokładnej identyfikacji i określenia mutacji somatycznych w genomach poszczególnych HSPC. Wiąże się to z izolacją i ekspansją klonalną HSPC in vitro. Te hodowle klonalne odzwierciedlają skład genetyczny oryginalnej komórki (tj. mutacje w oryginalnej komórce będą wspólne dla wszystkich innych komórek w hodowli). Takie podejście pozwala nam uzyskać wystarczającą ilość DNA do sekwencjonowania całego genomu (WGS). Wcześniej wykazaliśmy, że mutacje nagromadzone in vitro podczas hodowli klonalnej będą wspólne dla podzbioru komórek. Umożliwia to filtrowanie wszystkich mutacji in vitro, ponieważ będą one obecne w mniejszym ułamku odczytów w porównaniu z mutacjami nabytymi in vivo9. Poprzednie metody pozwoliły uzyskać wystarczającą ilość DNA z pojedynczej komórki dla WGS przy użyciu amplifikacji całego genomu (WGA)10. Jednak główną wadą WGA jest stosunkowo podatna na błędy i niezrównoważona amplifikacja genomu, co może skutkować wypadaniem alleli11. Niemniej jednak, ponieważ podejście to opiera się na ekspansji pojedynczych komórek in vitro, jest ono ograniczone do komórek krwi o wystarczającym potencjale replikacyjnym, co nie ma miejsca w przypadku metod zależnych od WGA. Wcześniejsze próby sekwencjonowania kultur klonalnych opierały się na użyciu warstw zasilających, aby zapewnić klonalną amplifikację pojedynczych HSPCs12. Jednak DNA z warstw zasilających może potencjalnie zanieczyścić DNA kultur klonalnych, zakłócając późniejsze wywoływanie mutacji i filtrowanie. Przedstawiona tutaj metoda opiera się wyłącznie na określonym pożywce do klonalnej ekspansji pojedynczych HSPC, a zatem pozwala uniknąć problemu zanieczyszczenia DNA. Do tej pory z powodzeniem stosowaliśmy tę metodę na ludzkim szpiku kostnym, krwi pępowinowej, żywotnie zamrożonym szpiku kostnym i krwi obwodowej.

Protokół

Próbki muszą być pobrane zgodnie z odpowiednimi protokołami etycznymi, a dawcy muszą wyrazić świadomą zgodę przed zabiegiem.

1. Przygotowanie materiału próbki

UWAGA: Podczas pracy ze świeżo uzyskanym materiałem, zacznij od kroku 1.1. Podczas pracy z zamrożonym materiałem zacznij od kroku 1.2.

  1. Przygotowanie świeżego szpiku kostnego, krwi pępowinowej lub krwi obwodowej
    1. Wyizolować frakcję jednojądrzastą z próbki za pomocą separacji w gradiencie gęstości, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów) i policzyć komórki jednojądrzaste za pomocą hemocytometru. Po wyizolowaniu komórek jednojądrzastych przejdź do kroku 1.3.
    2. OPCJONALNIE: Zalecana liczba komórek wymagana do posortowania pełnej płytki 384-dołkowej HSPC wynosi 1–2 x 107. Jeśli podczas wirowania w gradiencie gęstości izolowanych jest więcej komórek, należy przechowywać nadwyżkę komórek w ciekłym azocie.
    3. Ponownie zawieś komórki w 500 μl IMDM + 10% FBS na 1 x 107 komórek i dodaj kropla po kropli równą objętość IMDM + 30% FBS + 20% DMSO, aby uzyskać zawiesinę 1 x 107 komórek w 1 ml IMDM + 20% FBS + 10% DMSO.
    4. Natychmiast przenieść komórki jednojądrzaste do fiolek kriogenicznych o pojemności 1 ml i zamrozić komórki w temperaturze -80 °C w pojemniku do zamrażania komórek o kontrolowanej szybkości przez noc. Następnego dnia przenieś komórki do magazynu ciekłego azotu po dalszym przetwarzaniu.
  2. Przygotowanie zamrożonych komórek jednojądrzastych ze szpiku kostnego, krwi pępowinowej lub krwi obwodowej
    1. Przygotować 50 ml pożywki do rozmrażania komórek zawierającej 45 ml zmodyfikowanej pożywki Iscove'a Eagle's Medium (IMDM) i 5 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i ogrzać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    2. Pobrać fiolkę z próbką z magazynu ciekłego azotu, przenieść próbkę do suchego lodu i rozmrozić tak szybko, jak to możliwe, w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    3. Gdy próbka jest prawie rozmrożona, przetrzyj fiolkę 70% etanolem i przenieś jej zawartość do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Przepłukać fiolkę 1 ml wstępnie podgrzanego IMDM + 10% FBS, aby zebrać pozostałe komórki, i dodawać ten roztwór kroplami (5 s na kroplę) do rozmrożonej próbki, delikatnie obracając probówkę.
    4. Dodaj dodatkowe wstępnie podgrzane 15 ml IMDM + 10% FBS kroplami do próbki, delikatnie obracając probówkę.
    5. Granulować komórki przez odwirowanie przez 5 minut przy 350 x g.
    6. Usunąć wszystkie sklarowane nad osadem z wyjątkiem ±3 ml. Ponownie zawiesić komórki w pozostałym supernatencie i rozcieńczyć, dodając 20 ml IMDM + 10% FBS kropla po kropli, delikatnie potrząsając probówką.
    7. Pobrać 10 μl zawiesiny komórek do zliczania komórek. Rozcieńczyć te 10 μl, dodając 20 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Liczba komórek może się zmniejszyć po rozmrożeniu, z utratą do 50% komórek po rozmrożeniu. Żywotność komórek powinna wynosić od 70% do 90%.
  3. W przypadku pracy ze szpikiem kostnym lub komórkami krwi pępowinowej należy pobrać 5 x 106 komórek jednojądrzastych do hodowli MSC (krok 2.1). W przypadku pracy z krwią obwodową należy pobrać 2–5 x10 6 komórek do izolacji limfocytów T (krok 2.2)
    4. Pozostałe komórki osadzać przez
  4. 5 minut przy 350 x g i ponownie zawiesić w 3 ml buforu FACS (0,05% BSA + 1 mM EDTA w PBS).
  5. Przenieść 1 x 105 komórek do mikroprobówki wypełnionej 200 μl buforu FACS, który posłuży jako kontrola ujemna dla cytometrii przepływowej (krok 3.8) i trzymać na lodzie.

2. Hodowla komórkowa

UWAGA: Aby uzyskać katalogi mutacji nabytych somatycznie, należy odfiltrować specyficzne dla dawcy warianty linii zarodkowej. Rozpoczynając od biopsji szpiku kostnego lub krwi pępowinowej, mezenchymalne komórki zrębu (MSC) mogą być używane jako dopasowana kontrola do filtrowania zmienności linii zarodkowej. W takim przypadku należy postępować zgodnie z sekcją 2.1. W przypadku stosowania (zmobilizowanej) krwi obwodowej wykonaj krok 2.2, aby wyizolować i użyć limfocytów T jako dopasowanej próbki kontrolnej do filtrowania pod kątem zmienności linii zarodkowej (Rysunek 1). Populacja limfocytów T będzie miała ten sam poród rodowy, co HSPC.

  1. Kultura MSC
    1. Przygotuj 50 ml pożywki MSC zawierającej 45 ml pożywki DMEM/F12, 10% FBS, 500 μl 200 mM alternatywy L-glutaminy lub L-glutaminy oraz 500 μl roztworu penicyliny/streptomycyny.
    2. Płytkę około 5 x 105 komórek jednojądrzastych w 1,5 ml pożywki MSC na dołek. Umieścić komórki w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    3. Wymień pożywkę po 24 godzinach, a następnie wymieniaj pożywkę co 3 dni, aby upewnić się, że wszystkie komórki krwiotwórcze zostały zmyte. Kontynuuj hodowlę, aż zbieżność osiągnie 100%.
    4. Jeśli MSCs zlewają się, przemyj komórki 1 ml PBS i zbierz MSC, dodając 200 μl trypsyny lub alternatywy trypsyny na studzienkę. Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Dodać 800 μl pożywki MSC i pipetować komórki w górę i w dół, aby rozluźnić komórki z płytki dołka.
    5. Przenieść MSCs do probówki do mikrowirówki i granulować komórki przez wirowanie przez 5 minut przy 350 x g. Usunąć supernatant i kontynuować izolację DNA lub przechowywać osad w temperaturze -20 °C do późniejszej izolacji DNA (sekcja 4).
  2. Izolacja limfocytów T<br /> nuta: W przypadku użycia (zmobilizowanej) krwi obwodowej, limfocyty T można wyizolować i wykorzystać jako kontrolę linii zarodkowej.
    1. Zawiesić osad komórkowy w 100 μl roztworu barwiącego anty-CD3 (rozcieńczenie przeciwciała anty-CD w buforze FACS w stosunku 1:100).
    2. Umyj komórki, dodając 1 ml buforu FACS. Granulować komórki przez odwirowywanie przez 5 minut przy 350 x g i ponownie zawiesić w 300 μl buforu FACS.
    3. Wyizolować co najmniej 5 x 105 komórek CD3+ za pomocą sortera FACS w probówce polistyrenowej o pojemności 5 ml wstępnie wypełnionej 1 ml FBS.
    4. Osadzać posortowane komórki za pomocą wirowania przez 5 minut przy 350 x g, usunąć supernatant i kontynuować bezpośrednio izolację DNA (sekcja 4) lub przechowywać osad w temperaturze -20 °C do późniejszej izolacji DNA.

3. Izolacja, sortowanie i kultura HSPC

  1. Wirować w 1–2 x 107 komórek jednojądrzastych przez 5 minut przy 350 x g i ponownie zawiesić w 50 μl buforu FACS (patrz krok 2.2.1). Przenieść komórki do probówki do mikrowirówki.
    nuta: Podczas sortowania z komórkami >2 x 107 należy odpowiednio zwiększyć objętość mieszaniny przeciwciał i buforu FACS.
  2. Przygotować 50 μl 2x mieszanki barwiącej HSC zgodnie z recepturą przedstawioną w Tabeli 1.
pkt.
przeciwciałoobjętość [μL]
BV421-CD345
FITC-Lineage mix (CD3/14/19/20/56)5
PE-CD38cyfra arabska
Pakiet APC-CD900,5
PerCP/Cy5.5 - CD45RA5
PE/CY7- CD49f1
FITC -CD161
FITC-CD115
Bufor FACS25,5

Tabela 1: Mieszanka sortowania HSC. Pokazano tabelę wskazującą rozcieńczenia przeciwciał stosowanych do sortowania HSC.

  1. Zmieszać 50 μl roztworu komórkowego z przygotowaną mieszanką barwiącą HSC i inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT) lub przez 1 godzinę na lodzie w celu związania przeciwciał.
  2. Przemyć komórki, dodając 1 ml buforu FACS i osadu, wirując przez 5 minut przy 350 x g.
  3. Ponownie zawiesić komórki w 300 μl buforu FACS i przefiltrować zawiesinę komórek przez 35 μm rurkę polistyrenową o pojemności 5 ml z sitkiem o pojemności 5 ml, aby usunąć grudki komórek przed sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją (FACS).
  4. Przygotować 25 ml pożywki hodowlanej HSPC, składającej się z 1x pożywki SFEM uzupełnionej 100 ng/ml SCF, 100 ng/ml Flt3, 50 ng/ml TPO, 10 ng/ml IL-3, 20 ng/mL IL-6 i 100 ng/ml preparatu antybiotykowego (patrz tabela materiałów).
  5. Wypełnij 384-dołkową płytkę do hodowli komórkowych 75 μl pożywki hodowlanej HSPC w każdym dołku.
    nuta: Aby zapobiec parowaniu pożywki w studzienkach zewnętrznych, należy napełnić dołki zewnętrzne 75 μl sterylnej wody lub PBS i nie używać tych studzienek do sortowania komórek.
  6. Sortowanie pojedynczych HSPC
    1. Ustaw bramki do sortowania HSPC na podstawie niebarwionej kontroli (krok 1.9) i 10 000 komórek z barwionej próbki. Reprezentatywny wynik dla ustawiania bramek jest przedstawiony na Rysunek 1. Bramkowanie pojedynczych komórek poprzez narysowanie bramki wokół liniowej frakcji wysokości FSC w funkcji obszaru FSC. Użyj niebarwionej frakcji kontrolnej, aby narysować bramkę dla frakcji rodowodu. Narysuj bramki dla komórek CD34 + i dalej scharakteryzuj ten podzbiór, ustawiając specyficzną bramkę dla komórek CD38-CD45RA.
    2. Załaduj płytkę 384-dołkową na maszynę FACS i posortuj pojedyncze komórki.
      nuta: Jeśli ma to zastosowanie do maszyny FACS, włącz opcję zachowania danych sortowania indeksów, aby umożliwić ponowne śledzenie posortowanych komórek.
  7. Hodowla pojedynczo sortowanych HSC
    1. Bezpośrednio przenieść płytkę 384-dołkową do nawilżonego inkubatora o temperaturze 37 °C z 5% CO2,
      nuta: Aby zapobiec parowaniu podczas hodowli, owiń płytkę hodowlaną 384 dołków (z pokrywką) przezroczystą folią polietylenową.
    2. Trzymaj płytkę 384 dołków w inkubatorze przez 3-4 tygodnie, aż pojawią się widoczne klony. Reprezentatywne obrazy kultury klonalnej są przedstawione na Rysunek 2. W zależności od stanu materiału wejściowego, 5%–30% posortowanych komórek rozszerzy się klonalnie.

4. Zbieranie klonów HSPC

  1. Po 4 tygodniach hodowli określ, które studnie mają zbieg 30% lub wyższy.
  2. Wstępnie napełnij (dla każdego wyrostka klonalnego) 1,5 ml mikroprobówek 1 ml 1% BSA w PBS i oznacz probówkę zgodnie z odpowiednim dołkiem.
  3. Wstępnie zwilż końcówkę pipety 1% BSA w PBS, aby zminimalizować liczbę komórek przyklejających się do końcówki pipety.
  4. Pipetować w górę/w dół pożywki w studzience gwałtownie (co najmniej 5 razy) za pomocą pipety o pojemności 200 μl (ustawionej na 75 μl) i zeskrobać dno studzienki, aby poluzować komórki w studzience, a następnie zebrać zawiesinę komórek w oznakowanej mikroprobówce odpowiadającej studzience.
  5. Pobrać 75 μl świeżego 1% BSA do PBS i powtórzyć pipetowanie w studzience, aby zapewnić maksymalny wychwyt komórek.
    nuta: Komórki hodowane klonalnie mogą przyklejać się do dna studni. Sprawdź studzienki za pomocą standardowego mikroskopu ze światłem odwróconym, aby upewnić się, czy wszystkie komórki zostały zebrane.
  6. Jeśli wszystkie studzienki o zbiegu >30% zostały zebrane, umieść płytkę 384 dołków z powrotem w inkubatorze. Kultury klonalne mogą rozmnażać się do 5 tygodni.
  7. Wirować zawiesinę komórek przez 5 minut w temperaturze 350 x g. Powinna być widoczna mała granulka.
  8. Ostrożnie usunąć wszystko, z wyjątkiem około 5 μl supernatantu. Granulki komórkowe można zamrażać w temperaturze -20 °C i przechowywać przez wiele miesięcy przed izolacją DNA.

5. Izolacja DNA

  1. Wyizolować DNA komórek HSPC i MSC/T-cell za pomocą zestawu do izolacji DNA w mikroskali zgodnie z instrukcją producenta z następującymi regulacjami:
    1. Dodać 2 μl RNazy A po dodaniu buforu AL w sekcji 2. Inkubować przez 2 minuty przed dodaniem proteinazy K.
    2. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 56 °C zamiast 10 minut.
    3. Eluuj DNA, ładując kolumnę 50 μl buforu TE o niskim poziomie EDTA (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA). Aby uzyskać optymalną elucję, ponownie załaduj eluat na kolumnę i ponownie zakręć.
  2. Oznaczyć stężenie DNA za pomocą DNA o wielkości 2 μl na klon. Wydajność DNA zwykle waha się między 0,5–3 ng/μl.

6. Sekwencjonowanie

  1. Wykonaj sekwencjonowanie DNA zgodnie z opisem Jager et al.13

7. Mapowanie i wywoływanie mutacji somatycznych

  1. Mapuj dane wyjściowe sekwencjonowania (pliki FASTQ) do genomu referencyjnego i wywołaj mutacje zgodnie z opisem w Jager et al.13
  2. Sprawdź dane pod kątem nieprawidłowych zmian kariotypowych w sekwencyjnych klonach i danych zbiorczych za pomocą narzędzia do analizy liczby kopii, takiego jak Control-FreeC14. Do tej pory nie odnotowaliśmy żadnych HSPC z aberracjami kariotypowymi.
  3. Wygeneruj czarną listę, która składa się z panelu niedopasowanych normalnych próbek do celów filtrowania z własnego zestawu próbek, jak opisano wcześniej13, lub użyj następującej przesłanej czarnej listy: .
  4. Filtruj wariacje pojedynczych nukleotydów za pomocą SNVFI .
    1. Wstępnie ustawiony plik SNVFI.config, tak aby wszystkie ścieżki do funkcji pomocniczych były poprawne.
    2. Uruchom SNVFI z plikiem .ini skonfigurowanym zgodnie z ustawieniami widocznymi w Plik uzupełniający 1 (SNVFI.ini). Aby wykluczyć mutacje indukowane in vitro, filtrujemy pod kątem VAF ≥0.39.
  5. Sprawdź dane wyjściowe wariantowej frakcji allelowej (VAF) SNVFI (Rysunek 4). Sprawdź, czy pik wykresu gęstości jest bliski 0,5, co wskazuje, że próbka jest klonalna.
  6. OPCJONALNIE: Aby określić część genomu, która jest pokryta podczas filtrowania, określ regiony callable wzdłuż linii zarodkowej i kontroli za pomocą CallableLoci z GATK (Genome Analysis ToolKit):
    java -jar GenomeAnalysisTK.jar \
    -T CallableLoci \
    -R odniesienie.fasta \
    -I myreads.bam \
    -summary table.txt \
    -o callable_status.łóżko
  7. OPCJONALNIE: Pobierz regiony wywoływane z danych wyjściowych CallableLoci i wykonaj przecięcia parami między próbkami a masą przy użyciu skryptu języka Python CallableLoci_processor.py obecnego pod adresem https://github.com/ToolsVanBox/CallableLoci_processor. Powstałe w ten sposób pliki łóżkowe mogą być wykorzystane do dalszego filtrowania danych wyjściowych SNVFI i do sprawdzenia profilu mutacji w sekcji 9:
    CallableLoci_processor.py dir_in dir_out sample_name bulk_name –próbki próbka1 próbka2 próbka3

8. Indel Calling

  1. Zaznacz wszystkie wstawienia i usunięcia (indele) w pliku raw_variants.vcf za pomocą narzędzia GATK SelectVariants:
    java -Xmx12G \
    -jar GenomeAnalysisTK.jar \
    -T Warianty_wyboru \
    -R reference_genome.fasta \
    -V raw_variants.vcf \
    -o raw_INDELs.vcf \
    -selectType INDEL
  2. Filtruj listę raw_INDELS.vcf za pomocą INDELFI :
    perl INDELFI.pl -i input.vcf (od kroku 8.1) \
    -s próbka testu kolumny \
    -c Próbka kontrolna kolumny

9. Inspekcja profilu mutacji

  1. Użyj wynikowych plików .vcf z danych wyjściowych SNVFI z kroku 7.6 (lub z kroku 7.9 z opcjonalną analizą loci wywoływania), aby przeanalizować profil mutacji genomowych, typy mutacji i analizę sygnatur przy użyciu pakietu R MutationalPatterns15: . Aby uzyskać reprezentatywne dane wyjściowe, które można uzyskać za pomocą wynikowego pliku .vcf, takiego jak spektrum mutacji 96-trinukleotydowych, zobacz Rysunek 5.

10. Budowa drzewa linii rozwojowej z wykorzystaniem podstawień zasad

  1. Aby skonstruować drzewo linii rozwojowej, wykryj wspólne mutacje między klonami. Mutacje obecne w pierwszych gałęziach drzewa genealogicznego mogą być również subklonalnie obecne w próbce zbiorczej (MSC/limfocyty T). Późniejsze rozgałęziające się linie będą definiowane przez mutacje wspólne tylko dla klonów HSPC.
  2. Aby zidentyfikować mutacje, które są obecne w podzbiorze klonów i podklonalnie obecne w masie, wykonaj następujące kroki.
  3. Aby odfiltrować mutacje somatyczne współdzielone między klonami, uruchom skrypt filterSomatic.py w terminalu opartym na systemie Unix. Skrypt można znaleźć pod adresem https://github.com/ToolsVanBox/filterSomatic. Przed uruchomieniem tego skryptu edytuj plik filterSomatic.ini (zobacz Plik uzupełniający 2), aby ustawić ścieżki i dostosować inne parametry.
  4. Uruchom polecenie filterSomatic.py (python3 filterSomatic.py -i filterSomatic.ini).
  5. Filtruj pod kątem mutacji, które są subklonalnie obecne w większości, używając Determine_lowVAF_bulk. Skrypt języka R w terminalu opartym na systemie Unix. Skrypt można znaleźć pod adresem https://github.com/ToolsVanBox/Identify_lowVAF_bulk_muts. Spowoduje to wygenerowanie oddzielnych plików .vcf dla współdzielonych i unikalnych SNV:
    Rscript Determine_lowVAF_bulk. R
    --vcf ścieżka/do/Filter_somatic_output.vcf
    --bulk bulk_name
    --sample_name nazwa-próbki
    --płeć [M|F]
    --out_dir out_dir
  6. Określ wszystkie mutacje wspólne dla klonów, które nie są obecne w próbce zbiorczej, nakładając na siebie wszystkie pozycje mutacji (połącz kolumny 1 i 2 wyjścia SNVFI).
  7. Wyklucz wyniki fałszywie dodatnie uzyskane w krokach 10.5 i 10.6 przez ręczną inspekcję przy użyciu IGV16. Mutacje są uważane za fałszywe, gdy nie są obecne, gdy mutacja jest obecna w linii zarodkowej lub gdy występuje w słabo zmapowanych regionach, patrz Rysunek 7.
    nuta: Zdecydowanie zalecamy ponowne sekwencjonowanie wszystkich współdzielonych loci niezależnie przy użyciu sekwencjonowania ukierunkowanego lub Sangera.
  8. Użyj wspólnych mutacji uzyskanych w krokach 10.1 i 10.2, aby zbudować tabelę binarną mutacji w porównaniu ze zsekwencjonowanymi klonami, gdzie 0 oznacza, że mutacja nie jest obecna, a 1 oznacza obecność mutacji.
  9. Wydrukuj tabelę binarną mutacji, tak jak na mapie cieplnej, wraz z dendrogramem wskazującym relacje linii między komórkami za pomocą R. Mapa cieplna wskazuje stan mutacji dla każdej komórki. Zobacz dane wyjściowe tej funkcji (Rysunek 6).

    Klony <- read.table("Ścieżka/Do/Tabeli_binarnej")

    my_palette <- colorRampPalette(c("#cccccc", "#333333"))(n = 2)
    col_breaks <- c(0,0,5,1)

    heatmap.2(klony, distfun=funkcja(x) dist(x,metoda = 'binarny'),
    hclustfun=funkcja(x) hclust(x,metoda = średnia),
    dendrogram = "kolumna", Rowv = F,
    col=my_palette, breaks=col_breaks,
    trace="brak", density.info="brak")

Wyniki

Procedura eksperymentalna
Schemat eksperymentalny przedstawiono na Rysunku 1. W zależności od rodzaju materiału wejściowego należy postępować zgodnie z różnymi etapami. Na Rysunku 2 przedstawiono wyniki cytometrii przepływowej z sortowania komórek krwi pępowinowej. Najpierw wszystkie komórki monocytyczne są wybierane poprzez wyznaczenie szeroko określonego bramowania (gate) wokół tej populacji. Następnie izoluje się singlety, wybierając komórki o liniowym stosunku FSC-H/FSC-A, ponieważ niższy stosunek FSC-H/FSC-A obejmuje dublety lub skupiska komórek. Niebarwiona próbka kontrolna służy do zdefiniowania bramek sortowania dla lineage-, CD34+, CD38-, CD45RA-. Dodatkowo CD90 i CD49f mogą być wykorzystane do rozróżnienia komórek progenitorowych od komórek macierzystych zdolnych do samoodnowienia17 (Rysunek 2). Sortowanie indeksowane umożliwia śledzenie poszczególnych komórek, a posortowane komórki przedstawiono jako brązowe kropki. Podczas hodowli komórkowej poszczególne klony mogą rozwijać się w różnym tempie – niektóre klony powiększają się w ciągu 3 tygodni, podczas gdy inne osiągają pełną ekspansję dopiero w piątym tygodniu hodowli. Reprezentatywny wzrost kolonii przedstawiono na Rysunku 3A,B. Przedstawiono również reprezentacyjne zdjęcie niemal konfluencyjnej hodowli masowej MSC w 11. dniu po wysiewaniu (Rysunek 3C).

Kontrola jakości po sekwencjonowaniu i analiza mutacji
Przedstawiono przykładowy wynik analizy liczby kopii wygenerowany przez Control-FreeC14 w celu sprawdzenia zmian liczby kopii (Rysunek 4). Informacje kariotypowe mogą wskazać, które chromosomy należy wykluczyć podczas uruchamiania SNVFI (krok 7.6). Wykres VAF stworzony przez SNVFI (Rysunek 5) to histogram częstości wariantowych alleli w próbce. Szczyt na wykresie gęstości przy wartości 0,5 wskazuje, że próbka jest klonalna. Aby uzyskać głębszy wgląd w biologiczne przyczyny mutacji, można je analizować przy użyciu pakietu R MutationalPatterns15. Przedstawiono tutaj typową analizę generującą wykres 96-trinukleotydowy (Rysunek 6). Oprócz kwantyfikacji różnych typów mutacji, narzędzie to umożliwia również ekstrakcję sygnatur.

Konstrukcja drzewa linii rozwojowych
Mutacje wspólne dla klonów lub obecne w klonie (przy niskim VAF) w kontroli linii zarodkowej są walidowane przy użyciu IGV. Mutacje uznaje się za prawdziwe, gdy występują w próbce i nie wykazują wysokich poziomów VAF w linii zarodkowej (Rysunek 7A). Mutacje uznaje się za fałszywe, gdy nie są widoczne w IGV, co może zdarzyć się w regionach o słabym mapowaniu (Rysunek 7B). W innych przypadkach zdarzenia wykryte przez SNVFI są pominiętymi mutacjami linii zarodkowej (Rysunek 7C). W przypadku tych mutacji w wybranych klonach wysoce zalecane jest niezależne ponowne sekwencjonowanie metodą celowaną. Po wykryciu wspólnych mutacji somatycznych między klonami generowana jest macierz binarna (krok 10.8). Konstruowana jest mapa ciepła zawierająca komórki z i bez wspólnych mutacji A-M. Powyżej tej mapy ciepła wskazane jest drzewo linii rozwojowych (Rysunek 8).

Schemat procesu sortowania komórek; etapy: hodowla MSC, izolacja limfocytów T, hodowla klonalna, izolacja DNA.
Rycina 1: Schemat blokowy przedstawiający procedurę eksperymentalną w zależności od materiału wejściowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schematy cytometrii przepływowej przedstawiające sortowanie komórek i statystyki; markery: CD34, CD38, CD90, CD45RA.
Rycina 2: Strategia sortowania komórek. W pierwszej kolejności wykonano bramkowanie dla małych komórek mononuklearnych. Następnie wyselekcjonowano pojedyncze komórki poprzez wybór frakcji liniowej. Następnie wybrano komórki linii negatywnej. Wszystkie komórki CD34+ CD38- CD45- zostały posortowane jako pojedyncze komórki. Należy zwrócić uwagę na frakcję komórek zaznaczoną na brązowo, które są komórkami posortowanymi wyróżnionymi za pomocą opcji „index sorting”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Etapy wzrostu hodowli komórkowej na obrazach mikroskopowych; tworzenie monowarstwy, wizualizacja w kontraście fazowym.
Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki hodowli komórkowych. Reprezentatywne klony HSPC w płytce 384-dołkowej w (A) 2 tygodnie po wysianiu oraz (B) 4 tygodnie po wysianiu. (C) Hodowla MSC po 2 tygodniach wymiany medium. Pasek skali = 100 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres wariacji liczby kopii genów; pozycja genomiczna względem liczby kopii, porównanie zbiorcze HSPC i MSC.
Rycina 4: Kariotypy. (A) Klonalna hodowla HSPC oraz (B) próbka zbiorcza MSC. Kariotypy określono za pomocą analizy głębokości odczytu. Oba wykresy wskazują na próbkę o prawidłowym kariotypie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Histogram częstotliwości alleli wariantowych (VAF), wykres gęstości; analiza zmienności genetycznej, wizualizacja danych.
Rysunek 5: Histogram częstotliwości alleli wariantowych. Histogram częstotliwości alleli wariantowych dla wariantów w klonie przed ostatnim krokiem filtrowania SNVFI (VAF >0,3). Szczyt przy VAF = 0,5 wskazuje, że próbka jest klonalna. Mutacje subklonalne z niskim VAF są wykluczane podczas ostatniego kroku filtrowania SNVFI (VAF >0,3). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy względnego wkładu w różnych kontekstach; geny oznaczone kolorami.
Rysunek 6: Reprezentatywna analiza widma mutacyjnego mutacji somatycznych w próbce HSPC. Przedstawiono względny wkład każdej zmiany trynukleotydowej (w której zmutowana jest zasada środkowa) w całkowite widmo. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki sekwencjonowania genomowego, schemat, porównujący próbkę z kontrolą, wyróżniający mutacje i warianty.
Rycina 7: Manualna inspekcja mutacji przy użyciu IGV16. (A) Mutacje uznaje się za prawdziwe, gdy występują w klonie, a nie w próbce zbiorczej. (B) Mutacje uznaje się za fałszywie dodatnie, gdy występują w regionie słabo zmapowanym. (C) Mutacje uznaje się za fałszywie dodatnie, gdy występują w kontroli linii zarodkowej. Linia pionowa wskazuje pozycję zidentyfikowanej mutacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat analizy skupień; interakcje mutacyjne; wizualizacja danych genetycznych; badanie bioinformatyczne.
Rysunek 8: Konstrukcja drzewa linii rozwojowych. Przedstawiono dendrogram wskazujący linie rozwojowe oddzielające się w trakcie rozwoju. Mapa ciepła pod dendrogramem wskazuje obecność mutacji w różnych klonach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Przedstawiono metodę wykrywania mutacji, które nagromadziły się w ciągu życia u poszczególnych HSPC i skonstruowania wczesnego drzewa linii rozwojowej na podstawie tych danych o mutacjach.

Aby pomyślnie przeprowadzić te testy, należy spełnić kilka krytycznych wymagań. Po pierwsze, należy zapewnić żywotność próbki. Szybkie obchodzenie się z próbką ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia skuteczności procedury. Po drugie, utrata siły działania czynnika wzrostu negatywnie wpłynie na ekspansję klonalną HSPC. Aby zapewnić wysoką moc czynnika wzrostu, ważne jest, aby unikać cykli zamrażania i rozmrażania i przygotowywać jednorazowe porcje. Po trzecie, po wykonaniu WGS, wywoływania mutacji i filtrowania, kluczowe znaczenie ma walidacja klonalności hodowli klonalnej. Aby potwierdzić klonalność hodowli, VAF mutacji powinien skupiać się wokół 0,5 w kariotypowo normalnej próbce (ryc. 3). W komórkach o niskim obciążeniu mutacjami, takich jak HSPC krwi pępowinowej, trudniej jest określić klonalność ze względu na niską liczbę mutacji.

Nasze podejście opiera się na ekspansji in vitro pojedynczych komórek, aby umożliwić WGS. Dlatego nasze podejście jest ograniczone do komórek, które mają potencjał replikacyjny do klonalnej ekspansji, takich jak HSPC. W naszych rękach około 5%-30% wszystkich posortowanych komórek jest w stanie odpowiednio się rozwijać. Zmniejszone tempo wzrostu może potencjalnie skutkować błędem selekcji. Jak omówiono wcześniej, metody wykorzystujące WGA mogą przezwyciężyć to odchylenie selekcyjne, ponieważ technika ta nie opiera się na ekspansji komórek. Jednak WGA ma swoje własne wady, a amplifikacja klonalna pozostaje jedyną metodą dokładnego określenia liczby mutacji w całym genomie bez alleli i równego pokrycia wzdłuż genomu, szczególnie w próbkach o niskiej prawdziwej liczbie mutacji somatycznych.

Dane wygenerowane przy użyciu tego podejścia można wykorzystać do określenia filogenezy układu krwiotwórczego, ponieważ mutacje wykryte w pojedynczych komórkach można wykorzystać do analizy linii komórkowych, jak pokazano na rycinie 6. Zazwyczaj jedna lub dwie mutacje mogą zdefiniować każdą gałąź u zdrowego dawcy1. Ponieważ linie rozgałęziają się wcześnie po zapłodnieniu, mutacje definiujące te pierwsze gałęzie będą również obecne z niskim VAF w dopasowanej normalnej próbce, która została użyta do filtrowania wariantów linii zarodkowej 1,18,19. W takim przypadku preferowane jest stosowanie komórek niehematopoetycznych, takich jak MSC, ponieważ oczekuje się, że oddzielą się one bardzo wcześnie w trakcie rozwoju od układu krwiotwórczego. Ponieważ limfocyty T są pochodzenia krwiotwórczego, użycie tych komórek jako dopasowanej normalnej próbki do filtrowania wariantów linii zarodkowej może zatem zakłócić konstrukcję najwcześniejszego rozgałęzienia drzewa linii rozwojowej. Subklonalna obecność mutacji specyficznych dla gałęzi w niektórych dojrzałych populacjach krwi, które można zmierzyć za pomocą ukierunkowanego głębokiego sekwencjonowania, wskaże, że potomstwo tej gałęzi może dać początek temu dojrzałemu typowi komórek. Ponadto nasze podejście pozwala ocenić konsekwencje mutatywne ekspozycji na mutageny in vivo i ostatecznie, w jaki sposób może to przyczynić się do rozwoju białaczki.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie zostało wsparte grantem VIDI Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO) (nr 016.Vidi.171.023) dla R. v. B.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,20 &mikro; m filtr strzykawkowyCorning431219
50 ml Strzykawka, Luer lockBD613-3925
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA9647-50G
CD11c FITCBioLegend301603Clone 3.9
CD16 FITCBioLegend302005Clone 3G8
CD3 BV650Biolegend300467Clone UCHT1
CD34 BV421BioLegend343609561
CD38 PEBioLegend303505Clone HIT2
CD45RA PerCP/Cy5.5BioLegend304121Clone HI100
CD49f PE/Cy7BioLegend313621Clone GoH3
CD90 APCBioLegend328113Clone 5E10
Sitko do komórek 5 mlCorning
Płyta CELLSTAR, 384w, 130 µ L, F-bottom, TC, pokrywaGreiner781182
Fiolka kriogenicznaCorning430487
dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD2650
DMEM/F12ThermoFisher61965059
EDTASigma-AldrichE4884-500G
Płodowa surowica bydlęcaThermoFisher10500
GlutaMAXThermoFisher25030081
Human Flt3-Ligand, premiumklasy Miltenyi Biotech130-096-479Rekonstytut w jednorazowych podwielokrotnościach (25 μ L) przy 100 μ g/ml w 0,1% BSA w PBS
Ludzka rekombinowana IL-3 (z ekspresją E. coli)Stem Cell Technologies78040.1Rekonstytuta w podwielokrotnościach jednorazowego użytku (2,5 μ L) przy 100 μ g/ml w 0,1% BSA w PBS
Ludzka rekombinowana IL-6 (z ekspresją E. coli)Technologie komórek macierzystych78050.1Rekonstytucja w podwielokrotnościach jednorazowego użytku (5 μ L) przy 100 μ g / ml w 0,1% BSA w PBS
Human SCF, premium klasaMiltenyi Biotech130-096-695Rekonstytut w podwielokrotnościach jednorazowego użytku (25 μ L) przy 100 μ g / ml w 0,1% BSA w PBS
Human TPO, premium klasyMiltenyi Biotech130-095-752Rekonstytut w jednorazowych podwielokrotnościach (12,5 μ L) przy 100 μ g / ml w 0,1% BSA w PBS
Integrative Genomics Viewer 2.4Broad Institutehttps://software.broadinstitute.org/software/igv/download
ThermoFisher12440061Iscove'a Eagle's Medium
(CD3/14/19/20/56) Klony FITCBioLegend348701: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56
Technologie komórek macierzystychLymphoprep#07861Używany do separacji gradientu gęstości
PBSWykonany w zakładzie Instytutu. Komercyjnie dostępny PBS może być również stosowany
Penicylina-StreptomycynaThermoFisher15140122
PrimocinInvivogenant-pm-1Preparat antybiotykowy
QIAamp DNA Micro KitQiagen56304
Fluorometr Qubit 2.0ThermoFisherQ32866
Zestaw testowy Qubit dsDNA HSThermoFisherQ32854
RNAzywa AQiagen19101
SH800S Sorter komórekSonySH800S
StemSpan SFEM, 500 mLStem Cell Technologies9650
TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTAG-Biosciences786-151
TrypLE ExpressThermoFisher12605-10
352235Zmodyfikowana linia

Bibliografia

  1. Osorio, F. G., et al. Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis. Cell Reports. 25, 2308-2316 (2018).
  2. Genovese, G., et al. Clonal Hematopoiesis and Blood-Cancer Risk Inferred from Blood DNA Sequence. New England Journal of Medicine. 371, 2477-2487 (2014).
  3. Jaiswal, S., et al. Age-Related Clonal Hematopoiesis Associated with Adverse Outcomes. New England Journal of Medicine. 371, 2488-2498 (2014).
  4. Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. Clonal haematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults. Nature Communications. 7, 1-7 (2016).
  5. Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., Wedge, D. C., Campbell, P. J., Stratton, M. R. Deciphering Signatures of Mutational Processes Operative in Human Cancer. Cell Reports. 3, 246-259 (2013).
  6. Alexandrov, L. B., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500, 415-421 (2013).
  7. Alexandrov, L., et al. The Repertoire of Mutational Signatures in Human Cancer. bioRxiv. , (2018).
  8. Behjati, S., et al. Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes. Nature. 513, 422-425 (2014).
  9. Blokzijl, F., et al. Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life. Nature. 538, 260-264 (2016).
  10. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: Current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17, 175-188 (2016).
  11. Dong, X., et al. Accurate identification of single-nucleotide variants in whole-genome-amplified single cells. Nature Methods. 14, 491-493 (2017).
  12. Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia. Cell. 150, (2012).
  13. Jager, M., et al. Measuring mutation accumulation in single human adult stem cells by whole-genome sequencing of organoid cultures. Nature Protocols. 13, 59-78 (2018).
  14. Boeva, V., et al. Control-FREEC: A tool for assessing copy number and allelic content using next-generation sequencing data. Bioinformatics. 28, 423-425 (2012).
  15. Blokzijl, F., Janssen, R., van Boxtel, R., Cuppen, E. MutationalPatterns: Comprehensive genome-wide analysis of mutational processes. Genome Medicine. 10, 1-11 (2018).
  16. Thorvaldsdóttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): High-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14, 178-192 (2013).
  17. Notta, F., et al. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science. , (2011).
  18. Lee-Six, H., et al. Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations. Nature. 561, 473-478 (2018).
  19. Behjati, S., et al. Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes. Nature. , (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

hematopoetyczne kom rki macierzystesekwencjonowanie ca ego genomuhodowla klonalnamutacje somatycznesortowanie kom rekcytometria przep ywowacz sto wyst powania wariantu allelicznegoanaliza sygnatur mutacyjnychIntegrative Genomic Viewermacierz binarna
Charakterystyka ładunku mutacyjnego i składu klonalnego krwi ludzkiej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.