Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Bezpośredni nokaut genów nerwowych komórek macierzystych rdzenia kręgowego aksolotla poprzez elektroporację kompleksów białko-gRNA CAS9

7.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59850

⸱

9 lipca 2019

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, South China Normal University, 2The Research Institute of Molecular Pathology (IMP), Vienna Biocenter (VBC), 3Institute for Brain Research and Rehabilitation (IBRR), South China Normal University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół do przeprowadzenia ograniczonego czasowo i przestrzennie nokautowania genów w rdzeniu kręgowym aksolotla poprzez wstrzyknięcie kompleksu CAS9-gRNA do kanału centralnego rdzenia kręgowego, a następnie elektroporację.

Streszczenie

Aksolotl posiada unikalną zdolność do pełnej regeneracji swojego rdzenia kręgowego. Wynika to w dużej mierze z tego, że komórki wyściółki pozostają przez całe życie jako nerwowe komórki macierzyste (NSC), które namnażają się, aby zreformować cewkę wyściółkową i różnicować się w utracone neurony po urazie rdzenia kręgowego. Rozszyfrowanie, w jaki sposób te NSC zachowują pluripotencję po rozwoju i namnażają się po urazie rdzenia kręgowego w celu zreformowania dokładnej struktury przed urazem, może dostarczyć cennych informacji na temat tego, jak rdzenie kręgowe ssaków mogą się regenerować, a także potencjalnych opcji leczenia. Przeprowadzenie nokautów genów w określonych podzbiorach NSC w ograniczonym czasie pozwoli na badanie mechanizmów molekularnych stojących za tymi procesami regeneracyjnymi, bez zakłóceń spowodowanych efektami zakłócającymi rozwój. Opisano tutaj metodę wykonywania nokautu genów w NSC rdzenia kręgowego aksolotla przy użyciu systemu CRISPR-Cas9. Poprzez wstrzyknięcie kompleksu CAS9-gRNA do kanału centralnego rdzenia kręgowego, a następnie elektroporację, docelowe geny są eliminowane w NSC w określonych obszarach rdzenia kręgowego w pożądanym punkcie czasowym, co pozwala na badania molekularne NSC rdzenia kręgowego podczas regeneracji.

Wprowadzenie

Rdzeń kręgowy większości kręgowców nie jest w stanie zregenerować się po urazie, co prowadzi do trwałego kalectwa. Kilka salamander, takich jak aksolotl, jest godnymi uwagi wyjątkami. Aksolotl może w pełni zregenerować strukturalnie identyczny rdzeń kręgowy i całkowicie przywrócić funkcję rdzenia kręgowego. Duża część zdolności regeneracyjnych rdzenia kręgowego aksolotla wynika z komórek wyściółki. Komórki te wyściełają kanał centralny i w przeciwieństwie do tych u ssaków, komórki wyściółki aksolotla pozostają jako nerwowe komórki macierzyste (NSC) po rozwoju embrionalnym. Po urazie rdzenia kręgowego (np. w wyniku amputacji ogona) te NSC namnażają się, aby odrosnąć rurkę wyściółkową i różnicować się, zastępując utracone neurony1,2,3. Odkrycie, w jaki sposób NSC rdzenia kręgowego aksolotla pozostają pluripotencjalne i aktywują się po urazie, może dostarczyć cennych informacji na temat opracowywania nowych strategii terapeutycznych dla pacjentów.

Dzięki postępom w technice nokautowania genów CRISPR-Cas9, wykonywanie nokautów w celu rozszyfrowania funkcji genu stało się łatwiejsze i okazało się, że ma szerokie zastosowanie u różnych gatunków, w tym aksolotlów4,5,6,7,8. Niedawne wydanie pełnego genomu aksolotla i transkryptomu pozwala teraz na ukierunkowanie dowolnego locus genomowego i lepszą ocenę efektów poza celem9,10,11,12,13,14. Opracowano zoptymalizowane protokoły nokautowania i wbijania aksolotli przy użyciu systemu CRISPR-Cas915. Wykazano, że dostarczanie maszynerii CRISPR-Cas9 w postaci rybonukleoproteiny białkowej CAS9-gRNA (RNP) jest bardziej wydajne niż przy użyciu plazmidów kodujących Cas9 i gRNA4. Jest to prawdopodobnie spowodowane tym, że RNP jest mniejszy niż wektory plazmidowe, jego zdolność do natychmiastowego tworzenia pęknięć DNA i chroni gRNA przed degradacją RNA. Ponadto użycie RNP omija transkrypcję i translację; W ten sposób unika się problemów, takich jak siła promotora i optymalne wykorzystanie kodonów, gdy elementy plazmidowe pochodzą z innego gatunku.

Badania nad utratą funkcji są jednym z ogólnych podejść do badania potencjalnych funkcji interesujących genów. W celu zbadania funkcji genów podczas regeneracji, najlepiej byłoby wykonać nokaut tuż przed kontuzją, aby uniknąć wpływu na rozwój. Ponadto nokaut powinien być ograniczony zarówno do NSC, jak i do regionu regeneracji. Wyeliminowanie docelowego genu we wszystkich NSC (w tym w mózgu, co ma miejsce w systemach Cre-LoxP) może wywołać efekty niezwiązane z regeneracją, które mogą zakłócić interpretację wyników. Na szczęście struktura rdzenia kręgowego aksolotla stwarza wyjątkową okazję do nokautowania w NSC w czasie i przestrzeni. Większość NSC rdzenia kręgowego styka się z kanałem centralnym i stanowi zdecydowaną większość komórek stykających się z kanałem centralnym16,17. Dlatego wstrzyknięcie kompleksu CAS9-gRNA do kanału centralnego, a następnie elektroporacja, umożliwia dostarczenie do NSC rdzenia kręgowego w żądanym regionie w określonym czasie4,18,19. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób jest to wykonywane, co prowadzi do wysoce penetrującego nokautu w docelowych NSC rdzenia kręgowego. Następnie przeprowadza się dalszą analizę w celu zbadania wpływu na regenerację i zachowanie NSC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach muszą być przeprowadzane zgodnie z lokalnymi i krajowymi przepisami dotyczącymi doświadczeń na zwierzętach oraz za zgodą odpowiedniej instytucjonalnej komisji rewizyjnej.

1. Przygotowanie mieszanki CAS9-gRNA RNP

  1. Projektowanie i synteza gRNAs.
    UWAGA: Zapoznaj się z innymi publikacjami dotyczącymi projektowania i syntezy gRNA, w tym jedną dotyczącą wyłącznie aksolotlów15,20,21,22.
  2. Białko CAS9-NLS można uzyskać, przygotowując je we własnym zakresie lub kupując je komercyjnie.
  3. Przygotować mieszaninę CAS9-gRNA, mieszając 5 μg białka CAS9-NLS, 4 μg gRNA, 0,9 μl buforu 10x CAS9 i uzupełnić objętość do 10 μl wolnym od nukleazH2O. Podwielokrotnić mieszaninę i przechowywać w temperaturze -80 °C, jeśli nie zostanie natychmiast zużyta.

2. Przygotowanie płytek agarozowych do elektroporacji

  1. Przygotować 200 ml 2% (wag./obj.) roztworu agarozy w 1x DPBS. Rozpuść przez podgrzanie roztworu w kuchence mikrofalowej i wylej go na 10 cm szalki Petriego na głębokość około 10 mm (na tyle głęboko, aby przykryć całe zwierzę).
  2. Pozwól płytkom zastygnąć w temperaturze pokojowej. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C, jeśli nie zostaną natychmiast użyte.
  3. Za pomocą skalpeli chirurgicznych przetnij płytkę agarozy, aby zrobić szczelinę do trzymania ogona prosto, studzienkę do dopasowania do ciała zwierzęcia i dwie dodatkowe studzienki do umieszczenia elektrod (Rysunek 1E).
  4. Umieść talerz na lodzie i napełnij go po brzegi lodowatym 1x DPBS. Użyj tego samego rozwiązania DPBS do wykonania płyt, aby zapewnić stałą przewodność elektryczną w konfiguracji.

3. Konfiguracja elektroporatora

  1. Skonfiguruj elektroporator. Ustaw impuls poringowy tak, aby składał się z jednego impulsu bipolarnego o napięciu 70 V, o czasie trwania 5 ms, interwale 50 ms i bez zaniku napięcia. Ustaw impuls przesyłowy tak, aby miał cztery impulsy bipolarne 40 V, o czasie trwania 50 ms, interwale 999 ms i 10% zaniku napięcia.
  2. Podłącz elektrody do elektroporatora i wyreguluj pęsetę tak, aby była oddalona od siebie o 7 mm. Zanurz elektrody w zlewce DPBS przed i pomiędzy elektroporacją.

4. Przygotowanie i ładowanie szklanych kapilar do mikroiniekcji

  1. Wykonaj test rampy na płonącym/brązowym ściągaczu do mikropipet zgodnie z instrukcjami producenta, aby określić wartość cieplną.
  2. Ciągnąć kapilary iniekcyjne ze stożkowymi końcami, stosując następujące parametry: ciepło = wartość testu rampy, ciągnięcie = 100, prędkość = 100, czas = 100.
  3. Obserwuj igłę pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą drobnych kleszczyków przełam kapilarnę pod kątem, tak aby miała skośną końcówkę. Złam w miejscu, w którym jest wystarczająco cienka, aby celować w kanał centralny, a jednocześnie wystarczająco mocna, aby przebić skórę.
    UWAGA: Punkt, w którym średnica wynosi około 20 μm lub około 50% średnicy rdzenia kręgowego, jest dobrym punktem wyjścia. Aby uzyskać optymalne łamanie, może być konieczne wiele prób.
  4. Dodać roztwór Fast Green FCF do mieszanki RNP w stosunku 1:30 i załadować około 5 μl mieszanki iniekcyjnej do kapilary za pomocą końcówki do pipety Microloader.
  5. Zamontuj kapilar na pompie pneumatycznej, ze skośną końcówką skierowaną w dół.

5. Konfiguracja pompy pneumatycznej

  1. Skonfiguruj pompę pneumatyczną. Ustaw blokadę na 0,5 funta na cal kwadratowy (psi), wysuń na 2 psi, a czas trwania na bramkowany.
  2. Przetestuj ustawienia pompy kapilarnej i pneumatycznej, zanurzając kapilar w kropli wody i naciskając pedał nożny w celu wstrzyknięcia. Upewnij się, że mieszanina iniekcyjna wypływa powolnym, ale stałym strumieniem.
  3. Wyregulować ciśnienie podtrzymania, jeśli mieszanina iniekcyjna zaczyna samoistnie wyciekać lub woda jest zasysana do kapilary. Zwiększyć ciśnienie wyrzutu lub rozbić większą część kapilary, jeśli mieszanina iniekcyjna wypływa zbyt wolno. Zmniejszyć ciśnienie wyrzutu, jeśli wtrysk wypływa zbyt szybko.

6. Wstrzykiwanie mieszanki RNP do rdzenia kręgowego

  1. Znieczulaj aksolotle w 0,03% roztworze benzokainy przez co najmniej 10 minut. Sprawdź, czy zwierzęta nie reagują, przewracając je do góry nogami w wodzie.
  2. Podnieś zwierzę za pomocą kleszczy pierścieniowych i połóż je na łóżku z silikonu, lewą stroną zwierzęcia skierowaną do góry i ogonem skierowanym w prawo. Umieść miejsce wstrzyknięcia w środku pola widzenia mikroskopu stereoskopowego (Rysunek 1A).
  3. Ustaw mikromanipulator tak, aby kapilar wchodził pod kątem 60° z prawej strony pola widzenia (Rysunek 1B).
  4. Zidentyfikuj rdzeń kręgowy i kanał centralny (Rysunek 1C).
    UWAGA: Rdzeń kręgowy to struktura rurkowa nad struną grzbietową.
  5. Kierując się do kanału centralnego, przesuń naczynia włosowate do przodu, aby delikatnie przebić skórę i mięsień do centralnego kanału rdzenia kręgowego. Ogranicz ruch naczyń włosowatych do małych kroków, ponieważ rdzeń kręgowy znajduje się tuż pod mięśniami ogona.
  6. Naciśnij i przytrzymaj pedał nożny, aby wstrzyknąć mieszankę do kanału centralnego. Obserwuj, czy mieszanina RNP rozprzestrzenia się wzdłuż kanału centralnego jako niebieska linia w obu kierunkach, co pokazuje, że kapilara została prawidłowo ustawiona (Rysunek 1D).
  7. Jeśli tak się nie stanie, przytrzymaj pedał nożny, jednocześnie lekko przesuwając kapilarnę do środka i na zewnątrz, aż mieszanina RNP zacznie wchodzić do środka. Jeśli naczynia włosowate zostaną zatkane przez tkankę, oczyść ją, wyrzucając do wody pod wyższym ciśnieniem.
  8. Dostosuj ciśnienie wyrzutu tak, aby było wystarczające, aby mieszanina RNP rozprzestrzeniła się w kanale centralnym, ale nie na tyle, aby wysadziła konstrukcję.
  9. Przytrzymaj pedał nożny, tak aby mieszanina iniekcyjna rozprowadzała się dalej wzdłuż kanału centralnego, aż dotrze do pęcherzyka końcowego na końcu rdzenia kręgowego i komór w mózgu.
    UWAGA: Może to potrwać do 2 minut w zależności od wielkości zwierzęcia. Po pewnym czasie może być konieczne zwiększenie ciśnienia, aby mieszanina RNP dostała się do komór mózgu.
  10. Po udanym wstrzyknięciu należy jak najszybciej przystąpić do elektroporacji.

7. Elektroporacja

  1. Przenieść zwierzę za pomocą kleszczy pierścieniowych na przygotowaną płytkę do elektroporacji agarozy (Rysunek 1E) na lodzie. Umieść ogon w szczelinie tak, aby był umieszczony w warstwie agarozy (Rysunek 1F).
  2. Umieść elektrody w studzienkach po obu stronach ogona. Upewnij się, że całe zwierzę i elektrody są pokryte lodowatym PBS.
  3. Naciśnij przełącznik nożny, aby rozpocząć elektroporację.
  4. Po zakończeniu elektroporacji włóż zwierzę z powrotem do wody.
  5. W razie potrzeby należy wstrzyknąć więcej zwierząt.
  6. Sprawdź, czy elektroporowane zwierzęta są zdrowe po ustąpieniu znieczulenia i czy nie ma uszkodzeń ogona.

8. Ocena skuteczności nokautu

  1. Napraw ogon zwierzęcia poddanego elektroporacji. Wykonaj przekroje ogona, a następnie barwienie immunohistochemiczne, aby ocenić skuteczność nokautu na poziomie białka.
    UWAGA: Jeśli amputacja ogona ma być wykonana po elektroporacji, można do tego celu użyć odciętego ogona. Na przykład zwierzęta poddane elektroporacji gRNA przeciwko Gfp lub tyrozynazie mogą być używane jako kontrola negatywna4.
  2. Alternatywnie, elektroporowany rdzeń kręgowy może zostać wyekstrahowany i poddany lizie w celu uzyskania DNA. Wykonaj genotypowanie PCR, a następnie sekwencjonowanie Sangera lub sekwencjonowanie nowej generacji, aby ocenić procent edytowanych loci15.
    UWAGA: Wynikowa wydajność edycji będzie zaniżona rzeczywista wydajność edycji dla NSC, ze względu na włączenie nieelektroporowanych komórek i neuronów, które nie mają wierzchołkowego kontaktu z centralnym światłem, a zatem nie otrzymają mieszanki RNP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Iniekcja i elektroporacja kompleksu CAS9-gRNA przeciwko Sox2 do kanału centralnego rdzenia kręgowego aksolotla doprowadziły do masowej utraty immunoreaktywności SOX2 w większości NSCs rdzenia kręgowego, przy zastosowaniu gRNA przeciwko tyrozynazie (Tyr) jako kontroli (Rycyna 2A). B3-tubulina (barwiona TUJ1) jest markerem neuronów i nie była wyrażana w NSCs, a komórki SOX2- TUJ1- otaczające kanał centralny uznano za komórki z delecjami Sox2. Ilościowa analiz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany protokół pozwala na ograniczony czasowo i przestrzennie nokaut genów w NSC w rdzeniu kręgowym aksolotl. Obecny protokół pozwala na precyzyjne namierzanie NSC w określonym czasie i miejscu z wysoką penetracją. Pozwala to uniknąć potencjalnych działań niepożądanych wynikających z nokautu genów w NSC w innych regionach, takich jak mózg, które występują podczas korzystania z systemu Cre-LoxP. Pozwala to również uniknąć skutków rozwojowych wynikających z uporczywego nokautu, co pozwala na badanie funkcji genów skoncen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Prof. Elly M. Tanaka za jej ciągłe i długoterminowe wsparcie. Praca ta była wspierana przez grant (317716) Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC), granty na rozpoczęcie badań z South China Normal University (S82111 i 8S0109) oraz grant China Postdoctoral Science Foundation (2018M633067).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarozaSigma-AldrichA9539
BenzokainaSigma-AldrichE1501-100G
Benzokaina 0,03 % (wag./vol)Wymieszać 500 ml 10&razy; TBS, 500 ml 400% (wag./obj.) Holtfreter' s i 30 ml 10% (wag./obj.) roztworu podstawowego benzokainy. Napełnić objętość do 10 l dH2O. Roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej do 6 miesięcy.
Benzokaina 10 % (wag./obj.)Zmieszać 50 g benzokainy w 500 ml 100% (obj./obj.) etanolu. Roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej do 12 miesięcy.
Kapilary ze szkła borokrzemianowego 1,2 mm średnica zewnętrzna, średnica wewnętrzna 0,94 mmInstrument jąkający się BF120-94-8
CaCl2· 2H2OMerck102382
bufor CAS9, 10xMix 200 mM HEPES i 1,5 M KCl w wodzie wolnej od RNaz. Dostosuj pH do 7,5. Filtrować sterylizować, porcjować i przechowywać w temperaturze − 20 &stopni; C przez okres do 24 miesięcy
białko CAS9-NLS   PNA BioCP03
Szalki do hodowli komórkowych, 10cmFalcon351029
Dumont #5 - Kleszcze drobneFine Scientific Instruments11254-20
ElektroporatorNepa Gene NEPA21
BEXCUY21EDIT II
Fast Green FCFSigma-AldrichF7252-5G
Fast Green FCF Solution, 5xRozpuść 12,5 mg proszku Fast Green FCF w 10 ml 1&razy; Pbs.
Ściągacz do mikropipet płonących/brązowych Instrument jąkający się P-97
Holtfreter' Roztwór S 400% (wag./obj.) Rozpuścić 11,125 g MgSO4· 7H2O, 5,36 g CaCl2· 2H2O, 158,4 g NaCl i 2,875 g KCl w 10 l dH2O. Roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej do 6 miesięcy.
KClMerck104936
MgSO4· 7H2OKońcówki105886
MicroloaderEppendorf5242956003
Micromanipulator NarishigeMN-153 
NaClMerck106404
Pneumatyczna pompa PicoPumpWorld Precision Instruments SYS-PV830
Kleszcze pierścienioweFine Scientific Instruments11103-09
Mikroskop stereoskopowyOlympusSZX10 
Tris baseSigma-AldrichT6066
Tris-buforowana sól fizjologiczna, 10xRozpuść 24,2 g zasady Tris i 90 g NaCl w 990 ml dH2O. Dostosuj pH do 8,0, dodając 10 ml HCl o stężeniu 37% (obj. / obj.). Roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej do 6 miesięcy.
Pęseta z 2-okrągłą elektrodą platynową o zmiennej szczelinie, średnica 10 mmNepa Gene 
Generator impulsów do pipet Merck CUY650P10

Bibliografia

  1. O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression. Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).
  2. Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres. Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).
  3. Nordlander, R. H., Singer, M. The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail. Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).
  4. Fei, J. F., et al. Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein–gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration. npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002(2016).
  5. Fei, J. F., et al. CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration. Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).
  6. Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).
  7. Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, (2017).
  8. Fei, J. -F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).
  9. Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).
  10. Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
  11. Smith, J. J., et al. A chromosome-scale assembly of the axolotl genome. Genome Research. 373548, (2019).
  12. Smith, J. J., et al. Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources. BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).
  13. Campbell, L. J., et al. et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).
  14. Stewart, R., et al. Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in. the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).
  15. Fei, J. -F., et al. Application and optimization of CRISPR–Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum). Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).
  16. Holder, N., et al. Continuous growth of the motor system in the axolotl. Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).
  17. Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration. Developmental Biology. 432 (1), 63-71 (2017).
  18. Albors, A. R., Tanaka, E. M. High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).
  19. Albors, A. R., et al. et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration. eLife. 4, 1-29 (2015).
  20. Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  21. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
  22. Graham, D. B., Root, D. E. Resources for the design of CRISPR gene editing experiments. Genome Biology. 16 (1), 260(2015).
  23. Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

CRISPR-Cas9kompleks Cas9-gRNAiniekcja do kanału centralnegoanaliza immunohistochemicznaPCR genotypującysekwencjonowanie metodą Sangera
Bezpośredni nokaut genów nerwowych komórek macierzystych rdzenia kręgowego aksolotla poprzez elektroporację kompleksów białko-gRNA CAS9
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.