Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Tworzenie sferoid ludzkich komórek więzadeł przyzębia na błonach chitozanu

5.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59855

⸱

19 czerwca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Periodontology, School & Hospital of Stomatology, Tongji University, Shanghai Engineering Research Center of Tooth Restoration and Regeneration, 2Department of Periodontology, Dental Diseases Prevention & Treatment Center of Jiading District, 3College of Materials Science and Engineering, Tongji University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli sferoidów komórek ludzkiego więzadła przyzębia (PDL) za pomocą filmów chitozanowych. Hodowla trójwymiarowych (3D) sferoid komórkowych stanowi alternatywę dla konwencjonalnego systemu hodowli polistyrenowych do hodowli tkankowych (TCPS).

Streszczenie

Komórki więzadła przyzębia (PDL) są bardzo obiecujące dla regeneracji tkanek przyzębia. Tradycyjnie komórki PDL są hodowane na dwuwymiarowych (2D) podłożach, takich jak polistyren do hodowli tkankowych (TCPS). Jednak podczas hodowli in vitro zaobserwowano charakterystyczne zmiany w komórkach PDL. Zjawisko to wynika prawdopodobnie z tego, że TCPS 2D różni się od trójwymiarowego (3D) mikrośrodowiska in vivo. W porównaniu z komórkami hodowanymi na podłożach 2D, komórki hodowane w mikrośrodowisku 3D wykazują więcej podobieństw do komórek in vivo. Dlatego modele 3D hodowli komórkowych stanowią obiecującą alternatywę dla konwencjonalnej jednowarstwowej hodowli komórkowej 2D. Aby ulepszyć konwencjonalne modele hodowli komórkowych PDL, opracowaliśmy niedawno metodę hodowli komórek 3D, która opiera się na sferoidalnym tworzeniu komórek PDL na warstwach chitozanu. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły hodowli sferoidów komórkowych oparte na filmach chitozanowych. System hodowli 3D sferoid komórkowych PDL pokonuje niektóre ograniczenia związane z konwencjonalną jednowarstwową hodowlą komórkową 2D, a zatem może być odpowiedni do wytwarzania komórek PDL o zwiększonej skuteczności terapeutycznej dla przyszłej regeneracji tkanek przyzębia.

Wprowadzenie

Zapalenie przyzębia, inicjowane głównie przez płytkę nazębną1, charakteryzuje się uszkodzeniem tkanek przyzębia, w tym więzadła przyzębia (PDL), kości wyrostka zębodołowego i cementu. Obecne metody leczenia zapalenia przyzębia są zwykle skuteczne w zapobieganiu postępowi aktywnej choroby, ale regeneracja utraconych tkanek przyzębia pozostaje wyzwaniem klinicznym. Ostatnio poczyniono znaczne postępy w metodach regeneracji tkanek przyzębia opartych na komórkach, aby przezwyciężyć wady obecnych metod leczenia2,3,4.

Nasz poprzedni przegląd systematyczny wykazał, że komórki PDL wykazują duży potencjał do regeneracji przyzębia5. Tradycyjnie komórki PDL są hodowane na dwuwymiarowych (2D) podłożach, takich jak polistyren do hodowli tkankowych (TCPS). Jednak charakterystyczne zmiany w komórkach PDL zaobserwowano podczas hodowli in vitro6. Zjawisko to wynika prawdopodobnie z tego, że TCPS 2D różni się od trójwymiarowego (3D) mikrośrodowiska in vivo7. W porównaniu z komórkami hodowanymi na podłożach 2D, komórki hodowane w mikrośrodowisku 3D wykazują więcej podobieństw do komórek in vivo8. Dlatego modele 3D hodowli komórkowych stanowią obiecującą alternatywę dla konwencjonalnej jednowarstwowej hodowli komórkowej 2D.

Konwencjonalna metoda hodowli 3D polega na zamknięciu komórek w biomateriałach 3D. W porównaniu z komórkami zamkniętymi w biomateriałach 3D, sferoidy komórkowe bardziej naśladują sytuację in vivo, ponieważ sferoidy są agregatami komórek rosnących bez ciał obcych9,10,11,12. Doniesiono, że sferoidy komórkowe promowały bioaktywność MSC poprzez zachowanie składników macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), w tym fibronektyny i lamininy13. Aby ulepszyć konwencjonalne modele hodowli komórkowych PDL, niedawno opracowaliśmy metodę hodowli komórek 3D PDL, która opiera się na sferoidalnym tworzeniu komórek PDL na foliach chitozanowych14. Tworzenie sferoidów zwiększyło zdolność komórek PDL do samoodnawiania się i różnicowania osteogennego14. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły hodowli sferoidów komórek PDL oparte na filmach chitozanowych. System hodowli 3D sferoid komórkowych PDL przezwycięża niektóre niedociągnięcia związane z konwencjonalną hodowlą komórkową TCPS, a zatem może być odpowiedni do wytwarzania komórek PDL o zwiększonej skuteczności terapeutycznej dla przyszłej regeneracji tkanek przyzębia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół badania został zatwierdzony przez Komisję Etyki Szkoły i Szpitala Stomatologicznego, Uniwersytet Tongji. Wszyscy pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę.

1. Izolacja komórek PDL

  1. Przygotuj pożywkę proliferacyjną do hodowli komórek PDL: pożywkę α-MEM uzupełnioną 10% FCS i 100 U / ml pióra / paciorkowca.
  2. Przygotuj pojemnik z lodem do przenoszenia izolowanych trzecich zębów trzonowych.
  3. Sterylizuj narzędzia chirurgiczne za pomocą autoklawu.
  4. Ekstrakcja normalnych trzecich zębów trzonowych dotkniętych chorobą człowieka od dorosłych (w wieku 18-28 lat) w Klinice Dentystycznej Szkoły i Szpitala Stomatologicznego Uniwersytetu Tongji.
  5. Umieścić trzecie zęby trzonowe w pożywce proliferacyjnej i przenieść do laboratorium w temperaturze 4 °C.
  6. Umieść usunięty ząb na sterylnej szalce Petriego o średnicy 100 mm, pracując w kapturze z przepływem laminarnym.
  7. Dodaj 10 ml PBS, aby umyć usunięty ząb. Powtórz krok prania dwukrotnie.
  8. Za pomocą sterylnego skalpela delikatnie oddziel PDL od korzenia.
    UWAGA: PDL należy zeskrobać ze środkowej trzeciej części korzenia, aby uniknąć zanieczyszczeń z tkanek dziąseł lub wierzchołkowych.
  9. Zmiel PDL na 1-2 mm fragmenty za pomocą wysterylizowanego ostrza skalpela.
  10. Umieść fragmenty PDL w kolbie hodowlanej T-25, wypełnionej 3-4 ml pożywki proliferacyjnej.
  11. Wyhodować próbki w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 z wilgotnym powietrzem.
  12. Zaobserwowano zmianę pożywki hodowlanej po wyrośnięciu komórek PDL. Zwykle potrzeba 1-2 tygodni na wyrośnięcie komórek PDL. Obserwuj wzrost komórek PDL za pomocą mikroskopu kontrastowego z odwróconymi fazami.
  13. Następnie zmieniaj pożywkę hodowlaną dwa razy w tygodniu.
  14. Gdy komórki PDL osiągną konfluencję, subhodowla komórek w stosunku 1:4 (pasaż 1).
  15. Obserwuj wzrost komórek codziennie i zmieniaj pożywkę hodowlaną dwa razy w tygodniu.
  16. Wykonuj każde kolejne przejście w stosunku 1:4 po osiągnięciu przez komórki 80% zbieżności. Użyj komórek PDL od trzeciej do piątej generacji do wysiewu komórek.

2. Przygotowanie filmów chitozanowych

  1. W celu przygotowania 1% (v/v) roztworu kwasu octowego dodać 5 ml kwasu octowego do 495 ml podwójnie destylowanej wody w czystej szklanej zlewce.
  2. W celu przygotowania 1% w/v roztworu chitozanu odważyć 5 g proszku chitozanu (średnia masa cząsteczkowa 400 kDa, 85% stopień acetylacji) i dodać do 495 ml 1% (v/v) roztworu kwasu octowego.
  3. Mieszać przygotowany roztwór przez 24 godziny za pomocą mieszadła i magnetycznej płytki mieszającej w temperaturze 60 °C.
  4. Przygotowany roztwór należy sterylizować w autoklawie, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie chitozanu.
    UWAGA: Na tym etapie eksperyment można wstrzymać.
  5. Aby utworzyć warstwy chitozanu, dodaj 1% w/v roztworu chitozanu do naczyń z polistyrenu do kultur tkankowych (TCPS) w ilości 0,25 ml/cm2. Na przykład dodać 0,5 ml 1% w/v roztworu chitozanu do jednego dołka z 24-dołkową płytką.
  6. Suszyć naczynia TCPS w piekarniku w temperaturze 60 °C przez 24 godziny, aby utworzyć film chitozanowy.
  7. Przygotować 0,5 N wodorotlenku sodu (NaOH). Wymieszaj 10 g NaOH, po trochu, z dużą objętością podwójnie destylowanej wody za pomocą mieszadła magnetycznego, a następnie rozcieńczyć roztwór, aby uzyskać 0,5 l.
    UWAGA: Dodaj NaOH do wody - nie dodawaj wody do stałego NaOH. Nie dotykaj NaOH! Może to spowodować oparzenia chemiczne.
  8. Zneutralizować warstwy chitozanu za pomocą 0,5 N NaOH. Dodać 0,5 ml 0,5 N roztworu NaOH do jednego dołka 24-dołkowej płytki na 2 godziny.
  9. Umyj folie chitozanu trzykrotnie wodą podwójnie destylowaną.
    UWAGA: Na tym etapie eksperyment można wstrzymać.
  10. Przed wysiewem komórek wysterylizuj 24-dołkowe płytki pokryte chitozanem w 70% alkoholu przez noc w temperaturze pokojowej.
  11. Przepłukać płytki pokryte chitozanem trzykrotnie PBS w temperaturze pokojowej.
  12. Sterylizuj płytki pokryte chitozanem przez obróbkę w świetle ultrafioletowym przez noc w temperaturze pokojowej.

3. Rozsiewanie komórek

  1. Wstępnie podgrzać roztwór PBS pożywki proliferacyjnej i roztwór trypsyny/EDTA do temperatury 37 °C.
  2. Odrzucić supernatant z kolby do hodowli komórek T-75.
  3. Przemyć zbiegające się komórki PDL 10 ml roztworu PBS.
  4. Wyrzuć roztwór PBS.
  5. Dodać 1 ml roztworu trypsyny/EDTA do kolby do hodowli komórek T-75.
  6. Inkubować komórki w roztworze trypsyny/EDTA przez 3 minuty w temperaturze 37 °C.
  7. Zakończyć proces trawienia trypsyny, dodając 3 ml pożywki proliferacyjnej do kolby do hodowli komórek T-75.
  8. Przygotować zawiesinę komórkową przenieść do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
  9. Odwirowywać zawiesinę przez 5 minut w temperaturze 300 x g i temperaturze pokojowej.
  10. Odrzucić supernatant ze stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl pożywki proliferacyjnej.
  11. Policz komórki PDL za pomocą hemocytometru.
  12. Nasiona komórek PDL o gęstości 0,5 x 104, 1 x 104, 3 x 104 i 6 x 104 komórki/cm2.
  13. Hodowla komórek PDL na foliach chitozanu w inkubatorze w temperaturze 37 °C w 5% CO2 z wilgotnym powietrzem.
  14. Następnie zmieniaj pożywkę hodowlaną dwa razy w tygodniu.
  15. W dniach 1, 2, 3, 4 i 5 codziennie obserwuj morfologię komórek za pomocą mikroskopu kontrastowego z odwróconymi fazami.

4. Przeżywalność komórek

  1. Po 1, 3 i 6 dniach hodowli określ przeżycie komórek za pomocą komercyjnego zestawu żywotności/cytotoksyczności.
  2. W probówce o pojemności 15 ml przygotuj 2 ml świeżego roztworu 2 mM kalceiny-AM i 4 mM homodimeru etydyny w PBS, wirując przez 5 s.
    UWAGA: Utrzymuj proces w ciemności.
  3. Usunąć pożywkę hodowlaną i umyć sferoidy w PBS.
  4. Inkubować sferoidy w PBS zawierającym 2 mM kalceiny-AM i 4 mM homodimeru etydyny przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  5. Przepłucz sferoidy dwukrotnie w PBS. W przypadku sferoid z jednego dołka na płytce 24-dołkowej należy za każdym razem użyć 2 ml PBS.
  6. Obserwuj próbki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy powiększeniu 10x lub 20x.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zastosowanie niniejszego protokołu pozwoliło na pomyślne utworzenie żywotnych sferoidów komórek PDL. Na Rycini 1 pokazano, że na błonach chitozanowych obserwowano głównie komórki w zawiesinie lub sferoidy zamiast komórek przylegających. Przy gęstości zasiewu 0,5 x 104 komórek/cm2 przylegające komórki PDL stwierdzano sporadycznie w 1. i 3. dniu, a sferoidy komórek PDL obserwowano rzadko. Przeciwnie, przy gęstościach zasiewu 3 x 104

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym badaniu wprowadzono system hodowli komórkowych 3D w celu przezwyciężenia pewnych ograniczeń związanych z konwencjonalną jednowarstwową hodowlą komórkową 2D. Zgodnie z protokołem, sferoidy komórkowe PDL zostały z powodzeniem utworzone przez hodowlę komórek na błonach chitozanu. Nasze poprzednie badanie wykazało, że tworzenie sferoidów zwiększyło zdolności do samoodnawiania się i różnicowania osteogennego komórek PDL14. Zamiast używać enzymu do zbierania komórek z TCPS, sferoidy komórek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było sponsorowane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC 81700978), Fundusze Badań Podstawowych dla Uniwersytetów Centralnych (1504219050), Fundację Nauk Przyrodniczych w Szanghaju (17ZR1432800) oraz Shanghai Medical Exploration Project (17411972600).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
α-MEMGibco11900-073
kwas octowy Sigma-Aldrich64197
Kolba do hodowli komórkowych 25 cm2Corning430639
Kolba do hodowli komórkowych 75 cm2Corning430641
ChitozanHeppe Medical  Chitozan GmbH/masa cząsteczkowa 500 kDa, stopień deacetylacji 85%
FCSGibco26140-079
Żywy/martwy Żywotność / Cytotoksyczność Zestawmolekularny  SondyL3224
NaOHSigma-Aldrich1310732
PBSKeyGen Biotech 
długopis/paciorkowiecGibco15140-122
Trypsyna/EDTA KeyGen Biotechnologia 
stożkowa probówka wirówkowa 15 mlCorning430790
Płytka 24-dołkowaCorning3524
KGB5001KGM25200

Bibliografia

  1. Albandar, J. M. Epidemiology and risk factors of periodontal diseases. Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).
  2. Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology. Periodontology 2000. 24, 253-269 (2000).
  3. Chen, F. M., Jin, Y. Periodontal tissue engineering and regeneration: current approaches and expanding opportunities. Tissue Engineering Part B Review. 16 (2), 219-255 (2010).
  4. Yu, N., et al. Enhanced periodontal tissue regeneration by periodontal cell implantation. Journal of Clinical Periodontology. 40 (7), 698-706 (2013).
  5. Yan, X. Z., Yang, F., Jansen, J. A., de Vries, R. B., van den Beucken, J. J. Cell-Based Approaches in Periodontal Regeneration: A Systematic Review and Meta-Analysis of Periodontal Defect Models in Animal Experimental Work. Tissue Engineering Part B Review. 21 (5), 411-426 (2015).
  6. Itaya, T., et al. Characteristic changes of periodontal ligament-derived cells during passage. Journal of Periodontal Research. 44 (4), 425-433 (2009).
  7. Zhang, J., Li, B., Wang, J. H. The role of engineered tendon matrix in the stemness of tendon stem cells in vitro and the promotion of tendon-like tissue formation in vivo. Biomaterials. 32 (29), 6972-6981 (2011).
  8. Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).
  9. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
  10. Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
  11. Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
  12. Kabiri, M., et al. 3D mesenchymal stem/stromal cell osteogenesis and autocrine signalling. Biochemical and Biophysical Research Communications. 419 (2), 142-147 (2012).
  13. Lee, J. H., Han, Y. S., Lee, S. H. Long-Duration Three-Dimensional Spheroid Culture Promotes Angiogenic. Activities of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & therapeutics. 24 (3), 260-267 (2016).
  14. Yan, X. Z., van den Beucken, J., Yuan, C., Jansen, J. A., Yang, F. Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films. Oral Diseases. 24 (6), 1083-1092 (2018).
  15. Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. , (2012).
  16. LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. Cancer Research. 64 (5), 1621-1631 (2004).
  17. Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Engineering Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
  18. Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 9176357(2016).
  19. Tong, J. Z., Sarrazin, S., Cassio, D., Gauthier, F., Alvarez, F. Application of spheroid culture to human hepatocytes and maintenance of their differentiation. Biology of the Cell. 81 (1), 77-81 (1994).
  20. Lee, W. Y., et al. The use of injectable spherically symmetric cell aggregates self-assembled in a thermo-responsive hydrogel for enhanced cell transplantation. Biomaterials. 30 (29), 5505-5513 (2009).
  21. Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
  22. Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
  23. Miyagawa, Y., et al. A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation. Tissue Engineering Part A. 17 (3-4), 513-521 (2011).
  24. Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
  25. Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential. Cell and Tissue Research. 347 (3), 701-711 (2012).
  26. Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

kom rki wi zad a oz bnegotworzenie sferoid wtr jwymiarowa hodowla kom rkowag sto wysiewu kom rekpo ywka do proliferacjitrypsyna EDTAmikroskopia kontrastowatest ywotno cir nicowanie osteogenne
Tworzenie sferoid ludzkich komórek więzadeł przyzębia na błonach chitozanu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.