Artykuł metodologiczny

Identyfikacja białek oddziałujących z fosforanem inozytolu lub fosfoinozytylem za pomocą chromatografii powinowactwa sprzężonej ze spektrometrią Western Blot lub spektrometrią mas

DOI:

10.3791/59865

⸱

26 lipca 2019

1Institute of Parasitology, McGill University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół skupia się na identyfikacji białek, które wiążą się z fosforanami inozytolu lub fosfonozytydami. Wykorzystuje chromatografię powinowactwa z biotynylowanymi fosforanami inozytolu lub fosfoinozytydami, które są unieruchamiane przez streptawidynę do agarozy lub kulek magnetycznych. Fosforan inozytolu lub białka wiążące fosfoinozytol są identyfikowane za pomocą Western blot lub spektrometrii mas.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fosforany inozytolu i fosfoinozytydy regulują kilka procesów komórkowych u eukariontów, w tym ekspresję genów, transport pęcherzyków, transdukcję sygnału, metabolizm i rozwój. Metabolity te wykonują tę aktywność regulacyjną poprzez wiązanie się z białkami, zmieniając w ten sposób konformację białka, aktywność katalityczną i/lub interakcje. Opisana tutaj metoda wykorzystuje chromatografię powinowactwa sprzężoną ze spektrometrią mas lub Western blot w celu identyfikacji białek, które oddziałują z fosforanami inozytolu lub fosfoinozytydami. Fosforany inozytolu lub fosfoinozytydy są chemicznie znakowane biotyną, która jest następnie wychwytywana przez streptawidynę sprzężoną z agarozą lub kulkami magnetycznymi. Białka są izolowane przez ich powinowactwo wiązania do metabolitu, a następnie eluowane i identyfikowane za pomocą spektrometrii mas lub Western blot. Metoda ma prosty przepływ pracy, który jest czuły, nieradioaktywny, wolny od liposomów i konfigurowalny, wspierając precyzyjną analizę interakcji białek i metabolitów. Podejście to może być stosowane w metodach ilościowej spektrometrii mas bez znakowania lub znakowanych aminokwasami w celu identyfikacji interakcji białko-metabolit w złożonych próbkach biologicznych lub przy użyciu oczyszczonych białek. Protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem analizy białek z Trypanosoma brucei, ale można go dostosować do pokrewnych pasożytów pierwotniaków, drożdży lub komórek ssaków.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fosforany inozytolu (IPS) i fosfoinozytydy (PI) odgrywają kluczową rolę w biologii eukariontów poprzez regulację procesów komórkowych, takich jak kontrola ekspresji genów1,2,3, transport pęcherzyków4, transdukcja sygnału5,6, metabolizm7,8,9, oraz development8,10. Funkcja regulacyjna tych metabolitów wynika z ich zdolności do interakcji z białkami, a tym samym regulowania funkcji białek. Po związaniu przez białka, IP i PI mogą zmieniać konformację białka11, aktywność katalityczna12, lub interakcje13, a tym samym wpływać na funkcję komórkową. IP i PI są rozmieszczone w wielu subkomórkowych przedziałach, takich jak nucleus2,3,14,15, retikulum endoplazmatyczne16,17, plasma membrane1 i cytozol18, albo związane z białkami3,19 lub z RNAs20.

Rozszczepienie związanego z błoną PI(4,5)P2 przez fosfolipazę C powoduje uwolnienie Ins(1,4,5)P3, który może być fosforylowany lub defosforylowany odpowiednio przez kinazy IP i fosfatazy. IP to rozpuszczalne cząsteczki, które mogą wiązać się z białkami i pełnić funkcje regulacyjne. Na przykład Ins(1,4,5)P3 w metazoanie może działać jako drugi przekaźnik, wiążąc się z receptorami IP3, co indukuje zmiany konformacyjne receptora, a tym samym uwalnianie Ca2+ z magazynów wewnątrzkomórkowych11. Ins(1,3,4,5)P4 wiąże się z kompleksem deacetylazy histonowej i reguluje tworzenie i aktywność kompleksu białkowego13. Inne przykłady funkcji regulacyjnych IP obejmują kontrolę organizacji chromatyny21, transport RNA22,23, RNA editing24, oraz transkrypcja1,2,3. W przeciwieństwie do tego, PI są często związane z rekrutacją białek do błony plazmatycznej lub błon organelli25. Jednak nową właściwością PI jest zdolność do kojarzenia się z białkami w środowisku niebłoniastym3,15,19,26. Tak jest w przypadku steroidogennego czynnika receptora jądrowego, którego funkcja kontroli transkrypcji jest regulowana przez PI(3,4,5)P319, oraz polimerazy poli-A, której aktywność enzymatyczna jest regulowana przez jądrową PI(4,5)P226. Rola regulacyjna IP i PI została wykazana w wielu organizmach, w tym w drożdżach22,27, komórkach ssaków19,23, Drosophila10 i worms28. Istotna jest rola tych metabolitów w trypanosomach, które wcześnie oddzieliły się od linii eukariotycznej. Metabolity te odgrywają istotną rolę w kontroli transkrypcji Trypanosoma brucei1,3, development8, biogeneza organelli i ruch białek29,30,31,32, a także biorą udział w kontrolowaniu rozwoju i infekcji patogenów T. cruzi33,34,35, Toxoplasma36 i Plasmodium5,37. W związku z tym zrozumienie roli IP i PI w trypanosomach może pomóc w wyjaśnieniu nowej funkcji biologicznej tych cząsteczek i zidentyfikowaniu nowych celów leków.

Specyficzność wiązania białka i IP lub PI zależy od domen oddziałujących z białkami i stanu fosforylacji inozytolu13,38, chociaż interakcje z lipidową częścią PI również występują19. Różnorodność IP i PI oraz ich modyfikujących kinazy i fosfatazy zapewnia elastyczny mechanizm komórkowy do kontrolowania funkcji białka, na który wpływ ma dostępność i obfitość metabolitów, stan fosforylacji inozytolu i powinowactwo białek do interakcji1,3,13,38. Chociaż niektóre domeny białkowe są dobrze scharakteryzowane39,40,41, np. domena homologii pleckstrin 42 i SPX (SYG1/Pho81/XPR1) domeny43,44,45niektóre białka oddziałują z IP lub PI za pomocą mechanizmów, które pozostają nieznane. Na przykład białko represorowo-aktywatorowe 1 (RAP1) T. brucei nie ma kanonicznych domen wiążących PI, ale oddziałuje z PI(3,4,5)P3 i transkrypcją kontrolną genów zaangażowanych w zmienność antygenową3. Chromatografia powinowactwa i analiza spektrometrii mas białek oddziałujących IP lub PI z komórek trypanosomów, drożdży lub ssaków zidentyfikowały kilka białek bez znanych domen wiążących IP lub PI8,46,47. Dane sugerują dodatkowe niescharakteryzowane domeny białkowe, które wiążą się z tymi metabolitami. W związku z tym identyfikacja białek, które oddziałują z IP lub PI, może ujawnić nowe mechanizmy interakcji białko-metabolit i nowe komórkowe funkcje regulacyjne dla tych małych cząsteczek.

Opisana tutaj metoda wykorzystuje chromatografię powinowactwa sprzężoną z Western blotting lub spektrometrią mas w celu identyfikacji białek, które wiążą się z IP lub PI. Wykorzystuje biotynylowane adresy IP lub PI, które są albo usieciowane ze streptawidyną sprzężoną z kulkami agarozy, albo alternatywnie, wychwycone za pomocą kulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną (Rysunek 1). Metoda zapewnia prosty przepływ pracy, który jest czuły, nieradioaktywny, wolny od liposomów i nadaje się do wykrywania wiązania białek z lizatów komórkowych lub oczyszczonych białek3 (Rysunek 2). Metoda może być stosowana w bez8,< klasie sup = "xref">46 lub w połączeniu z ilościową spektrometrią mas znakowaną aminokwasami < sup class = "xref">47 w celu identyfikacji białek wiążących IP lub PI ze złożonych próbek biologicznych. W związku z tym metoda ta jest alternatywą dla kilku dostępnych metod badania interakcji IP lub PI z białkami komórkowymi i pomoże w zrozumieniu funkcji regulacyjnej tych metabolitów w trypanosomach i być może innych eukariontach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Analiza białek wiążących IP lub PI za pomocą chromatografii powinowactwa i Western blotting

  1. Chromatografia wzrostu, lizy i powinowactwa komórek
    1. Hoduj komórki T. brucei do połowy fazy logarytmicznej i monitoruj żywotność i gęstość komórek. Łącznie 5,0 x 107 komórek wystarcza do jednego testu wiązania.
      1. W przypadku form krwiobiegowych hoduj komórki w pożywce HMI-9 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Utrzymuj gęstość komórek między 8,0 x 105 do 1,6 x 106 komórek/ml.
        UWAGA: Gęstość wyższa niż 1,8 x 106 komórek/ml może wpływać na żywotność komórek. Czas podwojenia odmiany T. brucei 427 uprawianej in vitro wynosi od 5,5 do 6,5 godziny.
      2. W przypadku form procyklicznych hoduj komórki w pożywce SDM-79 uzupełnionej 10% FBS w temperaturze 27 °C i utrzymuj gęstość komórek między 1,0 x 107 a 3,0 x 107 komórek/ml.
      3. W przypadku białek oczyszczonych (np. białek rekombinowanych) należy pobrać od 0,5 do 1 μg białka i rozcieńczyć w 450 μl buforu wiążącego (25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,2% glikolu 4-nonylofenylopolietylenowego, pH 7,4). Zachowaj 5% rozcieńczonego białka (wejściowego) do analizy Western blot. Przejdź do kroku 1.1.7.
    2. Odwirować komórki przy 1 600 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT). Odrzucić supernatant.
      UWAGA: Patrz krok 2.1.2, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat wirowania dużych objętości kultur.
    3. Delikatnie zawiesić osad w 10 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami o pH 7,4, uzupełnionego 6 mM glukozy (PBS-G) i wstępnie podgrzanego do temperatury 37 °C w celu przepłukania komórek. Następnie odwirować komórki o sile 1 600 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórzyć procedurę dwukrotnie.
    4. Zawiesić osad w 1 ml PBS-G. Następnie przenieść objętość do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 1 600 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
      UWAGA: Granulki komórkowe można błyskawicznie zamrażać w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C lub ciekłym azocie.
    5. Ponownie zawiesić osad w 0,5 ml buforu do lizy (25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1% t-oktylofenoksypolietylen, pH 7,4) uzupełnionego 1,5x koktajlem inhibitora proteazy i 1x koktajlem inhibitora fosfatazy (tabela materiałów) wstępnie schłodzonym w lodzie w celu lizy komórek. Inkubować lizat przez 10 minut, obracając się z prędkością 50 obr./min w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Jest to krytyczny krok, ponieważ białka mogą ulec degradacji, jeśli nie będą traktowane zgodnie ze wskazaniami. W razie potrzeby sprawdzić integralność lizatu białkowego za pomocą elektroforezy w żelu dodecylosiarczanowo-poliakryloamidowym (SDS/PAGE).
      UWAGA: T-oktylofenoksypolietylen jest toksyczny i może powodować podrażnienie skóry i oczu. Używaj rękawiczek, osłony oczu i osłony twarzy.
    6. Odwirować lizat przy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml w celu przeprowadzenia testów wiązania. Zachowaj 5% całkowitego lizatu (wejściowego) do analizy Western blot. Supernatant zawiera białka pasożytów ekstrahowane buforem do lizy.
    7. Zebrać 50 μl IP lub PI sprzężonych z kulkami agarozy (tj. 50 μl gnojowicy) lub 50 μl kulek agarozy i wirować przez 1 minutę przy 1 000 x g. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 50 μl buforu wiążącego w celu zrównoważenia kulek. Użyj koralików niesprzężonych jako kontrolki. Używaj kulek IP/PI o różnej konfiguracji fosforanów, w tym form niefosforylowanych, do kontrolowania niespecyficznych interakcji.
    8. Dodaj 50 μl kulek IP lub PI do lizatu komórkowego lub oczyszczonych białek (każdy 1 ml kulek zawiera 10 nmol sprzężonych IP lub PI). Utrzymuj objętość kulek IP lub PI w granicach 10% całkowitego lizatu i, jeśli to konieczne, dostosuj objętość reakcji wiązania za pomocą buforu wiążącego.
      1. W przypadku testów konkurencji należy dodać do reakcji wiązania różne stężenia niesprzężonych IP lub PI (np. 1-, 10-, 100-krotny nadmiar molowy w porównaniu z kulkami IP- lub PI).
    9. Inkubować reakcję przez 1 godzinę lub przez noc, w temperaturze 4 °C i obracając się z prędkością 50 obr./min.
      UWAGA: Reakcje wiązania z oczyszczonymi białkami można przeprowadzić w temperaturze pokojowej w zależności od stabilności białka. Jeśli używasz IP lub PI sprzężonych tylko z biotyną, przejdź do kroku 1.1.9.1, w przeciwnym razie przejdź do kroku 1.1.10.
      1. Dodać 50 μl streptawidyny sprzężonej z kulkami magnetycznymi do reakcji wiązania i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, obracając z prędkością 50 obr./min.
    10. Odwirować mieszaninę przez 1 minutę przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant (przepływowy) i zachować osad. Zachowaj 5% supernatantu do analizy Western blot.
      UWAGA: W przypadku korzystania z kulek magnetycznych należy usunąć supernatanty i wykonać kolejne płukania za pomocą stojaka magnetycznego (wirowanie nie jest konieczne).
    11. Dodać 1 ml buforu płuczącego (25 mM HEPES, 300 mM NaCl, 0,2% glikolu 4-nonylofenylopolietylenowego, pH 7,4) i ponownie zawiesić żywicę, stukając lub obracając probówkę (nie używać pipety, ponieważ kulki mogą przyczepiać się do końcówek pipet). Odwirowywać reakcję przez 1 minutę przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Powtórz procedurę, w sumie pięć prań.
      UWAGA: Glikol 4-nonylofenylo-polietylenowy jest toksyczny i może powodować podrażnienie skóry i oczu. Używaj rękawiczek, osłony oczu i osłony twarzy.
    12. Dodaj 50 μl 2x buforu Laemmli uzupełnionego 710 mM 2-merkaptoetanolem do kulek i wymieszaj przez stuknięcie lub wirowanie w celu elucji białek. Ogrzewać w temperaturze 95 °C przez 5 minut, następnie odwirować przez 10 000 x g przez 1 minutę i zebrać supernatant (zawierający eluowane białka). Alternatywnie, eluuj białka za pomocą 8 M mocznika / 100 mM glicyny o pH 2,9, aby uniknąć stosowania SDS. Zamrozić eluat w temperaturze -80 °C, w przeciwnym razie przejść do analizy Western blot.
      UWAGA: 2-merkaptoetanol jest toksyczny i może powodować podrażnienia skóry, oczu i dróg oddechowych. Używaj rękawiczek i pracuj w kapturze chemicznym.
  2. Analiza Western blot
    1. Zmieszać 15 μl próbek wejściowych (z etapu 1.1.6) lub przepływowych (z etapu 1.1.10) z 5 μl 4 buforu Laemmli. Podgrzewać próbki wprowadzane i przepływające przez 5 minut w temperaturze 95 °C. Dla próbek eluowanych w 8 M moczniku/100 mM glicynie o pH 2,9, zmieszać 15 μl eluatu z 5 μl 4x buforu Laemmliego i ogrzewać przez 5 minut w temperaturze 95 °C.
      UWAGA: Ten krok nie jest konieczny w przypadku próbek eluowanych w 2x buforze Laemmli.
    2. Załadować studzienki 4-20% żelu SDS/PAGE z 2,5 μl wkładu, 2,5 μl przepływowego i 20 μl eluowanych próbek i załadować drabinkę białkową zgodnie z zaleceniami producenta.
      UWAGA: Wybierz żel% zgodnie z masą cząsteczkową interesującego Cię białka.
    3. Uruchom SDS/PAGE przy napięciu 150 V przez 30-45 minut w pracującym buforze lub do momentu, gdy niebieski barwnik buforu Laemmli znajdzie się na końcu żelu.
      UWAGA: Czas pracy może się różnić w zależności od sprzętu laboratoryjnego.
    4. Usuń żel ze szklanych (lub plastikowych) płytek i zanurz w buforze transferowym na 15 minut.
    5. Przenieść białka do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) lub membrany nitrocelulozowej. Namocz membrany i bibułę filtracyjną o grubości 3 mm w buforze transferowym. Złóż kanapkę z trzema arkuszami bibuły filtracyjnej, membraną nitrocelulozową lub PVDF, żelem i dodatkowymi trzema arkuszami bibuły filtracyjnej. Upewnij się, że w kanapce nie są uwięzione pęcherzyki powietrza. W razie potrzeby użyj wałka, aby usunąć bąbelki. Ustaw membranę na katodzie, a żel po stronie anody kasety.
      UWAGA: Zapoznaj się z instrukcjami producenta membrany, aby uzyskać informacje na temat aktywacji membrany lub przygotowania blot.
    6. Umieść kasetę zawierającą kanapkę w zbiorniku transferowym z buforem transferowym. Umieścić zbiornik w pojemniku na lód lub w temperaturze 4 °C (np. w chłodni). Przenoszenie białek pod napięciem 100 V przez 1 godzinę (prąd waha się w granicach 200-400 mA). Alternatywnie można przełączyć na noc przy stałym prądzie 15 mA w temperaturze 4 °C.
    7. Zdejmij membranę z kasety. Inkubować błonę w 6% beztłuszczowym mleku w proszku rozcieńczonym w PBS z 0,05% polisorbatu 20 (PBS-T) lub kompatybilnym roztworem blokującym, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w celu zablokowania membrany.
      UWAGA: Przed zablokowaniem membrany jakość transferu można sprawdzić za pomocą bejcy Ponceau S. Inkubować błonę przez 1 minutę w 15 ml Ponceau S, spłukać w wodzie i uwidocznić pasma.
    8. Usunąć roztwór blokujący i inkubować błonę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z obrotem 50 obr./min w przeciwciałach pierwszorzędowych rozcieńczonych w 6% odtłuszczonym mleku w proszku rozcieńczonym w PBS-T. Alternatywnie, inkubować membranę przez noc w temperaturze 4 °C z obrotem 50 obr./min.
      UWAGA: Czas inkubacji może się różnić w zależności od jakości przeciwciał; jednak większość przeciwciał będzie działać przy inkubacjach trwających 1-3 godziny w RT. Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi stężenia lub rozcieńczania przeciwciał.
    9. Przemyć blot przez inkubację membrany w PBS-T przez 5 minut z obrotem 50 obr./min przy RT. Powtórzyć procedurę 3-5 razy. W zależności od jakości przeciwciał może być konieczne więcej płukań.
    10. Inkubować błonę w przeciwciałach drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą chrzanową (HRP) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w 6% beztłuszczowym mleku w proszku rozcieńczonym w PBS-T z obrotem 50 obr./min.
      UWAGA: Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi stężenia lub rozcieńczania przeciwciał.
    11. Umyj blot zgodnie z opisem w kroku 1.2.9.
    12. Dodaj podłoże chemiluminescencyjne, aby przykryć membranę. Usunąć nadmiar substratu i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
      UWAGA: Zapoznaj się z instrukcjami producenta, aby uzyskać zalecenia dotyczące odczynników chemiluminescencyjnych.
    13. Uchwyć sygnał chemiluminescencyjny za pomocą kamery. Alternatywnie użyj filmu rentgenowskiego, aby uchwycić sygnał chemiluminescencyjny.

2. Analiza białek wiążących IP/PI metodą chromatografii powinowactwa i spektrometrii mas

  1. Chromatografia wzrostu, lizy i powinowactwa komórek
    1. Hoduj komórki T. brucei do środkowej fazy logarytmicznej i monitoruj żywotność i gęstość komórek.
      UWAGA: Łącznie 1,0 x 1010 komórek wystarcza do dwóch testów wiązania. Użycie mniejszej liczby komórek niż wskazano tutaj może wpłynąć na wykrycie białek o niskiej liczebności za pomocą spektrometrii mas.
      1. W przypadku form krwiobiegu T. brucei hoduj komórki w środkowej fazie logarytmicznej (8,0 x 10 5-1,6 x 106 komórek/ml) w pożywce HMI-9 uzupełnionej 10% FBS w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . W przypadku szczepu 427 5 l kultury da 0,5-1,0 x10 10 komórek. Monitoruj wzrost komórek, aby uniknąć gęstości wyższej niż 1,8 x 106 komórek/ml, co może wpływać na żywotność komórek. Utrzymać objętość hodowli komórkowej na poziomie 1/10 objętości kolby; W przeciwnym razie słabe napowietrzenie wpłynie na tempo wzrostu komórek.
        UWAGA: Szczep 427 ma czas podwojenia wynoszący 5,5-6,5 godziny.
      2. W przypadku form procyklicznych hoduj komórki w pożywce SDM-79 uzupełnionej 10% FBS w temperaturze 27 °C i utrzymuj gęstość komórek między 1,0 x 107 a 3,0 x 107 komórek/ml. 500 ml hodowli da 0,5-1,5 x 1010 komórek.
    2. Odwirować komórki przy 1 600 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 ml PBS-G podgrzanego w temperaturze 37 °C. Użyć probówek wirowych z okrągłym dnem (tabela materiałów), ponieważ osady krwi T. brucei są łatwo zakłócane podczas używania wirników wirówek o stałym kącie nachylenia. Ponownie odwirować komórki przy 1 600 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml PBS-G. Odwirować komórki przy stężeniu 1 600 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórzyć procedurę i po ostatnim płukaniu wyrzucić supernatant.
      UWAGA: Granulki mogą być błyskawicznie zamrażane w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze -80 °C lub ciekłym azotze.
    4. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml buforu do lizy wstępnie schłodzonego w lodzie i uzupełnionego 1,5x koktajlem inhibitora proteazy i 1x koktajlem inhibitora fosfatazy (tabela materiałów). Inkubować lizat przez 10 minut w temperaturze 4 °C, obracając z prędkością 50 obr./min.
    5. Odwirować lizat przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant (rozpuszczone białka) i rozcieńczyć go w 20 ml buforu wiążącego.
    6. Zebrać 400 μl IP lub PI sprzężonych z kulkami agarozy (tj. 400 μl gnojowicy) lub 400 μl kulek kontrolnych i odwirować przez 1 minutę przy 1 000 x g w temperaturze pokojowej stężenia. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 400 μl buforu wiążącego w celu zrównoważenia kulek. Użyj kulek agarozy jako kontroli negatywnej, aby określić specyficzne wzbogacenie interakcji białko-metabolit w porównaniu z interakcjami niespecyficznymi (np. białka, które wiążą się niespecyficznie z kulkami). Używaj IP lub PI z różnymi konfiguracjami fosforanów, w tym formami nieufosforylowanymi, aby kontrolować niespecyficzne interakcje spowodowane ładunkami fosforanowymi lub wiązaniem z biotyną.
    7. Dodać 400 μl kulek IP/PI lub kulek kontrolnych do 10 ml lizatu i inkubować przez 1 godzinę lub przez noc, w temperaturze 4 °C, obracając się z prędkością 50 obr./min. Jeśli używasz IP lub PI sprzężonych tylko z biotyną (bez kulek), przejdź do kroku 2.1.7.1, w przeciwnym razie przejdź do kroku 2.1.8.
      1. Dodać 100 μl streptawidyny sprzężonej z kulkami magnetycznymi i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, obracając z prędkością 50 obr./min.
    8. Odwirować reakcję wiązania przez 1 minutę przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant (przepływowy) i zachować osad. Zachowaj 5% supernatantu do analizy Western blot.
    9. Dodać 5 ml buforu płuczącego do osadu, delikatnie wymieszać obracając probówkę, a następnie odwirować przez 1 minutę w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad. Powtórz pranie pięć razy. W przypadku korzystania z kulek magnetycznych należy zebrać supernatanty i przeprowadzić płukanie za pomocą stojaka magnetycznego (wirowanie nie jest konieczne).
    10. Dodać 50 μl 2x buforu Laemmli (lub 8 M mocznika/100 mM glicyny o pH 2,9, aby uniknąć stosowania SDS) do kulek i wymieszać przez stukanie lub wirowanie (unikać pipetowania, ponieważ kulki mogą przyczepiać się do końcówek pipet), a następnie podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 5 minut. Wirować przez 10 000 x g przez 1 minutę i zebrać supernatant (eluowane białka). Powtórz procedurę dwukrotnie, aby zebrać w sumie trzy frakcje.
    11. Zamrozić eluat w temperaturze -80 °C, w przeciwnym razie oddzielić białka w SDS/PAGE lub przechowywać w roztworze do trypsynizacji i analizy metodą spektrometrii mas.
  2. Trawienie białek trypsyną w spektrometrii mas
    UWAGA: Przedstawiono dwa warianty tej procedury dla sekcji 2.2.1 (w żelu) lub sekcji 2.2.2 (w roztworze) trawienia białek. Zaleca się stosowanie probówek o niskiej wiązalności białek, aby zapobiec stratom próbki. Skonsultuj się z chemikiem analitycznym w zakładzie proteomiki w sprawie przydatności protokołu dla dostępnych próbek i przyrządów do spektrometru mas.
    1. Trypsynizacja białek w żelu
      1. Po oddzieleniu białek w SDS/PAGE krótko spłucz żel w wodzie o wysokiej czystości. Przenieś żel na czystą szklaną płytkę. Wycinaj opaski białkowe czystym ostrzem i unikaj wycinania dodatkowego żelu na zewnątrz pasm. Pokrój kawałki żelu na małe kawałki (tj. około 1 mm kwadratu) i przenieś je do probówki o pojemności 1 ml. W razie potrzeby użyj końcówki do pipety, ale przed użyciem upewnij się, że końcówka pipety została przepłukana w etanolu.
        UWAGA: Używaj rękawiczek, aby uniknąć zanieczyszczenia żelem. Kawałki żelu można przechowywać w temperaturze -20 °C.
      2. Dodać 100 μl wody o wysokiej czystości lub wysokiej wydajności do chromatografii cieczowej do probówek, aby spłukać kawałki żelu. Wylej wodę.
        1. W przypadku fluorescencyjnie barwionych kawałków żelu Coomassie lub rutenu należy inkubować kawałki żelu w roztworze odbarwiającym (25 mM NH4HCO3 w 50% acetonitrylu) przez 1 godzinę, a następnie wyrzucić roztwór. Powtarzaj procedurę, aż barwienie nie będzie widoczne.
          UWAGA: Przygotować roztwory zawierające NH4HCO3 przez rozcieńczenie z roztworu podstawowego o stężeniu 100 mM NH4HCO3, pH 7,8,
          UWAGA: Acetonitryl jest rozpuszczalnikiem lotnym, łatwopalnym i toksycznym. NH4HCO3 może powodować podrażnienie skóry lub oczu. Używaj rękawiczek i pracuj pod kapturem chemicznym.
        2. W przypadku kawałków żelu zabarwionego srebrem, kawałki żelu inkubować w 50 μl roztworu odbarwiającego do barwienia srebra (15 mMK 3[Fe(CN)6], 50 mM Na2S2O3) w wodzie przez 30 minut. Wyrzucić roztwór i przemyć kawałki żelu 200 μl wody. Powtórz pranie pięć razy lub do momentu, gdy żółty kolor żelu nie będzie widoczny.
          UWAGA: K3[Fe(CN)6] może powodować podrażnienie skóry lub oczu. Używaj rękawiczek.
      3. Odwodnić kawałki żelu za pomocą 200 μl acetonitrylu przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie wyrzuć roztwór.
        UWAGA: Odwodnione kawałki żelu mają mniejszą objętość, są nieprzezroczyste i lepkie. Jeśli kilka kawałków żelu zostanie połączonych w jednej tubce, powtórz procedurę, aby skutecznie odwodnić kawałki żelu.
      4. Dodać 50 μl (lub objętość wystarczającą do pokrycia kawałków żelu) roztworu redukującego (10 mM ditiotreitol [DTT] w 100 mM NH4HCO3) i inkubować w temperaturze 56 °C przez 1 godzinę. Następnie schłodzić probówki do temperatury RT i wyrzucić nadmiar roztworu redukującego.
      5. Dodać 50 μl (lub objętość wystarczającą do pokrycia kawałków żelu) roztworu alkilacji (50 mM jodoacetamidu w 100 mM NH4HCO3) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie wyrzuć nadmiar roztworu alkilacji.
      6. Odwodnić kawałki żelu za pomocą 200 μl acetonitrylu przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć acetonitryl i uwodnić kawałki żelu za pomocą 100 mM NH4HCO3 przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
      7. Ponownie odwodnić kawałki żelu za pomocą 200 μl acetonitrylu przez 10 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić nadmiar roztworu.
      8. Dodać 15 μl trypsyny klasy spektrometrii mas rozcieńczonej w 50 mM buforze NH4HCO3 lub objętość wystarczającą do pokrycia uwodnionych kawałków żelu i inkubować przez 4 godziny lub przez noc w temperaturze 37 °C. Utrzymywać całkowitą ilość trypsyny między 100 a 500 ng (lub 20 ng trypsyny/μg białka).
      9. Schłodzić próbkę do temperatury regulowanej i odwirowywać przez 1 minutę przy 2 000 x g w mikrowirówce. Dodać 10-20 μl 5% kwasu mrówkowego rozcieńczonego w wodzie i inkubować przez 10 minut w temperaturze RT.
        UWAGA: Kwas mrówkowy jest łatwopalny, i toksyczny. Używaj rękawiczek i pracuj pod kapturem chemicznym.
      10. Odwirować zgodnie z krokiem 2.2.1.9, a następnie zebrać supernatant (zawierający wyekstrahowane peptydy) do innej probówki. Dodać 20 μl 5% kwasu mrówkowego rozcieńczonego w 50-60% acetonitrylu do probówki i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Zebrać wyekstrahowane frakcje peptydowe w tej samej probówce.
      11. Wysuszyć próbkę w koncentratorze próżniowym i rozpuścić w 10 μl 0,5% kwasu octowego i 2% acetonitrylu do analizy metodą spektrometrii mas. Odwirować i zebrać roztwór na dnie probówki; przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C lub -80 °C.
    2. Trypsynizacja białek w roztworze
      1. Wytrącić białka, aby zmniejszyć objętość próbki, odsalanie i wymianę buforu. Dodać do próbki sześć objętości schłodzonego (-20 °C) acetonu, np. 600 μl acetonu na 100 μl próbki. Wirować i inkubować w temperaturze -20 °C przez 15 minut do 1 godziny. Roztwór stanie się mętny lub utworzy osad.
        UWAGA: Aceton jest toksyczny i łatwopalny. Używaj rękawiczek i pracuj pod kapturem chemicznym.
      2. Odwirować próbki w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Zdekantować aceton i suszyć granulki na powietrzu przez 15 minut.
      3. Dodaj 10 μl 6-8 M mocznika lub 1% SDS w 50 mM NH4HCO3, aby rozpuścić osad i odwirować do wymieszania. W przypadku większych ilości białek (> 10 μg) należy użyć do 20 μl buforu do rozpuszczania.
      4. Dodać 5 μl roztworu redukującego i odwirować. Zmniejsz objętość za pomocą mikrowirówki. Jeśli próbki są rozcieńczone w moczniku, należy inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Jeżeli próbki rozcieńcza się w karcie charakterystyki, a następnie inkubuje się przez 1 godzinę w temperaturze 56 °C.
      5. Zmniejsz objętość za pomocą mikrowirówki. Dodać 3 μl roztworu alkilacji i odwirować. Następnie zmniejsz głośność i inkubuj w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
      6. Dodać 3 μl roztworu redukującego, aby zneutralizować reakcję. Powoli rozcieńczyć próbkę do 1 M mocznika lub 0,05% SDS, używając 50 mM NH4HCO3,
        UWAGA: Bufor do trawienia trypsyny musi zawierać detergent lub denaturant. Limity stężeń dla denaturantów wynoszą: 0,05% SDS; 0,1% oktylu B-D-glukopiranozyd; 0,1% glikol 4-nonylofenylopolietylenowy; 0,1% T-oktylofenoksypolietylenu; 0,1% polisorbat 20; 0,1% 3-[(3-cholamidopropylo)dimetyloamonio]-1-propanosulfonian; < 1 M mocznik lub tiomocznik.
      7. Dodać 5 μl trypsyny klasy spektrometrii mas rozcieńczonej w 50 mM buforze NH4HCO3 i inkubować przez 4 godziny lub przez noc w temperaturze 37 °C. Utrzymać całkowitą ilość trypsyny między 100 a 500 ng (lub 20 ng trypsyny/μg białka).
      8. Schłodzić próbkę do temperatury pokojowej i odwirować objętość za pomocą mikrowirówki. Dodać 5% kwasu octowego (lub 5% kwasu mrówkowego w 50% acetonitrylu), aby wygasić reakcję.
      9. Wysuszyć próbki w koncentratorze próżniowym, jak wskazano w kroku 2.2.1.11. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C. Peptydy odsalać i zagęszczać za pomocą kolumny z odwróconymi fazami, takiej jak końcówka C18, a następnie analizować za pomocą spektrometrii mas.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza interakcji RAP1 i PI(3,4,5)P3 za pomocą chromatografii powinowactwa i Western blotting
Ten przykład ilustruje zastosowanie tej metody do analizy wiązania PI przez RAP1 z lizatu T. brucei lub przez rekombinowane białko RAP1 T. brucei. W testach wiązania wykorzystano lizaty form krwi T. brucei, które wyrażają RAP1 znakowany hemaglutyniną (HA). RAP1 jest białkiem zaangażowanym w kontrolę transkrypcji genów wariantu glikoproteiny powierzchniowej (VSG)3...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identyfikacja białek, które wiążą się z IP lub PI, ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia funkcji komórkowej tych metabolitów. Chromatografia powinowactwa sprzężona ze spektrometrią Western blot lub spektrometrią mas daje możliwość identyfikacji białek oddziałujących z IP lub PI, a tym samym uzyskania wglądu w ich funkcję regulacyjną. IP lub PI chemicznie znakowane [np. Ins(1,4,5)P3 chemicznie połączone z biotyną] i usieciowane z kulkami agarozy za pomocą streptawidyny lub wychwycone przez paciorkowce magnetyczne streptaw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Kanadyjską Radę ds. Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC, RGPIN-2019-04658); Suplement wprowadzający NSERC Discovery dla naukowców na wczesnym etapie kariery (DGECR-2019-00081) oraz przez Uniwersytet McGill.  

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcetonSigma-Aldrich650501Keton
AcetonitrylSigma-Aldrich271004Rozpuszczalnik 
Wodorowęglan amonuSigma-AldrichA6141Wirówka do soli nieorganicznych
Avanti J6-MIBeckman CoulterAvanti J6-MIWirówka do dużych objętości (np. 1L)
Butelki wirówkiSigma-AldrichB1408Butelki do odwirowania 1L kultury
Koraliki kontrolneEchelonP-B000-1mlOdczynnik do chromatografii powinowactwa - kontrola
Cukier D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270, dodany do PBS w celu utrzymania żywotności komórek
Ditiothreitol (DTT) Bio-Rad1610610Środek redukujący
Dynabeads M-270 StreptawidynaThermoFisher Scientific65305Kulki streptawidyny do wiązania z ligandami biotyny
Inhibitor proteazy wolny od EDTA KoktajlRoche11836170001Inhibitory proteazy
Bufor do elektroforezyBio-Rad161073225 mM Tris, 192 mM glicyna, 0,1% SDS, pH 8,3
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 15 mlCorning Life Sciences430052Do odwirowania 10 ml kultur
Kwas mrówkowySigma-Aldrich106526Kwas
GlicynaSigma-AldrichG7126Aminokwasowa
pożywka do hodowli komórkowych HMI-9ThermoFisher ScientificME110145P1Pożywka do hodowli komórkowych T. brucei krwioobiegu
Imperial Protein StainThermoFisher Scientific24615Barwienie Coomassie do wykrywania białek w SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 BeadsEchelonQ-B0145-1mlOdczynnik do chromatografii powinowactwa 
Natychmiastowy  Beztłuszczowe  Suchy  MilkThomas ScientificC837M64Odczynnik blokujący do Western blot
JodoacetamidSigma-AldrichI6125Odczynnik alkilujący do białek lub peptydów cysteinowych
Lab  RotatorThomas Scientific1159Z92Do oznaczania wiązań
Probówki do mikrowirówek LoBindThermoFisher Scientific13-698-793Rurki wiążące niskobiałkowe do spektrometrii
mas Nonidet  P-40 (Igepal CA-630)Sigma-Aldrich21-3277Detergent
PBS, pH 7,4ThermoFisher Scientific10010031Bufor fizjologiczny
Podłoże peroksydazy do chemiluminescencjiThermoFisher Scientific32106Podłoże do wykrywania białek
Inhibitor fosfatazy PhosSTOP Tabletki koktajlowe Fosfataza4906845001Roche inhibitory
PI(3)P BeadsEchelonP-B003a-1mlOdczynnik do chromatografii powinowactwa 
PI(3,4)P2 BeadsEchelonP-B034a-1mlOdczynnik do chromatografii powinowactwa 
PI(3,4,5)P3 diC8EchelonP-3908-1mgOdczynnik do chromatografii powinowactwa 
PI(3,4,5)P3 BeadsEchelonP-B345a-1mlOdczynnik do chromatografii powinowactwa 
PI(3,5)P2 BeadsEchelonP-B035a-1mlOdczynnik do chromatografii powinowactwa 
PI(4)P BeadsEchelonP-B004a-1mlOdczynnik do chromatografii powinowactwa 
PI(4,5)P2 diC8EchelonP-4508-1mgOdczynnik do chromatografii powinowactwa 
PI(4,5)P2 BeadsEchelonP-B045a-1mlOdczynnik do chromatografii powinowactwa 
PI(5)P BeadsEchelonP-B005a-1mlOdczynnik do chromatografii powinowactwa 
Ponceau S roztwórSigma-AldrichP7170Barwienie białek (0,1% [w/v] w 5% kwasie octowym)
Heksacyjanożelazian(III)Sigma-Aldrich702587Sól potasowa 
PtdIns BeadsEchelonP-B001-1mlOdczynnik do chromatografii powinowactwa 
Membrana PVDFBio-Rad1620177do Western blotting 
Wirówka z chłodzeniemEppendorf5910 RMikrowirówka do małych objętości (np. 1,5 ml)
Dodecylosiarczan soduSigma-Aldrich862010Detergent
Tiosiarczan soduSigma-Aldrich72049Chemiczny 
Koncentratory próżniowe SpeedVacThermoFisher ScientificSPD120-115Stężenie próbki (np. do spektrometrii mas)
Kolby T175 do hodowli komórkowych ThermoFisher Scientific159910Do uprawy 50 ml kultury T. brucei
Trypsyna, klasa spektrometrii masPromegaV5280Trypsyna do trawienia białek
MocznikSigma-AldrichU5128Odczynnik denaturujący
VortexFisher Scientific02-215-418Do mieszania reakcji
Bufor transferowy Western blottingBio-Rad161073425 mM Tris, 192 mM glicyna, pH 8,3 z 20% metanolem
Whatman  Papier 3 mmSigma-AldrichWHA3030861Papier do transferu Wester
2-merkaptoetanol (14,2 M)Bio-Rad1610710Środek redukujący
2x Laemmli Sample BufferBio-Rad161-0737Bufor ładujący białko
4– 20% Mini-PROTEAN  TGX Prefabrykowane żele białkoweBio-Rad4561094Żel do elektroforezy białek
4x Laemmli Sample BufferBio-Rad161-0747Bufor ładujący białko
Western Bloch

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cestari, I., Stuart, K. Inositol phosphate pathway controls transcription of telomeric expression sites in trypanosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2803-2812 (2015).
  2. Odom, A. R., Stahlberg, A., Wente, S. R., York, J. D. A role for nuclear inositol 1,4,5-trisphosphate kinase in transcriptional control. Science. 287 (5460), 2026-2029 (2000).
  3. Cestari, I., McLeland-Wieser, H., Stuart, K. Nuclear Phosphatidylinositol 5-Phosphatase Is Essential for Allelic Exclusion of Variant Surface Glycoprotein Genes in Trypanosomes. Molecular and Cellular Biology. 39 (3), (2019).
  4. Billcliff, P. G., et al. OCRL1 engages with the F-BAR protein pacsin 2 to promote biogenesis of membrane-trafficking intermediates. Molecular Biology of the Cell. 27 (1), 90-107 (2016).
  5. Brochet, M., et al. Phosphoinositide metabolism links cGMP-dependent protein kinase G to essential Ca(2)(+) signals at key decision points in the life cycle of malaria parasites. PLoS Biology. 12 (3), 1001806(2014).
  6. Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Saiardi, A. The signaling role of inositol hexakisphosphate kinases (IP6Ks). Advances in Enzyme Regulation. 51 (1), 74-82 (2011).
  7. Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics. Science. 334 (6057), 802-805 (2011).
  8. Cestari, I., Anupama, A., Stuart, K. Inositol polyphosphate multikinase regulation of Trypanosoma brucei life stage development. Molecular Biology of the Cell. 29 (9), 1137-1152 (2018).
  9. Bang, S., et al. AMP-activated protein kinase is physiologically regulated by inositol polyphosphate multikinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 616-620 (2012).
  10. Seeds, A. M., Tsui, M. M., Sunu, C., Spana, E. P., York, J. D. Inositol phosphate kinase 2 is required for imaginal disc development in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15660-15665 (2015).
  11. Hamada, K., Miyatake, H., Terauchi, A., Mikoshiba, K. IP3-mediated gating mechanism of the IP3 receptor revealed by mutagenesis and X-ray crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4661-4666 (2017).
  12. Watson, P. J., et al. Insights into the activation mechanism of class I HDAC complexes by inositol phosphates. Nature Communications. 7, 11262(2016).
  13. Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate. Nature. 481 (7381), 335-340 (2012).
  14. Irvine, R. F. Nuclear lipid signalling. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 4 (5), 349-360 (2003).
  15. Sobol, M., et al. UBF complexes with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in nucleolar organizer regions regardless of ongoing RNA polymerase I activity. Nucleus. 4 (6), 478-486 (2013).
  16. Nascimbeni, A. C., et al. ER-plasma membrane contact sites contribute to autophagosome biogenesis by regulation of local PI3P synthesis. EMBO Journal. 36 (14), 2018-2033 (2017).
  17. Martin, K. L., Smith, T. K. The myo-inositol-1-phosphate synthase gene is essential in Trypanosoma brucei. Biochemical Society Transactions. 33, Pt 5 983-985 (2005).
  18. Matsu-ura, T., et al. Cytosolic inositol 1,4,5-trisphosphate dynamics during intracellular calcium oscillations in living cells. Journal of Cell Biology. 173 (5), 755-765 (2006).
  19. Blind, R. D., et al. The signaling phospholipid PIP3 creates a new interaction surface on the nuclear receptor SF-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (42), 15054-15059 (2014).
  20. Lin, A., et al. The LINK-A lncRNA interacts with PtdIns(3,4,5)P3 to hyperactivate AKT and confer resistance to AKT inhibitors. Nature Cell Biology. 19 (3), 238-251 (2017).
  21. Steger, D. J., Haswell, E. S., Miller, A. L., Wente, S. R., O'Shea, E. K. Regulation of chromatin remodeling by inositol polyphosphates. Science. 299 (5603), 114-116 (2003).
  22. York, J. D., Odom, A. R., Murphy, R., Ives, E. B., Wente, S. R. A phospholipase C-dependent inositol polyphosphate kinase pathway required for efficient messenger RNA export. Science. 285 (5424), 96-100 (1999).
  23. Adams, R. L., Mason, A. C., Glass, L., Aditi,, Wente, S. R. Nup42 and IP6 coordinate Gle1 stimulation of Dbp5/DDX19B for mRNA export in yeast and human cells. Traffic. 18 (12), 776-790 (2017).
  24. Macbeth, M. R., et al. Inositol hexakisphosphate is bound in the ADAR2 core and required for RNA editing. Science. 309 (5740), 1534-1539 (2005).
  25. Dickson, E. J., Hille, B. Understanding phosphoinositides: rare, dynamic, and essential membrane phospholipids. Biochemical Journal. 476 (1), 1-23 (2019).
  26. Mellman, D. L., et al. A PtdIns4,5P2-regulated nuclear poly(A) polymerase controls expression of select mRNAs. Nature. 451 (7181), 1013-1017 (2008).
  27. Lee, Y. S., Mulugu, S., York, J. D., O'Shea, E. K. Regulation of a cyclin-CDK-CDK inhibitor complex by inositol pyrophosphates. Science. 316 (5821), 109-112 (2007).
  28. Nagy, A. I., et al. IP3 signalling regulates exogenous RNAi in Caenorhabditis elegans. EMBO Reports. 16 (3), 341-350 (2015).
  29. Hall, B. S., et al. TbVps34, the trypanosome orthologue of Vps34, is required for Golgi complex segregation. Journal of Biological Chemistry. 281 (37), 27600-27612 (2006).
  30. Rodgers, M. J., Albanesi, J. P., Phillips, M. A. Phosphatidylinositol 4-kinase III-beta is required for Golgi maintenance and cytokinesis in Trypanosoma brucei. Eukaryotic Cell. 6 (7), 1108-1118 (2007).
  31. Gilden, J. K., et al. The role of the PI(3,5)P2 kinase TbFab1 in endo/lysosomal trafficking in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 214, 52-61 (2017).
  32. Demmel, L., et al. The endocytic activity of the flagellar pocket in Trypanosoma brucei is regulated by an adjacent phosphatidylinositol phosphate kinase. Journal of Cell Science. 129 (11), 2285(2016).
  33. Gimenez, A. M., et al. Phosphatidylinositol kinase activities in Trypanosoma cruzi epimastigotes. Molecular and Biochemical Parasitology. 203 (1-2), 14-24 (2015).
  34. Hashimoto, M., et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor regulates replication, differentiation, infectivity and virulence of the parasitic protist Trypanosoma cruzi. Molecular Microbiology. 87 (6), 1133-1150 (2013).
  35. Cestari, I., Haas, P., Moretti, N. S., Schenkman, S., Stuart, K. Chemogenetic Characterization of Inositol Phosphate Metabolic Pathway Reveals Druggable Enzymes for Targeting Kinetoplastid Parasites. Cell Chemical Biology. 23 (5), 608-617 (2016).
  36. Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores. Journal of Biological Chemistry. 277 (29), 25870-25876 (2002).
  37. McNamara, C. W., et al. Targeting Plasmodium PI(4)K to eliminate malaria. Nature. 504 (7479), 248-253 (2013).
  38. Tresaugues, L., et al. Structural basis for phosphoinositide substrate recognition, catalysis, and membrane interactions in human inositol polyphosphate 5-phosphatases. Structure. 22 (5), 744-755 (2014).
  39. Varnai, P., et al. Quantifying lipid changes in various membrane compartments using lipid binding protein domains. Cell Calcium. 64, 72-82 (2017).
  40. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Letters. 590 (15), 2454-2468 (2016).
  41. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains--their role in signalling and membrane trafficking. Current Biology. 11 (21), 882-893 (2001).
  42. Klarlund, J. K., et al. Signaling by phosphoinositide-3,4,5-trisphosphate through proteins containing pleckstrin and Sec7 homology domains. Science. 275 (5308), 1927-1930 (1997).
  43. Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
  44. Gerasimaite, R., et al. Inositol Pyrophosphate Specificity of the SPX-Dependent Polyphosphate Polymerase VTC. ACS Chemical Biology. 12 (3), 648-653 (2017).
  45. Potapenko, E., et al. 5-Diphosphoinositol pentakisphosphate (5-IP7) regulates phosphate release from acidocalcisomes and yeast vacuoles. Journal of Biological Chemistry. 293 (49), 19101-19112 (2018).
  46. Wu, M., Chong, L. S., Perlman, D. H., Resnick, A. C., Fiedler, D. Inositol polyphosphates intersect with signaling and metabolic networks via two distinct mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6757-6765 (2016).
  47. Jungmichel, S., et al. Specificity and commonality of the phosphoinositide-binding proteome analyzed by quantitative mass spectrometry. Cell Reports. 6 (3), 578-591 (2014).
  48. Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei. Cell. 137 (1), 99-109 (2009).
  49. Cestari, I., Stuart, K. Transcriptional Regulation of Telomeric Expression Sites and Antigenic Variation in Trypanosomes. Current Genomics. 19 (2), 119-132 (2018).
  50. Clough, T., Thaminy, S., Ragg, S., Aebersold, R., Vitek, O. Statistical protein quantification and significance analysis in label-free LC-MS experiments with complex designs. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 6(2012).
  51. Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
  52. DeGrasse, J. A., Chait, B. T., Field, M. C., Rout, M. P. High-yield isolation and subcellular proteomic characterization of nuclear and subnuclear structures from trypanosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 77-92 (2008).
  53. Opperdoes, F. R. A rapid method for the isolation of intact glycosomes from Trypanosoma brucei by Percoll -gradient centrifugation in a vertical rotor. Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (3), 181-186 (1981).
  54. Pereira, N. M., de Souza, W., Machado, R. D., de Castro, F. T. Isolation and properties of flagella of trypanosomatids. The Journal of protozoology. 24 (4), 511-514 (1977).
  55. Subota, I., et al. Proteomic analysis of intact flagella of procyclic Trypanosoma brucei cells identifies novel flagellar proteins with unique sub-localization and dynamics. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (7), 1769-1786 (2014).
  56. Fukuda, M., Kojima, T., Kabayama, H., Mikoshiba, K. Mutation of the pleckstrin homology domain of Bruton's tyrosine kinase in immunodeficiency impaired inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate binding capacity. Journal of Biological Chemistry. 271 (48), 30303-30306 (1996).
  57. Knodler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. BioTechniques. 38 (6), (2005).
  58. Best, M. D. Global approaches for the elucidation of phosphoinositide-binding proteins. Chemistry and Physics of Lipids. 182, 19-28 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Trypanosoma bruceiinterakcje bia kowebiotynilowany metabolitagaroza z streptawidyntest wi zania

Powiązane artykuły