Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rekonstytucja rekombinowanej Drosophila Atlastin w liposomach wspomagana detergentami do testów mieszających lipidy

7.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59867

⸱

3 lipca 2019

 , 
1Department of BioSciences, Rice University

W tym artykule

Podsumowanie

Biologiczna fuzja błonowa jest katalizowana przez wyspecjalizowane białka fuzyjne. Pomiar właściwości fuzogennych białek można osiągnąć za pomocą testów mieszania lipidów. Przedstawiamy metodę oczyszczania rekombinowanej atlastyny Drosophila, białka pośredniczącego w homotypowej fuzji ER, odtwarzaniu go do wstępnie uformowanych liposomów i testowaniu zdolności fuzyjnej.

Streszczenie

Fuzja błonowa jest kluczowym procesem w komórce eukariotycznej. Wyspecjalizowane białka są niezbędne do katalizowania fuzji. Atlastyny są białkami rezydującymi w retikulum endoplazmatycznym (ER) zaangażowanymi w homotypową fuzję ER. Szczegółowo opisujemy tutaj metodę oczyszczania S-transferazy glutationowej (GST) i polihistydyny znakowanej atlastyną Drosophila za pomocą dwóch rund chromatografii powinowactwa. Badanie reakcji fuzyjnych in vitro wymaga wprowadzenia oczyszczonych białek fuzyjnych do dwuwarstwy lipidowej. Liposomy są idealnymi błonami modelowymi, ponieważ skład lipidowy i wielkość mogą być regulowane. W tym celu opisujemy metodę rekonstytucji poprzez usuwanie detergentu dla atlastyny Drosophila do wstępnie uformowanych liposomów. Chociaż dostępnych jest kilka metod rekonstytucji, rekonstytucja przez usunięcie detergentu ma kilka zalet, które sprawiają, że nadaje się do atlastin i innych podobnych białek. Zaletą tej metody jest wysoka wydajność rekonstytucji i prawidłowa orientacja odtworzonego białka. Metodę tę można rozszerzyć na inne białka błonowe i do innych zastosowań, które wymagają proteoliposomów. Dodatkowo opisujemy test mieszania lipidów proteoliposomów oparty na FRET, stosowany jako pomiar fuzji błonowej.

Wprowadzenie

Fuzja membranowa jest krytycznym procesem w wielu reakcjach biologicznych. W warunkach biologicznych fuzja błonowa nie jest spontaniczna i wymaga wyspecjalizowanych białek fuzyjnych do katalizowania takich reakcji1. Homotypowa fuzja błonowa ER jest pośredniczona u zwierząt przez atlastynę GTPazy związanej z dynaminą2. Rola Atlastyny w fuzji homotypowej ma fundamentalne znaczenie dla połączeń trójdrożnych w obwodowym ER, które stanowią dużą, wzajemnie połączoną sieć kanalików rozciągających się w całej komórce. Atlastyny mają zachowaną morfologię domeny składającą się z dużej GTPazy, środkowej domeny z trzema wiązkami helis, hydrofobowej kotwicy błonowej i krótkiego cytoplazmatycznego C-końcowego ogona3. Badania in vitro z rekombinowaną atlastyną Drosophila wykazały, że po rozpuszczeniu do liposomów zachowuje swoje właściwości fuzogenne. Inne atlastyny, w tym ludzkie homologi, nie były w stanie podsumować fuzji in vitro. Opisujemy tutaj metodologię oczyszczania rekombinowanej atlastyny Drosophila znakowanej GST i polihistydyną, odtwarzania jej do liposomów i oznaczania fuzji.

Badanie fuzji błonowej in vitro stanowi wyzwanie, ponieważ białka fuzogeniczne zazwyczaj mają kotwicę błonową. W celu ich zbadania konieczne jest odtworzenie ich do modelowych dwuwarstw lipidowych. Duże pęcherzyki jednowarstwowe (LUV) są użytecznym narzędziem do badania interakcji białek lipidowych. Przedstawiamy tutaj system do wytwarzania LUV o różnym składzie lipidowym do testów rekonstytucji białek i fuzji. Rekonstytucja integralnych białek w LUV może być osiągnięta za pomocą różnych metod, w tym rekonstytucji za pośrednictwem rozpuszczalnika organicznego, mechanizmów mechanicznych lub rekonstytucji wspomaganej detergentem4. Przedstawiamy tutaj metodę rekonstytucji atlastyny Drosophila do wstępnie uformowanych liposomów poprzez usunięcie detergentem. Zaletą tej metody rekonstytucji jest wysoka wydajność rekonstytucji i prawidłowa orientacja atlastyny w dwuwarstwie lipidowej. Dodatkowo, dzięki tej metodzie, białko nie jest suszone ani wystawiane na działanie rozpuszczalników organicznych, dzięki czemu zachowuje strukturę i funkcję. Jedną z jego wad jest obecność detergentów może nie być idealna dla wszystkich białek, a końcowe proteoliposomy mogą mieć pewien detergent wbudowany w dwuwarstwę lipidową. Można zastosować dalszą dializę w celu wyeliminowania większej ilości detergentu. Jednak dializa może trwać długo i dlatego może prowadzić do utraty aktywności białka.

Ocena aktywności fuzji atlastyny może być określona za pomocą testów mieszania lipidów, jak opisano wcześniej2. W tym miejscu przedstawiamy metodę pomiaru fuzji za pośrednictwem atlastyny przez lipidy znakowane N-(7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazolo-4-ylem (NBD)/lizzaminą rodaminę-B sulfonyl (rodamina). Ten test wymaga fuzji proteoliposomów donorowych (znakowanych) i proteoliposomów akceptorowych (nieznakowanych). Uwalnianie FRET można zmierzyć podczas reakcji jako rozcieńczenie pary donor-akceptor z "znakowanych" liposomów do "nieznakowanych" liposomów w wyniku mieszania lipidów podczas fuzji błonowej (Rysunek 1)5. Chociaż test ten służy jako wskaźnik zastępczy dla fuzji błonowej, jest ograniczony w rozróżnianiu między fuzją błonową a hemifuzją, stanem, w którym mieszają się tylko zewnętrzne płatki. Aby rozwiązać ten problem, alternatywą jest zewnętrzne wygaszanie NBD za pomocą ditionitu. Zgodnie z tą samą metodologią, co w przypadku testów mieszania lipidów NBD/rodaminy, po wygaszeniu zewnętrznej ulotki wszelkie uwolnienie NBD FRET przez fuzję będzie spowodowane mieszaniem wewnętrznej ulotki8.

Alternatywne testy fuzji za pomocą wewnętrznego mieszania zawartości wodnej tylko pełne połączenie 5. Przykładami tego są testy terbu (Tb)/kwasu dipikolinowego (DPA) i testy kwasu aminonaftalenotrisulfonowego (ANTS)/bromku p-ksylenu bis(pirydyny) (DPX). W testach Tb / DPA pula liposomów z enkapsulowaną Tb jest mieszana i łączona z liposomami z enkapsulowanym DPA; po fuzji fluorescencja jest zwiększana poprzez wewnętrzny transfer energii z DPA do Tb w [Tb(DPA)3]3- kompleksie chelatacyjnym6. W przeciwieństwie do tego, w przypadku testów ANTS/DPX, fluorescencja ANTS jest wygaszana przez DPX7. Podczas gdy systemy te zajmują się mieszaniem zawartości wewnętrznej, wymagane jest bardziej dogłębne przygotowanie liposomów w celu usunięcia niekapsułkowanych odczynników, a także niezamierzonej interakcji fluoroforów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Oczyszczanie białka GST-DAtl-His8

  1. Ekspresja białka i przygotowanie lizatu
    1. Przekształć szczep BL21 (DE3) E. coli konstruktem GST-DAtl-His8 w wektorze pGEX4-T32 i wyselekcjonuj kolonie na płytce z ampicyliną.
    2. Wybierz pojedynczy transformant i zaszczep 5 mL LB + ampicylina (5 µL ampicyliny 100 mg/mL) w probówce do hodowli o pojemności 14 mL, a następnie inkubuj w temperaturze 25 °C przy wytrząsaniu z prędkością 200 rpm przez 6-8 h.
      UWAGA: Ze względu na nieszczelną ekspresję (leaky expression) nie zaleca się inkubacji w wyższych temperaturach. Wzrost w temperaturze 25 °C ogranicza agregację białka w tym okresie wzrostu.
    3. Zaszczep 200 mL LB + ampicylina za pomocą 1 mL hodowli wstępnej (5 mL) i inkubuj przez noc (~15–18 h) w temperaturze 25 °C.
    4. Następnego dnia rano zbierz komórki przez wirowanie (2,000 x g przez 10 min) i resuspenduj w 5 mL LB.
    5. Zaszczep 4 L LB + ampicylina i zmierz OD600 (0.05–0.15). Inkubuj w temperaturze 25 °C z wytrząsaniem.
      UWAGA: Odstaw niewielką ilość pożywki do wykorzystania jako wzorca (blank) podczas pomiarów OD600 przed dodaniem bakterii.
    6. Mierz OD600 co godzinę, aż osiągnie wartość w zakresie 0.4–0.5. W tym momencie obniż temperaturę do 16 °C.
    7. Indukuj ekspresję za pomocą 0.2 mM IPTG (800 µL roztworu stokowego 1 M), 10 min po tym, jak inkubator osiągnie 16 °C. Inkubuj przez noc (~15–18 h) w temperaturze 16 °C.
      UWAGA: Niższa temperatura zwiększa wydajność funkcjonalnego białka poprzez ograniczenie agregacji atlastyny.
    8. Następnego dnia rano zbierz komórki przez wirowanie przy 7,500 x g w temperaturze 4 °C.
    9. Resuspenduj komórki w 200 mL buforu A200 (25 mM HEPES (pH 7.4) i 200 mM KCl).
    10. Wiruj komórki przy 11,000 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
    11. Resuspenduj osad w 40 mL buforu do lizy (A200 plus 10% glicerolu, 2 mM 2-merkaptoetanolu, 4% Triton X-100 (TX100), 40 mM imidazolu oraz jednej tabletki koktajlu inhibitorów proteaz bez EDTA).
      UWAGA: Dodaj TX-100 po resuspensji, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza i piany.
    12. Przepuść zawiesinę przez igłę 18 G, a następnie trzykrotnie przepuść komórki przez homogenizator wysokociśnieniowy przy ciśnieniu ~10,000 psi.
    13. Wiruj ekstrakt przy 125,000 x g przez 1 h.
      UWAGA: Opcjonalnie rozpuść osad w stosunku 1:2 (w:v) w 8 M mocznika i inkubuj na rotatorze w temperaturze pokojowej przez noc. Mocznik jako denaturant powoli rozpuści wszelkie nierozpuszczalne białka w osadzie do analizy SDS-PAGE. Odstaw 1 μL do analizy SDS-PAGE i barwienia Coomassie.
    14. Przefiltruj ekstrakt przez sterylną membranę z azotanu celulozy o porach 0.45 µm, aby usunąć bakterie i duże fragmenty komórkowe.
      UWAGA: Opcjonalnie odstaw 1 μL do analizy SDS-PAGE i barwienia Coomassie.
  2. Oczyszczanie białka za pomocą chromatografii powinowactwa
    1. Nałóż przefiltrowany lizat na kolumnę z żywicą do chromatografii powinowactwa do jonów metali (IMAC) naładowaną Ni2+, uprzednio ekwilibrowaną buforem z niską zawartością imidazolu (A100 plus 10% glicerolu, 2 mM 2-merkaptoetanolu, 1% TX-100, 40 mM imidazolu) z prędkością 1 mL/min w temperaturze 4 °C.
    2. Przemyj kolumnę 25 mL buforu A100 plus 10% glicerolu, 2 mM 2-merkaptoetanolu, 0.1% Anapoe X-100, 40 mM imidazolu z prędkością 1 mL/min w temperaturze 4 °C. Eluuj białko gradientem liniowym imidazolu od 40 mM do 500 mM w objętości 30 mL, a następnie wykonaj końcowe przemywanie 5 mL buforu 500 mM.
    3. Połącz frakcje szczytowe i inkubuj przez 1 h w temperaturze 4 °C z napęczniałymi ziarnami GSH-Agarose, uprzednio napęcznianymi w wodzie i ekwilibrowanymi w buforze A100 z 10% glicerolem, 2 mM 2-merkaptoetanolem, 0.1% Anapoe X-100 i 1 mM EDTA.
      UWAGA: Ziarna GSH-Agarose można napęcznieć w 50 mL wody dzień wcześniej i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 1 h w temperaturze pokojowej. Aby usunąć wodę i bufor ekwilibrujący, wiruj w rotorze z koszyczkami wahadłowymi przy 500 x g przez 1 min bez hamowania. Odessij nadsącz za pomocą igły 26 G.
    4. Zwiruj ziarna GSH-Agarose w rotorze z koszyczkami wahadłowymi przy 500 x g bez hamowania i usuń nadsącz lizatu poprzez aspirację igłą 26 G.
    5. Przenieś ziarna do kolumny polyprep 10 mL i przemyj pięciokrotnie 5 mL buforu ekwilibrującego (A100 z 10% glicerolem, 2 mM 2-merkaptoetanolem, 0.1% Anapoe X-100 i 1 mM EDTA), wirując przy 500 x g.
    6. Eluuj białko za pomocą 1–1.5 mL buforu ekwilibrującego uzupełnionego o 10 mM zredukowanego glutationu. Rozdziel eluat na alikwoty i zamroź gwałtownie w ciekłym azocie. Białko można przechowywać w temperaturze -80 °C w nieokreślonym czasie.
      UWAGA: Dostosuj pH buforu elucyjnego do 7.4.
    7. Oznacz stężenie białka za pomocą testu amido black9 i oceń czystość za pomocą SDS-PAGE i barwienia Coomassie.

2. Rekonstytucja rekombinowanej atlastyny w liposomach

  1. Produkcja liposomów metodą ekstruzji10
    1. Przygotować zapasy mieszanin lipidowych w chloroformie (całkowite stężenie lipidów 10 mM). Wymagane lipidy to 1-palmitoylo-2-oleoylo-glycero-3-fosfocholina (POPC), 1,2-dioleoylo-sn-glycero-3-fosfo-L-seryna (DOPS), 1,2-dioleoylo-sn-glycero-3-fosfoetanoloamina-N-(7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-ylo) (NBD-DPPE) oraz 1,2-dipalmitoylo-sn-glycero-3-fosfoetanoloamina-N-(lisamina rodamina B sulfonyl) (Rh-DPPE). Liposomy akceptorowe składają się z POPC:DOPS (stosunek molowy 85:15), a liposomy donorowe z POPC:DOPS:Rh-PE:NBD-PE (stosunek molowy 83:15:1,5:1,5).
      UWAGA: Choć mieszaniny lipidowe POPC:DOPS są tradycyjnie stosowane w testach mieszania lipidów in vitro, dla różnych celów eksperymentalnych można zastosować alternatywne składy lipidowe. Liposomy POPC:DOPS są bardzo stabilne i trudniej ulegają fuzji, stanowiąc zatem bardzo rygorystyczny system do badań fuzji.
    2. Do mieszanin lipidowych dodać 1 μCi/mL L-α-dipalmitoylo-fosfatydylocholiny (cholina metyl-3H) w celu późniejszego oznaczenia stężeń lipidów za pomocą cieczscyntylacyjnego licznika. Odłożyć co najmniej 8 μL tego zapasu.
    3. Przenieść odpowiednią ilość mieszanin lipidowych do probówek ze szkła kwarcowego.
    4. Osuszyć mieszaniny lipidowe pod delikatnym strumieniem gazu N2 przez ok. 10 min, aż chloroform przestanie być widoczny.
    5. Dalej suszyć film lipidowy w deskrykatorze pod próżnią przez 30 min.
    6. Dodać do filmu lipidowego odpowiednią ilość roztworu wodnego A100 z 10% glicerolem, 2 mM 2-merkaptoetanolem i 1 mM EDTA, aby przywrócić stężenie do poziomu 10 mM. Resuspendować film lipidowy, lekko mieszając w wstrząsarze Vortex przez 15 min w temperaturze pokojowej. Zaleca się użycie wstrząsara Vortex przystosowanego do probówek ze szkła kwarcowego.
    7. Poddać uwodnione lipidy dziesięciokrotnemu cyklowi zamrażania i rozmrażania w ciekłym azocie. Po zamrożeniu w ciekłym azocie rozmrozić liposomy, pozostawiając roztwór w temperaturze pokojowej na 30 s, a następnie przenieść do wody w celu przyspieszenia rozmrażania. Cykle zamrażania i rozmrażania zminimalizują obecność pęcherzyków wielowarstwowych.
      OSTROŻNIE: Probówki mogą pęknąć, jeśli zawierają objętość większą niż 0,5 mL i zostaną przeniesione bezpośrednio z ciekłego azotu do wody.
    8. Przepuścić lipidy 19 razy przez filtry z poliwęglanu o rozmiarze porów 100 nm, używając mini-ekstrudera.
    9. Oznaczanie całkowitego stężenia lipidów w liposomach za pomocą licznika scyntylacyjnego
      UWAGA: Część lipidów może pozostać w probówkach szklanych i w mini-ekstruderze.
      1. Dodać 4 μL zapasu lipidów oraz liposomów do 3 mL koktajlu scyntylacyjnego.
      2. Zmierzyć średnią liczbę zliczeń na minutę (CPMA) dla zapasu i liposomów. Następnie obliczyć stężenie liposomów według następującego wzoru: Wzór na stężenie liposomów, stosunek CPMA; naukowa metoda obliczeniowa, równanie chemiczne.
    10. Przechowywać liposomy w temperaturze 4 °C do tygodnia. Dłuższe przechowywanie nie jest zalecane, ponieważ liposomy mogą z czasem ulegać agregacji, co obniża wydajność rekonstytucji.
  2. Rekonstytucja poprzez wbudowywanie wspomagane detergentem do preformowanych liposomów
    1. Obliczyć ilość buforu, białka, liposomów i dodatkowego detergentu do zmieszania:
      1. Ustalić pożądaną objętość całkowitą. Objętość ta składa się z buforu A100 z 10% glicerolem, 2 mM 2-merkaptoetanolem i 1 mM EDTA. Objętości mniejsze niż 250 μL nie mieszają się dobrze w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL.
      2. Obliczyć objętość liposomów potrzebną do uzyskania końcowego stężenia lipidów na poziomie ok. 1 mM. Odejmować tę objętość od objętości buforu.
      3. Obliczyć objętość białka potrzebną do uzyskania pożądanego stosunku molowego białka do lipidów (zazwyczaj 1:400). Odpowiednio zmniejszyć objętość buforu.
      4. Ustalić, ile dodatkowego detergentu należy dodać w celu nasycenia liposomów, dążąc do efektywnego stosunku detergentu do lipidów (Reff) w zakresie 0,64–0,8. Należy pamiętać o detergencie dodawanym wraz z białkiem. Wartość (Reff) określa równanie Wzór na efektywny współczynnik załamania, \(R_{\text{eff}} = \frac{{D_{\text{total}} - D_{\text{water}}}}{[\text{lipid}]}\)., gdzie Dtotal to całkowite stężenie detergentu, a Dwater to stężenie monomeru detergentu (0,18 mM dla TX-100 i Anapoe X-100 w obecności detergentu)4,11.
    2. Zmieszać roztwory w probówce 0,5 mL w następującej kolejności: bufor, detergent, białko i liposomy. Dodać liposomy szybko i natychmiast zmieszać w wstrząsarze Vortex przez 5 s, aby uhomogenizować mieszaninę.
    3. Inkubować reakcję w nutatorze przez 1 h w temperaturze 4 °C.
    4. Przygotować „zawiesinę” niepolarnych kulek adsorbentu polistyrenowego o stężeniu 0,2 g/mL w wodzie.
      UWAGA: „Zawiesinę” kulek adsorbentu polistyrenowego należy przygotować podczas poprzedniej 1-godzinnej inkubacji w kroku 2.2.3.
    5. Odważyć 0,2 g kulek adsorbentu polistyrenowego i przenieść je do probówki do mikrocentryfugi.
    6. Odgazować kulki, dodając do probówki 1 mL metanolu i mieszając przez 1 min. Odgazowane kulki opadną na dno.
    7. Odssać metanol i dodać do kulek wodę. Pozostawić kulki do wymieszania z wodą przez 5 min, a następnie odessać wodę. Powtórzyć czynność cztery razy, a następnie uzupełnić „zawiesinę” kulek adsorbentu polistyrenowego wodą do objętości 1 mL, aby uzyskać końcowe stężenie 0,2 g/mL.
      UWAGA: Kulki powinny nadal opadać na dno probówki. Jeśli tak się nie dzieje, odgazować ponownie. Do odsysania metanolu i wody z kulek używać igły 21 G lub większej.
    8. Obliczyć ilość kulek adsorbentu polistyrenowego potrzebną do zaabsorbowania całego detergentu w każdej próbce. 1 g kulek adsorbentu polistyrenowego absorbuje 70 mg TX-100. Aby obliczyć objętość zawiesiny kulek adsorbentu polistyrenowego potrzebną do każdej reakcji, podzielić całkowitą ilość detergentu w reakcji (krok 2.2.1.4) przez 70 mg, a następnie przez stężenie zawiesiny kulek (0,2 g/mL (krok 2.2.7).
    9. Przenieść obliczoną ilość zawiesiny kulek adsorbentu polistyrenowego do probówki 0,5 mL i odessać wodę.
      UWAGA: Aby przenieść kulki, należy odciąć koniec końcówki 20–200 µL; probówkę należy zawirrować w wstrząsarze Vortex tuż przed pipetowaniem, aby resuspendować osadłe kulki.
    10. Dodać próbki do probówki 0,5 mL zawierającej kulki adsorbentu polistyrenowego i inkubować próbkę w nutatorze przez 1 h w temperaturze 4 °C.
    11. Powtórzyć czynność dwukrotnie, pozostawiając stare kulki i przenosząc próbkę do świeżych kulek.
    12. Przenieść próbkę do czwartej probówki ze świeżymi kulkami i inkubować przez noc (~15–18 h) w temperaturze 4 °C.
  3. Rano oddzielić próbkę od kulek adsorbentu polistyrenowego i odwirować nierozpuszczalne agregaty białkowe, wirując przez 10 min przy 16 000 x g w temperaturze 4 °C.
  4. Zebrać nadsącz i oznaczyć końcowe stężenie lipidów za pomocą cieczscyntylacyjnego licznika (patrz krok 2.1.9.2). Opcjonalnie stężenie białka można oznaczyć za pomocą testu białek Amido Black9.
    UWAGA: W przypadku proteoliposomów atlastyny testy enzymatyczne należy przeprowadzać na świeżych liposomach. Długie przechowywanie w temperaturze 4 °C lub zamrażanie prowadzi do znacznemu spadku aktywności atlastyny.

3. Testy mieszania lipidów

  1. Doprowadzić proteoliposomy donora i akceptora do stężenia 0,15 mM każdego w buforze A100 z 10% glicerolem, 2 mM β-merkaptoetanolem, 1 mM EDTA i 5 mM MgCl2. Każdą reakcję (50 μL) należy dodać do dołka płaskiej, białej płytki 96-dołkowej odpowiedniej do pomiarów fluorescencji. Przygotować co najmniej 4 reakcje, w tym próbę potrójną oraz negatywną kontrolę bez GTP.
  2. Umieścić płytkę w wstępnie podgrzanym czytniku płytek w temperaturze 37 °C. Pomiar fluorescencji NBD (wzbudzenie 460 nm i emisja 535 nm) prowadzić przez 5 min w odstępach jednominutowych.
  3. Indukować fuzję poprzez dodanie 5 mM GTP (5 μL roztworu 50 mM GTP).
  4. Pomiar fluorescencji NBD prowadzić co minutę przez 1 h.
  5. Dodać 5 μL 2,5% w/v n-dodecyl-β-D-maltosidu w celu rozpuszczenia proteoliposomów i zmierzyć maksymalną fluorescencję NBD. Pomiar fluorescencji NBD prowadzić przez 15 min w odstępach jednominutowych.

4. Flotacja liposomów w nieciągłym gradiencie Iohexolu12

  1. (opcjonalnie) Przeanalizować wydajność rekonstytucji za pomocą testów flotacyjnych13.
  2. Przygotować 80% i 30% (w/v) roztwór iohexolu w buforze A100 z dodatkiem 10% glicerolu, 2 mM 2-merkaptoetanolu i 1 mM EDTA. Iohexol nie rozpuszcza się łatwo, dlatego roztwór ten należy przygotować dzień wcześniej, inkubując go przez noc w mieszalniku nutacyjnym w temperaturze 4 °C.
  3. Dokładnie zmieszać 150 μL 80% roztworu iohexolu z 150 μL próbki proteoliposomów, aby uzyskać stężenie 40% iohexolu. Przenieść mieszaninę do probówki Ultra-clear o wymiarach 5 x 41 mm2, unikając powstawania pęcherzyków powietrza.
  4. Powoli nanieść 250 μL 30% roztworu iohexolu na wierzch próbki, tworząc warstwę środkową. Należy unikać powstawania pęcherzyków i zaburzania warstwy dolnej. Na warstwę środkową powoli dodać 50 μL buforu A100 z 2 mM 2-merkaptoetanolem i 1 mM EDTA.
  5. Wirować gradient w rotorze z kątowo-ruchomymi koszykami przy 220,000 x g przez 4 h w temperaturze 4 °C, stosując powolne przyspieszanie i wyłączając hamowanie.
  6. Zebrać warstwy gradientu i przeanalizować je za pomocą SDS-PAGE oraz barwienia Coomassie; kwantyfikację można przeprowadzić metodą densytometrii. Rekonstytuowane białko powinno wypłynąć do górnej warstwy, natomiast agregaty białkowo-lipidowe osadzą się na dnie lub w warstwie środkowej.

5. Analiza orientacji zrekonstytuowanego białka za pomocą proteolizy trombiną

UWAGA: Opisany tutaj konstrukt atlastyny posiada miejsce cięcia trombiną pomiędzy końcem N-końcowego znacznika GST a początkiem atlastyny. Atlastyna w prawidłowej orientacji będzie miała to miejsce cięcia dostępne dla proteazy, natomiast białko w błędnej orientacji będzie chronione przez dwuwarstwę lipidową.

  1. Aby ocenić orientację proteoliposomów atlastyny, należy odłożyć co najmniej 8 μL świeżo zrekonstytuowanych proteoliposomów.
  2. Dodać 8 μL proteoliposomów oraz 1 μL trombiny w stężeniu 1 U/μL. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 h.
  3. Zneutralizować proteazę, dodając 1 μL koktajlu inhibitorów proteaz bez EDTA w stężeniu 5 mg/mL, a następnie inkubować przez 30 min w temperaturze 37 °C.
  4. Próbkę analizować za pomocą SDS-PAGE i barwienia Coomassie. Proporcję białka pociętego i niepociętego można wyznaczyć za pomocą densytometrii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wydajność rekonstytucji atlastyny przedstawiono na Rysunku 2. Rekonstytuowane proteoliposomy oddzielono w nieciągłym gradiencie ioheksolu. Białko nieinkorporowane osiadło w warstwie dolnej (B) lub środkowej (M). Białko rekonstytuowane unosiło się do warstwy górnej (T). Próbki z gradientu pobrano i poddano analizie za pomocą SDS-PAGE oraz barwienia Coomassie. Ilościowa analiza żelu za pomocą densytometrii wykazuje bardzo wysoką wydajność rekonstytucji przy pomijalnych stratach; 96% całkowitej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawione tu metody określają skuteczną metodę oczyszczania, odtwarzania i pomiaru aktywności fuzji rekombinowanej atlastyny. Aby zapewnić wysokie plony funkcjonalnego atlastinu, należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych kroków. Ekspresja atlastyny musi odbywać się w niskich temperaturach (16 °C), aby uniknąć agregacji i należy dążyć do uzyskania końcowego stężenia między 0,4–1,5 mg/ml. Bardzo rozcieńczone białko nie zostanie optymalnie odtworzone w stosunku białka do lipidów wynoszącym 1:400. Skuteczność rekonstytucj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. Michaelowi Sternowi i jego laboratorium za ich spostrzeżenia i opinie na temat projektów związanych z atlastyną. Prace te były wspierane przez Narodowy Instytut Ogólnych Nauk Medycznych [R01GM101377] oraz Narodowy Instytut Zaburzeń Neurologicznych i Udaru Mózgu [R01NS102676].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolumny chromatograficzne poli-prep 10 ml Biored731-1550
10 mm x 75 mm Rurki ze szkła krzemiennegoVWR608225-402
Średnica 47 mm, 0,45 μ m pore Whatman sterylne filtry membranoweWhatman7141 104
96 well biała płytkaNUNC437796
Anapoe X-100Anatrace9002-931-1
Zakłócacz rozwoju komórekAvestinAvestin Emulsiflex C3
DOPS (1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-phospho-L-seryna (sól sodowa))Avanti840035P-10mgDOPS
EDTAResearch organics inc.6381-92-6Kwas etylenodiaminotetraoctowy
koktajl inhibitorów proteazy bez EDTARoche11873580001Kompletny inhibitor proteazy
WytłaczarkaSigma AldrichZ373400 Podstawowa wytłaczarka Liposofast
System chromatografii cieczowej GE Akta PrimeGE Pharmacia8149-30-0006
Koraliki agarozy glutationowejSigma aldrichG4510-50ml
GlicerolEMDGX0185-5
GTPSigma Aldrich36051-31-7Hydrat soli sodowej 5' trifosforanu guanozyny
HEPES, bezkwasowyOmnipur5330
Imidazolfluka5670
Immobilizowana chromatografia powinowactwa do metalu (IMAC) kolumna żywicznaGE Healthcare170408011 mL HiTrap Chelating HP Kolumny do chromatografii immobilizowanej powinowactwa do metali
IohexolDokładna korporacja chemiczna i naukowaAN 7050 BLKAccudenz/Nycodenz
IPTGResearch products international corp.I56000-100.0IPTG, L-glutation bez dioksanu
zredukowanySigma-AldrichG4251-5g
Chlorek magnezuFisher7791-18-6
MetanolOmnisolvMX0488-1
NBD-DPPE (1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-(7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-ylo) (sól amonowa))Avanti236495NBD-DPPE
n-Dodecyl β-D-maltozydChem-Impex International21950
Niepolarne kulki adsorbentowe z polistyrenuBioRad152-3920SM2 Biokoraliki
Nuclepore track-etch poliwęglan 19 mm 0,1 μ m membrana porowaWhatman800309
Optima LE80K Ultra wirówkaBeckman Coulter
Fosfatydylocholina, L-&alfa;-dipalmitoilo [cholina metylo-3H]ARCART0284Lipidy miareczkowane
Czytnik płytekTECAN TECAN infinite M200
POPC (1-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfocholina)Avanti850457C-25mgPOPC
Chlorek potasuMP151944
Rh-DPPE (1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-(lisamina rodamina B sulfonyl) (sól amonowa))Avanti236495Rh-DPPE
Koktajl scyntylacyjnyNational DiagnosticsLS-272Ecoscint XR Roztwór scyntylacyjny do próbek wodnych lub niewodnych
Scyntylacja fiolkiBeckman592928Szybkoobrotowa nasadka Mini Poly-Q Fiolka
TrombinSigmaT1063-1kUTrombina z ludzkiego osocza
Triton X-100FisherBP151-500
Ultra-przezroczyste probówki wirówkowe 5 mm x 41 mmBeckman344090
Vortex 9 do 13 mm Uchwyt na probówkiVWR58816-138Wkładka do wirowania rurek
ze szkła krzemiennegoWorek ustalający Vortex VWR58816-132Ustalacz potrzebny do uchwytu rurki wirowej
VortexerVWR2.235074Vortex Genie 2 model G560
β-merkaptoetanol klasa biologii molekularnejCalbiochem444203

Bibliografia

  1. Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. Mechanics of membrane fusion. Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).
  2. Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin. Nature. 460, 978-983 (2009).
  3. McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F. GTP-dependent membrane fusion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 529-550 (2013).
  4. Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).
  5. Düzgüneş, N. Fluorescence Assays for Liposome Fusion. Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).
  6. Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents. Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).
  7. Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes. Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).
  8. Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).
  9. Schaffner, W., Weissmann, C. A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution. Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).
  10. MacDonald, R. C., et al. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).
  11. Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate. Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).
  12. Scott, B. L., et al. Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines. Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).
  13. Zhang, W., et al. Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association. PNAS. 114, 8550-8555 (2017).
  14. Parlati, F., et al. Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the α-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain. PNAS. 96, 12565-12570 (1999).
  15. Sugiura, S., Mima, J. Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p. Scientific Reports. 6, 20407(2016).
  16. Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543, 257-260 (2017).
  17. Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer. Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rekonstytucja liposom wusuwanie detergentumieszanie lipid w FRETtest fuzji b ontworzenie proteoliposom wmodel dwuwarstwy lipidowejchromatografia powinowactwaanaliza SDS PAGEfluorescencja NBD
Rekonstytucja rekombinowanej Drosophila Atlastin w liposomach wspomagana detergentami do testów mieszających lipidy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.