Artykuł metodologiczny

Dostrajanie degradacji w celu osiągnięcia specyficznego i wydajnego zubożenia białek

7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59874

⸱

20 lipca 2019

 ,  ,  ,  , 
1Wellcome Centre for Cell Biology, School of Biological Sciences, University of Edinburgh, 2Department of Plant Sciences, University of Cambridge, 3Sir William Dunn School of Pathology, University of Oxford

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół skutecznego i specyficznego usuwania interesującego białka w drożdżach Saccharomyces cerevisiae za pomocą systemu AID β-est.

Streszczenie

Receptor wiązania auksyny roślinnej, TIR1, rozpoznaje białka zawierające specyficzny motyw degronu indukowanego auksyną (AID) w obecności auksyny, kierując je do degradacji. System ten jest wykorzystywany w wielu nieroślinnych eukariontach, tak że docelowe białko, oznaczone motywem AID, ulega degradacji po dodaniu auksyny. Poziom ekspresji TIR1 jest krytyczny; nadmierna ekspresja prowadzi do degradacji białka znakowanego przez AID, nawet przy braku auksyny, podczas gdy niska ekspresja prowadzi do powolnego wyczerpania. Stworzono system AID indukowany β-estradiolem, z ekspresją TIR1 pod kontrolą promotora indukowanego β-estradiolem. Poziom TIR1 można dostosować poprzez zmianę czasu inkubacji z β-estradiolem przed dodatkiem auksyny. Protokół ten opisuje, w jaki sposób szybko wyczerpać docelowe białko za pomocą systemu AID. Odpowiedni czas inkubacji β-estradiolu zależy od obfitości białka docelowego. Dlatego skuteczne zubożenie zależy od optymalnego czasu, który minimalizuje również zubożenie niezależne od auksyny.

Wprowadzenie

Mutacje warunkowe, takie jak mutanty wrażliwe na temperaturę, są potężnym narzędziem do badania podstawowych białek, umożliwiając wzrost komórek w warunkach permisywnych, ale powodując utratę funkcji w warunkach niedozwolonych. Jednak metabolizm komórkowy może być poważnie zaburzony przez zmianę warunków wzrostu wymaganych do wywołania defektu, a także może powodować efekty niezamierzone. Opracowano kilka metod, w których białko będące przedmiotem zainteresowania jest warunkowo sekwestrowane1 lub jego ekspresja jest kontrolowana2,3 poprzez dodanie małej cząsteczki. Protokół ten wykorzystuje auksynę i system degronu indukowanego auksyną (AID) w celu skutecznego zubożenia białka docelowego.

System AID wywodzi się z roślin, gdzie auksyna (w tym protokole używany jest kwas indolo-3-octowy (IAA)), stymuluje oddziaływanie białka Aux/IAA z TIR1, członkiem kompleksu ligazy ubikwityny SCF U34. Interakcja kompleksu SCF powoduje poliubikwitynację białek z rodziny Aux/IAA, co skutkuje ich degradacją przez proteasom5,6.

Ten system został wcześniej zaadaptowany do użycia w drożdżach Saccharomyces cerevisiae7,8 poprzez ekspresję białka TIR1 z Oriza sativa (osTIR) w komórkach drożdży, gdzie jest w stanie oddziaływać z endogennym kompleksem drożdży SCF. Interesujące białko zostało oznaczone motywem z białka Aux/IAA IAA17, aby skierować je do degradacji. Funkcjonalne skróty IAA17 zostały opracowane później, takie jak AID*8,9,10, zawierające 43-aminokwasowy motyw wrażliwy na auksynę z Arabidopsis thaliana IAA17, wraz ze znacznikiem epitopu umożliwiającym wykrycie.

System początkowo przystosowany do stosowania w pączkujących drożdżach7,8 wyraził białko osTIR1 z drożdżowego promotora GAL. Ekspresja wymaga przejścia na pożywkę wzrostową z galaktozą jako jedynym źródłem węgla, co niestety powoduje przesunięcie diaux z szeroko zakrojonymi zmianami w metabolizmie komórkowym11. Z drugiej strony doniesiono, że konstytutywna ekspresja TIR1 może prowadzić do degradacji białka docelowego przy braku auksyny/IAA12, jeśli poziom ekspresji jest wysoki, podczas gdy niska ekspresja TIR1 powoduje nieefektywne zubożenie. Opracowano ulepszony system AID o nazwie β-est AID, w którym osTIR jest pod kontrolą indukowalnego promotora, który jest dostosowany do docelowego białka, przy minimalnym wpływie na metabolizm komórkowy. Aby to osiągnąć, skonstruowano sztuczny czynnik transkrypcyjny (ATF), w którym aktywator transkrypcji wirusa VP16 jest połączony z receptorem estrogenowym i domeną wiążącą DNA (DBD) z czterema palcami Zn. Gdy β-estradiol (estrogen) jest obecny, ATF może dostać się do jądra i indukować transkrypcję osTIR poprzez wiązanie się z jego promotorem (Z4EVpr)13,12.

osTIR wyrażenie jest zwykle wykrywalne około 20 minut po dodaniu β-estradiolu12. Jednak optymalny czas trwania ekspresji osTIR w celu osiągnięcia skutecznego zubożenia znakowanego białka auksyną, przy jednoczesnym uniknięciu wyczerpania przed dodaniem auksyny, musi być empirycznie określony dla każdego białka docelowego. Przybliżony czas tej wstępnej inkubacji można oszacować na podstawie wartości liczebności w bazie danych genomu Saccharomyces (SGD https://www.yeastgenome.org/). Jak widać na Rysunek 1, obfite białko, Dcp1 (2880 do 4189 cząsteczek / komórkę), wymaga 40 minut wstępnej inkubacji z β-estradiolem, bez zaobserwowania zubożenia niezależnego od auksyny. Znacznie mniej obfite białko, Prp2 (172 do 211 cząsteczek na komórkę), jest silnie zubożone już po 20 minutach wstępnej inkubacji. Zaleca się przetestowanie dwóch dodatkowych czasów wstępnej inkubacji, od 10 do 20 minut przed lub po tym początkowym szacowanym czasie (20 minut to minimalny zalecany czas). Optymalny czas przed inkubacją to czas, w którym białko docelowe nie uległo wyczerpaniu przed dodaniem auksyny, a po dodaniu auksyny wyczerpanie jest dopuszczalne lub poziomy białka zbliżają się do możliwego minimum. Tak więc, od Rysunek 1b, dla Prp22 z 30 minutami wstępnej inkubacji, poziomy nie spadły zbytnio 10 minut po dodaniu auksyny. Porównując to z 40 minutami wstępnej inkubacji i 15 minutami z IAA, gdzie występuje niewielkie dodatkowe wyczerpanie, nie ma korzyści z inkubacji z auksyną dłuższą niż 10 minut lub wstępnej inkubacji dłuższej niż 30 minut, zwłaszcza że istnieją dowody na niezależne od auksyny wyczerpanie po 40 minutach. W przypadku Dcp1 z 40 minutami wstępnej inkubacji (ostatni punkt, w którym poziom białka wynosi około 100% przed dodaniem auksyny), dopuszczalne jest 15 do 20 minut zubożenia auksyny. Zaleca się, aby czas wyczerpania był jak najkrótszy, aby zmniejszyć wtórny wpływ na metabolizm komórkowy14.

Ten artykuł pokazuje, jak korzystać z systemu β-est AID, optymalizując czas inkubacji β-estradiolu do ekspresji osTIR, aby osiągnąć szybkie wyczerpanie docelowego białka po dodaniu IAA bez wyczerpania przed dodaniem auksyny.

Protokół

UWAGA: Zobacz Rysunek 2 dla graficznego podsumowania.

1. Przygotowanie szczepu

  1. Używając szczepu ura3, wprowadź system AID β-est (tj. geny kodujące czynnik transkrypcyjny reagujący na β-estradiol (ATF) i osTIR) i AID* znakują białko docelowe (patrz Rysunek 3 i Tabela 1 dla podsumowania procedury).
    1. Przekształ<ć >plazmid pZTRK (marker oporności G418) lub pZTRL (marker LEU2) w szczep drożdży ura3- lub użyj plazmidu jako matrycy do produkcji produktu PCR do integracji genomowej.
    2. PCR amplifikuje ATF (oznaczone Z4EVATF na mapie plazmidu) i osTIR przy użyciu polimerazy o wysokiej wierności z jednego z plazmidów pZTRK lub pZTRL. Użyj starterów z 50 do 60 rozszerzeniami zasady 3' z homologią do regionu genomowego, aby skierować integrację przez rekombinację homologiczną16. W celu zapoznania się z integracją genomową tych dwóch składników, oddzielnie lub razem, patrz Tabela 1 dla starterów i warunków.
      nuta: Szczep pZ4EV-NTR1 ma już zintegrowane składniki w genomie (dostępne w Centrum Zasobów Genetycznych Drożdży w Japonii).
    3. Upewnij się, że białko docelowe jest oznaczone AID* za pomocą procedury Longtine17 (patrz Rysunek 3b i Tabela 1).
    4. Przeprowadź analizę wzrostu szczepu bez obecności β-estradiolu i IAA, aby określić, czy znacznik AID* wpływa na wzrost i przewidzieć tempo wzrostu do użycia w kroku 1.5.

2. Ogólna procedura wyczerpania

  1. Oblicz, ile kultury jest wymagane do pobrania wszystkich próbek; na przykład 10 ml kultury w OD600 0,8 jest wystarczające do ekstrakcji białka, RNA i DNA dla pojedynczej próbki, więc dla 6 próbek potrzebne jest co najmniej 60 ml kultury.
  2. Z hodowli wyhodowanej przez noc założyć wystarczającą ilość nowej kultury w temperaturzeod 600 0,1 do 0,2 i pozostawić do wzrostu w temperaturze 30 °C. Zalecane jest bogate podłoże, takie jak YPDA, chociaż można zastosować inne warunki wzrostu:
    Ekstrakt drożdżowy10 gramów
    Pepton20 gramów
    glukoza20 gramów
    Siarczan adeniny40 mg tabletki powlekania
    H2O do1 L

    nuta: Autoklaw lub sterylizacja filtra; Sterylizacja filtra jest preferowana, ponieważ kompleksy peptydowo-cukrowe wytwarzane w wyniku autoklawowania osadu w metanolu używanym do pobierania próbek.
  3. Przygotuj się do przyjęcia próbek.
    1. Umieścić 30 do 50% zamierzonej objętości próbki metanolu w probówce. Na przykład, jeśli ma zostać pobrana próbka o objętości 10 ml, wlej 5 ml metanolu do probówki Falcon o pojemności 15 ml i szczelnie zamknij probówkę. Po zamknięciu oznacz probówkę i umieść na suchym lodzie lub w temperaturze -80 °C do schłodzenia.
      ostrożność: Dozować metanol do dygestorium.
    2. Oznaczyć probówki o pojemności 1,5 ml do długotrwałego przechowywania próbek i umieścić w lodzie do ostygnięcia.
    3. Schłodzić wystarczającą ilośćH2O(co najmniej 1 ml na próbkę) na lodzie.
  4. Przewiduj rozwój kultury. Docelowy OD do pobierania próbek wynosi około 0,7 do 0,8, ale etap wstępnej inkubacji (inkubacja z β-estradiolem w celu wywołania osTIR) musi rozpocząć się wcześniej, aby hodowla osiągnęła w przybliżeniu właściwy OD do czasu pobrania próbek.
    nuta: Wskazane jest wykonanie krzywej wzrostu w warunkach, które mają być użyte w doświadczeniu, tak aby można było oszacować tę początkową średnicę zewnętrzną.
  5. Po osiągnięciu docelowego OD na początek wstępnej inkubacji, pobrać próbkę (zwykle 10 ml) do wstępnie przygotowanej probówki zawierającej zimny metanol. Odwróć na chwilę, aby wymieszać i umieść z powrotem w suchym lodzie.
    nuta: Próbkę można przenieść do lodu wodnego po około 5 minutach, jeśli jest to wygodne.
  6. Natychmiast dodać β-estradiol, 1 μl/ml kultury (końcowe stężenie 10 μM); należy wstępnie odmierzyć β-estradiol w pipecie gotowej do użycia w celu skrócenia czasu między pobraniem próbki a dodaniem β-estradiolu. Szybko wymieszaj, energicznie mieszając.
  7. Kontynuuj hodowlę jak poprzednio (krok 2.2), inkubuj (jest to etap "przed inkubacją") z β-estradiolem przez optymalny czas (w celu określenia optymalnego czasu przed inkubacją patrz Rysunek 1).
  8. Przygotować się do dodania IAA (auksyny). Pobrać objętość IAA potrzebną do wykonania kroku 2.10 (tj. 0,5 μl IAA na ml hodowli). Dzięki temu krok 2.20 jest szybszy
    9. .
  9. Zbierz próbkę zgodnie z krokiem 2.5.
  10. Natychmiast dodać IAA 0,5 μl/ml kultury do końcowego stężenia 750 μM, jak przygotowano w kroku 2.8. Szybko wymieszaj, energicznie mieszając.
  11. Zbierz próbki, zgodnie z krokiem 2.5, zgodnie z projektem eksperymentalnym. Albo pojedyncza próbka w czasie, gdy oczekuje się, że białko zostanie niezawodnie wyczerpane, albo wiele próbek w czasie wyczerpania. Na przykład 5-minutowe interwały są dogodne do pomiaru czasu i zapewniają szereg poziomów białka. Strategia optymalizacji, jak pokazano na Rysunek 1, wskaże odpowiednie czasy.
  12. Przetwórz próbki.
    1. Umieść próbki na lodzie, jeśli jeszcze tego nie zrobiono. Upewnij się, że żadna z próbek nie zamarzła; Jeśli tak, delikatnie rozgrzej dłoń, ciągle odwracając, aby temperatura nie wzrosła lokalnie.
      nuta: Najlepiej zrobić to w dłoni, ponieważ można ocenić temperaturę próbki, zawsze powinna być zimna. Ułóż na lodzie. Nie jest to punkt przerwy - gdy wszystkie próbki będą płynne, przejdź do następnego kroku.
    2. Gdy wszystkie próbki zostaną pobrane i nie zostaną już zamrożone, wirować w temperaturze 3 500 x g przez 2 minuty (w miarę możliwości w temperaturze 4 °C).
    3. Odlej mieszankę metanolu/podłoża i umieść z powrotem na lodzie; nie martw się, jeśli nie cały płyn został usunięty.
    4. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml lodowategoH2O(z kroku 2.3.3) i przenieść do oznakowanej probówki o pojemności 1,5 ml (przygotowanej w kroku 2.3.2) na lodzie.
    5. Krótko odwirować (np. 10 s w całkowitym czasie) przy >15 000 x g, aby ponownie zagnieździć komórki, umieścić je z powrotem na lodzie i usunąć płyn.
    6. UsunąćH2Oprzez aspirację. Granulki komórkowe mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C lub -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.
  13. Sprawdź poziom, do którego białko zostało zubożone przez analizę Western blot18.
    nuta: Wystarczająca ilość białka19 i/lub kwasu nukleinowego może być ekstrahowana z pojedynczej osadu komórkowego do większości celów, chociaż rzadkie gatunki RNA mogą wymagać większej objętości próbki.

Wyniki

Reprezentatywne przykłady deplecji przedstawiono na Rysunku 1. Trzy eksperymenty zaprezentowane na tej ilustracji były eksperymentami optymalizacyjnymi dla deplecji białek Prp2, Prp22 i Dcp1. Niskoobfitne białka spliceosomalne Prp2 i Prp22 uległy deplecji do poziomu poniżej 20% po 40 min preinkubacji z β-estradiolem, a następnie 15 min z auksyną. Dłuższy czas preinkubacji prowadzi do szybszej deplecji, ale powoduje również niepożądane zmniejszenie ilości białek jeszcze przed dodaniem auksyny. W porównaniu z nimi, bardziej obfite białko Dcp1 uległo deplecji jedynie do około 30% przy zastosowaniu tej samej procedury, natomiast 60 min preinkubacji doprowadziło do deplecji do 13% przy tej samej dawce auksyny, jednak kosztem deplecji przed dodaniem auksyny. Możliwe, że 50 min preinkubacji z β-estradiolem i 15 min z auksyną pozwoliłoby uzyskać podobne wyniki w krótszym czasie, co byłoby rozwiązaniem bardziej optymalnym.

Analiza degradacji białek; Prp22-AID*-6FLAG, Prp2-AID*-6FLAG, Dcp1-AID*-6HA; prążki żelowe, wykresy.
Rysunek 1: Szybkość deplecji może być regulowana poprzez modyfikację czasu wstępnej inkubacji z β-estradiolami. Western blot18 białek docelowych: (a i b) Prp22-AID*-6FLAG, (c i d) Prp2-AID*-6FLAG oraz (e i f) Dcp1-AID*-6HA, z kultur wstępnie inkubowanych z β-estradiolem (β-est) przez 20, 30, 40 lub 60 min przed dodaniem auksyny12. Na każdą ścieżkę nałożono równe ilości całkowitego białka. Pgk1 służy jako wizualna kontrola ładowania, z wyjątkiem panelu e, w którym Pgk1 i Dcp1 współmigrują. Ilościowe oznaczenie prążków białkowych z paneli a, c i e przedstawiono odpowiednio w panelach b, d oraz f. Jako miarę szybkości deplecji obliczono nachylenie (m) dla odcinka liniowego (od 100% do 30% wartości początkowych) każdej krzywej. Optymalny czas wstępnej inkubacji to czas, w którym poziomy białek są nadal zbliżone do poziomów nieindukowanych (100%), a następująca po nim szybkość deplecji jest wysoka. Dla Dcp1 (f) 60 min wstępnej inkubacji jest zbyt długim okresem, ponieważ białko zaczęło ulegać degradacji wobec braku auksyny, natomiast 20 min jest zbyt krótkim czasem, gdyż w tym przedziale czasowym białko nie ulega znaczącej deplecji. Po 40 min wstępnej inkubacji można zastosować 15 min z auksyną, ponieważ białko jest w ok. 70% zdepleowane i choć 20 min doprowadziłoby do dalszej deplecji, mogłoby to również wywołać efekty wtórne. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe z dwóch powtórzeń biologicznych. Dla każdego eksperymentu przedstawiono jeden reprezentatywny blot. Rysunek pochodzi z poprzedniej publikacji9. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat ekspresji i oczyszczania białka; indukcja β-estradiolem, IAA; przygotowanie próbek; przechowywanie w -80°C.
Rycina 2: Podsumowanie graficzne. Do odpowiedniej ilości hodowli rosnącej w pożywce bogatej i w wymaganej temperaturze należy dodać β-estradiol, aby rozpocząć preinkubację. Kontynuuj wzrost przez wymagany czas preinkubacji przed dodaniem IAA (auksyny) w celu rozpoczęcia procesu deplecji. Czas preinkubacji i deplecji zależy od białka, które ma zostać usunięte, jednak preinkubacja często trwa od 20-60 min, a czas deplecji zazwyczaj wynosi od 10 do 20 min. Próbki o objętości 10 mL należy pobrać na początku i na końcu preinkubacji oraz w trakcie deplecji. Próbki te są szybko utrwalane w zimnym metanolu przed wirowaniem i przechowywaniem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schematy plazmidów i konstruktów genetycznych dla analizy ekspresji genów i kierowania białek.
Rysunek 3: Tworzenie szczepów dla systemu B-est. (a) Aby wytworzyć szczep drożdży z systemem AID*, do szczepu należy wprowadzić plazmid pZTRL (LEU2) lub pZTRK (oporność na kanamycynę (G418)) lub alternatywnie ATF i osTIR można wstawić do genomu poprzez rekombinację homologiczną fragmentu wygenerowanego metodą PCR z starterów 3’ (patrz Rysunek 3b i Tabela 1). (b) Tagowanie białka docelowego na końcu C-końcowym osiąga się poprzez amplifikację PCR odpowiedniego regionu plazmidu pURA3-AID*-6FLAG (pURA3_AID*-6HA różni się tylko tagiem i można go traktować w dokładnie ten sam sposób), używając starterów Longtine S3-F i S2-R z rozszerzeniami 3’ homologicznymi do końca 3’ białka docelowego. Rozszerzenie startera forward powinno zawierać ostatni kodon aminokwasowy w ramce z początkiem tagu AID* i nie może zawierać kodonu stop. Rozszerzenie startera reverse powinno obejmować region poniżej regionu kodującego. Po wprowadzeniu do genomu komórki, które utraciły marker URA3 (poprzez rekombinację homologiczną między identycznymi regionami znajdującymi się na obu końcach markera), można wyselekcjonować poprzez wzrost na 5-FOA, który przeprowadza kontraselekcję komórek URA3. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

a. Sekwencje starterów
CelLokalizacjaStarterNazwaSekwencjaTm (°C)
pZTRL516FpZTRL_F<-region homologii->GCGACAGCATCACCGACTTCG61.23
7897RpZTR_RCGCCGCCTCTACCTTGCAGA<-region homologii (RC)->61.30
pZTRK9154FpZTRK_F<-region homologii->ACGTTGAGCCATTAGTATCAATTTGCTTACC59.40
5897RpZTR_RCGCCGCCTCTACCTTGCAGA<-region homologii (RC)->61.30
pURA3-AID*-6FLAG lub pURA3_AID*-6HAFS3-F<-region homologii->CGTACGCTGCAGGTCGAC59.21
RS2-RATCGATGAATTCGAGCTCG<-region homologii (RC)->52.76
pZRTL/K służy do amplifikacji systemu β-est AID
pURA3-AID*-6FLAG/6HA w celu amplifikacji AID* oraz znacznika epitopowego do znakowania białka docelowego (procedura Lontine)
<-region homologii->Region homologiczny do regionów flankujących, w które ma zostać wstawiony system. Im dłuższy jest ten region, tym większa jest prawdopodobieństwo sukcesu modyfikacji; zaleca się od 50 do 100 zasad.
<-region homologii (RC)->Region homologiczny do regionów flankujących, w które ma zostać wstawiony system; należy pamiętać o zastosowaniu komplementarności odwrotnej. Podobnie jak powyżej, im dłuższy jest ten region, tym lepiej.
Tm (°C)Tm przy użyciu metody %GC z dodatkiem 50 mM NaCl
b. Mieszanina PCR
KomponentObjętość (µL)
Szablon<10
Bufor NEB Phusion HF (5x)*100
Starter bezpośredni 100 µM2.5
Starter odwrotny 100 µM2.5
dNTP o stężeniu 10 mM każdy10
H2Odo 500
* Można również stosować bufor NEB Phusion GC Buffer (5x), lecz nie jest on preferowany
Przygotować tę mieszaninę i rozdzielić ją do 10 probówek po 50 µl wymieszać wszystkie składniki i przeprowadzić reakcję PCR zgodnie z Tabelą 1 c.
Sprawdź poprawność przebiegu reakcji PCR, przeprowadzając elektroforezę na żelu agarozowym
Połączyć wszystkie udane reakcje w jednej probówce i przeprowadzić wytrącanie etanolem
Przeprowadź transformację drożdży z wykorzystaniem całego materiału otrzymanego w wyniku reakcji PCR
c. Warunki PCR
KrokTemp (°C)Czas
Wstępna denaturacja9830 s
25–35 cykliDenaturacja9810 s
Wyżarzanie45–6020 s
Rozszerzenie7230 s/kb
Ostateczna elongacja7210 min
Przytrzymać8
Wyżarzaj w temperaturze 45 °C dla zestawu starterów Lontine (S3-F i S2-R) oraz 60 °C dla starterów pZTRL/K
Wydłużyć czas elongacji o 3 minuty dla PCR Lontine oraz o 3 minuty dla pZTRL/K

Tabela 1: Sekwencje starterów, skład mieszaniny PCR i warunki PCR.

Dyskusja

Dobrze zoptymalizowany protokół może spowodować szybkie i skuteczne zubożenie docelowego białka. Określenie przybliżonego czasu przed inkubacją za pomocą β-estradiolu jest ważne, ponieważ zwiększa to odtwarzalność wyczerpania, ale niewielkie różnice w czasie preinkubacji mogą być tolerowane. Z drugiej strony, należy zachować ostrożność z czasem po dodaniu auksyny, ponieważ poziom białka spada bardzo szybko.

Zaletą tego podejścia jest to, że dostrojone wyczerpanie można osiągnąć poprzez różne kombinacje czasu preinkubacji z czasem inkubacji β-estradiolu i IAA. Na przykład, w razie potrzeby, białko docelowe może być wolniej wyczerpywane poprzez skrócenie czasu wstępnej inkubacji.

System β-est AID oferuje pewne zalety w porównaniu z systemami, w których OsTIR jest wyrażony konstytutywnie. Na przykład, jeśli białko docelowe jest niezbędne do żywotności, regulowana ekspresja osTIR może zapobiec przedwczesnemu wyczerpaniu białka docelowego. Co więcej, ekspresja osTIR może być dostosowana do obfitości białka docelowego i jego podatności na degradację, a wyczerpanie może być szybkie lub powolne. Dwa małocząsteczkowe efektory, β-estradiol i auksyna, nie zaburzają metabolizmu drożdży w zastosowanych tu warunkach, w przeciwieństwie do rapamycyny, stosowanej w układzie zakotwiczenia1.

Należy zauważyć, że znakowanie niektórych białek zaburza ich funkcję, co stanowi problem w przypadku każdego ukierunkowanego systemu zubożenia. W takim przypadku znacznik N-terminal może działać, gdy tag C-terminal nie. Ponadto nie wszystkie białka zostaną skutecznie zubożone; na przykład znacznik AID na białku docelowym może być niedostępny dla białka osTIR. Dlatego, po znakowaniu AID, każde białko docelowe powinno zostać przetestowane pod kątem wpływu znacznika na wzrost oraz w celu ustalenia, czy wyczerpanie jest skuteczne, zanim czas wstępnej inkubacji β-estradiolu i leczenia auksyną zostanie zoptymalizowany.

Ten system AID* jest bardzo prosty i kompatybilny z każdą kolejną procedurą eksperymentalną, która nie wymaga dalszego wzrostu, taką jak analiza białek, DNA lub RNA lub mikroskopia. Ponadto system działa dobrze w połączeniu z tioznakowaniem w celu oczyszczenia powstającego RNA20.

System ten zapewnia szybki, specyficzny i powtarzalny sposób wyczerpywania białka bez wpływu na metabolizm komórki drożdży w inny sposób.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Podziękowania dla Jane Reid za zainicjowanie tego programu, Barbarze Terlouw za rozwój, Vahidowi Aslanzadehowi za konstrukcje "ura looper" i Susanie de Lucas za wiele pomocnych dyskusji. Praca ta została wsparta przez stypendium GIMO z Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología w Meksyku (CONACYT) i Szkoły Nauk Biologicznych Uniwersytetu w Edynburgu, stypendium doktoranckie Wellcome na IEM [105256] oraz przez finansowanie Wellcome [104648] dla JD Beggs. Prace w Wellcome Centre for Cell Biology są wspierane przez Wellcome core funding [092076].

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Siarczan adeninyFormediumDOC0230
AgarFormediumAGA03
Β-estradiolSigma AldrichE2758-1G10 mM roztwór w etanolu. Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
DMSOAlfa Aesar42780DMSO powinien być stały w temperaturze 4 & stopni; C
GlukozaFisher ScientificG/0500/60
IAA Kwas 1H-indolo-3-octowyAcross Orgainics122150100Analog auksyny. 1,5 M w DMSO. Rozwiązaniem będzie rdzawy kolor i ciemnieje w miarę upływu czasu; Ciemnoczerwony roztwór należy wyrzucić i przygotować nowy. Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
MetanolFisher ScientificM/4000/PC17UWAGA Toksyczny i łatwopalny
Phusion  Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNEBM0530
PeptonFormediumPEP03
SCSM pojedynczy drop-out – uraFormediumDSCS101
Ekstrakt z drożdżyFormediumYEA03
Drożdżowa baza azotowa bez aminokwasów z siarczanem amonuFormediumCYN0410

Bibliografia

  1. Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The Anchor-Away Technique: Rapid, Conditional Establishment of Yeast Mutant Phenotypes. Molecular Cell. 31, 925-932 (2008).
  2. Bellí, G., Garí, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic Acids Research. 26, 942-947 (1998).
  3. Alexander, R. D., et al. RiboSys, a high-resolution, quantitative approach to measure the in vivo kinetics of pre-mRNA splicing and 3′-end processing in Saccharomyces cerevisiae. RNA. 16, 2570-2580 (2010).
  4. Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. P. RING Domain E3 Ubiquitin Ligases. Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).
  5. Tan, X., et al. Mechanism of auxin perception by the TIR1 ubiquitin ligase. Nature. 446, 640-645 (2007).
  6. Teale, W. D., Paponov, I. A., Palme, K. Auxin in action: signalling, transport and the control of plant growth and development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 847-859 (2006).
  7. Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nature Methods. 6, 917-922 (2009).
  8. Morawska, M., Ulrich, H. D. An expanded tool kit for the auxin-inducible degron system in budding yeast. Yeast. 30, 341-351 (2013).
  9. Kubota, T., Nishimura, K., Kanemaki, M. T., Donaldson, A. D. The Elg1 Replication Factor C-like Complex Functions in PCNA Unloading during DNA Replication. Molecular Cell. 50, 273-280 (2013).
  10. Brosh, R., et al. A dual molecular analogue tuner for dissecting protein function in mammalian cells. Nature Communications. 7, 11742(2016).
  11. DeRisi, J. L., Iyer, V. R., Brown, P. O. Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale. Science. 278, 680-686 (1997).
  12. Mendoza-Ochoa, G. I., et al. A fast and tuneable auxin-inducible degron for depletion of target proteins in budding. Yeast. , (2018).
  13. McIsaac, R. S., et al. Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast. Nucleic Acids Res. 41, e57(2013).
  14. Prusty, R., Grisafi, P., Fink, G. R. The plant hormone indoleacetic acid induces invasive growth in Saccharomyces cerevisiae. PNAS. 101, 4153-4157 (2004).
  15. Geitz, D., St Jean, A., Woods, R. A., Schiest, R. H. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells. Nucleic Acids Research. 20, 1425(1992).
  16. Widlund, P. O., Davis, T. N. A high-efficiency method to replace essential genes with mutant alleles in yeast. Yeast. 22, 769-774 (2005).
  17. Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14, 953-961 (1998).
  18. Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. , e52099(2014).
  19. Volland, C., Urban-Grimal, D., Géraud, G., Haguenauer-Tsapis, R. Endocytosis and degradation of the yeast uracil permease under adverse conditions. Journal of Biological Chemistry. 269, 9833-9841 (1994).
  20. Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282(2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

System AIDindukowany beta estradiolemdodawanie auksynyekspresja TIR1hodowla kom rek dro d yfiksacja metanolemprotok wirowaniadeplekcja Prp2analiza Dcp1
Dostrajanie degradacji w celu osiągnięcia specyficznego i wydajnego zubożenia białek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.