Tania analiza chodu do fenotypowania behawioralnego mysich modeli choroby nerwowo-mięśniowej

Lokomocja wymaga skomplikowanej koordynacji neurologicznej i mięśniowo-szkieletowej, a deficyty w pojedynczym aspekcie ścieżek motorycznych mogą powodować zauważalne nieprawidłowości chodu^1,2. Analiza chodu jest kluczowym narzędziem dla badaczy testujących modele mysie, ponieważ dostarcza wymiernych danych behawioralnych na temat tego, jak dana choroba, uraz lub lek wpływa na ruch zwierzęcia³. Jednak zdigitalizowana analiza chodu wymaga zakupu bieżni, kamery i powiązanego oprogramowania, co może być zbyt drogie dla badaczy. Analiza chodu jest często używana sporadycznie do śledzenia zmian podłużnych w funkcjach motorycznych, dlatego może być trudno uzasadnić wydatki, jeśli jest używana sporadycznie⁴. Chociaż zdigitalizowane analizy mogą dostarczyć bardziej szczegółowych wskaźników chodu niż prosta analiza śladu ciała, te bardziej złożone pomiary nie zawsze są konieczne lub istotne dla charakterystyki fenotypu behawioralnego⁵.

Tutaj prezentujemy tanią metodę ręcznej analizy śladu jako szybką i czułą alternatywę dla cyfrowych programów do analizy chodu^6,7. Wykazano, że ręczna analiza śladów stóp wykrywa znaczące różnice w chodzie w wielu modelach chorób myszy^{4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17}, a w co najmniej jednym przypadku ta tania metoda zidentyfikowała zmiany w chodzie, które nie zostały wykryte przez powszechnie stosowany program do cyfrowej analizy chodu¹². Całkowity koszt materiałów jest nominalny i można go łatwo dostosować do innych modeli badań nad gryzoniami.

Chociaż istnieje wiele różnych wskaźników chodu, z których można czerpać dane, metoda, którą opisujemy, skupia się na trzech konkretnych wskaźnikach: długości kroku, szerokości kroku (znanej również jako "szerokość toru") i rozpiętości palców. Należy zauważyć, że parametry, które mają być oceniane, powinny być określane indywidualnie dla każdego modelu. Ta metoda analizy chodu nie jest przeznaczona do pomiaru funkcji poznawczych i nie jest zalecana do badań, które wymagają złożonych pomiarów biomechanicznych chodu¹⁶.

Prezentujemy dane behawioralne z kohorty myszy przed i po objawach, modelujących rdzeniowy i opuszkowy zanik mięśni sprzężony z chromosomem X (SBMA), chorobę nerwowo-mięśniową charakteryzującą się zwyrodnieniem neuronów ruchowych i zanikiem mięśni. U myszy tych rozwijają się postępujące deficyty chodu, które zbiegają się z pojawieniem się innych fenotypów specyficznych dla choroby. Dowodzi to słuszności i swoistości tej metody oraz potwierdza, że jest ona w stanie niezawodnie rozróżniać zwierzęta dotknięte chorobą od zdrowych.

Eksperymentalne myszy w tym badaniu to 2,5 (przedobjawowe) i 9-miesięczne (poobjawowe) transgeniczne myszy BAC fxAR121 na tle C57BL/6 (n_expt=12). Ten model został wygenerowany w naszym laboratorium i został w pełni scharakteryzowany jako potężny model myszy klasy SBMA9. Nietransgeniczne rodzeństwo z miotu zostało użyte jako grupa kontrolna (n_ctrl=8). SBMA jest chorobą ograniczoną płciowo, która w pełni objawia się tylko u samców, więc samce myszy zostały wykorzystane wyłącznie do tego badania. Na etapie planowania badacze muszą wziąć pod uwagę rozważania National Institutes of Health dotyczące płci jako zmiennej biologicznej w celu określenia wielkości i składu grupy¹⁸.

Wszystkie testy przeprowadzone na myszach zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Duke'a. Personel odpowiedzialny za testowanie i punktację musi być zaślepiony genotypem zwierzęcia lub warunkami doświadczalnymi do czasu zakończenia analizy chodu i punktacji prac dla całej kohorty.

1. Przygotowanie materiału testowego

1. Przeprowadź testy za pomocą tunelu zbudowanego z 3 wstępnie przyciętych przezroczystych paneli akrylowych o grubości 0,375 cala. Zmontuj tunel, sklejając panele ze sobą za pomocą szczeliwa, które specyficznie wiąże akryl i nie wydziela zapachów po wysuszeniu.
   1. W przypadku standardowych myszy C57BL/6 należy użyć następujących wymiarów tunelu: 2,5 cala szerokości, 3 cale wysokości i 13 cali długości. Myszy muszą być w stanie wygodnie przejść przez tunel i zrobić wystarczającą liczbę kroków (>4), aby można było zmierzyć chód.
2. Zbuduj komorę bramkową z wstępnie przyciętych szarych paneli akrylowych o grubości 0,375 cala, sklejonych tym samym uszczelniaczem, który jest używany w tunelu. Wymiary wnętrza komory wynoszą 4 cale. szeroki, 4 cale. długie i 3 cale. wysoki. Dopasuj otwór tej komory do otworu tunelu (2.5 cala szerokości x 3.0 cala wysokości). Ponieważ myszy naturalnie wolą zaciemnione przestrzenie od dobrze oświetlonych przestrzeni, używaj materiału, który jest nieprzezroczysty i ma ciemny kolor.
3. Do śledzenia kroków używaj papieru, który jest gruby i gładki (dobrze sprawdza się papier akwarelowy). Wytnij poszczególne paski papieru tak, aby były nieco szersze i dłuższe niż szerokość i długość tunelu. Jeśli używasz opisanych tutaj wymiarów tunelu, przytnij papier do 15 cali. długi o 3,5 cala. szeroki.
4. Użyj dwóch kontrastujących kolorów (np. zielonego i fioletowego) nietoksycznej, zmywalnej farby na bazie wody. Przypisz jeden kolor kończynom tylnym, a drugi kończynom przednim. Myszy po teście zlizują pozostałą farbę ze stóp, więc wybrana farba musi być całkowicie nietoksyczna.
5. Użyj dwóch okrągłych pędzli bębnowych, po jednym dla każdego koloru farby (~0,5 cm średnicy, stożkowa/spiczasta końcówka pędzla).
6. Wybierz linijkę z oznaczeniami z dokładnością do milimetrów i suwmiarkę z wymiarami do 0,1 mm. Do pisania na kartach do punktacji zaleca się ołówek.
7. Opcjonalnie: W przypadku zwierząt o wysokim poziomie lęku lub niskiej motywacji zapewnij zachętę behawioralną w komorze celów. Może to obejmować niewielkie ilości wysterylizowanych nasion słonecznika (umieszczonych w klatce domowej na 2 dni przed badaniem, aby umożliwić przyzwyczajenie). W dniu testowania umieść nasiona słonecznika w komorze bramkowej, aby zachęcić myszy do przejścia bez zatrzymywania się.

2. Zbieranie danych

1. Jeśli testowanie jest wykonywane w oddzielnym pomieszczeniu, zaaklimatyzuj myszy w nowym pomieszczeniu przez 30 minut, a następnie rozpocznij testy behawioralne. Dodatkowo, ponieważ myszy prowadzą naturalny nocny tryb życia, upewnij się, że wszystkie myszy są w pełni przytomne i czujne przez co najmniej 5 minut przed badaniem.
2. Przygotuj konfigurację testową, umieszczając tunel nad papierem i oznaczając papier identyfikatorem myszy i datą testu. Umieść komorę bramkową na końcu tunelu, łącząc oba otwarte końce. Dodaj nasiona słonecznika na końcu tunelu (wewnątrz komory bramkowej), aby w razie potrzeby zmotywować się.
3. Wyjmij badaną mysz z klatki i chwyć ją mocno za kark, upewniając się, że trzymasz ogon, aby ustabilizować ruch jej tylnych kończyn.
4. Pomaluj przednie łapy tak, aby cały spód wszystkich palców i środek stopy były w pełni pokryte farbą. Powtórz to z kontrastowym kolorem farby na tylnych łapach. Zetrzyj farbę, którą mysz dostanie się na inne części ciała, czystym damp płótno, aby zapobiec smugom, które mogą przeszkadzać w zbieraniu danych.
   UWAGA: Obchodzenie się z myszami musi być wykonywane przez doświadczonych badaczy, aby zminimalizować stres zwierząt.
5. Umieść mysz na początku tunelu i pozwól jej przejść aż do komory bramkowej, a następnie odzyskaj mysz, delikatnie wytrzyj jej stopy zwilżoną wodą szmatką i włóż ją z powrotem do klatki domowej.
6. Poczekaj, aż papier ze śladami stóp całkowicie wyschnie przed nacięciem. Przetrzyj obszar testowy i tunel etanolem lub równoważnym roztworem czyszczącym między każdym zwierzęciem.

3. Kryteria punktacji

1. Do oceniania należy używać kroków, które są spójnie rozmieszczone z wyraźnymi, nierozmazanymi śladami. Rysunek 1B to dobry przykład sekwencji śladów, którą można ocenić. Aby wygenerować wystarczające dane dotyczące punktacji, muszą być co najmniej 2 kolejne kroki z każdej stopy, ale zalecane jest 4-6 kroków na stopę. Nie dołączaj pierwszego i ostatniego odcisku stopy na papierze, ponieważ jest mało prawdopodobne, aby reprezentowały one normalny chód, ponieważ mysz zmienia prędkość chodzenia.
2. Użyj długości kroku, szerokości kroku i rozstawu palców jako trzech różnych miar chodu, które można analizować za pomocą tej metody.
   UWAGA: Długość i szerokość kroku wymagają wyraźnych, sekwencyjnych odcisków, w których obszar przedniej części stopy jest dobrze zaznaczony w farbie. Rozłożenie palców nie wymaga sekwencyjnych odcisków do punktacji, a jedynie wyraźne odciski pierwszego i ostatniego palca u jednej stopy. Jeśli jednak dany ślad nie jest uwzględniony w pomiarach długości lub szerokości kroku, nie może nie zostać oceniony pod kątem rozpiętości palców. Wszystkie trzy miary są oceniane w centymetrach.
   1. Zdefiniuj długość kroku jako odległość między dwoma sekwencyjnymi śladami stóp utworzonymi przez tę samą stopę (tj. jeden krok) (Rysunek 1A, 1B).
      1. Ołówkiem narysuj jednym krokiem okrąg o średnicy 2-4 mm wokół obszaru przedniej części stopy obu odcisków stóp kończyn przednich (oznaczonych kolorem przypisanym powyżej) i narysuj linię między nimi za pomocą linijki.
      2. Zapisz odległość między dwoma odciskami od środka każdego okręgu (tj. środka każdej podkładki pod stopy) jako Prawo-Przód 1 (RF1) lub Lewo-Przód 1 (LF1).
      3. Powtórz te czynności dla wszystkich kroków, które można ocenić (RF2, LF2, RF3, LF3 i tak dalej).
      4. Powtórz dla śladów prawych i lewych kończyn tylnych.
      5. Uśrednij wszystkie indywidualne zarejestrowane odległości kroku dla każdej kończyny. Na potrzeby analizy statystycznej poszczególni członkowie kohorty mogą być uśredniani razem.
   2. Zdefiniuj szerokość kroku jako miarę odległości między lewymi i prawymi kończynami przednimi lub tylnymi (Rysunek 1A, 1B).
      1. Aby ocenić tę odległość, narysuj i zmierz linię od zakreślonego obszaru przedniej części stopy jednej kończyny tylnej, która przecina się prostopadle z linią długości kroku na przeciwległej kończynie tylnej.
      2. Powtórz to dla wszystkich odcisków kończyn tylnych, które można uzyskać, a następnie uśrednij pomiary. Metoda obliczania szerokości kroku jest taka sama dla kończyn przednich i tylnych.
   3. Zdefiniuj rozpiętość palców jako odległość między pierwszym a ostatnim palcem u nogi na pojedynczym odcisku kończyny przedniej lub tylnej (Rysunek 1A, 1B).
      1. Użyj suwmiarki, aby zmierzyć odległość między czubkiem pierwszego odcisku palca a czubkiem ostatniego odcisku palca.
      2. Powtórz te czynności dla wszystkich odcisków kończyn tylnych, które można ocenić, i uśrednij pomiary. Metoda obliczania rozstawu palców u nóg jest taka sama dla kończyn przednich i tylnych.
3. Jeśli papieru nie można naciąć, pozwól zwierzęciu odpocząć przez 10 minut przed ponowną próbą.

Przy wystarczającej liczbie zwierząt, ta procedura jest w stanie wykryć różnice w chodach między genotypami myszy w obrębie tego samego szczepu w czasie. Rysunek 1B pokazuje reprezentatywne ślady odcisków stóp zebrane w naszym laboratorium, przy użyciu mysiego modelu rdzeniowego i opuszkowego zaniku mięśni (SBMA), zaburzenia neurodegeneracyjnego wpływającego na dolne neurony ruchowe i mięśnie szkieletowe. Wcześniej informowaliśmy, że samce transgenicznych myszy BAC fxAR121 rozwijają znaczną utratę masy ciała, upośledzenie siły chwytu i skrócenie kroku w wieku poobjawowym w porównaniu z nietransgenicznymi kontrolami z miotu9.

Tutaj prezentujemy wyniki analizy chodu z kohorty myszy transgenicznych (2,5 miesiąca życia) i poobjawowych (9 miesięcy) BAC fxAR121 i kontrolnych z miotu (Rysunek 2). Przed wystąpieniem choroby transgeniczne myszy BAC fxAR121 wykazywały podobną długość kroku, szerokość kroku i rozstaw palców u nóg w porównaniu z ich nietransgenicznymi grupami kontrolnymi z miotu. Po wystąpieniu choroby transgeniczne myszy BAC fxAR121 wykazują znacznie krótszą długość kroku (pkończyna przednia = 0,001, pkończyna tylna = 0,009) (Rysunek 2A). Podobna analiza podłużna nie wykazała różnic w szerokości kroku w żadnym z badanych grup wiekowych (p2,5 miesiąca = 0,709, p9 miesięcy = 0,204) (Rysunek 2B). Poobjawowe myszy transgeniczne BAC fxAR121 mają również znacznie węższy rozkład tylnych palców u nóg (p = 0,01) niż kontrole z miotu w tym samym wieku (Rysunek 2C). Myszy BAC fxAR121 modelują chorobę nerwowo-mięśniową, która dotyka przede wszystkim kończyn tylnych, dlatego nie zebrano szczegółowych pomiarów chodu kończyn przednich. Zachęcamy badaczy korzystających z tej metody analizy chodu do rozważenia fenotypu swoich modeli myszy i odpowiedniego wyboru wskaźników chodu kończyn przednich lub tylnych.

Rysunek 1: Środki analizy chodu i rozwiązywanie problemów.
A. Schematyczne przedstawienie analizy chodu u myszy, przedstawiające informacje o długości kroku, szerokości kroku i rozstawie palców. B. Reprezentatywny przykład sekwencji śladów stóp w analizie chodu, którą można ocenić, przedstawiający pomiar wszystkich trzech parametrów. C. Reprezentatywne przykłady problematycznych sekwencji śladów stóp w analizie chodu, których nie można ocenić. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Transgeniczne myszy SBMA BAC fxAR121 wykazują postępujący, neurodegeneracyjny fenotyp chodu, który można wykryć za pomocą analizy chodu.
Pomimo braku różnic w wieku przedobjawowym (2,5 miesiąca, nctl = 11, nexpt = 12), myszy BAC fxAR121 rozwijają znacznie skróconą długość kroku w porównaniu z ich nietransgenicznymi kontrolami miotu w stadiach poobjawowych (9 miesięcy, nctl = 8, nexpt = 12). B. Nie wykryto żadnych zmian w szerokości kroku w żadnym wieku. C. Objawowe myszy transgeniczne SBMA BAC fxAR121 wykazują znacznie zmniejszone rozprzestrzenianie się palców kończyn tylnych w porównaniu z nietransgenicznymi kontrolami miotu. N = 8-12 / grupa. ANOVA z testem Tukeya post hoc * p < 0,05, ** p < 0,01. Słupki błędów reprezentują SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.