Artykuł metodologiczny

Badanie długoterminowej plastyczności synaptycznej w międzypłytkowym hipokampie CA1 za pomocą zapisu pola elektrofizjologicznego

DOI:

10.3791/59879

⸱

11 sierpnia 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, City University of Hong Kong, 2Department of Nano-Bioengineering, Incheon National University, 3Division of Life Sciences, College of Life Sciences and Bioengineering, Incheon National University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użyliśmy elektrod rejestrujących i stymulujących w podłużnych wycinkach mózgu hipokampa oraz podłużnie rozmieszczonych elektrod rejestrujących i stymulujących w grzbietowym hipokampie in vivo, aby wywołać zewnątrzkomórkowe potencjały postsynaptyczne i wykazać długoterminową plastyczność synaptyczną wzdłuż podłużnego międzypłytkowego CA1.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie plastyczności synaptycznej w hipokampie skupiło się na wykorzystaniu sieci lamelarnej CA3-CA1. Mniej uwagi poświęcono podłużnej sieci międzypłytkowej CA1-CA1. Ostatnio jednak wykazano związek asocjacyjny między neuronami piramidowymi CA1-CA1. Dlatego istnieje potrzeba zbadania, czy podłużna sieć międzypłytkowa CA1-CA1 hipokampa wspiera plastyczność synaptyczną.

Zaprojektowaliśmy protokół do badania obecności lub braku długoterminowej plastyczności synaptycznej w międzypłytkowej sieci CA1 hipokampa, korzystając z zapisów pola elektrofizjologicznego zarówno in vivo, jak i in vitro. W przypadku nagrań pola zewnątrzkomórkowego in vivo, elektrody rejestrujące i stymulujące umieszczono w osi przegrodowo-skroniowej grzbietowego hipokampa pod kątem podłużnym, aby wywołać pobudzające potencjały postsynaptyczne pola. W przypadku nagrań pola zewnątrzkomórkowego in vitro podłużne warstwy hipokampa zostały przycięte równolegle do płaszczyzny przegrodowo-skroniowej. Elektrody rejestrujące i stymulujące umieszczono w warstwie oriens (S.O) i warstwie promienistej (S.R) hipokampa wzdłuż osi podłużnej. Umożliwiło nam to zbadanie specyficzności kierunkowej i warstwowej wywołanych pobudzających potencjałów postsynaptycznych. Już ustalone protokoły wykorzystano do wywołania długotrwałego wzmocnienia (LTP) i długotrwałej depresji (LTD) zarówno in vivo, jak i in vitro. Nasze wyniki wykazały, że podłużna międzypłytkowa sieć CA1 obsługuje zależne od receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDA) długoterminowe wzmocnienie (LTP) bez swoistości kierunkowej lub warstwowej. Sieć międzyblaszkowa, w przeciwieństwie do poprzecznej sieci blaszkowej, nie wykazywała jednak istotnego długotrwałego obniżenia (LTD).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hipokamp jest szeroko stosowany w badaniach kognitywnych1,2,3. Sieć blaszkowata hipokampa w osi poprzecznej tworzy obwody trisynaptyczne, które składają się z zakrętu zębatego, regionów CA3 i CA1. Sieć lamelarna jest uważana za równoległą i niezależną jednostkę4,5. Ten blaszkowaty punkt widzenia wpłynął na zastosowanie orientacji poprzecznej i przekrojów poprzecznych zarówno w badaniach elektrofizjologicznych hipokampa in vivo, jak i in vitro. W świetle pojawiających się badań, hipoteza blaszkowata jest ponownie oceniana6 i zwraca się również uwagę na sieć międzypłytkową hipokampa. Jeśli chodzi o sieć międzypłytkową hipokampa, region CA3 jest badany od dawna7,8,9,10, jednak podłużnemu regionowi hipokampa CA1 do niedawna poświęcano stosunkowo mało uwagi. W odniesieniu do sieci międzyblaszkowej CA1 wykazano, że krótkoterminowe właściwości synaptyczne wzdłuż grzbietowo-brzusznej podłużnej osi hipokampa CA1 szczurów różnią się11. Stwierdzono również, że skupiska komórek hipokampa reagujących na fazę i miejsce są systematycznie ułożone wzdłuż osi podłużnej hipokampa u szczurów, poddawanych zadaniu pamięci krótkotrwałej12. Stwierdzono również, że napady padaczkowe są zsynchronizowane wzdłuż całego hipokampa wzdłuż osi podłużnej13.

Większość badań podłużnego regionu hipokampa CA1 wykorzystuje jednak dane wejściowe z regionu CA3 do regionów CA111,14,15. Korzystając z unikalnego protokołu do tworzenia podłużnych wycinków mózgu, nasza poprzednia praca wykazała łączność asocjacyjną neuronów piramidowych CA1 wzdłuż osi podłużnej i implikowała jego zdolność do skutecznego przetwarzania sygnalizacji neuronalnej16. Istnieje jednak potrzeba ustalenia, czy neurony piramidowe CA1 wzdłuż osi podłużnej bez poprzecznego wejścia mogą wspierać długoterminową plastyczność synaptyczną. To odkrycie może dodać kolejny punkt widzenia do badań nad problemami neurologicznymi dotyczącymi hipokampa.

Zdolność neuronów do adaptacji skuteczności przekazywania informacji znana jest jako plastyczność synaptyczna. Plastyczność synaptyczna jest implikowana jako mechanizm leżący u podstaw procesów poznawczych, takich jak uczenie się i pamięć17,18,19,20. Długoterminowa plastyczność synaptyczna jest wykazywana jako długoterminowe wzmocnienie (LTP), które reprezentuje wzmocnienie odpowiedzi neuronalnej, lub długotrwała depresja (LTD), która reprezentuje osłabienie odpowiedzi neuronalnej. Badano długoterminową plastyczność synaptyczną w osi poprzecznej hipokampa. Jest to jednak pierwsze badanie, które wykazało długoterminową plastyczność synaptyczną w osi podłużnej hipokampa neuronów piramidowych CA1.

Opierając się na protokole używanym przez Yang et al.16, zaprojektowaliśmy protokół, aby zademonstrować LTP i LTD w osi podłużnej hipokampa neuronów piramidowych CA1. Użyliśmy samców myszy C57BL6 w wieku od 5 do 9 tygodni do eksperymentów in vitro i 6-12 tygodni do eksperymentów in vivo. Ten szczegółowy artykuł pokazuje, w jaki sposób uzyskano podłużne wycinki mózgu hipokampa od myszy do zapisów in vitro i jak zapisy in vivo zarejestrowano na osi podłużnej. W przypadku zapisów in vitro zbadaliśmy kierunkową specyficzność podłużnej plastyczności synaptycznej CA1, celując w przegrodę i skroniowy koniec hipokampa. Zbadaliśmy również specyficzność warstwową podłużnej plastyczności synaptycznej CA1, rejestrując z warstwy oriens i warstwy promienistej hipokampa. W przypadku nagrań in vivo zbadaliśmy kąty, które najlepiej odpowiadają podłużnemu kierunkowi hipokampa.

Korzystając zarówno z nagrań pola zewnątrzkomórkowego in vivo, jak i in vitro, zaobserwowaliśmy, że podłużnie połączone neurony piramidalne CA1 prezentowały LTP, a nie LTD. Orientacja poprzeczna obejmująca zarówno neurony CA3, jak i CA1 obsługuje jednak zarówno LTP, jak i LTD. Rozróżnienie w zdolnościach synaptycznych między orientacją poprzeczną i podłużną hipokampa może spekulatywnie oznaczać różnice w ich funkcjonalnej łączności. Potrzebne są dalsze eksperymenty, aby rozszyfrować różnice w ich zdolnościach synaptycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie zwierzęta były traktowane zgodnie z wytycznymi i przepisami Laboratorium Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Narodowego Instytutu Zdrowia. Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Miejskiego w Hongkongu i Narodowego Uniwersytetu Incheon.

1. Rejestracja terenowa in vivo

  1. Przygotowanie zwierząt
    1. Wstrzyknąć uretan (0,06 g na 25 g wagi) dootrzewnowo w celu znieczulenia myszy. Suplement z wstrzyknięciem domięśniowym atropiny (0,05 mg/kg). Trzymaj mysz w ciemnym, cichym miejscu, aż zacznie działać pełne znieczulenie.
      UWAGA: Uretan ma potencjał rakotwórczy. Należy obchodzić się z nim ostrożnie i nosić odzież ochronną, aby uniknąć kontaktu z odsłoniętą skórą.
      UWAGA: Alternatywnie izofluran może być stosowany jako znieczulenie.
    2. Od czasu do czasu sprawdzaj głębokość znieczulenia, aż zacznie działać pełna płaszczyzna znieczulenia chirurgicznego. Sprawdź głębokość znieczulenia, wykonując testy szczypania palców, uszu, ogona i dotyku rogówki, aby obserwować reakcję myszy na bodźce fizyczne.
      UWAGA: Nie należy obserwować odruchu ani dobrowolnego ruchu, gdy mysz znajduje się w pełnej płaszczyźnie znieczulenia chirurgicznego.
    3. W teście szczypania palców u nóg wyciągnij tylną lub przednią nogę myszy i mocno ściśnij parą kleszczy lub palców. Mysz nie jest potwierdzona do pełnego znieczulenia, jeśli wycofuje nogę lub trzęsie ciałem, ma zauważalną zwiększoną częstość oddechów lub wydaje dźwięki wokalne.
    4. W przypadku testu szczypania uszu mocno ściśnij końce małżowiny usznej kleszczami lub palcami. Pełne znieczulenie nie jest potwierdzone, jeśli mysz porusza wąsami do przodu, potrząsa głową, wydaje dźwięki wokalne lub obserwuje zwiększoną częstość oddechów.
    5. W przypadku testu szczypania ogona delikatnie i mocno przytrzymaj ogon myszy kleszczem lub palcem. Nie należy zaobserwować ruchów ogona, dźwięku głosu ani obserwowanego wzrostu częstości oddechów, gdy jest się w pełni znieczulonym do zabiegów chirurgicznych.
    6. W teście dotyku rogówki delikatnie dotknij rogówki myszy bawełnianym. Nie należy obserwować ruchów powiek, ruchów wąsów ani zauważalnego wzrostu częstości oddechów, gdy jest się w pełni znieczulonym do zabiegu.
    7. Ogol włosy na szyi i czaszce myszy.
    8. Umieść w pełni znieczuloną mysz na poduszce grzewczej ustawionej na 37 °C i włóż sondę temperatury doodbytnicy do odbytnicy. Dzięki temu ciepło wytwarzane przez poduszkę grzewczą dostosowuje się w odpowiedzi na zmiany temperatury ciała myszy.
    9. Nałóż żel pod oczy, aby zwilżyć oczy myszy.
    10. Delikatnie wyciągnij język na bok warg za pomocą kleszczy i zamocuj dwa przednie zęby w drugim lub trzecim otworze zęba instrumentu stereotaktycznego. Mocno przymocuj czaszkę myszy za pomocą zacisku oczkowego.
      UWAGA: Alternatywnie można użyć stereotaktycznego zacisku na ucho.
    11. Obserwując pod mikroskopem, oddziel tkankę podskórną i mięśnie na końcu kości międzyciemieniowej i potylicznej myszy za pomocą skalpela, aby odsłonić cisterna magna. Osusz oponę twardą wacikiem.
    12. Delikatnie nakłuj cisterna magna, wykonując płytkie cięcie ostrym spiczastym ostrzem skalpela, aby odsączyć płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF). Załóż bawełniany wacik, aby kontynuować opróżnianie płynu mózgowo-rdzeniowego.
  2. Kraniotomia
    1. Trzymając skórę na skórze głowy kleszczami, odetnij i usuń skórę nożyczkami chirurgicznymi. Wytnij wystarczająco dużo skóry, aby odsłonić ślady bregmy i lambda na skórze głowy. Utrzymuj odsłonięty obszar w suchości.
    2. Dostosuj zaciśniętą czaszkę myszy, aby umożliwić wyrównanie punktów bregma i lambda na poziomie o podobnej wysokości. Unikaj przechylania głowy zarówno w pozycji przednio-tylnej, jak i przyśrodkowej pozycji bocznej.
    3. Zaznacz punkty odpowiadające regionowi hipokampa za pomocą suwmiarki z noniuszem. Użyj mózgu myszy w książce współrzędnych stereotaktycznych jako odniesienia, aby pomóc w określeniu dokładnych współrzędnych.
      UWAGA: Miejsce, w którym należy zaznaczyć nacięcie hipokampa, to 1 mm x 3 mm na linii środkowej określanej jako przednio-tylna (AP) przy użyciu bregmy jako punktu odniesienia i 3 mm x 3 mm prostopadłe do linii środkowej (ML) w celu połączenia punktów na linii środkowej. Współrzędne stereotaktyczne są podane jako (AP: 1,3 i ML: 3,3).
    4. Wykonaj nacięcie w czaszce powyżej grzbietowej części hipokampa wzdłuż zaznaczonych punktów za pomocą skalpela lub wiertła szybkoobrotowego, obserwując pod mikroskopem.
      UWAGA: Po nacięciu należy uzyskać otwór w kształcie prostokąta o wymiarach 2 mm x 3 mm. Utrzymuj odsłonięty obszar w czystości, aby uniknąć obrażeń mózgu.
    5. Ostrożnie wyjmij luźną czaszkę kleszczami, aby odsłonić oponę twardą i za pomocą strzykawki lub zakraplacza delikatnie nałożyć fizjologiczny roztwór soli fizjologicznej, aby powierzchnia była wilgotna.
    6. Ostrożnie usuń oponę twardą za pomocą igły lub ostrych kleszczyków ze spiczastą końcówką.
      UWAGA: Należy uważać, aby nie spowodować uszkodzenia tkanki mózgowej podczas kraniotomii. Doprowadzi to do obrzęku mózgu i wpłynie na wyniki.
    7. Utrzymuj odsłoniętą tkankę mózgową wilgotną, nakładając sól fizjologiczną lub obojętny olej za pomocą zakraplacza lub strzykawki.
  3. Nagrywanie in vivo
    1. Zamocuj i umieść elektrodę stymulacyjną i rejestrującą mocno w uchwycie stereotaktycznym. Dostosuj przyrząd stereotaktyczny zgodnie z położeniem odpowiednich współrzędnych AP i ML dla elektrod stymulacyjnych i rejestrujących nad grzbietowym hipokampem CA1.
      UWAGA: Użyj mózgu myszy we współrzędnych stereotaktycznych jako przewodnika w lokalizowaniu współrzędnych grzbietowego podłużnego obszaru hipokampa CA1. Na przykład współrzędna stereotaktyczna dla regionu hipokampa CA1 będzie wynosić (AP 1.5, ML 1.0) dla elektrody rejestrującej i (AP 1.7, ML 1.5) dla elektrody stymulacyjnej.
    2. Umieść elektrodę stymulującą bocznie w stosunku do elektrody rejestrującej w kierunku wzdłużnym.
      UWAGA: Przed użyciem upewnij się, że zarówno elektrody stymulacyjne, jak i rejestrujące są czyste. Zapobiega to wprowadzaniu szumów podczas nagrywania.
    3. Do nagrań używaj elektrod wielokanałowych. Najpierw zlokalizuj współrzędne stereotaktyczne regionu hipokampa CA1 za pomocą pierwszego kanału. Pozostałe elektrody należy ustawić tak, aby kąt elektrody stymulującej i rejestrującej mieściły się w zakresie od 30° do 60° w stosunku do linii środkowej od punktu bregma.
      UWAGA: Kąt ten odpowiada orientacji podłużnej obszaru hipokampa CA1.
    4. Jako kontrolę, umieść elektrodę rejestrującą nad regionem CA1, a elektrodę stymulacyjną nad regionem CA3 grzbietowego hipokampa. Na przykład, używając mózgu myszy we współrzędnych stereotaktycznych jako przewodnika, współrzędna stereotaktyczna dla regionu hipokampa CA1-CA3 będzie wynosić (AP 1.8, ML 1.0) dla elektrody rejestrującej i (AP 1.5, ML 1.5) dla elektrody stymulującej.
      UWAGA: Ten krok jest alternatywną kontrolą i powinien być wykonany w osobnym eksperymencie.
    5. Umieść elektrodę referencyjną w dystalnej części odsłoniętego obszaru mózgu lub pod skórą myszy.
    6. Włącz system nagrywania.
    7. Otwórz oprogramowanie do nagrywania i gromadzenia danych.
      UWAGA: Różne laboratoria mają preferowane oprogramowanie do nagrywania i pozyskiwania danych.
    8. Obserwując pod mikroskopem, powoli obniżaj elektrody rejestrujące i stymulujące za pomocą mikromanipulatora, aż dotkną powierzchni mózgu. Zaznacz punkt jako punkt zerowy, aby rozpocząć obliczanie dokładnej głębokości do obszaru hipokampa.
      UWAGA: Mikromanipulator może być używany do monitorowania głębokości, na jaką elektroda jest wprowadzana w danym momencie. Obserwuj wzrost impedancji w momencie, gdy elektroda dotyka powierzchni mózgu.
    9. Powoli opuść elektrody na przybliżoną głębokość odpowiadającą wybranym współrzędnym stereotaktycznym dla hipokampa CA1.
      UWAGA: Użyj mózgu myszy we współrzędnych stereotaktycznych jako przewodnika, aby uzyskać przybliżoną głębokość odpowiadającą wybranym współrzędnym stereotaktycznym.
    10. Przeprowadzić stymulację (czas trwania 100 μs, powtarzany w odstępach 30 s) i regulować głębokość elektrody w krokach co 50 μm lub mniej, aż do momentu zaobserwowania stabilnego pobudzającego potencjału postsynaptycznego w polu wywołanym (fEPSP).
      UWAGA: Bodziec o natężeniu 20 μA zwykle wystarcza, aby wywołać obserwowalną reakcję.
    11. Upewnij się, że stabilny fEPSP został wywołany, zmieniając intensywność bodźca. Zauważalny wzrost nachylenia lub amplitudy fEPSP powinien być obserwowany z każdą zwiększoną intensywnością bodźca. Nazywa się to krzywą wejścia-wyjścia. Utwórz krzywą wejścia-wyjścia (I-O), aby wykryć maksymalną intensywność bodźca, przy której nie ma już wzrostu nachylenia wywołanego fEPSP (Rysunek 6).
      UWAGA: Odrzuć dane i zmień położenie elektrody, jeśli salwa światłowodu zniknie podczas eksperymentu.
    12. Użyj krzywej wejścia-wyjścia, aby ustawić intensywność linii bazowej na 40 - 50% maksimum. Użyj odpowiedniej intensywności bodźca do zapisu linii bazowej.
    13. Rejestruj potencjał lokalnego pola jako punkt odniesienia przez 20 - 30 minut.
    14. Użyj tej samej krzywej wejścia-wyjścia, aby ustawić intensywność bodźca dla wywołania stymulacji o wysokiej częstotliwości (HFS) lub tężca na 75% maksymalnej intensywności. Alternatywnie, w przypadku wywoływania długotrwałej depresji, utrzymuj tę samą intensywność bodźca, która jest używana do rejestrowania linii bazowej podczas wywoływania stymulacji o niskiej częstotliwości (LFS).
    15. Zastosuj stymulację tężcową impulsów 100 Hz 4 razy w odstępie 10 s, aby wywołać LTP.
      UWAGA: Używaj tego protokołu tylko podczas pracy nad długoterminowym eksperymentem ze wzmocnieniem.
    16. Zastosuj stymulację o niskiej częstotliwości 5 Hz (900 bodźców w ciągu 3 minut), 1 Hz LFS (900 bodźców w ciągu 15 minut) lub 1 Hz sparowany impuls (50 ms interwał sparowanych impulsów, 900 par bodźców w ciągu 15 minut), aby wywołać LTD zgodnie z już ustalonymi protokołami.
      UWAGA: Używaj tych protokołów tylko podczas pracy nad długoterminowym eksperymentem na depresję.
    17. Rejestrować potencjał pola lokalnego przez 1 godzinę po HFS lub LFS, alternatywnie.
    18. Eksportuj dane i analizuj za pomocą oprogramowania.
    19. Sprawdź położenie elektrody rejestrującej i stymulującej, podając stymulację prądem 10 μA przez 30 s w celu uszkodzenia zarejestrowanych obszarów. Przezsercowo perfunduj mysz 4% paraformaldehydem i zbierz mózg do krojenia i barwienia fioletem krezylowym zgodnie z tym.
    20. Eutanazja myszy przez zwichnięcie szyjki macicy lub wstrzyknięcie śmiertelnej dawki środka znieczulającego po eksperymencie.

2. Zapis terenowy in vitro

  1. Przygotowanie natlenionych roztworów do krojenia i sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF)
    1. Na 2 litry roztworu do krojenia dodać około 1 l podwójnie destylowanej wody do kolby miarowej i energicznie wymieszać na płycie mieszającej.
    2. Dodać następujące składniki roztworu do krojenia (w mM): 87,0 NaCl, 2,5 KCl, 1,3 NaH2PO4, 25,0 NaHCO3, 25,0 glukoza, 75,0 sacharoza, 7,0 MgCl 2,6H2O i 0,5 CaCl 2∙2H2O (tabela 1).
      UWAGA: Alternatywnie MgCl2∙6H2O i CaCl2∙2H2O można wykluczyć na tym etapie i dodać później w objętości gotowej do użycia.
    3. Uzupełnić do 2 l podwójnie destylowaną wodą, energicznie mieszając.
    4. Na 2 litry ACSF dodać około 1 l podwójnie destylowanej wody do kolby miarowej i energicznie wymieszać na płycie mieszadła.
    5. Dodaj następujące składniki roztworu ACSF (w mM): 125,0 NaCl, 2,5 KCl, 1,3 NaH2PO4, 25,0 NaHCO3, 25 glukozy, 1,0 MgCl2∙6H2O i 2,0 CaCl2∙2H2O (tabela 1).
      UWAGA: Alternatywnie MgCl2,6H 2O i CaCl2∙2H2O można wykluczyć na tym etapie i dodać później w gotowej do użycia objętości.
    6. Uzupełnić do 2 l podwójnie destylowaną wodą, energicznie mieszając.
  2. Konfiguracja i krojenie mózgu
    1. Wlać 400 ml już przygotowanego roztworu do krojenia do osobnej kolby i natlenić (95%O2/5% CO2) przez około 20 minut.
    2. Resztę 1,6 l roztworu należy przechowywać w lodówce o temperaturze 4 °C. Roztwór należy przechowywać do 1 tygodnia, po czym należy go wyrzucić, jeśli nie jest używany, aby uniknąć rozwoju grzybów.
    3. Wlać 200 ml natlenionego roztworu do krojenia do kolby, przykryć parafilmem i przenieść do zamrażarki o temperaturze -80 °C na około 20 minut, aby uzyskać błoto pośniegowe.
    4. Wlej pozostałe 200 ml roztworu do krojenia w plastry mózgu do komory na plasterki mózgu i przechowuj w łaźni wodnej o temperaturze 32 °C z ciągłym bulgotaniem.
    5. Przygotuj ławkę do krojenia. Połóż ręczniki papierowe i narzędzia chirurgiczne na ławce. Ułóż narzędzia chirurgiczne w kolejności użycia, aby ułatwić szybki i wydajny proces (Rysunek 7).
    6. Wyjmij schłodzony roztwór do krojenia z zamrażarki i wlej około 50 ml do zlewki. Wlać około 10 ml na szalkę Petriego zawierającą bibułę filtracyjną w celu jej zwilżenia. Umieść je na lodzie przy obszarze sekcji.
    7. Wlej resztę rozpylonego roztworu do krojenia do komory krojenia i przymocuj go do wibratomu.
    8. Znieczulij mysz izofluranem, korzystając z wytycznych i przepisów dotyczących opieki nad zwierzętami i korzystania z laboratorium Narodowego Instytutu Zdrowia oraz zatwierdzonych metod Instytucjonalnego Komitetu ds. Wykorzystania i Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Miejskiego w Hongkongu i Narodowego Uniwersytetu Incheon.
    9. Odetnij głowę znieczulonej myszy nożyczkami i połóż głowę na bibułce. Przetnij skórę pokrywającą czaszkę myszy i przetnij nożyczkami mięśnie skóry. Przetnij płytki czaszki wzdłuż linii środkowej do kości potylicznej za pomocą nożyczek chirurgicznych.
    10. Otwórz czaszkę kleszczami, aby odsłonić mózg. Delikatnie wydłub mózg szpatułką i umieść w schłodzonym roztworze do krojenia w zlewce. Poczekaj około 30 sekund.
    11. Wyjmij mózg za pomocą łyżki i ostrożnie umieść go na uprzednio zwilżonej bibule filtracyjnej na szalce Petriego.
    12. Oddziel dwie półkule mózgu wzdłuż linii środkowej za pomocą ostrza skalpela. Odizoluj hipokamp, delikatnie odrywając go od kory za pomocą szpatułki i ostrożnie umieść na zwilżonej bibule filtracyjnej. Wytnij przegrodowy i skroniowy koniec izolowanego hipokampa za pomocą skalpela.
    13. Podnieś izolowany hipokamp za pomocą szpatułki i pędzla. Delikatnie przetrzyj szpatułką bibułkę, aby usunąć nadmiar wody.
    14. Nałóż niewielką ilość kleju na płytkę do krojenia wibratomu.
    15. Aby uzyskać podłużny plasterek hipokampa CA1, przymocuj obszar CA3 hipokampa do płytki do krojenia za pomocą kleju. Szybko, ale ostrożnie umieść go w komorze krojenia wibratomu zawierającej schłodzony, natleniony roztwór do krojenia.
    16. W przypadku przekroju poprzecznego, który będzie służył jako kontrola, przymocuj brzuszny koniec hipokampa do płytki tnącej wibratomu. Szybko, ale ostrożnie umieść go w komorze krojenia zawierającej schłodzony, natleniony roztwór preparacyjny.
      UWAGA: Ten krok jest alternatywą dla powyższego kroku i powinien być wykonany osobno.
    17. Ustaw kąt ostrza na 90°. Ustaw parametry wibratomu na prędkość 0,05 mm/s, amplitudę 1,20 mm i grubość warstwy 400 μm.
    18. Pokrój przyczepiony hipokamp za pomocą wibratomu.
      UWAGA: Dobry podłużny wycinek mózgu hipokampa CA1 będzie miał jedną warstwę CA1 i 2 warstwy zakrętu zębatego. Można uzyskać maksymalnie 2 dobre plastry hipokampa. Alternatywnie, poprzeczny wycinek mózgu hipokampa będzie miał nienaruszony zakręt zębaty, regiony CA3 i CA1.
    19. Przenieś podłużne wycinki mózgu hipokampa z wibratomu za pomocą pipety i inkubuj je w komorze na wycinek mózgu w łaźni wodnej.
    20. Plastry inkubować w łaźni wodnej przez 20 minut w temperaturze 32 °C i doprowadzić do temperatury pokojowej na 30 minut odzyskiwania.
      UWAGA: Alternatywnie, przenieś wycinek mózgu po wyjęciu z łaźni wodnej i delikatnie umieść go w komorze rejestracyjnej z przepływającym natlenionym ACSF w temperaturze 32 °C na 30 minut rekonwalescencji.
    21. Podczas inkubacji w łaźni wodnej wlać 400 ml roztworu ACSF do oddzielnej kolby i natlenić (95% O2/5% CO2) przez około 20 - 30 minut przed przeniesieniem wycinka mózgu do komory rejestracyjnej. Ciągłe przelanie ACSF do komory nagraniowej z prędkością 2 ml/min.
    22. Włącz regulator temperatury, aby podgrzać przepływający ACSF do 32 °C.
    23. Resztę 1,6 l roztworu należy przechowywać w lodówce o temperaturze 4 °C. Roztwór należy przechowywać do tygodnia, po czym należy go wyrzucić, jeśli nie jest używany, aby uniknąć rozwoju grzybów.
  3. Zapis in vitro
    1. Skonfiguruj platformę nagraniową, włączając cały potrzebny sprzęt.
    2. Przenieś wycinek mózgu z komory przytrzymującej plasterek do komory nagrywającej. Dostosuj pozycję wycinka mózgu za pomocą kleszczy i przytrzymaj go na miejscu za pomocą harfy. Pozwól ACSF pracować przez co najmniej 20 minut. Dzięki temu wycinek mózgu jest stabilny przed nagraniem.
    3. Napełnij pipetę rejestrującą ACSF jako roztwór wewnętrzny.
    4. Sprawdź rezystancję pipety rejestrującej za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Rezystancja pipety rejestrującej powinna mieścić się w zakresie 3-5 MΩ.
    5. Włącz oprogramowanie do zbierania danych. Oprogramowanie to powinno mieć podobne funkcje, które umożliwiają pozyskiwanie danych w podobny sposób, jak pokazane wcześniej nagrania in vivo.
    6. Zamocuj mocno elektrody nagraniowe i stymulacyjne w uchwycie instrumentu stereotaktycznego. Umieścić elektrodę odniesienia w ACSF w komorze rejestracyjnej.
    7. W przypadku plastrów podłużnych należy umieścić elektrodę stymulacyjną i rejestrującą w warstwie oriens (S.O.). Zachowaj odległość między elektrodami na poziomie około 300 do 500 μm. Umieść elektrodę stymulacyjną po przegrodzie lub skroniowej stronie wycinka mózgu i nagrywaj z tej samej warstwy (Rysunek 8).
    8. Alternatywnie, umieścić elektrodę stymulującą i rejestrującą w warstwie promieniowej (S.R.). Umieść elektrodę stymulającą po przegrodzie lub skroniowej stronie wycinka mózgu.
    9. W przypadku warstw poprzecznych jako kontroli, umieść elektrodę stymulującą w regionie CA3 (szlak poboczny Schaffera), a elektrodę rejestrującą w regionie CA1 (Rysunek 9).
      UWAGA: Jest to alternatywny krok kontrolny i powinien być wykonany w osobnym eksperymencie.
    10. Włącz izolowany generator bodźców i podaj stymulację (czas trwania 100 μs, powtarzany w odstępach 30 s). Dostosuj głębokość i/lub położenie elektrody rejestrującej, aż do momentu zaobserwowania stabilnego potencjału wzbudzającego pola postsynaptycznego.
    11. Upewnij się, że stabilny fEPSP został wywołany, zmieniając intensywność bodźca. Zauważalną zmianę nachylenia fEPSP należy zaobserwować przy każdej zmianie intensywności bodźca. Nazywa się to krzywą wejścia-wyjścia. Utwórz krzywą wejścia-wyjścia (I-O), aby wykryć maksymalną intensywność bodźca, przy której nie ma już wzrostu nachylenia FEPSP (Rysunek 6).
      UWAGA: Odrzuć dane i zmień położenie elektrody, jeśli salwa światłowodu zniknie podczas eksperymentu.
    12. Użyj krzywej wejścia-wyjścia, aby ustawić intensywność bodźca dla zapisu linii podstawowej i dla wywołania stymulacji wysokiej częstotliwości (HFS) lub tężca na 30-40% maksymalnego wywołanego fEPSP.
    13. Alternatywnie, w przypadku eksperymentów dotyczących LTD, należy użyć krzywej wejścia-wyjścia, aby ustawić intensywność linii bazowej dla zapisu linii bazowej i dla wywołania stymulacji niskiej częstotliwości (LFS) na 70% maksymalnego wywołanego fEPSP.
    14. Rejestruj potencjał lokalnego pola jako linię bazową przez 20 - 30 minut.
    15. Zastosuj HFS impulsów 100 Hz dwukrotnie w odstępie 30 sekund, aby indukować LTP.
    16. Alternatywnie, w przypadku eksperymentów LTD, zastosuj stymulację o niskiej częstotliwości 5 Hz (900 bodźców w ciągu 3 minut) lub LFS 1 Hz (900 bodźców w ciągu 15 minut) lub sparowany impuls 1 Hz (50 ms interwał sparowanych impulsów, 900 par bodźców w ciągu 15 minut) w celu wywołania LTD zgodnie z już ustalonym protokołem.
    17. Rejestrować potencjał pola lokalnego przez 1 godzinę po HFS lub LFS.
    18. Eksportuj dane i analizuj.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badaliśmy długoterminową plastyczność synaptyczną podłużnych neuronów piramidowych CA1 hipokampa, korzystając z nagrań pola zewnątrzkomórkowego zarówno in vivo, jak i in vitro. LTP i LTD to aspekty długoterminowej plastyczności synaptycznej, które, jak wykazano, są jednokierunkowe w osi poprzecznej hipokampa.

Pokazaliśmy tutaj, że używając podłużnych wycinków mózgu hipokampa, w osi podłużnej CA1 hipokampa znajduje się LTP. Przygotowaliśmy podłużne wycinki hipokampa wzdłuż osi przegrodowo-skron...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W protokole przedstawiono metodę indukowania długoterminowej plastyczności synaptycznej in vivo, a także z wycinków mózgu w podłużnej osi CA1-CA1 hipokampa in vitro. Przedstawione kroki dostarczają wystarczająco dużo szczegółów, aby eksperymentator mógł zbadać LTP i LTD w podłużnym połączeniu CA1-CA1 w hipokampie. Praktyka jest potrzebna, aby doskonalić umiejętności wymagane do skutecznego rejestrowania potencjałów pobudzających w terenie.

Oprócz konieczności praktyki, istnieje kilka krytyczny...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Incheon National University (International Cooperative) Research Grant. Chcielibyśmy podziękować Pani Gona Choi za pomoc w zbieraniu danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Siarczan atropiny jednowodny, ≥ 97% (TLC), krystalicznaSigma-Aldrich5908-99-6Przechowywany w eksykatorze
Axon Digidata 1550B
Chlorek wapniaSigma-Aldrich10035-04-8
Clampex 10.7
D-(+)-Glukoza ≥ 99,5% (GC)Sigma-Aldrich50-99-7
Żel do oczuDechra
IsofluraneRWD Life SciencesR510-22
Chlorek magnezu sześciowodny, BioXtra, ≥ 99,0%Sigma-Aldrich7791-18-6
Elektrody matrycowe, wolframFHC18305
Multiclamp 700B Wzmacniacz
Chlorek potasu, BioXtra, ≥ 99,0%Sigma-Aldrich7447-40-7
Fosforan potasu jednozasadowy bezwodny ≥ 99%Sigma-Aldrich7778-77-0Przechowywany w pompie eksykatora
Dłuższa pompa precyzyjna Co., LtdT-S113& JY10-14
Olej silikonowySigma-Aldrich63148-62-9
Wodorowęglan sodu, BioXtra, 99,5-100,5%Sigma-Aldrich144-55-8
Chlorek sodu, BioXtra, ≥ 99.5% (AT)Sigma-Aldrich7647-14-5
Fosforan sodu jednozasadowy, proszekSigma-Aldrich7558-80-7
Sacharoza, ≥ 99.5% (GC)Sigma-Aldrich57-50-1
Regulator temperaturyWarner InstrumentsTC-324C
Mikroelektrody wolframoweFHC20843
Uretan, ≥ 99%Sigma-Aldrich51-79-6
VibratomeLeicaVT-1200S
Kąpiel wodnaInstrumenty grantoweSAP12

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Levy, W. B. A sequence predicting CA3 is a flexible associator that learns and uses context to solve hippocampal-like tasks. Hippocampus. 6 (6), 579-590 (1996).
  2. Eldridge, L. L., Knowlton, B. J., Furmanski, C. S., Bookheimer, S. Y., Engel, S. A. Remembering episodes: A selective role for the hippocampus during retrieval. Nature Neuroscience. 3 (11), 1149-1152 (2000).
  3. Sullivan Giovanello, K., Schnyer, D. M., Verfaellie, M. A critical role for the anterior hippocampus in relational memory: evidence from an fMRI study comparing associative and item recognition. Hippocampus. 14 (1), 5-8 (2004).
  4. Andersen, P., Bland, B., Dudar, J. D. Organization of the hippocampal output. Experimental Brain Research. 17 (2), 152-168 (1973).
  5. Andersen, P., Bliss, T. V. P., Skrede, K. K. Lamellar organization of hippocampal excitatory pathways. Experimental Brain Research. 13 (2), 222-238 (1971).
  6. Sloviter, R., Lømo, T. Updating the Lamellar Hypothesis of Hippocampal Organization. Frontiers in Neural Circuits. 6 (102), (2012).
  7. Ishizuka, N., Weber, J., Amaral, D. G. Organization of intrahippocampal projections originating from CA3 pyramidal cells in the rat. Journal of Comparative Neurology. 295 (4), 580-623 (1990).
  8. Tamamaki, N., Nojyo, Y. Crossing fiber arrays in the rat hippocampus as demonstrated by three-dimensional reconstruction. Journal of Comparative Neurology. 303 (3), 435-442 (1991).
  9. Swanson, L., Wyss, J., Cowan, W. An autoradiographic study of the organization of intrahippocampal association pathways in the rat. Journal of Comparative Neurology. 181 (4), 681-715 (1978).
  10. Rebola, N., Carta, M., Mulle, C. Operation and plasticity of hippocampal CA3 circuits: implications for memory encoding. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 208(2017).
  11. Papaleonidopoulos, V., Trompoukis, G., Koutsoumpa, A., Papatheodoropoulos, C. A gradient of frequency-dependent synaptic properties along the longitudinal hippocampal axis. BMC Neuroscience. 18 (1), 79(2017).
  12. Hampson, R. E., Simeral, J. D., Deadwyler, S. A. Distribution of spatial and nonspatial information in dorsal hippocampus. Nature. 402, 610(1999).
  13. Umeoka, S. C., Lüders, H. O., Turnbull, J. P., Koubeissi, M. Z., Maciunas, R. J. Requirement of longitudinal synchrony of epileptiform discharges in the hippocampus for seizure generation: a pilot study. Journal of Neurosurgery. 116 (3), 513-524 (2012).
  14. Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65, (2010).
  15. Milior, G., et al. Electrophysiological properties of CA1 pyramidal neurons along the longitudinal axis of the mouse hippocampus. Scientific Reports. 6, (2016).
  16. Yang, S., et al. Interlamellar CA1 network in the hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (35), 12919-12924 (2014).
  17. Tsien, J. Z., Huerta, P. T., Tonegawa, S. The Essential Role of Hippocampal CA1 NMDA Receptor–Dependent Synaptic Plasticity in Spatial Memory. Cell. 87 (7), 1327-1338 (1996).
  18. Bliss, T., Collingridge, G. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361, 31-39 (1993).
  19. Roman, F., Staubli, U., Lynch, G. Evidence for synaptic potentiation in a cortical network during learning. Brain Research. 418 (2), 221-226 (1987).
  20. McNaughton, B., Barnes, C., Rao, G., Baldwin, J., Rasmussen, M. Long-term enhancement of hippocampal synaptic transmission and the acquisition of spatial information. Journal of Neuroscience. 6 (2), 563-571 (1986).
  21. Sun, D. -g, et al. Long term potentiation, but not depression, in interlamellar hippocampus CA1. Scientific Reports. 8 (1), 5187(2018).
  22. Stepan, J., Dine, J., Eder, M. Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP. Frontiers in Neuroscience. 9, 160(2015).
  23. Milner, A. J., Cummings, D. M., Spencer, J. P., Murphy, K. P. Bi-directional plasticity and age-dependent long-term depression at mouse CA3-CA1 hippocampal synapses. Neuroscience Letters. 367 (1), 1-5 (2004).
  24. Bogerts, B., et al. Hippocampal CA1 deformity is related to symptom severity and antipsychotic dosage in schizophrenia. Brain. 136 (3), 804-814 (2013).
  25. Ho, N. F., et al. Progressive Decline in Hippocampal CA1 Volume in Individuals at Ultra-High-Risk for Psychosis Who Do Not Remit: Findings from the Longitudinal Youth at Risk Study. Neuropsychopharmacology. 42, 1361(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sie mi dzywarstwowa obszaru CA1hipokamp pod u nyrejestracje in vivorejestracje in vitrod ugotrwa e wzmocnienie synaptyczned ugotrwa e os abienie synaptycznezale ne od receptor w NMDAstratum oriens

Powiązane artykuły