Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nowa metoda korekcji dinukleotydu nikotynamidoadeninowego do wewnątrzkomórkowego pomiaru Ca2+ za pomocą analogu fura-2 w żywych komórkach

5.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59881

⸱

20 września 2019

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Ulsan College of Medicine/Asan Medical Center, 2Asan Medical Center, 3Asan Medical Institute of Convergence Science and Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Ze względu na nakładanie się na siebie długości fal wzbudzenia i emisji analogów NADH i fura-2, zakłócenia sygnału od obu substancji chemicznych w żywych komórkach są nieuniknione podczas ilościowego pomiaru [Ca2+]. W związku z tym opracowano nowatorską metodę korekcji online zakłóceń sygnału NADH w celu pomiaru [Ca2+].

Streszczenie

Do ilościowego pomiaru [Ca2+] często używa się analogów fura-2, które są ratiometrycznymi fluorosondami. Jednak użycie barwnika jest wewnętrznie ograniczone w żywych komórkach z powodu interferencji autofluorescencji, głównie z dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADH). Mówiąc dokładniej, jest to główna przeszkoda przy ilościowym pomiarze mitochondriów [Ca2+] przy użyciu analogów fury-2, ponieważ większość NADH znajduje się w mitochondriach. Jeśli stężenie barwnika fluorescencyjnego jest takie samo, pewna intensywność wzbudzenia powinna wytwarzać tę samą intensywność emisji. W związku z tym stosunek intensywności emisji dwóch różnych długości fal wzbudzenia powinien być stały. W oparciu o tę zasadę opracowano nowatorską metodę korekcji online zakłóceń sygnału NADH w celu pomiaru [Ca2+], dzięki której można uzyskać rzeczywistą intensywność sygnału NADH i fura-2. Ponadto opracowano nowatorskie równanie do obliczania [Ca2+] ze wzbudzeniem izobestowym lub wzbudzeniem przy 400 nm. Dzięki tej metodzie można było z powodzeniem zmierzyć zmiany w mitochondriach [Ca2+]. Ponadto, przy innym zestawie długości fal wzbudzenia i emisji, można jednocześnie mierzyć wiele parametrów, w tym NADH, [Ca2+] i pH lub potencjał błony mitochondrialnej (Ψm). Mitochondria [Ca2+] i Ψm lub pH mierzono za pomocą fura-2-FF i estru etylowego tetrametylorodaminy (TMRE) lub karboksyl-seminaftorodafluoru-1 (karboksyl-SNARF-1).

Wprowadzenie

Znacząca rola wewnątrzkomórkowego Ca2+ jest powszechnie znana1. Kwantyfikacja [Ca2+] jest niezbędna do zrozumienia procesów fizjologicznych funkcji komórkowych. Analogi Fura-2 są bardzo przydatne, ponieważ są wzbudzane w zakresie UV (<400 nm), a do pomiaru ilościowego można zastosować metodę ratiometryczną. Dlatego inne parametry fizjologiczne, takie jak pH, potencjał błonowy itp., można mierzyć za pomocą innych barwników fluorescencyjnych. Zakres stężenia mitochondrialnego Ca2+ ([Ca2+]m) wynosił podobno 0,08−20 μM2,3,4,5. Wśród analogów fury-2, fura-2-FF jest odpowiedni do pomiaru tego zakresu [Ca2+]. Jednak żywe komórki niestety zawierają NADH / NADPH dla swoich procesów metabolicznych, a NADH generuje interferencję sygnału z powodu nakładających się widm wzbudzenia i emisji z analogiem fury-2. Interferencja ta znacznie ogranicza stosowanie analogów fury-2. W szczególności, jeśli analog zostanie zastosowany do pomiaru mitochondriów [Ca2+], interferencja ta jest największą przeszkodą, ponieważ największa ilość NADH znajduje się w mitochondriach. Jest to dodatkowo skomplikowane przez to, że zmiany NADH są związane z potencjałem błony mitochondrialnej (Ψm), a zmiana Ψm wpływa na [Ca2+]m6,7,8,9. Ponadto, aby badać dynamikę [Ca2+]m, niezbędna jest znajomość stanu innych parametrów mitochondrialnych, takich jak NADH, Ψm i pH.

Emisje przy 450 nm i 500 nm z wzbudzeniami przy 353 nm, 361 nm i 400 nm zawierają sygnały z NADH i fura-2-FF, a równania są następujące. W tym przypadku 353 nm i 361 nm są izobestowymi punktami fury-2-FF dla emisji odpowiednio przy 450 nm i przy 500 nm.

F361,450 = F361,450,NADH + F361,450,Równanie Fura 1
F353,500 = F353,500,NADH + F353,500,Równanie Fury 2
F400,500 = F400,500,NADH + F400,500,Równanie Fury 3

gdzie Fx,y jest zmierzoną intensywnością emisji w y-nm przez wzbudzenie x-nm, Fx,y,NADH reprezentuje czystą intensywność emisji zależną od NADH, a Fx,y,Fura reprezentuje czystą intensywność emisji zależną od fura-2-FF. Przy tym samym stężeniu barwnika fluorescencyjnego pewna intensywność wzbudzenia powinna wytwarzać tę samą intensywność emisji. W związku z tym stosunek intensywności emisji dwóch różnych długości fal wzbudzenia powinien być stały. Ca2+ i fura-2 nie wpływały na charakterystykę fluorescencji NADH; w związku z tym stosunek emisji przy 450 nm i przy 500 nm NADH był stały przy każdej długości fali wzbudzenia. Ta sama zasada może być stosowana dla fury-2-FF w oparciu o założenie, że NADH lub [Ca2+] nie wpływa na widma emisji i wzbudzenia fura-2-FF. Jednak Ca2+ spowodował przesunięcie widmowe emisji fury-2-FF. Dlatego, aby usunąć efekt Ca2+, należy zastosować wzbudzenie izobestowe, które jest niezależne od Ca2+. Każda długość fali emisyjnej (tj. 450 nm i 500 nm) ma inny punkt izobestowy, a z naszego układu doświadczalnego wybrano 353 nm przy 500 nm i 361 nm przy 450 nm. Na tej podstawie poprawne są następujące równania10.

Rf = F361,450,Fura/F353,500,Równanie Fura 4
RN1 = F400,500,NADH/F361,450,NADH Równanie 5
RN2 = F353,500,NADH/F361,450,NADH Równanie 6

Z tymi stałymi, następujące równania z (Równanie 1) (Równanie 2) i (Równanie 3) są poprawne.

F361,450 = F361,450,NADH + Rf × F353,500,Równanie Fura 7
F353,450 = RN2 × F361,450,NADH + F353,500,Równanie Fury 8
F400,500 = RN1 × F361,450,NADH + F400,500,Równanie Fury 9

Z tych równań, jeśli znane są Rf, RN1 i RN2, można uzyskać czyste sygnały NADH i fura-2 w następujący sposób.

F361,450,NADH = (F361,450 - Rf × F353,500)/(1 − Rf × RN2) Równanie 10
F353,500,Fura = (RN2 × F361,450 − F353,500)/(Rf × RN2 − 1) Równanie 11
F400,500,Fura = F400,500 − RN1 × F361,450,NADH Równanie 12
RFura = F353,500,Fura/F400,500,Fura Równanie 13

Forma fura-2-FF związana z Ca2+ była praktycznie niefluorescencyjna na długości fali wzbudzenia 400 nm. Na podstawie tej właściwości można wyprowadzić następujące nowe równanie kalibracyjne.

[Ca2+] = Kd ∙ (F400,500,max/F353,500,max) × (RFura − Rmin) Równanie 14

gdzie Kd jest stałą dysocjacji, F400,500,max i F353,500,max to maksymalne wartości emitowanych sygnałów przy 500 nm ze wzbudzeniami odpowiednio przy 400 nm i 353 nm, a Rmin to minimumR Fura w stanie wolnym od Ca2+. Ponieważ zastosowano wzbudzenia izobestylowe, równanie można jeszcze bardziej uprościć w następujący sposób.

[Ca2+] = Kd ∙ (1 / Rmin) ∙ (RFura − Rmin) Równanie 15

Dlatego do obliczenia [Ca2+] wymagane są tylko wartości Kd i Rmin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez lokalny instytucjonalny komitet ds. opieki i użytkowania zwierząt.

1. Przygotowanie roztworu

  1. Przygotuj pojedyncze, świeżo wyizolowane miocyty serca11.
    UWAGA: Każde laboratorium może mieć inny roztwór do przechowywania komórek. Tutaj miocyty są przechowywane w pożywce hodowlanej (DMEM).
  2. Przygotować 100 ml roztworu wolnego od Ca2+ (Tabela 1).
  3. Przygotować 50 ml pożywki hodowlanej w zlewce o pojemności 50 ml. Podać 5 ml i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Pozostały roztwór przechowywać w temperaturze pokojowej.
  4. Przygotować 50 ml roztworu saponin, dodając 5 mg saponiny do 50 ml roztworu wolnego od Ca2+.
    UWAGA: Saponina służy do przenikania miocytów serca, usuwania przedziałów cytozolowych i wizualizacji tylko fluorescencji mitochondrialnej.
  5. Przygotować 16 μl 1 mM fura-2-FF-AM rozpuszczonego w dimetylosulfotlenku (DMSO).
    UWAGA: Przygotować 1 mM roztwór podstawowy fura-2-FF-AM rozpuszczony w DMSO i podwielokrotność 16 μl w probówce o pojemności 2 ml. Przechowywać je w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  6. Przygotować 50 ml roztworu wolnego od Ca2+ wolnego od NADH (tabela 1) i 50 ml roztworu nasyconego Ca2+ wolnego od NADH (tabela 1), gdy mają być mierzone punkty izobestowe. Dostosuj pH do 7,0 za pomocą KOH.
    UWAGA: Roztwór wolny od Ca2+ bez NADH (tabela 1) zawiera 10 μM FCCP i 100 μM ADP bez żadnych substratów mitochondrialnych w celu zminimalizowania NADH w mitochondriach.
  7. Przygotować 50 ml roztworu wolnego od Ca2+, 50 ml roztworu jabłczanu, 50 ml roztworu pirogronianu, 50 ml roztworu jabłczanu i pirogronianu oraz 50 ml roztworu rotenonu do wykorzystania do pomiarów współczynnika korygującego NADH (Tabela 1).

2. Procedura ładowania fluorosondy do mitochondriów

  1. Przygotować roztwór obciążający barwnik, dodając 2 ml pożywki hodowlanej do 16 μl 1 mM fura-2-FF-AM.
    UWAGA: Barwnik fluorescencyjny jest kruchy w świetle. Przygotuj roztwór tuż przed użyciem. Roztwór zawierający barwnik fluorescencyjny należy przechowywać w ciemnym miejscu. Końcowe stężenie fura-2-FF-AM wynosi 8 μM. Jeśli użyto karboksy-SNARF-1, należy przygotować roztwór do ładowania barwnika z 2 μM karboksy-SNARF-1-AM.
  2. Weź 2 ml wyizolowanych komórek i umieść je w probówce o pojemności 5 ml w pozycji pionowej.
  3. Odczekaj 15 minut, aż miocyty opadną na dno i usuń supernatant.
    UWAGA: Supernatant może zawierać resztki komórek. Nie odwirowywać probówki, aby uniknąć uszkodzenia komórek.
  4. Dodać 2 ml roztworu obciążającego barwnik.
  5. Inkubować roztwór barwiący z komórkami przez 60 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Następnie umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 30 minut w pozycji pionowej.
  7. Usunąć sklarowany osad i dodać 4 ml podgrzanej pożywki o temperaturze 37 °C. Inkubować komórki przez 60 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  8. Na koniec usunąć supernatant, dodać 4 ml pożywki hodowlanej o temperaturze pokojowej i utrzymywać probówkę w temperaturze pokojowej.

3. Wprowadzenie wieloparametrycznego systemu pomiarowego

UWAGA: Rysunek 1 pokazuje schemat całego systemu.

  1. Jako źródło światła wzbudzającego należy użyć szybkiego monochromatora (polichromia II), który może zmienić światło w ciągu 3 ms.
  2. Użyj soczewki olejowej (40x, NA 1.3) z odwróconym mikroskopem, aby zwiększyć intensywność sygnału.
  3. Użyj filtra bliskiej podczerwieni i kamery ze sprzężeniem ładunkowym (CCD), aby monitorować pole obiektu bez zakłóceń sygnału fluorescencyjnego.
  4. Przechwyć obraz pola obiektu, aby uzyskać obszar.
  5. Dostosuj pole obiektu na ekranie monitora za pomocą przysłony pola tylko po to, aby pokazać komórkę w celu zmniejszenia tła.
  6. Użyj czterech fotopowielaczy z każdym filtrem pasmowo-przepustowym (450, 500, 590 i 640 nm), aby wykryć długości fal emisji metodą zliczania fotonów. Użyj odpowiednich lusterek dichroicznych, aby rozdzielić i przekierować światło emisyjne.
    UWAGA: Światło wzbudzenia jest bardzo silne w porównaniu ze światłem emisyjnym. Dlatego wybierz filtr pasmowo-przepustowy o najwyższych parametrach blokowania, aby zmniejszyć tło. System zliczania fotonów składa się z kombinacji PMT, jednostek licznika fotonów i szybkiego licznika. Do sterowania systemem i pobierania próbek danych wykorzystano specjalne oprogramowanie do jazdy. Konieczne jest znalezienie sposobu na zastosowanie tej metody z innymi systemami.

4. Metody korekcji NADH z wieloparametrycznym systemem pomiarowym

  1. Identyfikacja punktów izobestycznych Fura-2-FF in situ.
    UWAGA: W wielu raportach stwierdzono, że charakterystyka fluorescencji w komórkach ulega zmianie. Dlatego należy wykonać wszystkie procedury, aby uzyskać parametry korygujące zakłócenia in situ.
    1. Zamontuj naładowaną barwnikiem komórkę na mikroskopie i odczekaj 3 minuty, aby zanurzyć komórki na dnie.
      UWAGA: Dostosuj liczbę komórek, aby zobaczyć około jednej komórki na jedno pole obiektywu za pomocą soczewki obiektywu 40x.
    2. Roztwór wolny od Ca2+ należy ukrwić w temperaturze 37 °C.
    3. Po wycelowaniu w komórkę zmierz tło wolne od komórek i obszar komórki, jak pokazano w sekcji 4.1. Oblicz tło komórki na podstawie obszaru komórki.
      UWAGA: Oba sygnały tła muszą być korygowane w każdym eksperymencie.
    4. Roztworem saponin należy perfundować przez 60 sekund i powrócić do roztworu wolnego od NADH Ca2+.
    5. Pomiar sygnałów emitowanych przez Fura-2-FF przy długości fali 450 nm i 500 nm jednocześnie poprzez skanowanie wzbudzenia od 350 nm do 365 nm z krokiem co 0,1 nm.
    6. Przeprowadzić fuzję roztworu nasyconego Ca2+ wolnego od NADH i powtórzyć krok 4.2.5.
    7. Odejmij sygnały w roztworze nasyconymCa2+ od sygnałów w warunkach wolnych odCa2+.
    8. Powtórzyć procedury od 4.2.2 do 4.2.7 z innymi pojedynczymi miocytami serca.
      UWAGA: Jeśli intensywność sygnału osłabnie, powtórz od 4.2.1. Powtórz procedurę dla co najmniej 5 różnych komórek.
    9. Ze wszystkich uzyskanych sygnałów oblicz odchylenia standardowe emisji przy każdym wzbudzeniu i wybierz długość fali wzbudzenia pokazującą minimalną wartość odchylenia standardowego (SD) jako punkt izobestowy.
      UWAGA: Reprezentatywne liczby są pokazane w Rysunek 2.
  2. Wykrywanie sygnału tła i metody korekcji obszaru komórki
    UWAGA: Istnieją dwa rodzaje tła. Jedna pochodzi z komórek, a druga z odbicia na szkiełku okładkowym (tło wolne od komórek). Oba tła muszą być korygowane w każdym eksperymencie.
    1. Zamontuj komórki bez barwnika w kąpieli pod mikroskopem i odczekaj 3 minuty, aby opaść komórki na dno. Uzyskuj roztwór wolny od NADH, Ca2+ przez około 5 minut.
      UWAGA: Szybkość perfuzji całego roztworu wynosi 2-3 ml / min w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Dostosuj liczbę komórek, aby zobaczyć około jednej komórki na jedno pole obiektywu za pomocą soczewki obiektywu 40x.
    2. Ustaw pole obiektu tak, aby obejmowało komórkę docelową.
    3. Po wyprowadzeniu komórki poza pole zmierz sygnały tła okna wolnego od komórek i ustaw je jako offsety.
      UWAGA: Sygnał oznacza sygnał świetlny, który ma zostać wykryty w systemie zliczania fotonów.
    4. Przywróć komórkę do pozycji początkowej i zmierz sygnały tła komórki oraz obszar komórki.
      UWAGA: Mimo że światło wzbudzenia jest filtrowane za pomocą filtra pasmowoprzepustowego, nadal zawiera dość dużą ilość przefiltrowanego światła. Światło to jest rozpraszane podczas uderzania w komórki i powoduje znaczny sygnał tła, ponieważ system zliczania fotonów jest bardzo czuły. Trzeba to poprawić.
      UWAGA: Obszar komórki można obliczyć na podstawie przechwyconego obrazu komórki i dostępnego oprogramowania do obrazowania. Jednostką obszaru komórki może być dowolna jednostka, w tym liczba pikseli. Konieczna jest tylko standaryzacja.
    5. Powtórz od 4.1.1 do 4.1.4 10 razy, aby uzyskać zależność między obszarem komórki a sygnałami tła komórki.
      UWAGA: Później sygnały tła komórki można obliczyć na podstawie obszaru komórki z relacji. Ponieważ żarówka wzbudzenia starzeje się, procedurę tę należy powtarzać co najmniej raz w miesiącu.
  3. Pomiar współczynników R
    1. Obliczyć Rf za pomocą równania 4 z sygnałów otrzymanych w ppkt 4.2.
    2. Zamontuj bezbarwne komórki na mikroskopie i przelej roztwór wolny od Ca2+.
    3. Zmierz sygnały, takie jak F361, 450, NADH, F400, 500, NADH, F361, 450, NADH i F353, 500, NADH.
    4. Perfaktywować roztwór jabłczanu i powtórzyć czynności opisane w ppkt 4.3.3 i zmierzyć sygnały.
    5. Przeprowadzić perfuzję roztworu pirogronianu i powtórzyć czynności opisane w pkt 4.3.3 i zmierzyć sygnały.
    6. Przeprowadzić perfuzję roztworu jabłczanu i pirogronianu i powtórzyć czynności opisane w pkt 4.3.3 i zmierzyć sygnały.
    7. Przeprowadzić perfuzję roztworu rotenonu i powtórzyć czynności opisane w pkt 4.3.3. i zmierzyć sygnały.
      UWAGA: Przykład sygnału NADH zarejestrowanego na 5 mM pirogronianu, 5 mM jabłczanu plus 5 mM pirogronianu i 10 μM dodatku rotenonu pokazano w Rysunek 3.
    8. Oblicz każde nachylenie F361, 450, NADH w porównaniu z F400, 500, NADH i F361, 450, NADH w stosunku do F353, 500, NADH. Jak pokazano w Rysunek 3. Każde nachylenie wskazuje RN1 i RN2.

5. Wybór światła wzbudzenia i emisji dla TMRE lub karboksy-SNARF-1

  1. Jeśli dodatkowo zastosowano TMRE do pomiaru potencjału mitochondrialnego, należy użyć długości fali wzbudzenia 530 nm i długości fali emisji 590 nm.
  2. Jeśli dodatkowo użyto karboksy-SNARF-1 do pomiaru potencjału mitochondrialnego, należy użyć długości fali wzbudzenia 540 nm i długości fali emisji 590 nm i 640 nm12.

6. Wybór wartości Kd fura-2-FF

  1. Zmiana pH może wpływać na wartości Kd dla wiązania Ca2+ na fura-2-FF10. Użyj wartości Kd 5,28 przy pH 7,5 dla mitochondriów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zmiany mitochondrialnego Ca2+ po korekcie10
Rycina 4 przedstawia zmiany [Ca2+]m przed i po korekcie. Wyniki wyraźnie wykazały znaczne zmiany w [Ca2+]m. Mitochondrialne spoczynkowe stężenie wapnia przy braku cytosolowego Ca2+ ([Ca2+]c) wynosiło 1,03 ± 0,13 µM (średnia ± S.E., n = 32), a maksymalne [Ca2+]m przy 1-µM [Ca2+]c wynosiło 29,6 ± 1,61 µM (...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Z powodzeniem opracowano metodę korekcji zakłóceń do pomiaru sygnałów analogów NADH i fura-2. Dokładny pomiar sygnałów jest niezbędny do dokładnej korekcji. Jednak inherentna natura urządzenia fluorescencyjnego wytwarza sygnał tła niezwiązany z sygnałem NADH fury-2. Najwyższej jakości filtr pasmowo-przepustowy może przepuszczać tylko do 10−8 niepożądanych długości fal światła. Jednak sygnał fluorescencyjny z pojedynczej komórki jest bardzo mały, a odbicie światła wzbudzającego po filtrze pasmowo-przepustowym j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez Program Badań Podstawowych przez Narodową Fundację Badawczą Korei (NRF) finansowany przez Ministerstwo Edukacji (2018R1A6A3A01011832), przez Ministerstwo Nauki, ICT i Planowania Przyszłości (NRF-2016M3C1A6936606) oraz przez Ministerstwo Handlu, Przemysłu i Energii (10068076).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2 mL probówka eppendorfAxygenMCT-200-C2 mL Probówka
AD/DA konwerterInstrutechITC-18Sprzęt
ADP, sól monopotasowa 5′-difosforanu adenozyny dwuwodnaSigma-aldrichA5285Chemikalia
Filtr pasmowyEaling Electro-Optics, Inc35-3920Sprzęt, 640± Filtr pasmowy 11nm
< strong> < / strong>Omega Optical690-9823Equipment, 590 i plusmn; Filtr pasmowy 15nm
< strong> / strong< / strong>Omega Optical500DF20-9916Sprzęt, 500 i plusmn; Filtr pasmowy 20nm
Chroma Technology Corp.60685Sprzęt, 450± 30nm
Roztwór chlorku wapnia< / strong>Sigma-aldrich21114Chemikalia<
strong>karboksyl-SNARF-1(AM)InvitrogenC1272Chemikalia
Kamera z urządzeniem sprzężonym z ładunkiem (CCD)PhilipsFTM1800NH/HGIEquipment
Dichroic mirrorChroma Technology Corp.86009Sprzęt, Wielopasmowe zwierciadło dichroiczne, Odbicie : < 400nm, 490 i plusmn; 10, 560± 10, skrzynia biegów: 460± 15, 510± 20, >580nm
Dichroiczne lustro< / mocne>Chroma Technology Corp.567DCXRUSprzęt, Odbicie : < 560nm, Transmisja : > 580 nm
< mocne>zwierciadło dichroiczneChroma Technology Corp.480dclpSprzęt, Odbicie : < 470nm, Transmisja: > 490 nm
< mocne>zwierciadło dichroiczneChroma Technology Corp.20728Sprzęt, Wielopasmowe zwierciadło dichroiczne, Odbicie : < 405 nm, 470 i plusmn; 30, transmisja: 430nm ~ 520nm, > 640 nm
< strong>Dimethyl suloxide (DMSO) < / strong>Sigma-aldrich154938Chemicals
DMEM, Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s MediumSigma-aldrichD5030Chemikalia
EGTA, Kwas egtazynowy, Kwas etylenowo-bis(oksyetylenonitrolo)tetraoctowy, Eter glikolowy, Kwas diaminotetraoctowySigma-aldrichE4378Chemikalia
FCCP, 4-trifluorometoksyfenylohydrazon mezosalonitryluSigma-aldrich21857Chemikalia
polowa membranaNikon86506Sprzęt
Fura-2-FF(AM)TEFLABS137chemikalia
Zielona probówkaprobówkaDWM
HEPES,  Kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy, Kwas N-(2-hydroksyetylo)piperazyno-N′-(2-etanosulfonowy), Kwas N-(2-hydroksyetylo)piperazyno-N′-(2-etanosulfonowy)) Sigma-aldrichH3375Chemicals
High-speed counterNational InstrumentsNI-6022Equipment
Hot mirrorChroma Technology Corp.21002Sprzęt, 50:50
Mikroskop odwrócony NikonTE-300Sprzęt
MalateSigma-aldrich27606Chemicals
Filtr bliskiej podczerwieni Chroma Technology Corp.Sprzęt D750/100X, 750± Soczewka
zanurzeniowa 100nm NikonMRF0140040x, NA 1.3; Ekwipunek
Licznik fotonówHamamatsuC3866Sprzęt
Rurka zwielokrotniająca fotonyHamamatsuR2949Sprzęt
Polichromia IITill PhotonicsSA3/MG04Sprzęt
Chlorek potasuMerck1.04936Chemikalia
Roztwór wodorotlenku potasuSigma-aldrichP4494Chemikalia
PirogronianSigma-aldrich107360Chemikalia
RotenonSigma-aldrichR8875Chemikalia
SaponinaSigma-aldrichS4521Chemikalia
TMRE, Tetrametylorodamina, ester etylowy < / strong>Sondy molekularneT669Chemikalia

Bibliografia

  1. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
  2. Miyata, H., et al. Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes. American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).
  3. Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. G. The loading of fura-2 into mitochondria in the intact perfused rat heart and its use to estimate matrix Ca2+ under various conditions. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 24 (7), 765-773 (1992).
  4. Griffiths, E. J., Halestrap, A. P. Pyrophosphate metabolism in the perfused heart and isolated heart mitochondria and its role in regulation of mitochondrial function by calcium. Biochemical Journal. 290 (Pt 2), 489-495 (1993).
  5. Crompton, M., Moser, R., Ludi, H., Carafoli, E. The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues. European Journal of Biochemistry. 82 (1), 25-31 (1978).
  6. Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).
  7. Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes. Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).
  8. Brandes, R., Bers, D. M. Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae. Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).
  9. Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).
  10. Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat. Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).
  11. Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium. Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).
  12. Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism. Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).
  13. Page, E. Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology. American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).
  14. Page, E., McCallister, L. P., Power, B. Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).
  15. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Metoda korekcji NADHpomiar wapnia mitochondrialnegowzbudzenie izosbestyczneratiometryczna sonda fluorescencyjnainterferencja sygna u NADHpotencja b ony mitochondrialnejester etylowy tetrametylorodaminykarboksy seminaphtorhodafluor 1roztw r wolny od wapnia
Nowa metoda korekcji dinukleotydu nikotynamidoadeninowego do wewnątrzkomórkowego pomiaru Ca2+ za pomocą analogu fura-2 w żywych komórkach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.