Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Interakcje i przenikanie błony mitochondriów mózgowych przez fibryle amyloidowe

5.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59883

⸱

28 września 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Institute for Advanced Studies in Basic Sciences (IASBS), Zanjan, 45137-66731, Iran

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Dostępny jest tutaj protokół do badania interakcji między natywnymi formami, prefibrylarnymi i dojrzałymi fibrylami amyloidowymi różnych peptydów i białek z mitochondriami izolowanymi z różnych tkanek i różnych obszarów mózgu.

Streszczenie

Coraz więcej dowodów wskazuje, że przenikanie błon, w tym błon wewnętrznych, takich jak mitochondria, jest powszechną cechą i głównym mechanizmem toksyczności indukowanej przez agregaty amyloidowe w chorobach neurodegeneracyjnych. Jednak większość doniesień opisujących mechanizmy rozrywania błon opiera się na systemach modelowych fosfolipidów, a badania bezpośrednio ukierunkowane na zdarzenia zachodzące na poziomie błon biologicznych są rzadkie. Opisano tutaj model do badania mechanizmów toksyczności amyloidu na poziomie błony. Do izolacji mitochondriów stosuje się pożywkę o gradiencie gęstości w celu uzyskania preparatów o minimalnym zanieczyszczeniu mieliną. Po potwierdzeniu integralności błony mitochondrialnej bada się interakcję włókienek amyloidowych powstających z α-synukleiny, insuliny bydlęcej i lizozymu białka jaja kurzego (HEWL) z mitochondriami mózgu szczura, jako model biologiczny in vitro. Wyniki pokazują, że leczenie mitochondriów mózgu zespołami fibrylarnymi może powodować różne stopnie przepuszczalności błony i zwiększenie zawartości ROS. Wskazuje to na zależne od struktury interakcje między włókienkami amyloidowymi a błoną mitochondrialną. Sugeruje się, że właściwości biofizyczne włókienek amyloidowych i ich specyficzne wiązanie z błonami mitochondrialnymi mogą stanowić wyjaśnienie niektórych z tych obserwacji.

Wprowadzenie

Zaburzenia związane z amyloidem, znane jako amyloidozy, stanowią dużą grupę chorób definiowanych przez pojawienie się nierozpuszczalnych złogów białkowych w różnych tkankach i narządach1,2. Wśród nich zaburzenia neurodegeneracyjne są najczęstszymi formami, w których agregaty białkowe pojawiają się w ośrodkowym lub obwodowym układzie nerwowym2. Chociaż zaproponowano szereg mechanizmów związanych z toksycznością agregatów amyloidowych3, coraz więcej dowodów wskazuje na rozerwanie błony komórkowej i przepuszczalność jako główny mechanizm patologii amyloidu4,5. Oprócz błony komórkowej może to również dotyczyć organelli wewnętrznych (tj. mitochondriów).

Interesujące, pojawiające się dowody sugerują, że dysfunkcja mitochondriów odgrywa kluczową rolę w patogenezie chorób neurodegeneracyjnych, w tym chorób Alzheimera i Parkinsona6,7. Zgodnie z tym problemem, liczne raporty wskazują na wiązanie i akumulację amyloidowego β-peptydu, α-synukleiny, huntingtyny i zmutowanych białek SOD1 związanych z ALS z mitochondriami8,9,10,11. Uważa się, że mechanizm przenikania błony przez agregaty amyloidu zachodzi albo poprzez tworzenie dyskretnych kanałów (porów) i/lub poprzez niespecyficzny mechanizm podobny do detergentu5,12,13. Warto zauważyć, że większość tych wniosków została oparta na doniesieniach dotyczących modelowych systemów fosfolipidowych, a badania bezpośrednio ukierunkowane na zdarzenia zachodzące w błonach biologicznych są rzadkie. Oczywiste jest, że te sztuczne dwuwarstwy lipidowe niekoniecznie odzwierciedlają wewnętrzne właściwości błon biologicznych, w tym mitochondriów, które są strukturami niejednorodnymi i składają się z szerokiej gamy fosfolipidów i białek.

W obecnym badaniu, mitochondria wyizolowane z mózgów szczurów są używane jako model biologiczny in vitro do zbadania destrukcyjnych skutków włókienek amyloidowych powstających z α-synukleiny (jako białka amyloidogennego), insuliny bydlęcej (jako modelowego peptydu wykazującego znaczącą homologię strukturalną z ludzką insuliną zaangażowaną w amyloidozę zlokalizowaną iniekcyjnie) oraz lizozymu białka jaja kurzego (HEWL; jako powszechne białko modelowe do badania agregacji amyloidu). Interakcje i możliwe uszkodzenia błon mitochondrialnych wywołane przez włókienka amyloidowe są następnie badane, obserwując uwalnianie dehydrogenazy jabłczanu mitochondriów (MDH) (zlokalizowanej w macierzy mitochondrialnej) i wzmocnienie mitochondriów reaktywnych form tlenu (ROS).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Nauk Medycznych w Teheranie. Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie i niekorzystne skutki dla szczurów poprzez naostrzenie ostrzy gilotyny oraz stosowanie zdecydowanych i szybkich ruchów ostrza.

1. Homogenizacja mózgu i izolacja mitochondriów

UWAGA: Wszystkie odczynniki do izolacji mitochondriów zostały przygotowane zgodnie z procedurą opracowaną przez Simsa i Andersona14.

  1. Przygotowanie buforów do izolacji mitochondriów
    1. Przygotować 100 mM roztwór Tris-HCl: odważyć 0,605 g Tris-HCl i rozpuścić w około 40 mL wody dejonizowanej (DW) w zlewce. Przenieść roztwór do kolby miarowej o pojemności 50 mL i uzupełnić objętość końcową do 50 mL wodą DW.
    2. Przygotować 10 mM roztwór EDTA: odważyć 0,202 g EDTA i rozpuścić w około 40 mL DW w zlewce. Przenieść roztwór do kolby miarowej o pojemności 50 mL i uzupełnić objętość końcową do 50 mL wodą DW.
      UWAGA: Oba roztwory można przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 4 tygodnie.
    3. Przygotować roztwór stokowy Tris-HCl/EDTA/sacharoza: dodać 30 mL 100 mM Tris-HCl i 30 mL 10 mM EDTA do zlewki. Odważyć 32,86 g sacharozy i dodać do zlewki, mieszając za pomocą mieszadła magnetycznego. Po rozpuszczeniu sacharozy przenieść roztwór do kolby miarowej o pojemności 100 mL i uzupełnić objętość końcową do 100 mL wodą DW.
      UWAGA: Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 dni.
    4. Przygotować bufor do izolacji (IB): dodać 100 mL roztworu stokowego Tris-HCl/EDTA/sacharoza do około 150 mL DW. Dostosować pH do 7,4 poprzez dodanie 0,1 M HCl. Uzupełnić objętość końcową do 300 mL wodą DW.
    5. Przygotować 15% (v/v) medium do gradientu gęstości w IB, dodając 1,5 mL medium do gradientu gęstości do 8,5 mL zimnego buforu IB.
    6. Przygotować 10 mg/mL roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA): odważyć 20 mg BSA wolnej od kwasów tłuszczowych i rozpuścić w około 1,5 mL DW w fiolce o pojemności 2 mL. Uzupełnić objętość końcową do 2 mL wodą DW i przechowywać na lodzie do momentu użycia.
      UWAGA: Roztwory z kroków 1.1.4–1.1.6 należy przygotować świeżo w dniu izolacji mitochondriów i przechowywać na lodzie do momentu użycia.
  2. Izolacja mózgu szczura
    UWAGA: Dekapitację i usunięcie mózgu samców szczurów (150–200 g) przeprowadzono zgodnie z metodą Simsa i Andersona14.
    1. Umieścić zlewkę o pojemności 30 mL w pojemniku z lodem i dodać do niej 10 mL zimnego buforu IB.
    2. Przeprowadzić dekapitację szczura za pomocą gilotyny do małych zwierząt i usunąć mózg z czaszki w ciągu 1 min od dekapitacji, aby ograniczyć pogorszenie właściwości mitochondriów.
    3. Szybko przenieść mózg do zlewki zawierającej zimny bufor IB.
  3. Homogenizacja mózgu i przygotowanie mitochondriów
    UWAGA: Frakcje mitochondrialne izolowano zgodnie z protokołem opisanym przez Simsa i Andersona14, z pewnymi modyfikacjami opisanymi wcześniej15. Ważne jest, aby pracować szybko i utrzymywać wszystkie elementy na lodzie przez całą procedurę.
    1. Przemyć tkankę 2x 30 mL buforu IB, przenieść do zlewki z zimnym IB i drobno posiekać mózg nożyczkami.
    2. Dodać 10 objętości schłodzonego buforu IB (około 10 mL IB na mózg szczura).
    3. Przenieść zawiesinę tkankową do zimnego homogenizatora Dounce'a o pojemności 20 mL.
    4. Zhomogenizować fragmenty tkanki, wykonując dziewięć ruchów góra-dół za pomocą zmotoryzowanego tłoka.
      UWAGA: Po każdej serii trzech ruchów homogenizacji pozostawić mieszaninę na lodzie przez około 30 s, aby zapewnić utrzymanie niskiej temperatury homogenatu.
    5. Przenieść homogenat do schłodzonej probówki wirówkowej o pojemności 10 mL i wirować przy 1 300x g i 4 °C przez 3 min.
    6. Ostrożnie zlać nadsącz, przenieść go do schłodzonej probówki wirówkowej o pojemności 10 mL i wirować przy 21 000x g w 4 °C przez 10 min.
    7. Usunąć nadsącz i resuspendować osad w zimnym 15% roztworze medium do gradientu gęstości (5 mL na każdy mózg), delikatnie mieszając zawiesinę pipetą.
    8. Wirować w rotorze z kątem stałym przy 30 700x g w 4 °C przez 5 min, stosując powolne przyspieszanie (45 s od 0 rpm do 500 rpm, a następnie normalne przyspieszanie) oraz hamowanie (bez hamulców). Powinno to doprowadzić do powstania dwóch wyraźnych pasm materiału (Rysunek 1A, lewo).
    9. Za pomocą pipety Pasteura usunąć wyraźne pasmo materiału zgromadzone na górze gradientu, które składa się głównie z mieliny. Następnie usunąć w miarę możliwości roztwór medium do gradientu gęstości znajdujący się nad materiałem (w paśmie 2), nie tracąc przy tym wzbogaconej frakcji mitochondrialnej w paśmie 2.
      UWAGA: Pasmo 2 zawiera zarówno mitochondria synaptyczne, jak i niesynaptyczne.
    10. Dodać 8 mL buforu IB do frakcji mitochondrialnej, delikatnie mieszając zawiesinę pipetą.
    11. Wirować przy 16 700x g w 4 °C przez 10 min i ostrożnie usunąć nadsącz, nie naruszając luźnego osadu na dnie.
    12. Dodać 1 mL 10 mg/mL BSA wolnej od kwasów tłuszczowych do probówki wirówkowej, delikatnie mieszając zawiesinę końcówką pipety. Uzupełnić objętość końcową do 5 mL na mózg, dodając bufor IB.
    13. Wirować przy 6 900x g w 4 °C przez 10 min, co powinno doprowadzić do powstania zwartego osadu (Rysunek 1A, prawo).
    14. Zlać nadsącz i delikatnie resuspendować osad mitochondrialny w buforze IB, rozdzielić na aliquoty do probótek 0,5 mL i przechowywać w ciekłym azocie do momentu użycia.

2. Oznaczanie stężenia białka

UWAGA: Stężenie białka jest mierzone metodą Lowry'ego i współpracowników16.

  1. Przygotowanie roztworów do oznaczenia metodą Lowry'ego
    1. Przygotuj roztwór A: odważ 0,4 g NaOH oraz 2 g Na2CO3 i rozpuść w 80 mL DW, następnie przelej roztwór do kolby miarowej o pojemności 100 mL i dopełnij DW do 100 mL.
    2. Przygotuj roztwór B: odważ 0,1 g winianu potasu i sodu oraz 0,05 g CuSO4 i rozpuść w 8 mL DW, następnie przelej roztwór do kolby miarowej o pojemności 10 mL i dopełnij DW do 10 mL.
      UWAGA: Zarówno roztwór A, jak i B mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.
    3. Przygotuj roztwór C: dodaj 0,5 mL odczynnika Folina do 7,5 mL DW.
      UWAGA: Roztwór C należy przygotować bezpośrednio przed użyciem i przechowywać w ciemności.
    4. Przygotuj standardy BSA o stężeniach końcowych 0, 20, 40, 60, 80, 100 i 120 µg/mL, łącząc odpowiednio 0, 20, 40, 60, 80, 100 i 120 µL BSA o stężeniu 1 mg/mL z odpowiednią ilością DW, aby uzyskać 1000 µL roztworu.
  2. Pomiar stężenia białka
    UWAGA: Dla uzyskania większej dokładności należy wykonać ten etap w trzech powtórzeniach.
    1. Do każdego dołka płytki 96-dołkowej dodaj 50 µL roztworów standardowych oraz homogenatu mitochondrialnego, a następnie dodaj 45 µL roztworu A. Następnie inkubuj płytkę przez 10 min w łaźni wodnej ustawionej na 50 °C.
    2. Dodaj 5 µL roztworu B i inkubuj płytkę przez 10 min w ciemności w temperaturze pokojowej (RT).
    3. Dodaj 150 µL roztworu C i inkubuj płytkę przez 10 min w łaźni wodnej ustawionej na 50 °C.
    4. Wstaw płytkę do czytnika płytek i zmierz wartości absorbancji dla standardów oraz zawiesiny mitochondrialnej przy 650 nm. Następnie, korzystając z krzywej kalibracyjnej, oblicz zawartość białka w mitochondriach.

3. Oznaczanie integralności błony mitochondrialnej

UWAGA: Integralność błony mitochondrialnej potwierdza się poprzez pomiar aktywności dehydrogenazy jabłczanowej (MDH) w wyizolowanych mitochondriach przed i po przerwaniu błony za pomocą Triton X-100.

  1. Rozcieńczyć homogenat mitochondrialny do stężenia 1 mg/mL zimnym buforem IB i przenieść do dwóch probówek o pojemności 1,5 mL (zazwyczaj 195 μL mitochondriów na probówkę).
  2. Do jednej probówki dodać 5 µL 20% (v/v) Triton X-100 (rozcieńczonego w DW) (jako kontrolę pozytywną dla maksymalnej aktywności enzymu), a do drugiej 5 µL DW (jako kontrolę), a następnie wymieszać za pomocą mieszadła.
  3. Inkubować probówki przez 10 min w ciepłej łaźni wodnej ustawionej na 30 °C.
  4. Osadzić mitochondria poprzez wirowanie probówek w rotorze kątowym przy 16 000 x g i 4 °C przez 15 min.
  5. Ostrożnie zebrać otrzymane nadnadtopłyny w celu oznaczenia aktywności mitochondrialnej MDH przy użyciu standardowego testu spektrofotometrycznego opisanego w następnej sekcji.
  6. Obliczyć integralność błony mitochondrialnej według następującego wzoru:
    Wzór na integralność błony, ΔOD340nm, obliczenie procentowe, metoda analizy biochemicznej.

4. Oznaczanie aktywności MDH

UWAGA: Aktywność MDH mierzono spektrofotometrycznie zgodnie z opisem Sottocasy i wsp.17.

  1. Przygotowanie roztworów do oznaczenia aktywności MDH
    1. Przygotować 50 mM roztwór Tris-HCl (pH = 7,5): przygotować roztwór o stężeniu 7,9 mg/mL w DW przy użyciu Tris-HCl i dostosować pH do 7,5 w temperaturze 25 °C za pomocą 1,0 M NaOH.
    2. Przygotować 50 mM roztwór szczawiooctanu: przygotować roztwór o stężeniu 6,6 mg/mL przy użyciu szczawiooctanu w Tris-HCl.
      UWAGA: Roztwór ten jest niestabilny po rozpuszczeniu i powinien zostać przygotowany bezpośrednio przed użyciem.
    3. Przygotować 10 mM roztwór β-NADH: przygotować roztwór o stężeniu 7,81 mg/mL przy użyciu β-NADH w Tris-HCl.
  2. Oznaczanie aktywności MDH
    UWAGA: Końcowe stężenia w 1,0 mL mieszaniny reakcyjnej wynoszą 50 mM Tris-HCl, 5 mM szczawiooctanu i 0,1 mM β-NADH.
    1. Ustawić spektrofotometr na 25 °C i 340 nm. Do kuwety ślepej pipetować 890 µL buforu Tris-HCl, 100 µL roztworu szczawiooctanu i 10 µL roztworu NADH, a do kuwety z próbką 880 µL buforu Tris-HCl, 100 µL roztworu szczawiooctanu i 10 µL roztworu NADH.
    2. Inkubować kuwety w spektrofotometrze przez 3–4 min i przeprowadzić zerowanie względem próby ślepej.
    3. Następnie dodać 10 µL homogenatu mitochondrialnego (1 mg/mL) do kuwety z próbką, natychmiast wymieszać przez odwrócenie i rejestrować spadek absorbancji wynikający z utleniania NADH przy 340 nm przez 1 min.

5. In vitro formowanie włókien α-synukleiny, insuliny wołowej i HEWL

  1. Przygotowanie białek
    1. α-synukleina:
      UWAGA: Ekspresja i oczyszczanie rekombinowanej α-synukleiny są przeprowadzane zgodnie z opisem Hoyera i wsp.18 z pewnymi modyfikacjami, a czystość α-synukleiny jest potwierdzana za pomocą SDS-PAGE.
      1. Oczyszczoną α-synukleinę dializować przez noc przeciwko roztworowi soli fosforanowo-buforowanej (PBS).
      2. Oznaczyć stężenie białka, korzystając z współczynnika wymierania 5600 M-1 cm-1 przy 275 nm19.
      3. Białko podzielić na alykwooty w probówkach 1,5 mL i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
    2. Insulina wołowa i HEWL:
      1. Przygotować insulinę wołową oraz HEWL.
      2. Każde białko rozpuścić w 50 mM buforze glicynowym (pH = 1,6; pH skorygować za pomocą HCl).
      3. Oznaczyć stężenie insuliny wołowej i HEWL, korzystając z współczynnika wymierania odpowiednio 1,0 oraz 2,63 dla 1,0 mg/mL przy 276 nm i 280 nm20,21.
  2. Indukcja fibrylacji amyloidowej
    1. Przygotowanie roztworów do fibrylacji amyloidowej:
      1. Przygotować bufor do tioflawiny T (ThT): odważyć 0,3 g NaH2PO4 i rozpuścić w 80 mL DW, skorygować pH do 6,5, a następnie uzupełnić objętość do 100 mL wodą DW.
      2. Przygotować roztwór stokowy ThT (5 mM): odważyć 1,6 mg ThT i rozpuścić w 1 mL buforu ThT, przefiltrować przez papier filtracyjny 0,22 μm i przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
        UWAGA: Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C do 4 tygodni.
      3. Przygotować roztwór ThT (1 mM): dodać 200 µL roztworu stokowego ThT (5 mM) do 800 µL buforu ThT.
        UWAGA: Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia.
    2. In vitro tworzenie włókien amyloidowych α-synukleiny:
      1. Do probówek 1,5 mL dodać alykwooty (294 µL) roztworu białka (200 μM) oraz 6 µL roztworu ThT (1 mM), a następnie wymieszać.
      2. Inkubować probówki w termomikserze w temperaturze 37 °C przy stałym mieszaniu z prędkością 800 rpm przez 4 dni.
      3. Pobrać alykwooty (10 µL) inkubowanych próbek w regularnych odstępach czasu i dodać 490 µL buforu ThT, dokładnie wymieszać i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT).
      4. Ustawić szerokości szczelin wzbudzenia i emisji odpowiednio na 5 nm i 10 nm, a następnie zmierzyć fluorescencję ThT przy wzbudzeniu 440 nm i emisji 485 nm za pomocą spektrofluorometru.
    3. In vitro tworzenie włókien amyloidowych insuliny wołowej:
      1. Do probówki 1,5 mL dodać 637 µL roztworu białka (250 µM). Następnie dodać 13 µL roztworu ThT (1 mM) i wymieszać.
      2. Do każdego dołka płytki 96-dołkowej z przezroczystym dnem dodać alykwooty (200 µL) roztworu białka (250 µM) zawierającego 20 µM ThT i uszczelnić płytkę przezroczystą taśmą uszczelniającą.
      3. Włożyć płytkę do czytnika płytek fluorescencyjnych i inkubować w temperaturze 57 °C bez wstrząsania.
      4. Mierzyć fluorescencję ThT w odstępach 30 min, przy wzbudzeniu 440 nm i emisji 485 nm, przez 12 h.
        UWAGA: Wstrząsnąć płytką przez 5 s przed każdym pomiarem.
    4. In vitro tworzenie włókien amyloidowych HEWL:
      1. Do każdego dołka płytki 96-dołkowej z przezroczystym dnem dodać alykwooty (200 µL) roztworu białka (1 mM) zawierającego 20 µM ThT i uszczelnić płytkę przezroczystą taśmą uszczelniającą.
      2. Włożyć płytkę do czytnika płytek fluorescencyjnych i inkubować w temperaturze 57 °C bez wstrząsania.
      3. Mierzyć fluorescencję ThT w odstępach 2 h, przy wzbudzeniu 440 nm i emisji 485 nm, przez 4 dni.
        UWAGA: Dla wszystkich trzech białek tworzenie włókien amyloidowych potwierdzono za pomocą mikroskopii sił atomowych (Rycina 2B).

6. Traktowanie mitochondriów fibrylami amyloidowymi, test uwalniania MDH i pomiar ROS

  1. Inkubacja wyizolowanych mitochondriów z włóknami amyloidowymi
    1. Włączyć wirówkę oraz łaźnię wodną i ustawić je odpowiednio na 4 °C i 30 °C.
    2. Przy użyciu IF rozcieńczyć homogenat mitochondrialny do stężenia końcowego 1 mg/mL.
    3. Przygotować dwie serie probówek 1,5 mL zawierających homogenaty mitochondrialne (jedną serię do testu uwalniania MDH, a drugą do pomiaru mitochondrialnych ROS).
    4. Do homogenatu mitochondrialnego (objętość końcowa = 200 µL) dodać alikwoty świeżych lub amyloidowych włókien α-synukleiny, insuliny bydlęcej lub HEWL (w stężeniach końcowych 5 µM, 10 µM, 20 µM i 25 µM; jako kontrolę zastosować PBS lub bufor glicynowy) (patrz Tabela 1, Tabela 2 oraz Tabela 3), a następnie delikatnie wymieszać roztwór pipetą.
      UWAGA: W teście uwalniania MDH jako kontrolę pozytywną maksymalnego uwalniania enzymu zastosować Triton X-100 (w stężeniu końcowym 0,5% [v/v]).
    5. Inkubować probówki zawierające zawiesiny mitochondrialne przez 30 min w łaźni wodnej ustawionej na 30 °C.
    6. Zmierzyć uwalnianie mitochondrialnej MDH oraz zawartość ROS zgodnie z opisem w sekcjach 6.2 i 6.3.
  2. Test uwalniania mitochondrialnej MDH
    1. Inkubowane homogenaty mitochondrialne wirować przy 16,000 x g przez 15 min, a następnie ostrożnie zebrać otrzymane nadnadlewki w celu oznaczenia aktywności mitochondrialnej MDH zgodnie z opisem w sekcji 4.
    2. Obliczyć uwalnianie MDH jako ułamek efektu maksymalnego (Triton X-100) w następujący sposób:

Wzór na uwalnianie MDH, Triton X-100, równanie do analizy sygnału eksperymentalnego, obliczenia naukowe.

  1. Pomiar mitochondrialnych form reaktywnych tlenu (ROS)
    UWAGA: Zawartość mitochondrialnych ROS jest określana z wykorzystaniem wrażliwego na utlenianie fluorogennego prekursora dihydrodichlorocybokarbofluoresceiny diadcetanu (DCFDA)22.
    1. Przygotować roztwory do pomiaru mitochondrialnych ROS. Przygotować roztwór DCFDA o stężeniu 50 µM poprzez rozpuszczenie w metanolu (przygotować świeżo) oraz roztwór bursztynianu o stężeniu 200 mM poprzez rozpuszczenie w DW.
    2. Do każdego dołka płytki 96-dołkowej pipetować 191 µL inkubowanego homogenatu mitochondrialnego, a następnie dodać 4 µL DCFDA 50 µM (stężenie końcowe 1 µM) oraz 5 µL bursztynianu 200 mM (stężenie końcowe 5 mM).
    3. Inkubować płytkę przez 30 min w ciepłej łaźni wodnej ustawionej na 30 °C, delikatnie mieszając.
    4. Włożyć płytkę do fluorescencyjnego czytnika płytek i zmierzyć intensywność fluorescencji przy wzbudzeniu 485 nm i emisji 530 nm.

7. Analiza statystyczna

  1. Wszystkie eksperymenty należy przeprowadzić co najmniej 2 lub 3 razy, stosując pomiary w trzech powtórzeniach, a następnie wykonać odpowiednie testy statystyczne. W niniejszym opracowaniu wyniki przedstawiono jako średnia ± SD, a zastosowano test t Studenta dla prób zależnych tDo obliczenia istotności statystycznej wykorzystano test -. Wartości p mniejsze niż 0,01 oraz 0,05 uznano za statystycznie istotne (*p < 0,05; **p < 0.01).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Protokół opisuje model badania oddziaływań włókien amyloidowych z mitochondriami mózgu szczura jako in vitro model biologiczny. Do preparatyki mitochondriów zastosowano 15% (v/v) medium do gradientu gęstości w celu usunięcia mieliny jako głównego zanieczyszczenia tkanki mózgowej14. Jak pokazano na Rysunku 1A, wirowanie przy 30 700 × g doprowadziło do powstania dwóch wyraźnych prążków materiału: mieliny (jako głównego skła...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Liczne wyniki eksperymentalne potwierdzają hipotezę, że cytotoksyczność agregatów fibrylarnych jest istotnie związana z ich zdolnością do interakcji z błonami biologicznymi i przenikania przez nie 4,5. Jednak większość danych opiera się na sztucznych dwuwarstwach lipidowych, które niekoniecznie odzwierciedlają wewnętrzne właściwości błon biologicznych, które są niejednorodnymi strukturami z szeroką gamą fosfolipidów i białek. W tym miejscu, wykorzystując mitochon...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z Rady Badawczej Instytutu Zaawansowanych Studiów Nauk Podstawowych (IASBS), Zanjan, Iran.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dioctan 2&,,7&-dichlorodihydrofluoresceinySigma35845
Siarczan amonuMerck1012171000
płytka 96-dołkowaCorning
Black Przezroczysta płytka 96-dołkowaCorning
Insulina bydlęcaSigmaI6634
Surowica bydlęca Albumina (BSA)SigmaA2153
BSA zasadniczo wolna od kwasów tłuszczowychSigmaA6003
WirówkaSigma
Krystalicznie przezroczysta taśma uszczelniającaCorning
CuSO4Sigma451657
Worek do dializy (odcięty 2 KDa)SigmaD2272
HomogenizatorDouncePotter Elvehjem
EDTASigmaE9884
Czytnik płytek fluorescencyjnychBioTek
Spektrofotometr fluorescencyjnyCary Eclipse VARIAN
FolinMerckF9252
Gilotyna GlycineSigmaG7126
Wyprodukowana w Iranie
HClMerckH1758
Lizozym białka jaja kurzego (HEWL)SigmaL6876
Na2CO3SigmaS7795
NaH2PO4SigmaS7907
NaOHMerckS8045
SzczawiooctanSigmaO4126
PercollGE Opieka zdrowotna
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)SigmaCS0030
PMSFSigmaP7626
Winian potasu soduSigma217255
Kuweta kwarcowaSigma
Spektrofotometranalityczny analytik jenaSPEKOL 2000 model
SuccinateSigmaS2378
SacharozaMerck1076871000
ThermomixerEppendorph
T SigmaT3516
Tris-HClMerck1082191000
Triton X-100SigmaT9284
TryptonQUELAB
Kąpiel wodnaMemmert
Ekstrakt z drożdżyQUELAB
β-NADHSigmaN8129
Tioflavin

Bibliografia

  1. Merlini, G., Bellotti, V. Molecular mechanisms of amyloidosis. New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).
  2. Berg, I. Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Linköping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , Linköping University. Linköping Institute of Technology, Department of Physics, Chemistry and Biology (2010).
  3. Kagan, B. L. Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage. Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. Uversky, V. N., Fink, A. L. , Springer US. New York. 223-236 (2006).
  4. Demuro, A., et al. Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers. The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).
  5. Kayed, R., et al. Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases. The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).
  6. Manczak, M., Park, B. S., Jung, Y., Reddy, P. H. Differential expression of oxidative phosphorylation genes in patients with Alzheimer's disease: implications for early mitochondrial dysfunction and oxidative damage. Neuromolecular Medicine. 5, 147-162 (2004).
  7. Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. Mitochondrial alterations in Parkinson's disease: new clues. Journal of Neurochemistry. 107, 317-328 (2008).
  8. Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
  9. Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
  10. Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
  11. Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
  12. Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R. Amyloid peptide channels. The Journal of Membrane Biology. 202, 1-10 (2004).
  13. Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations. Nature. 418, 291(2002).
  14. Sims, N. R., Anderson, M. F. Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation. Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).
  15. Ghobeh, M., et al. Interaction of Aβ (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products. Peptide Science. 102, 473-486 (2014).
  16. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry. 193, 265-275 (1951).
  17. Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria. Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).
  18. Hoyer, W., et al. Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions. Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).
  19. Weinreb, P. H., et al. NACP, a protein implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded. Biochemistry. 35, 13709-13715 (1996).
  20. Porter, R. R. Partition chromatography of insulin and other proteins. The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).
  21. Goldberg, M. E., Rudolph, R., Jaenicke, R. A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured reduced egg white lysozyme. Biochemistry. 30, 2790-2797 (1991).
  22. Young, T. A., Cunningham, C. C., Bailey, S. M. Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol. Archives of Biochemistry and Biophysics. 405, 65-72 (2002).
  23. Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products. Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).
  24. Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).
  25. Fink, A. L. The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein. Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).
  26. Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains. Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).
  27. Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. Lipid bilayer disruption by oligomeric α-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core. Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).
  28. Kourie, J. I., Henry, C. L. Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 29, 741-753 (2002).
  29. Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416, 507-511 (2002).
  30. Bolognesi, B., et al. ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species. ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).
  31. Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content. Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).
  32. Roqanian, S., et al. Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action. International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).
  33. Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein. The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).
  34. Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains. Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).
  35. Devi, L., et al. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
  36. Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. Interaction of α-synuclein with biomembranes in Parkinson's disease-role of cardiolipin. Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).
  37. Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
  38. Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
  39. Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
  40. Oladzad Abbasabadi, A., et al. Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1. International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja mitochondriówgradient gęstościdehydrogenaza malonianowapomiar ROSalfa-synukleinainsulina wołowalizozym z białka jaja kurzego
Interakcje i przenikanie błony mitochondriów mózgowych przez fibryle amyloidowe
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.