Method Article

Interakcje i przenikanie błony mitochondriów mózgowych przez fibryle amyloidowe

DOI:

10.3791/59883

⸱

September 28th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Institute for Advanced Studies in Basic Sciences (IASBS), Zanjan, 45137-66731, Iran

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostępny jest tutaj protokół do badania interakcji między natywnymi formami, prefibrylarnymi i dojrzałymi fibrylami amyloidowymi różnych peptydów i białek z mitochondriami izolowanymi z różnych tkanek i różnych obszarów mózgu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Coraz więcej dowodów wskazuje, że przenikanie błon, w tym błon wewnętrznych, takich jak mitochondria, jest powszechną cechą i głównym mechanizmem toksyczności indukowanej przez agregaty amyloidowe w chorobach neurodegeneracyjnych. Jednak większość doniesień opisujących mechanizmy rozrywania błon opiera się na systemach modelowych fosfolipidów, a badania bezpośrednio ukierunkowane na zdarzenia zachodzące na poziomie błon biologicznych są rzadkie. Opisano tutaj model do badania mechanizmów toksyczności amyloidu na poziomie błony. Do izolacji mitochondriów stosuje się pożywkę o gradiencie gęstości w celu uzyskania preparatów o minimalnym zanieczyszczeniu mieliną. Po potwierdzeniu integralności błony mitochondrialnej bada się interakcję włókienek amyloidowych powstających z α-synukleiny, insuliny bydlęcej i lizozymu białka jaja kurzego (HEWL) z mitochondriami mózgu szczura, jako model biologiczny in vitro. Wyniki pokazują, że leczenie mitochondriów mózgu zespołami fibrylarnymi może powodować różne stopnie przepuszczalności błony i zwiększenie zawartości ROS. Wskazuje to na zależne od struktury interakcje między włókienkami amyloidowymi a błoną mitochondrialną. Sugeruje się, że właściwości biofizyczne włókienek amyloidowych i ich specyficzne wiązanie z błonami mitochondrialnymi mogą stanowić wyjaśnienie niektórych z tych obserwacji.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaburzenia związane z amyloidem, znane jako amyloidozy, stanowią dużą grupę chorób definiowanych przez pojawienie się nierozpuszczalnych złogów białkowych w różnych tkankach i narządach1,2. Wśród nich zaburzenia neurodegeneracyjne są najczęstszymi formami, w których agregaty białkowe pojawiają się w ośrodkowym lub obwodowym układzie nerwowym2. Chociaż zaproponowano szereg mechanizmów związanych z toksycznością agregatów amyloidowych3, coraz więcej dowodów wskazuje na rozerwanie błony komórkowej i przepuszczalność jako główny mechanizm patologii amyloidu4,5. Oprócz błony komórkowej może to również dotyczyć organelli wewnętrznych (tj. mitochondriów).

Interesujące, pojawiające się dowody sugerują, że dysfunkcja mitochondriów odgrywa kluczową rolę w patogenezie chorób neurodegeneracyjnych, w tym chorób Alzheimera i Parkinsona6,7. Zgodnie z tym problemem, liczne raporty wskazują na wiązanie i akumulację amyloidowego β-peptydu, α-synukleiny, huntingtyny i zmutowanych białek SOD1 związanych z ALS z mitochondriami8,9,10,11. Uważa się, że mechanizm przenikania błony przez agregaty amyloidu zachodzi albo poprzez tworzenie dyskretnych kanałów (porów) i/lub poprzez niespecyficzny mechanizm podobny do detergentu5,12,13. Warto zauważyć, że większość tych wniosków została oparta na doniesieniach dotyczących modelowych systemów fosfolipidowych, a badania bezpośrednio ukierunkowane na zdarzenia zachodzące w błonach biologicznych są rzadkie. Oczywiste jest, że te sztuczne dwuwarstwy lipidowe niekoniecznie odzwierciedlają wewnętrzne właściwości błon biologicznych, w tym mitochondriów, które są strukturami niejednorodnymi i składają się z szerokiej gamy fosfolipidów i białek.

W obecnym badaniu, mitochondria wyizolowane z mózgów szczurów są używane jako model biologiczny in vitro do zbadania destrukcyjnych skutków włókienek amyloidowych powstających z α-synukleiny (jako białka amyloidogennego), insuliny bydlęcej (jako modelowego peptydu wykazującego znaczącą homologię strukturalną z ludzką insuliną zaangażowaną w amyloidozę zlokalizowaną iniekcyjnie) oraz lizozymu białka jaja kurzego (HEWL; jako powszechne białko modelowe do badania agregacji amyloidu). Interakcje i możliwe uszkodzenia błon mitochondrialnych wywołane przez włókienka amyloidowe są następnie badane, obserwując uwalnianie dehydrogenazy jabłczanu mitochondriów (MDH) (zlokalizowanej w macierzy mitochondrialnej) i wzmocnienie mitochondriów reaktywnych form tlenu (ROS).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) Nauk Medycznych Uniwersytetu Teherańskiego. Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie i szkodliwe skutki dla szczurów, ostrząc ostrza gilotyny i stosując zdecydowane i szybkie ruchy ostrza.

1. Homogenizacja mózgu i izolacja mitochondriów

UWAGA: Wszystkie odczynniki do izolacji mitochondriów zostały przygotowane zgodnie z Sims and Anderson14.

  1. Przygotowanie do izolacji mitochondriów
    1. Przygotować 100 mM roztwór Tris-HCl: odważyć 0,605 g Tris-HCl i rozpuścić go w około 40 ml wody dejonizowanej (DW) w zlewce. Przenieść roztwór do kolby miarowej o pojemności 50 ml i zwiększyć końcową objętość do 50 ml przez dodanie DW.
    2. Przygotować 10 mM roztworu EDTA: odważyć 0,202 g EDTA i rozpuścić go w około 40 ml DW w zlewce. Przenieść roztwór do kolby miarowej o pojemności 50 ml i zwiększyć końcową objętość do 50 ml poprzez dodanie DW.
      UWAGA: Oba roztwory można przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 4 tygodnie.
    3. Przygotować roztwór podstawowy Tris-HCl/EDTA/sacharozy: dodać 30 ml 100 mM Tris-HCl i 30 ml 10 mM EDTA do zlewki. Odważyć 32,86 g sacharozy i dodać ją do zlewki, mieszając mieszadłem magnetycznym. Po rozpuszczeniu sacharozy przenieść roztwór do kolby miarowej o pojemności 100 ml i zwiększyć końcową objętość do 100 ml przez dodanie DW.
      UWAGA: Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 dni.
    4. Przygotować bufor izolacyjny (IB): dodać 100 ml Tris-HCl/EDTA/sacharozy do około 150 ml DW. Dostosuj pH do 7,4, dodając 0,1 M HCl. Zwiększ końcową objętość do 300 ml, dodając DW.
    5. Przygotować pożywkę o gradiencie gęstości 15% (v/v) z IB, dodając 1,5 ml pożywki o gradiencie gęstości do 8,5 ml zimnego IB.
    6. Przygotować 10 mg/ml roztworu albuminy surowicy bydlęcej (BSA): zważyć 20 mg BSA wolnego od kwasów tłuszczowych i rozpuścić go w około 1,5 ml DW w fiolce o pojemności 2 ml. Zwiększ końcową objętość do 2 ml, dodając DW i przechowuj ją na lodzie do czasu użycia.
      UWAGA: Świeżo przygotuj roztwory z kroków 1.1.4–1.1.6 w dniu izolacji mitochondriów i przechowuj je na lodzie do czasu użycia.
  2. Izolacja mózgu szczura
    UWAGA: Dekapitację i usunięcie mózgu samcom szczurów (150–200 g) przeprowadzono zgodnie z Sims and Anderson14.
    1. Umieść zlewkę o pojemności 30 ml w wiaderku z lodem i dodaj do niej 10 ml zimnego IB.
    2. Odetnij głowę szczura gilotyną dla małych zwierząt i usuń mózg z czaszki w ciągu 1 minuty od dekapitacji, aby ograniczyć pogorszenie właściwości mitochondriów.
    3. Szybko przenieś mózg do zlewki zawierającej zimny IB.
  3. Homogenizacja mózgu i przygotowanie mitochondriów
    UWAGA: Frakcje mitochondrialne zostały wyizolowane zgodnie z protokołem opisanym przez Simsa i Andersona14, z pewnymi modyfikacjami opisanymi wcześniej15. Ważne jest, aby pracować szybko i utrzymywać wszystko na lodzie przez cały czas trwania zabiegu.
    1. Umyj tkankę 2x 30 ml IB, przenieś do zlewki zawierającej zimny IB i drobno zmielić mózg nożyczkami.
    2. Dodać 10 objętości wstępnie schłodzonego IB (około 10 ml IB na mózg szczura).
    3. Przenieść zawiesinę tkankową do 20 ml homogenizatora Dounce na zimno.
    4. Homogenizuj kawałki tkanek za pomocą dziewięciu ruchów w górę iw dół za pomocą zmotoryzowanego tłuczka.
      UWAGA: Pozostaw mieszaninę na lodzie na około 30 s po każdej serii trzech suwów homogenizacji, aby upewnić się, że homogenat pozostaje zimny.
    5. Przenieść homogenat do wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej o pojemności 10 ml i odwirować w temperaturze 1 300 g i 4 °C przez 3 minuty.
    6. Ostrożnie zdekantować supernatant i przenieść go do wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej o pojemności 10 ml i odwirować w temperaturze 21 000 g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
    7. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w zimnym roztworze o gradiencie gęstości 15% (5 ml na każdy mózg), delikatnie mieszając mieszaninę pipetą.
    8. Wirować w wirniku o stałym kącie nachylenia 30 700 g w temperaturze 4 °C przez 5 minut, stosując powolne przyspieszanie (45 s od 0 obr./min do 500 obr./min, a następnie normalne przyspieszanie) i zwalnianie (bez hamulców). W ten sposób powinny powstać dwa odrębne pasma materiału (Rysunek 1A, po lewej).
    9. Za pomocą pipety Pasteura usuń ostry pasek materiału nagromadzony w górnej części gradientu, który zawiera głównie mielinę. Następnie usuń roztwór pożywki o gradiencie gęstości pokrywający materiał (w paśmie 2) tak bardzo, jak to możliwe, nie tracąc żadnej ze wzbogaconej frakcji mitochondrialnej w paśmie 2,
      UWAGA: Pasmo 2 zawiera zarówno mitochondria synaptyczne, jak i niesynaptyczne.
    10. Dodać 8 ml IB do frakcji mitochondrialnej, delikatnie mieszając mieszaninę pipetą.
    11. Wirować przy 16 700 g w temperaturze 4 °C przez 10 minut i ostrożnie usunąć supernatant, pozostawiając luźne osady na dnie nienaruszone.
    12. Dodać 1 ml BSA wolnego od kwasów tłuszczowych 10 mg/ml do probówki wirówkowej, delikatnie mieszając mieszaninę końcówką pipety. Zwiększ końcową objętość do 5 ml na mózg, dodając IB.
    13. Wirować przy 6,900x g w 4 °C przez 10 minut, co powinno dać twardy osad (Rysunek 1A, po prawej).
    14. Zdekantować supernatant i delikatnie zawiesić osad mitochondrialny w IB, podzielić go na probówki o pojemności 0,5 ml i przechowywać w ciekłym azocie do czasu użycia.

2. Oznaczanie stężenia białka

UWAGA: Stężenie białka jest mierzone metodą Lowry'ego i wsp.16.

  1. Przygotowanie roztworów do testu Lowry'ego
    1. Przygotować roztwór A: zważyć 0,4 g NaOH i 2 g Na2CO3 i rozpuścić w 80 ml DW, następnie przenieść roztwór do kolby miarowej o pojemności 100 ml i zwiększyć objętość do 100 ml przez dodanie DW.
    2. Przygotować roztwór B: odważyć 0,1 g winianu potasowo-sodowego i 0,05 gCuSO4 i rozpuścić w 8 ml DW, następnie przenieść roztwór do kolby miarowej o pojemności 10 ml i zwiększyć objętość do 10 ml przez dodanie DW.
      UWAGA: Zarówno roztwory A, jak i B mogą pozostać stabilne w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.
    3. Przygotuj roztwór C: Dodać 0,5 ml roztworu foliny do 7,5 ml DW.
      UWAGA: Przygotuj roztwór C świeży i trzymaj z dala od światła do czasu użycia.
    4. Przygotować wzorce BSA o końcowych stężeniach 0, 20, 40, 60, 80, 100 i 120 μg/ml, łącząc 0, 20, 40, 60, 80, 100 i 120 μl odpowiednio 1 mg/ml BSA z wystarczającą ilością DW do uzyskania 1000 μl roztworu.
  2. Pomiar stężenia białka
    UWAGA: Aby uzyskać większą dokładność, uruchom ten krok w trzech egzemplarzach.
    1. Dodać 50 μl roztworów wzorcowych i homogenatu mitochondrialnego do każdego dołka na 96-dołkowej płytce, a następnie dodać 45 μl roztworu A. Następnie inkubować płytkę przez 10 minut w ciepłej łaźni wodnej o temperaturze 50 °C.
    2. Dodać 5 μl roztworu B i inkubować płytkę przez 10 minut w ciemności w temperaturze pokojowej (RT).
    3. Dodać 150 μl roztworu C i inkubować płytkę przez 10 minut w ciepłej łaźni wodnej o temperaturze 50 °C.
    4. Załadować płytkę do czytnika płytek i zapisać wartości absorbancji dla wzorców i zawiesiny mitochondrialnej przy 650 nm. Następnie, za pomocą krzywej kalibracyjnej, oblicz zawartość białka w mitochondriach.

3. Określanie integralności błony mitochondrialnej

UWAGA: Integralność błony mitochondrialnej jest potwierdzana przez pomiar aktywności dehydrogenazy jabłczanowej (MDH) w izolowanych mitochondriach przed i po przerwaniu błony przez Triton X-100.

  1. Rozcieńczyć homogenat mitochondrialny do 1 mg/ml zimnym IB i umieścić w dwóch probówkach o pojemności 1,5 ml (zwykle 195 μl mitochondriów na probówkę).
  2. Dodać 5 μl 20% (v/v) Triton X-100 (rozcieńczony DW) do jednej probówki (jako kontrola pozytywna dla maksymalnej aktywności enzymu) i 5 μl DW do drugiej probówki (dla kontroli), a następnie wymieszać z mieszadłem.
  3. Inkubować probówki przez 10 minut w ciepłej łaźni wodnej o temperaturze 30 °C.
  4. Mitochondria osadów przez odwirowanie probówek w wirniku o stałym kącie nachylenia przy 16 000 x g i temperaturze 4 °C przez 15 minut.
  5. Ostrożnie zebrać otrzymane supernatanty w celu oznaczenia aktywności mitochondrialnego MDH przy użyciu standardowego testu spektrofotometrycznego opisanego w następnym rozdziale.
  6. Oblicz integralność błony mitochondrialnej w następujący sposób:
    figure-protocol-1

4. Określanie aktywności MDH

UWAGA: Aktywność MDH została zmierzona spektrofotometrycznie, jak opisano przez Sottocasa et al.17.

  1. Przygotowanie roztworów do oznaczania aktywności MDH
    1. Przygotować 50 mM roztwór Tris-HCl (pH = 7,5): przygotować roztwór 7,9 mg/ml w DW przy użyciu Tris-HCl i dostosować pH do 7,5 w temperaturze 25 °C za pomocą 1,0 M NaOH.
    2. Przygotować 50 mM roztwór szczawiooctanu: przygotować roztwór 6,6 mg/ml przy użyciu szczawiooctanu w Tris-HCl.
      UWAGA: Ten roztwór nie jest stabilny raz w roztworze i powinien być przygotowany bezpośrednio przed użyciem.
    3. Przygotuj 10 mM roztwór β-NADH: przygotuj roztwór 7,81 mg/ml przy użyciu β-NADH w Tris-HCl.
  2. Oznaczanie aktywności MDH
    UWAGA: Końcowe stężenia testowe w 1,0 ml mieszaniny reakcyjnej wynoszą 50 mM Tris-HCl, 5 mM szczawiooctanu i 0,1 mM β-NADH.
    1. Ustawić spektrofotometr na 25 °C i 340 nm. Odpipetować 890 μl buforu Tris-HCl, 100 μl roztworu szczawiooctanu i 10 μl roztworu NADH do ślepej kuwety i 880 μl buforu Tris-HCl, 100 μl roztworu szczawiooctanu i 10 μl roztworu NADH do kuwety na próbkę.
    2. Inkubować kuwety w spektrofotometrze przez 3–4 minuty i odnosić do ślepej próby.
    3. Następnie dodać 10 μl homogenianu mitochondrialnego (1 mg/ml) do kuwety na próbkę, natychmiast wymieszać przez inwersję i rejestrować spadki absorbancji spowodowane utlenianiem NADH przy 340 nm przez 1 min.

5. Tworzenie in vitro α-synukleiny, insuliny bydlęcej i włókienek HEWL

  1. Preparat białkowy
    1. α-synukleina:
      UWAGA: Ekspresję i oczyszczanie rekombinowanej α-synukleiny przeprowadza się zgodnie z opisem Hoyer et al.18 z pewnymi modyfikacjami, a czystość α-synukleiny potwierdza SDS-PAGE.
      1. Oczyszczoną α-synukleinę dializować przez noc w stosunku do soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
      2. Określ stężenie białka za pomocą współczynnika ekstynkcji 5600 M-1 cm-1 przy 275 nm19.
      3. Porcje białka umieszcza się w probówkach o pojemności 1,5 ml i przechowuje w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
    2. Insulina bydlęca i HEWL:
      1. Należy podać zarówno insulinę bydlęcą, jak i HEWL.
      2. Rozpuść każde białko w 50 mM buforze glicyny (pH = 1,6; dostosuj pH za pomocą HCl).
      3. Określić stężenie insuliny bydlęcej i HEWL za pomocą współczynnika ekstynkcji 1,0 i 2,63 dla 1,0 mg/ml odpowiednio przy 276 nm i 280 nm20,21.
  2. Indukcja migotania amyloidu
    1. Przygotowanie roztworów do migotania amyloidu:
      1. Przygotować bufor tioflawinowy T (ThT): odważyć 0,3 g NaH2PO4 i rozpuścić w 80 ml DW, dostosować pH do 6,5 i zwiększyć objętość do 100 ml przez dodanie DW.
      2. Przygotować roztwór podstawowy ThT (5 mM): zważyć 1,6 mg ThT i rozpuścić go w 1 ml buforu ThT, przepuścić przez bibułę filtracyjną o wielkości 0,22 μm i trzymać z dala od światła w temperaturze 4 °C do momentu użycia><. UWAGA: Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C do 4 tygodni.
      3. Przygotować roztwór ThT (1 mM): dodać 200 μl roztworu podstawowego ThT (5 mM) do 800 μl buforu ThT.
        UWAGA: Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
    2. Tworzenie α nitkina amyloidowego in vitro:
      1. Dodać podwielokrotności (294 μl) roztworu białkowego (200 μM) i 6 μl roztworu ThT (1 mM) do probówek o pojemności 1,5 ml, a następnie wymieszać.
      2. Inkubować probówki w termomikserze w temperaturze 37 °C przy ciągłym mieszaniu przy 800 obr./min przez 4 dni.
      3. Pobrać podwielokrotności (10 μl) inkubowanych próbek w regularnych odstępach czasu i dodać 490 μl buforu ThT, dokładnie wymieszać i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
      4. Ustaw szerokości szczeliny wzbudzenia i emisji odpowiednio na 5 nm i 10 nm i zmierz fluorescencję ThT przez wzbudzenie przy 440 nm i emisję przy 485 nm za pomocą spektrofotometru fluorescencyjnego.
    3. Tworzenie włókien amyloidowych insuliny bydlęcej in vitro:
      1. Dodać 637 μl roztworu białkowego (250 μM) do probówki o pojemności 1,5 ml. Następnie dodać 13 μl roztworu ThT (1 mM) i wymieszać.
      2. Dodać podwielokrotności (200 μl) roztworu białkowego (250 μM) zawierającego 20 μM ThT do każdego dołka na 96-dołkowej płytce z przezroczystym dnem i uszczelnić płytkę krystalicznie czystą taśmą uszczelniającą.
      3. Umieścić płytkę w czytniku płytek fluorescencyjnych i inkubować w temperaturze 57 °C bez mieszania.
      4. Pomiar fluorescencji ThT w odstępach 30 minut, ze wzbudzeniem przy 440 nm i emisją przy 485 nm, przez 12 h.
        UWAGA: Potrząsaj płytką przez 5 s przed każdym pomiarem.
    4. Tworzenie włókienek amyloidowych HEWL in vitro:
      1. Dodać podwielokrotności (200 μl) roztworu białkowego 1 mM) zawierającego 20 μM ThT do każdego dołka na 96-dołkowej płytce z przezroczystym dnem i uszczelnić płytkę krystalicznie czystą taśmą uszczelniającą.
      2. Umieścić płytkę w czytniku płytek fluorescencyjnych i inkubować w temperaturze 57 °C bez mieszania.
      3. Mierz fluorescencję ThT w odstępach 2-godzinnych, ze wzbudzeniem przy 440 nm i emisją przy 485 nm, przez 4 dni.
        UWAGA: Dla wszystkich trzech białek tworzenie włókien amyloidowych potwierdza mikroskopia sił atomowych (Rysunek 2B).

6. Leczenie mitochondriów za pomocą włókienek amyloidowych, test uwalniania MDH i pomiar ROS

  1. Inkubacja izolowanych mitochondriów z włókienkami amyloidowymi
    1. Włączyć wirówkę i łaźnię z ciepłą wodą i ustawić odpowiednio na 4 °C i 30 °C.
    2. Stosując IF, rozcieńczyć homogenat mitochondrialny do końcowego stężenia 1 mg/ml.
    3. Przygotuj dwie serie probówek o pojemności 1,5 ml zawierających homogenaty mitochondrialne (jedna seria do testu uwalniania MDH, a druga do pomiaru mitochondrialnego ROS).
    4. Dodać porcje świeżych lub amyloidowych włókienek α-synukleiny, insuliny bydlęcej lub HEWL (w końcowych stężeniach 5 μM, 10 μM, 20 μM i 25 μM; użyć PBS lub buforu glicyny jako kontroli) do homogenatu mitochondrialnego (końcowa objętość = 200 μl) (patrz Tabela 1, Tabela 2 i Tabela 3), a następnie delikatnie wymieszać roztwór pipetą.
      UWAGA: Do testu uwalniania MDH należy użyć Triton X-100 (o stężeniu końcowym 0,5% [v/v]) jako kontroli pozytywnej w celu maksymalnego uwolnienia enzymu.
    5. Probówki zawierające zawiesiny mitochondrialne inkubować przez 30 minut w ciepłej łaźni wodnej nastawionej na 30 °C.
    6. Zmierz uwalnianie mitochondrialnego MDH i zawartość ROS, jak opisano w sekcjach 6.2 i 6.3.
  2. Test uwalniania mitochondrialnego MDH
    1. Odwirować inkubowane homogenaty mitochondrialne przy 16 000 x g przez 15 minut, a następnie ostrożnie zebrać otrzymane supernatanty w celu oznaczenia aktywności mitochondrialnego MDH, jak opisano w sekcji 4.
    2. Obliczyć uwalnianie MDH jako ułamek maksymalnego efektu (Triton X-100) w następujący sposób:

figure-protocol-2

  1. Mitochondrialny pomiar ROS
    UWAGA: Zawartość mitochondrialnego ROS jest oznaczana za pomocą wrażliwego na utlenianie fluorogenicznego prekursora dihydrodichlorokarboksylesceiny dihydrodichlorokarboksylesceiny (DCFDA)22.
    1. Przygotuj roztwory do pomiaru mitochondrialnego ROS. Przygotować 50 μM roztwór DCFDA, rozpuszczając się w metanolu (przygotować świeży) i 200 mM roztwór bursztynianu, rozpuszczając w DW.
    2. Odpipetować 191 μl inkubowanego homogenatu mitochondrialnego do każdego dołka na 96-dołkowej płytce i dodać 4 μl 50 μM DCFDA (1 μM stężenie końcowe) i 5 μL 200 mM bursztynianu (5 mM stężenie końcowe).
    3. Inkubować płytkę przez 30 minut w ciepłej łaźni wodnej o temperaturze 30 °C, delikatnie mieszając.
    4. Załaduj płytkę do czytnika płytek fluorescencyjnych i zmierz intensywność fluorescencji, ze wzbudzeniem przy 485 nm i emisją przy 530 nm.

7. Analiza statystyczna

  1. Wykonuj wszystkie eksperymenty co najmniej 2 lub 3 razy z trzema testami i przeprowadź odpowiednie testy statystyczne. W tym przypadku wyniki są prezentowane jako średnia ± SD, a do obliczenia istotności statystycznej wykorzystano sparowany test t-Studenta. Wartości P mniejsze niż 0,01 i 0,05 uznano za statystycznie istotne (*p < 0,05; **p < 0,01).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisuje model do badania interakcji fibrylu amyloidowego z mitochondriami mózgu szczura jako model biologiczny in vitro. Do przygotowania mitochondriów użyto pożywki o gradiencie gęstości 15% (v/v) w celu usunięcia mieliny jako głównego zanieczyszczenia tkanki mózgowej14. Jak pokazano w Rysunek 1A, wirowanie przy 30 700 x g wytworzyło dwa odrębne pasma materiału, mielinę (jako główny składnik pasma 1) i pasmo 2, które zawi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Liczne wyniki eksperymentalne potwierdzają hipotezę, że cytotoksyczność agregatów fibrylarnych jest istotnie związana z ich zdolnością do interakcji z błonami biologicznymi i przenikania przez nie 4,5. Jednak większość danych opiera się na sztucznych dwuwarstwach lipidowych, które niekoniecznie odzwierciedlają wewnętrzne właściwości błon biologicznych, które są niejednorodnymi strukturami z szeroką gamą fosfolipidów i białek. W tym miejscu, wykorzystując mitochon...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z Rady Badawczej Instytutu Zaawansowanych Studiów Nauk Podstawowych (IASBS), Zanjan, Iran.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Dioctan 2&,,7&-dichlorodihydrofluoresceinySigma35845
Siarczan amonuMerck1012171000
płytka 96-dołkowaCorning
Black Przezroczysta płytka 96-dołkowaCorning
Insulina bydlęcaSigmaI6634
Surowica bydlęca Albumina (BSA)SigmaA2153
BSA zasadniczo wolna od kwasów tłuszczowychSigmaA6003
WirówkaSigma
Krystalicznie przezroczysta taśma uszczelniającaCorning
CuSO4Sigma451657
Worek do dializy (odcięty 2 KDa)SigmaD2272
HomogenizatorDouncePotter Elvehjem
EDTASigmaE9884
Czytnik płytek fluorescencyjnychBioTek
Spektrofotometr fluorescencyjnyCary Eclipse VARIAN
FolinMerckF9252
Gilotyna GlycineSigmaG7126
Wyprodukowana w Iranie
HClMerckH1758
Lizozym białka jaja kurzego (HEWL)SigmaL6876
Na2CO3SigmaS7795
NaH2PO4SigmaS7907
NaOHMerckS8045
SzczawiooctanSigmaO4126
PercollGE Opieka zdrowotna
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)SigmaCS0030
PMSFSigmaP7626
Winian potasu soduSigma217255
Kuweta kwarcowaSigma
Spektrofotometranalityczny analytik jenaSPEKOL 2000 model
SuccinateSigmaS2378
SacharozaMerck1076871000
ThermomixerEppendorph
T SigmaT3516
Tris-HClMerck1082191000
Triton X-100SigmaT9284
TryptonQUELAB
Kąpiel wodnaMemmert
Ekstrakt z drożdżyQUELAB
β-NADHSigmaN8129
Tioflavin

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Merlini, G., Bellotti, V. Molecular mechanisms of amyloidosis. New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).
  2. Berg, I. Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Linköping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , Linköping University. Linköping Institute of Technology, Department of Physics, Chemistry and Biology (2010).
  3. Kagan, B. L. Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage. Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. Uversky, V. N., Fink, A. L. , Springer US. New York. 223-236 (2006).
  4. Demuro, A., et al. Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers. The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).
  5. Kayed, R., et al. Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases. The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).
  6. Manczak, M., Park, B. S., Jung, Y., Reddy, P. H. Differential expression of oxidative phosphorylation genes in patients with Alzheimer's disease: implications for early mitochondrial dysfunction and oxidative damage. Neuromolecular Medicine. 5, 147-162 (2004).
  7. Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. Mitochondrial alterations in Parkinson's disease: new clues. Journal of Neurochemistry. 107, 317-328 (2008).
  8. Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
  9. Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
  10. Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
  11. Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
  12. Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R. Amyloid peptide channels. The Journal of Membrane Biology. 202, 1-10 (2004).
  13. Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations. Nature. 418, 291(2002).
  14. Sims, N. R., Anderson, M. F. Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation. Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).
  15. Ghobeh, M., et al. Interaction of Aβ (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products. Peptide Science. 102, 473-486 (2014).
  16. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry. 193, 265-275 (1951).
  17. Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria. Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).
  18. Hoyer, W., et al. Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions. Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).
  19. Weinreb, P. H., et al. NACP, a protein implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded. Biochemistry. 35, 13709-13715 (1996).
  20. Porter, R. R. Partition chromatography of insulin and other proteins. The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).
  21. Goldberg, M. E., Rudolph, R., Jaenicke, R. A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured reduced egg white lysozyme. Biochemistry. 30, 2790-2797 (1991).
  22. Young, T. A., Cunningham, C. C., Bailey, S. M. Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol. Archives of Biochemistry and Biophysics. 405, 65-72 (2002).
  23. Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products. Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).
  24. Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).
  25. Fink, A. L. The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein. Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).
  26. Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains. Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).
  27. Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. Lipid bilayer disruption by oligomeric α-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core. Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).
  28. Kourie, J. I., Henry, C. L. Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 29, 741-753 (2002).
  29. Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416, 507-511 (2002).
  30. Bolognesi, B., et al. ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species. ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).
  31. Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content. Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).
  32. Roqanian, S., et al. Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action. International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).
  33. Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein. The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).
  34. Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains. Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).
  35. Devi, L., et al. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
  36. Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. Interaction of α-synuclein with biomembranes in Parkinson's disease-role of cardiolipin. Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).
  37. Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
  38. Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
  39. Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
  40. Oladzad Abbasabadi, A., et al. Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1. International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Amyloid FibrilsBrain MitochondriaMembrane PermeabilizationMitochondrial IsolationDensity GradientMalate DehydrogenaseROS MeasurementAlpha SynucleinBovine InsulinHen Egg White Lysozyme

Related Articles