Artykuł metodologiczny

Badania przesiewowe inhibitorów kinaz w samoorganizujących się mikromacierzach białek ludzkich

8.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59886

⸱

23 października 2019

 , 
1Virginia G. Piper Center for Personalized Diagnostics, Biodesign Institute, Arizona State University, 2Department of Pediatrics, and Biochemistry/Molecular Biology, College of Medicine, Pennsylvania State University

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono szczegółowy protokół generowania samodzielnie składających się mikromacierzy białek ludzkich do badań przesiewowych inhibitorów kinaz.

Streszczenie

Badania przesiewowe inhibitorów kinaz są kluczowe dla lepszego zrozumienia właściwości leku i identyfikacji potencjalnie nowych celów o implikacjach klinicznych. Zgłoszono kilka metodologii umożliwiających przeprowadzenie takich badań przesiewowych. Jednak każdy z nich ma swoje własne ograniczenia (np. badania przesiewowe tylko analogów ATP, ograniczenie do stosowania oczyszczonych domen kinaz, znaczne koszty związane z testowaniem więcej niż kilku kinaz jednocześnie oraz brak elastyczności w badaniach przesiewowych kinaz białkowych z nowymi mutacjami). W tym miejscu przedstawiono nowy protokół, który pokonuje niektóre z tych ograniczeń i może być stosowany do bezstronnych badań przesiewowych inhibitorów kinaz. Mocną stroną tej metody jest jej zdolność do porównywania aktywności inhibitorów kinaz w wielu białkach, zarówno między różnymi kinazami, jak i różnymi wariantami tej samej kinazy. Wykorzystuje się samoorganizujące się mikromacierze białkowe generowane w wyniku ekspresji kinaz białkowych przez ludzki system transkrypcji i translacji in vitro (IVTT). Białka wyświetlane na mikromacierzy są aktywne, co pozwala na pomiar działania inhibitorów kinaz. Poniższa procedura szczegółowo opisuje kroki protokołu, od generowania mikromacierzy i selekcji po analizę danych.

Wprowadzenie

Kinazy białkowe są odpowiedzialne za fosforylację swoich celów i mogą modulować złożone szlaki molekularne, które kontrolują wiele funkcji komórkowych (np. proliferację komórek, różnicowanie, śmierć komórki i przetrwanie). Deregulacja aktywności kinazy jest związana z ponad 400 chorobami, co sprawia, że inhibitory kinaz są jedną z głównych klas leków dostępnych w leczeniu wielu chorób, w tym raka, zaburzeń sercowo-naczyniowych i neurologicznych, a także chorób zapalnych i autoimmunologicznych1,2,3.

Wraz z nadejściem medycyny precyzyjnej, identyfikacja nowych terapii, zwłaszcza inhibitorów kinaz, ma duże znaczenie farmaceutyczne i kliniczne. Do identyfikacji możliwych nowych par kinazy/inhibitorów kinazy można zastosować kilka podejść, w tym projektowanie de novo inhibitorów kinaz i identyfikację nowych celów dla istniejących leków zatwierdzonych przez FDA. To ostatnie jest szczególnie atrakcyjne, ponieważ czas i pieniądze potrzebne do wdrożenia tych leków w klinikach są drastycznie zmniejszone ze względu na dostępność danych z poprzednich badań klinicznych. Kanonicznym przykładem zmiany przeznaczenia inhibitora kinazy jest imatynib, początkowo przeznaczony do leczenia przewlekłej białaczki szpikowej (CML) poprzez hamowanie BCR-Abl, który może być również z powodzeniem stosowany w leczeniu guzów podścieliskowych przewodu pokarmowego z nadekspresją c-Kit (GISTs)4,5,6,7.

Badania przesiewowe inhibitorów kinaz mogą być przeprowadzane w testach wiązania lub testach enzymatycznych. Pierwsza klasa testów koncentruje się na interakcjach białko-lek i może dostarczyć informacji, takich jak miejsce ligacji i powinowactwo. Ponieważ aktywność kinazy w czasie tych testów jest nieznana, wiele interakcji może zostać pominiętych lub błędnie zidentyfikowanych z powodu zmian konformacyjnych w białku. Z drugiej strony, testy enzymatyczne wymagają, aby kinazy białkowe były aktywne i dostarczały cennych informacji na temat wpływu inhibitora na aktywność enzymu, jednak ten rodzaj badań przesiewowych jest na ogół bardziej czasochłonny i kosztowny. Obecnie oba rodzaje testów są komercyjnie dostępne z kilku źródeł. Stanowią one niezawodną opcję do badań przesiewowych inhibitorów kinaz z kilkoma ograniczeniami, w tym: I) większość metod obejmuje indywidualne testowanie wielu kinaz, co może sprawić, że badanie przesiewowe dużego zestawu białek będzie kosztowne; II) zestaw kinaz, które mają być badane, jest ograniczony do listy wstępnie wyselekcjonowanych kinaz typu dzikiego i kilku dobrze znanych zmutowanych wersji niektórych kinaz, co utrudnia testowanie wielu nowych zmutowanych izoform

.

W tym kontekście, mikromacierze białkowe są potężną platformą, która jest w stanie przezwyciężyć niektóre z ograniczeń oferowanych przez komercyjnie dostępne techniki. Nadaje się do wykonywania testów enzymatycznych w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych przy użyciu pełnodługich, aktywnych białek o dowolnej sekwencji będącej przedmiotem zainteresowania. Mikromacierze można wygenerować za pomocą metody samoorganizującej się, takiej jak NAPPA (nukleinowa programowalna matryca białkowa), w której białka są wyrażane w samą porę przed testami, co zwiększa prawdopodobieństwo, że te wyświetlane w macierzy są rzeczywiście aktywne. Białka wyświetlane na NAPPA są wytwarzane przy użyciu rybosomów i białek opiekuńczych pochodzenia ludzkiego w celu zwiększenia prawdopodobieństwa naturalnego fałdowania i aktywności.

Białka są początkowo programowane poprzez drukowanie na powierzchni mikromacierzy cDNA kodujących interesujące nas geny, połączone za pomocą znacznika przechwytującego, razem z agentem wychwytującym. Białka są następnie wytwarzane na mikromacierzach przy użyciu systemu transkrypcji i translacji in vitro (IVTT), a świeżo eksprymowane białka są unieruchamiane na powierzchni mikromacierzy przez czynnik wychwytujący. Wyrażone macierze NAPPA mogą być używane do badania białek wyświetlanych na tablicy w sposób bezstronny, wysokoprzepustowy8,9.

Poprzednio pokazano, że białka wyświetlane na tablicach NAPPA są prawidłowo złożone, aby wchodzić w interakcje ze znanymi partnerami10; ponadto, ich aktywność enzymatyczna została po raz pierwszy wykorzystana w 2018 roku, kiedy pokazano, że kinazy białkowe wyświetlane na mikromacierzy autofosforylatują11. Do tej pory metodologia NAPPA była wykorzystywana do wielu różnych zastosowań, w tym do odkrywania biomarkerów12,13,14,15,16,17, interakcje białko-białko10,18, identyfikacja substratu19, oraz badania przesiewowe na obecność narkotyków11. Jej elastyczność jest jedną z kluczowych cech platformy, która pozwala na dostosowanie do każdej aplikacji.

Tutaj przedstawiono protokół badania przesiewowego inhibitorów kinazy tyrozynowej w samoorganizujących się matrycach NAPPA. Platforma jest zoptymalizowana pod kątem wyświetlania aktywnych ludzkich kinaz białkowych oraz do analizy aktywności kinaz białkowych, z niskim tłem i wysokim zakresem dynamiki. Wśród modyfikacji wdrożonych w celu wykorzystania NAPPA do badań przesiewowych inhibitorów kinaz znajdują się: I) zmiany w chemii drukującej, II) defosforylacja mikromacierzy białkowej przed badaniem przesiewowym inhibitora kinazy oraz III) optymalizacja wykrywania fosforylowanych białek na matrycy. Protokół ten jest pierwszym w swoim rodzaju i dostarcza unikalnych informacji na temat badania kinaz w mikromacierzach NAPPA.

Protokół

1. Typowe i rozwiązania, które należy stosować

  1. Przygotuj podłoże TB: Wspaniały bulion (24 g/L ekstraktu drożdżowego; 20 g/L tryptonu; 4 mL/L glicerolu; 0,017 M KH2PO4; i 0,072 M K2HPO4). Roztwory 0,017 M KH2PO4 i 0,072 M K2HPO4 można zakupić jako 10-krotny bufor fosforanowy (0,17 M KH2PO4 i 0,72 M K2HPO4).
  2. Przygotuj pożywkę LB: Luria-Bertani (5 g/l ekstraktu drożdżowego; 10 g/l tryptonu i 10 g/l NaCl). Doprowadzić pH do 7,0 za pomocą 5 M NaOH.
  3. Przygotuj 1x TBS: sól fizjologiczna buforowana Tris (TBS: 50 mM Tris-Cl, pH = 7,5; 150 mM NaCl).
  4. Przygotuj 1x TBST: TBS uzupełniony o 0,1% Tween 20.

2. Przygotowanie DNA

UWAGA: DNA wykorzystywane do tworzenia macierzy NAPPA musi być bardzo czyste; dlatego komercyjne mini-preparaty DNA nie są zalecane. Obecnie stosowane są dwa protokoły preparacji DNA: domowy mini-prep o wysokiej przepustowości (opisany tutaj) lub komercyjny Midi- lub Maxi-prep. Średnia przepustowość wewnętrznego protokołu mini-prep wynosi 1 500 próbek dziennie na osobę.

  1. Rozwój bakterii w celu uzyskania własnej, wysokowydajnej mini-prep
    1. Przygotuj płytkę dookólną LB/Agar. Wlać 30–40 ml agaru LB (1,5% agaru bakteriologicznego w pożywce LB uzupełnionej antybiotykiem w celu selekcji dodatnich klonów) do każdej płytki z pojedynczym dołkiem.
    2. Punktowy zapas glicerolu na płytce LB / agar. Rozcieńczyć glicerolu w pożywce LB (1:300, zwykle 2 μL w 600 μL LB). Wstrząsaj przez 10 minut. Umieścić 3 μl rozcieńczonego wywaru na płytce LB/agar. Inkubować w temperaturze 37 °C, do góry nogami, przez noc.
    3. Zaszczepić kultury. Za pomocą 96-pinowego urządzenia, które zostało wysterylizowane w 80% etanolu i płomieniu, zaszczepij kulturę z płytki agarowej w bloku głębokiej studzienki z 1,5 ml na studzienkę pożywki gruźliczej uzupełnionej antybiotykiem.
    4. Inkubuj kultury. Przykryć blok uszczelką przepuszczającą gaz i inkubować przez 22–24 godziny w temperaturze 37 °C, 300–800 obr./min, w zależności od wytrząsarki.
      UWAGA: Wytrząsarki ustawione na 800 obr./min są optymalne do tej inkubacji. Użycie wytrząsarki o mniejszej prędkości może skutkować mniej gęstymi kulturami i niższą wydajnością oczyszczania DNA.
    5. Kultury granulek. Wirować bloki w temperaturze 3 800 x g i w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Odrzucić supernatant.
  2. Własne mini-prep<br /> o wysokiej przepustowości UWAGA: Pipety wielokanałowe lub automatyczne dozowniki mogą być używane do wykonywania wewnętrznego mini-przygotowania o wysokiej przepustowości. Jeśli używasz dozownika automatycznego, upewnij się, że system został wyczyszczony przed użyciem i między roztworami.
    1. Przygotuj wszystkie roztwory używane podczas mini-przygotowania:
      1. Przygotować roztwór 1: bufor do reprodukcji zawiesiny TE (50 mM Tris, pH = 8,0; 10 mM EDTA, pH = 8,0; 0,1 mg/ml RNAse). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
      2. Przygotować roztwór 2: Bufor do lizy NaOH/SDS (0,2 M NaOH; 1% SDS). Aby uzyskać lepsze wyniki, należy użyć świeżo przygotowanego roztworu.
      3. Przygotować roztwór 3: bufor neutralizacyjny KOAC (2,8 M KOAc). Doprowadzić pH roztworu do 5,1 za pomocą lodowatego kwasu octowego. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
      4. Przygotować roztwór N2: bufor równowagowy (100 mM Tris; 900 mM KCl; 15% EtOH; 0,15% Triton X-100). Doprowadzić pH roztworu do 6,3 za pomocą kwasu fosforowego.
      5. Przygotuj roztwór N3: bufor bash (100 mM Tris; 1,15 M KCl; 15% EtOH). Doprowadzić pH roztworu do 6,3 za pomocą kwasu fosforowego.
      6. Przygotować roztwór N5: bufor elucyjny (100 mM Tris; 1 M KCl; 15% EtOH). Doprowadzić pH roztworu do 8,5 za pomocą kwasu fosforowego.
        UWAGA: Skuteczna kontrola wiązania, płukania i elucji DNA podczas wymiany anionowej jest w dużym stopniu zależna od stężenia KCl w buforze i wartości pH. Niezbędne są dokładne pomiary składników buforowych i regulacja pH. Niewielkie odchylenia od opisanych pomiarów mogą skutkować znaczną utratą plonów.
    2. Ponownie zawiesić pellet. Dodać 200 μl roztworu 1 i wstrząsać z prędkością 2 000 obr./min przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Do udanej lizy konieczne jest całkowite ponowne zawieszenie osadu. W razie potrzeby przekręć blok wirowo.
    3. Liza bakterii. Dodać 200 μl roztworu 2, uszczelnić płytkę aluminiową uszczelką i odwrócić 5x. Ostrożnie zmierz ten krok od początku dodawania roztworu 2. Nie przekraczać 5 minut.
    4. Zneutralizować roztwór. Dodać 200 μl roztworu 3, uszczelnić płytkę aluminiową uszczelką i odwrócić 5x. Uszczelka może być luźna z powodu do lizy/neutralizacji, dlatego należy zachować ostrożność podczas odwracania. Częściowa inwersja, w której roztwór nigdy nie dotyka uszczelki, jest zalecana, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu między próbkami.
    5. Klarowny lizat. Odwirować płytki przy 3 800 x g i temperaturze 4 °C przez 30 minut.
    6. Przygotować zawiesinę żywicy anionowymiennej podczas etapu wirowania granulowania lizatu. Używając butelki o pojemności 1 l, napełnij ją żywicą anionowymienną, aż osiągnie oznaczenie 300 ml, a następnie dodaj roztwór N2 do 900 ml.
      UWAGA: Ten krok należy wykonać w okapie, aby chronić się przed wdychaniem krzemionki.
    7. Przygotuj płytki z żywicy anionowymiennej. Ułóż płyty filtracyjne na głębokim bloku studziennym, aby działały jako naczynie na odpady. Wymieszaj zawiesinę anionowymienną, aż stanie się jednorodna, a następnie wlej do szklanego koryta. Używając dysz P1000 o szerokim otworze, przenieś 450 μl gnojowicy do każdej studzienki płyt filtracyjnych.
    8. Odwirować ułożone w stos płytki (płytka żywiczna/płytka z głęboką studzienką) przy wolnym przyspieszaniu przez 5 minut przy 130 x g i RT. Odrzucić przepływ.
    9. Przenieść supernatant lizatu na płytkę żywiczną/blok głębokiej studzienki. Obracaj ułożone w stos talerze przez 5 minut przy 30 x g z niską prędkością narastania.
    10. Umyj kolumnę. Dodać 400 μl roztworu N3 (bufor do płukania) do każdej studzienki. Przenieś płytkę żywiczną do kolektora próżniowego, aby usunąć bufor myjący. Powtórz kroki prania 3x. Podczas ostatniego prania upewnij się, że wszystkie studzienki są odpowiednio opróżnione. Obracaj płytki stosu o gramaturze 150 x g przez 5 minut, aby usunąć resztki buforu.
    11. Eluować DNA. Umieść płytkę z żywicą na czystej płytce zbiorczej o pojemności 800 μl. Dodać 300 μl roztworu N5 do każdego dołka. Pozostaw na 10 minut w temperaturze RT, a następnie obracaj ułożone w stos talerze przez 5 minut przy 20 x g z niską prędkością narastania. Obracaj ułożone w stos talerze przez 1 minutę przy 233 x g.
    12. Określić ilościowo DNA i przechowywać płytki w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia lub przejść bezpośrednio do wytrącania DNA.
      UWAGA: Konieczne jest co najmniej 30 μg DNA na próbkę. Jeśli uzysk DNA jest niski, zaleca się powtórzenie minipreparatyki DNA lub alternatywnie połączenie dwóch płytek na etapie wytrącania (sekcja 2.3).
  3. Wytrącanie DNA
    1. Rozmrozić płytki, wirować w celu homogenizacji roztworu DNA i wirować z prędkością 230 x g przez 30 sekund, aby zebrać cały roztwór na dnie studzienki.
    2. Do każdej studzienki dodać 40 μl 3 M NaOAc i 240 μl izopropanolu. Przykryj płytkę aluminiową uszczelką i wymieszaj, odwracając 3x.
    3. Odwirować płytki przez 30 minut w temperaturze 3 800 x g i temperaturze 25 °C. Ostrożnie wyrzucić supernatant.
      UWAGA: Aby połączyć dwie płytki, przenieś DNA z drugiej płytki do osadu z pierwszej płytki i powtórz kroki 2.3.2–2.3.3.
    4. Umyj i wytrącić DNA. Do każdej studzienki dodać 400 μl 80% etanolu. Uszczelnij płyty aluminiową uszczelką i potrząsaj z prędkością 1 000 obr./min przez 30 minut. Wirować przy 3 800 x g przez 30 minut w temperaturze 25 °C. Odrzucić supernatant.
    5. Wysuszyć granulki DNA. Ułóż talerze do góry nogami pod kątem na ręcznikach papierowych i pozostaw do wyschnięcia na 1–2 godziny, aż na dnie studzienki nie będzie alkoholu. Uszczelnij i odwiruj przy 230 x g przez 2 minuty, aby sprowadzić wszelkie granulki.
    6. Po wyschnięciu płytek należy je uszczelnić aluminiową uszczelką i zamrozić w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia lub kontynuować ponowne zawieszanie DNA (krok 4.1).

3. Powłoka szkiełkowa aminozylanu

  1. Umieść szkiełka w metalowym stojaku. Sprawdź wzrokowo każdy slajd, aby upewnić się, że nie ma zadrapań ani niedoskonałości.
  2. Zanurz szkiełka w roztworze powlekającym (2% odczynnik aminozylowy w acetonie) na 15 minut podczas kołysania. Roztwór aminozylanu może być użyty do pokrycia dwóch stojaków po 30 szkiełek każda, zanim będzie musiał zostać wyrzucony.
  3. Krok płukania. Zanurz ruszt szkiełkowy w praniu acetonem (99% acetonu), potrząśnij w przód iw tył, a następnie szybko w górę iw dół 5x. Przechyl do jednego rogu, aby spłynąć, a następnie zanurz się w wodzie ultraczystej szybko w górę iw dół 5x. Przechyl, aby spłynęła, a następnie połóż na serwetkach.
    UWAGA: Myjkę acetonową można użyć dwukrotnie, natomiast wodę ultraczystą należy za każdym razem wymieniać.
  4. Wysuszyć szkiełka za pomocą sprężonego powietrza, na nie ze wszystkich stron przez około 3 minuty, aż wszystkie kropelki wody zostaną usunięte. Przechowuj powlekane szkiełka w RT w metalowym stojaku w szczelnie zamkniętym pudełku.

4. Przygotowanie próbki tablicy

  1. Zawiesić osad DNA z wewnętrznego mini-preparatu (krok 2.3.6) w 20 μl ultraczystej wody i wstrząsać z prędkością 1000 obr./min przez 2 godziny. W przypadku przygotowania DNA midi/max należy rozcieńczyć każdą próbkę do końcowego stężenia 1,5 μg/μl i przenieść 20 μl na płytkę zbiorczą o pojemności 800 μl.
  2. Przygotuj mieszankę drukarską. Na jedną płytkę 96-dołkową przygotuj 1 ml mieszanki drukarskiej [237,5 μl ultraczystej wody; 500 μl polilizyny (0,01%); 187,5 μl BS3 (bis-sulfosuccinimidyl, 50 mg/ml w DMSO); i 75 μl poliklonalnego przeciwciała przeciw flagowemu przeciwciału królikowi).
    UWAGA: Chemikalia należy dodawać w określonej kolejności, aby uniknąć wytrącania się.
  3. Do każdej próbki dodać 10 μl mieszanki drukarskiej, uszczelnić płytki folią aluminiową i wstrząsać w temperaturze pokojowej przez 90 minut z prędkością 1 000 obr./min. Przechowuj płytki przez noc (~16 h) w temperaturze 4 °C.
  4. W dniu drukowania krótko zawiruj i obróć płyty. Przenieść 28 μl każdej próbki na płytkę z matrycą 384. Transfer ten można wykonać za pomocą automatyzacji lub pipety wielokanałowej. Bardzo ważne jest, aby śledzić położenie próbek na płytce matrycy 384.
  5. Krótko obróć talerz w dół, aby usunąć wszelkie bąbelki. Uszczelnij płytki folią.

5. Generacja tablic NAPPA: drukowanie mikromacierzy

UWAGA: Wszystkie warunki drukowania zostały zoptymalizowane dla urządzenia wymienionego w Tabeli Wyposażenia i Materiałów. W przypadku korzystania z innej tablicy może być wymagana dalsza optymalizacja.

  1. Czyszczenie tablicy. Przed rozpoczęciem opróżnij wszystkie zbiorniki na odpady i w razie potrzeby napełnij je ultraczystą wodą lub 80% etanolem. Czyść szpilki jeden po drugim za pomocą niestrzępiących się chusteczek i ultraczystej wody. Osusz kołki niestrzępiącymi się chusteczkami i ostrożnie umieść je z powrotem w głowicy macierzy
    2. .
  2. Konfiguracja Arrayera: specyfikacja druku [maksymalna liczba stempli na tusz: 1; liczba stempli na punkt: 1; czas wielostemplowy: --; czas stemplowania (ms): 0 ms; czas pisania odręcznego (ms): 0 ms; regulacja głębokości druku: 90 mikronów; liczba przyłożeń: 0]. Następnie postępuj zgodnie z protokołem sterylizacji: mycie wodą ultraczystą przez 2 000 ms z czasem schnięcia 0 ms i czasem oczekiwania 500 ms; powtórz te kroki 6 razy; następnie mycie 80% etanolem przez 2 000 ms z czasem schnięcia 1 200 ms i czasem oczekiwania 500 ms; Powtórz te kroki 6 razy.
  3. Projekt slajdu: skonfiguruj tablicę z żądanym wzorcem tablicy. Projekt powinien uwzględniać kilka czynników [tj. liczbę replik dla każdej próbki, lokalizację i liczbę cech kontrolnych, układ tablicy (jeden blok, kilka identycznych bloków), liczbę tablic do wydrukowania, długość serii itp.].
  4. Umieść szkiełka pokryte aminozelanem (krok 3.4) na pokładzie macierzy. Sprawdź, czy odkurzacz utrzymuje wszystkie szkiełka bezpiecznie na miejscu. Uruchom nawilżacz (powinien być ustawiony na 60%).
  5. Umieść płytkę 384-dołkową na pokładzie macierzy. Uruchom program.
  6. Oznacz mikrotablice. Po zakończeniu drukowania umieść etykiety slajdów na dolnej (niezadrukowanej) stronie każdego slajdu. Utrzymuj kolejność drukowania slajdów na pokładzie w kolejności numerycznej.
  7. Przechowuj wydrukowane matryce w RT w metalowym stojaku w szczelnie zamkniętym pudełku z pakietem krzemionki. Szkiełka przechowywane w suchym środowisku mają okres przydatności do spożycia do jednego roku.
  8. (Opcjonalnie): druga partia 90 preparatów może zostać wydrukowana przy użyciu tych samych próbek. W tym celu należy wyjąć płytkę 384-dołkową z pokładu matrycy, gdy tylko drukowanie płytki zostanie zakończone. Uszczelnić i przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C. Po całkowitym przygotowaniu pierwszej partii macierzy, wyjmij je z pokładu, umieść nowe szkiełka pokryte aminozelanem i rozpocznij nowy przebieg. Upewnij się, że każda płytka 384-dołkowa znajduje się w temperaturze pokojowej przez 30 minut przed użyciem. Jeśli w partii szkiełek drukuje się więcej niż cztery repliki na próbkę, zaleca się podzielenie płytek 384-dołkowych na dwie płytki w celu zmniejszenia parowania próbki poprzez zmniejszenie czasu spędzonego na pokładzie matrycy.
    UWAGA: Sprawdź wszystkie zbiorniki przed rozpoczęciem drugiego biegu.

6. Wykrywanie DNA na preparatach NAPPA

  1. Zablokuj slajdy. Umieścić szkiełka w pudełku z pipetami i dodać 30 ml buforu blokującego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę na wytrząsarce na biegunach.
  2. Plamić szkiełka. Odrzucić roztwór blokujący i dodać 20 ml buforu blokującego i 33 μl fluorescencyjnego barwnika interkalującego DNA. Inkubować przez 15 minut z mieszaniem. Następnie szybko spłucz szkiełka ultraczystą wodą i osusz powietrzem pod ciśnieniem. Kontynuuj skanowanie (sekcja 11).

7. Wyrażenie slajdów NAPPA

  1. Zablokuj szkiełka buforem blokującym na wytrząsarce kołyszącej w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Użyj około 30 ml w pudełku z pipetami na cztery szkiełka.
  2. Opłucz szkiełka ultraczystą wodą i osusz przefiltrowanym sprężonym powietrzem. Nałożyć uszczelkę na każdą prowadnicę zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Dodaj mieszankę IVTT. Każde szkiełko będzie wymagało 150 μl mieszanki IVTT. Rozcieńczyć 82,5 μl lizatu HeLa w 33 μl wody DEPC i uzupełnić 16,5 μl białek pomocniczych i 33 μl mieszaniny reakcyjnej. Dodaj mieszankę IVTT od końca bez etykiety lub bez próbki. Powoli odpipetować mieszaninę (dopuszczalne jest, jeśli tymczasowo zgrzela się na końcu wlotu). Delikatnie masuj uszczelkę tak, aby mieszanka IVTT rozprowadziła się i pokryła całą powierzchnię matrycy. Nałóż małe okrągłe uszczelki portów na oba porty.
  4. Umieść szkiełka na wsporniku i przenieś je do programowalnego inkubatora schładzania. Inkubować przez 90 minut w temperaturze 30 °C w celu ekspresji białka, a następnie przez 30 minut w temperaturze 15 °C w celu unieruchomienia białka pytającego.
  5. Umyj i zablokuj szkiełka. Zdjąć uszczelkę i zanurzyć szkiełka w pudełku z pipetami zawierającymi około 30 ml 1x TBST uzupełnionego 5% mlekiem do wyświetlania białka (sekcja 8) lub 1x TBST uzupełnionego 3% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) do testów kinaz lub badań przesiewowych leków (sekcja 9). Inkubować w temperaturze pokojowej z mieszaniem przez 20 minut i powtórzyć ten krok 2 razy.

8. Wykrywanie białek na tablicach NAPPA

  1. Dodaj przeciwciało pierwszorzędowe. Wyjmij szkiełka z roztworu blokującego (krok 7.5) i delikatnie osusz tylną stronę (stronę niezadrukowaną) za pomocą ręcznika papierowego. Umieść szkiełka na podporze i nałóż 600 μl przeciwciała pierwszorzędowego (mysia flaga antyflagowa) rozcieńczonego w stosunku 1:200 w 1x TBST + 5% mleka. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  2. Umyj szkiełka 1x TBST + 5% mleka na bujanym shakerze (3x po 5 min każda).
  3. Dodaj przeciwciało drugorzędowe. Wyjmij szkiełka z roztworu myjącego i delikatnie osusz tylną stronę ręcznikiem papierowym. Umieść szkiełka na podłożu i nałóż 600 μl przeciwciała wtórnego (przeciwciało anty-mysie cy3-labbeled) rozcieńczonego w stosunku 1:200 w 1x TBST + 5% mleka. Chronić szkiełka przed światłem i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Umyj szkiełka 1x TBST na bujanym shakerze (3x po 5 min każda). Szybko spłucz szkiełka ultraczystą wodą i wysusz powietrzem pod ciśnieniem. Kontynuuj skanowanie (sekcja 11).

9. Badania przesiewowe inhibitorów kinazy tyrozynowej na matrycach NAPPA

UWAGA: W tym samym eksperymencie można przetwarzać wiele preparatów, jednak upewnij się, że na każdym kroku przetwarzany jest jeden slajd na raz i aby nie wysychały między krokami. Dodaj wszystkie roztwory do końca szkiełka bez etykiety lub próbki.

  1. Przygotuj wszystkie roztwory używane podczas badania przesiewowego leku:
    1. Przygotować roztwór fosfatazy/DNazy, łącząc następujące elementy: 1x bufor metalofosfatazy białkowej (50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,01% Brij 35 przy pH = 7,5); 1 mM MnCl2; 8 000 jednostek fosfatazy białka lambda; i 2 jednostki DNazy I. Przygotować 400 μL roztworu dla każdej mikromacierzy. Dodaj fosfatazę i DNazę tuż przed użyciem.
    2. Zrób rozcieńczenie leku. Leki są odtwarzane w DMSO do końcowego stężenia 10 mM. Aby upewnić się, że wszystkie stężenia leków są testowane na tablicy, upewnij się, że ta sama objętość DMSO (10 000x zapas w DMSO) jest tworzona dla każdego stężenia i utrzymywana w temperaturze -80 °C. W momencie stosowania leki rozcieńcza się w wodzie w stosunku 1:100.
    3. Przygotować roztwór leku/kinazy, łącząc następujące elementy: 1x bufor kinazy (25 mM Tris-HCl o pH = 7,5); 5 mM beta-glicerofosforanu; 2 mM DTT; 0,1 mM Na3VO4; 10 mM MgCl2; 500 μM ATP; i 2 μL leku (rozcieńczony w wodzie w stosunku 1:100). Przygotować 200 μl roztworu dla każdej mikromacierzy.
  2. Wykonaj leczenie fosfatazą i DNazą. Wyjmij szkiełka z roztworu blokującego (krok 7.5) i delikatnie osusz tylną stronę ręcznikiem papierowym. Umieść szkiełka na podkładzie i nałóż 200 μl roztworu fosfatazy/DNazy. Umieść szkiełko nakrywkowe z mikromacierzą, aby uniknąć parowania. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 45 minut w piekarniku.
  3. Traktowanie fosfatazą i DNazą II: wyjąć matryce z pieca, wyrzucić szkiełko nakrywkowe, usunąć nadmiar roztworu i nałożyć 200 μl świeżo przygotowanego roztworu fosfatazy i DNazy. Przykryć mikroukłady szkiełkiem nakrywkowym i inkubować w suszarce przez kolejne 45 minut w temperaturze 30 °C.
  4. Umyj szkiełka za pomocą 1x TBST + 0,2 M NaCl na bujanej wytrząsarce (3x po 5 min każda).
  5. Wykonaj leczenie farmakologiczne i reakcję kinazy. Wyjmij szkiełka z roztworu myjącego i delikatnie osusz tył ręcznikiem papierowym. Umieść szkiełka na podkładzie i nałóż 200 μl roztworu leku/kinazy. Umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu, aby uniknąć parowania. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 30 °C w piecu.
  6. Umyj szkiełka za pomocą 1x TBST + 0,2 M NaCl na bujanej wytrząsarce (3x po 5 min każda).
  7. Powtórz kroki 8.1–8.4, używając jako przeciwciała pierwszorzędowego przeciwciała anty-phosho-Tyr rozcieńczonego w stosunku 1:100. Zastąp 1x TBST + 5% mleka we wszystkich krokach 1x TBST + 3% BSA.

10. Protokół automatycznej hybrydyzacji

UWAGA: Alternatywnie, stacja hybrydyzacji może być użyta do automatyzacji wszystkich hybrydyzacji i mycia na tablicach NAPPA (sekcje 7-9), a protokół jest dostarczany jako Plik Uzupełniający 1.

11. Akwizycja obrazu

UWAGA: Obrazy mikromacierzy powinny być uzyskiwane w rozdzielczości 20 mikronów lub wyższej.

  1. Załaduj mikromacierze do magazynka z uchwytem na szkiełka białkami skierowanymi do góry. Załaduj magazynek do skanera mikromatrycowego.
  2. Wybierz zielony laser z filtrem emisyjnym 575/30 nm, aby zeskanować sygnał z przeciwciała wtórnego znakowanego CY-3. Jeśli używany jest inny fluorofor, wybierz odpowiedni laser/długość fali, aby wykryć sygnał z barwnika fluorescencyjnego.
  3. Zdefiniuj nazwę każdego obrazu i lokalizację, w której zostaną zapisane.
  4. (Opcjonalnie): dla każdego nowego fluoroforu zaleca się optymalizację warunków skanowania w celu wykrycia liniowego zakresu natężenia sygnału. W tym celu należy zeskanować mikromacierz za pomocą szeregu fotopowielaczy (PMT) i wzmacniać, aż uzyskasz wyraźny obraz z nienasyconym sygnałem i niskim tłem.
  5. Skanuj wszystkie mikromacierze ze zoptymalizowanymi ustawieniami i pamiętaj o wyłączeniu automatycznego odzyskiwania.
    UWAGA: W celu analizy danych wszystkie mikromacierze powinny być skanowane przy użyciu tych samych ustawień skanowania. W przypadku testów kinaz z użyciem cy3 jako fluoroforu, obrazy są skanowane z 20% PMT, intensywnością lasera 25% i rozdzielczością 10 mikronów, przy użyciu skanera wymienionego w Tabeli Wyposażenia i Materiałów.

12. Przetwarzanie i analiza danych

UWAGA: Dostępnych jest kilka pakietów oprogramowania do kwantyfikacji danych z mikromacierzy o podobnych możliwościach. Opisana tutaj procedura została opracowana dla oprogramowania wymienionego w Tabeli Wyposażenia i Materiałów.

  1. Załaduj pliki TIFF do ilościowego określenia, zaprojektuj siatkę tak, aby pasowała do układu mikromacierzy i dostosuj rozmiar plamek, aby objąć cały sygnał o minimalnej możliwej powierzchni. Sąsiednie miejsca nie powinny na siebie zachodzić. Sprawdź wzrokowo, jak dobrze działa oprogramowanie i w razie potrzeby dostosuj siatkę ręcznie.
  2. Określ ilościowo intensywność sygnału mikromacierzy. Sprawdź wzrokowo miejsca pod kątem wszelkich nieprawidłowości (niespecyficzne wiązanie, kurz itp.) i usuń je z analizy danych.
  3. Skoryguj tło lokalnie, używając sygnału sąsiednich obszarów na tablicy, w których nie ma żadnego punktu.
  4. Normalizacja danych. Aby porównać sygnał z różnych macierzy, należy znormalizować intensywność sygnału każdej mikromacierzy. Aby wykluczyć wszelkie wartości odstające, znormalizuj dane przy użyciu obciętej średniej 30% sygnału z kontroli pozytywnej (plamki IgG) zdefosforylowanych mikromacierzy.
    UWAGA: Sygnał z plamki IgG nie zmienia się podczas fosforylacji i defosforylacji mikromacierzy i nadaje się do normalizacji.
  5. Zidentyfikuj aktywne kinazy. Dla każdej cechy wyświetlanej w mikromacierzy oblicz stosunek między znormalizowaną intensywnością sygnału w układach autofosforylowanych i defosforylowanych. Ustal próg 1,5-krotnej zmiany dla identyfikacji aktywnych kinaz i oznacz wszystkie inne cechy jako niezdolne do poddania się autofosforylacji (N/A).
  6. Obliczyć aktywność każdej kinazy zidentyfikowanej w kroku 12.5 jako procent skorygowanego sygnału (intensywność sygnału znormalizowanej macierzy kontroli pozytywnej (DMSO) odjęta przez intensywność sygnału znormalizowanej macierzy kontroli ujemnej (defosforylowana).

Wyniki

Samoorganizujące się mikromacierze NAPPA stanowią solidną platformę, która może być wykorzystywana w wielu różnych zastosowaniach, w tym do odkrywania biomarkerów, badania oddziaływań białko-białko, identyfikacji substratów oraz przesiewania leków10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20.

Ogólna metodologia przyjęta do badania aktywności kinaz oraz przesiewania inhibitorów kinaz tyrozynowych na mikrotablicach NAPPA została przedstawiona schematycznie na Rysunku 1. Najpierw mikrotablice NAPPA są generowane poprzez immobilizację cDNA i czynnika wychwytującego na powleczonych mikrotablicach. Następnie cDNA służą jako matryca do transkrypcji i translacji białek z wykorzystaniem ludzkiego systemu IVTT, a nowo zsyntetyzowane białka są immobilizowane przez czynnik wychwytujący9. Jakość wydrukowanej mikrotablicy można monitorować poprzez pomiar poziomu DNA (potwierdzając spójność drukowania) lub białka wykazanego na tablicy (potwierdzając ekspresję i wychwyt białka; Rysunek 1). Aby zmniejszyć sygnał tła i zwiększyć zakres dynamiczny eksperymentu, mikrotablice są traktowane 1) fosfatazą lambda w celu usunięcia fosforylacji z reszt Ser/Thr/Tyr, a następnie 2) DNazą, aby uprościć chemię w plamce i zmniejszyć tło (Rysunek 1).

Kolejnym krokiem jest reakcja autofosforylacji, w której mikromacierze inkubuje się z buforem kinazy w obecności ATP (negatywna kontrola macierzy, określana jako mikromacierze defosforylowane), a bufor kinazy jest uzupełniany o ATP (kontrola dodatnia, określana jako macierze autofosforylowane) lub ATP + DMSO (kontrola nośnika). Należy podkreślić, że na tym etapie nie dodaje się kinazy; w związku z tym wewnętrzną aktywność każdej kinazy unieruchomionej na mikromacierzy określa się poprzez pomiar poziomu jej fosforylacji z wykorzystaniem przeciwciała pan anty-fosfotyrozynowego, a następnie przeciwciała wtórnego znakowanego cy3 (Rysunek 1).

Kontrola jakości macierzy NAPPA-kinase, zawierających panel ludzkich kinaz białkowych naniesionych w czterech kopiach, została przedstawiona na Rysunku 2. Poziomy unieruchomionego DNA zmierzono za pomocą barwienia DNA, co wykazało jednolity sygnał w obrębie mikromacierzy, sugerując, że ilość DNA naniesiona na macierz była równomierna. Można również zaobserwować kilka punktów bez żadnego barwienia DNA. Punkty te odpowiadają niektórym kontrolom, w których z mieszaniny do naniesienia pominięto DNA [t.j. puste miejsca (nic nie naniesiono), punkty z wodą, punkt z oczyszczonym IgG (poli-lizyna, łącznik i oczyszczone IgG), sama mieszanina do naniesienia (pełna mieszanina do naniesienia: poli-lizyna oraz łącznik i przeciwciało anty-flag, bez żadnego DNA)]. Poziomy białek wykazanych na mikromacierzach NAPPA-kinase oceniono po reakcji IVTT przy użyciu przeciwciała anty-tag.

Do screeningu kinaz wykorzystano znacznik Flag, a poziom białka wykazanego na mikrotablicy zmierzono za pomocą przeciwciała anty-flag. Jak pokazano, większość plamek zawierających cDNA wykazała wykrywalne poziomy białka. Niektóre plamki kontrolne bez cDNA również ujawniły sygnał z przeciwciałem anty-flag: plamka IgG (użyta do wykrycia aktywności przeciwciała wtórnego) oraz plamki z pustym wektorem (cDNA koduje tylko znacznik) (Rysunek 2). Mikrotablice NAPPA-kinase wykazały dobrą powtarzalność między slajdami, przy czym korelacja poziomów ekspresji białek między różnymi partiami nadruków była wyższa niż 0,88 (Rysunek 2). W obrębie tej samej partii korelacja była jeszcze wyższa, bliska 0,92 (dane nie pokazano).

Następnie, aktywność autofosforylacji kinazy białek wyeksponowanych na macierzy zmierzono przy użyciu przeciwciała przeciwko fosfotyrozynie (Rysunek 3). Białka wyeksponowane na macierzy wykazały wysokie poziomy fosforylacji po ekspresji (Rysunek 3, lewa strona), co może być spowodowane wewnętrzną aktywnością kinazy białek wyeksponowanych na macierzy lub obecnością aktywnych kinaz w mieszaninie IVTT. Fosforylację tę całkowicie usunięto poprzez traktowanie fosfatazą lambda, a następnie takie macierze wykorzystano do testów kinazy. Po defosforylacji reakcje autofosforylacji przeprowadzone bez ATP nie wykazały istotnych poziomów fosforylacji, zgodnie z oczekiwaniami, podczas gdy macierze inkubowane w buforze kinazy w obecności ATP wykazały fosforylację białek już po 15 min (Rysunek 3). W celu przesiewania leków aktywność kinazy mierzono po 60 min reakcji autofosforylacji, aby zmaksymalizować liczbę przetestowanych kinaz.

Porównanie macierzy, w których poziomy fosforylacji mierzono bezpośrednio po ekspresji białek (Rysunek 3, lewo) oraz po 60 min reakcji autofosforylacji (Rysunek 3, prawo) wykazało: i) białka fosforylowane tylko po ekspresji, co sugeruje, że mogą one być fosforylowane egzogennie przez białka obecne w mieszaninie IVTT, ale nie mogą ulegać autofosforylacji; ii) białka fosforylowane tylko po reakcji autofosforylacji, co sugeruje, że białka te nie były aktywne po ekspresji i wymagały kofaktorów obecnych w buforze kinazy, aby stać się aktywnymi; lub iii) białka fosforylowane na obu macierzach, co sugeruje, że były one aktywne w obu warunkach (Rysunek 3).

Jako przykład wyników uzyskanych podczas przesiewania inhibitorów tyrozynokinazy na matrycach NAPPA-kinase wykorzystano trzy inhibitory kinaz o odmiennej selektywności względem kinaz białkowych: staurosporynę, imatynib i ibrutynib. We wszystkich badaniach przesiewowych zdefosforylowane mikrotablice NAPPA inkubowano z rosnącymi stężeniami TKI (w zakresie od 100 nM do 10 uM) podczas reakcji autofosforylacji. Pierwszym przetestowanym TKI była staurosporyna, globalny inhibitor kinaz białkowych, który wykazał silne hamowanie kinaz na mikrotablicy w odniesieniu do niemal wszystkich badanych kinaz11.

Następnie przetestowano imatynib, inhibitor ABL i c-Kit stosowany w leczeniu przewlekłej białaczki szpikowej oraz guzów stromalnych przewodu pokarmowego4,5,6,7. Na macierzach NAPPA-kinase imatynib wykazał znaczną redukcję aktywności Abl1 oraz BCR-Abl1, podczas gdy inne kinazy pozostały w większości niezakłócone (Rysunek 4A). Ilościowe oznaczenie aktywności kinaz zostało znormalizowane względem macierzy defosforylowanej i przedstawione jako procent macierzy kontrolnej dodatniej (sam nośnik). Dane dla TNK2 (kinaza nieistotna), Abl1 oraz BCR-Abl1 przedstawiono na Rysunku 4B. Zgodnie z oczekiwaniami, imatynib wykazał selektywne hamowanie w stosunku do Abl1 i BCR-ABl1. Dane dla c-Kit były niejednoznaczne ze względu na brak aktywności na macierzach kontrolnych dodatnich.

Na koniec przetestowano ibrutynib, zatwierdzony przez FDA kowalencyjny inhibitor kinazy tyrozynowej Brutona (BTK). Ibrutynib jest obecnie stosowany w leczeniu kilku nowotworów krwi z nadaktywną BTK, w tym przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL), chłoniaka komórek płaszcza oraz makroglobulinemii Waldenströma21,22. Rysunek 4C przedstawia reprezentatywne wyniki uzyskane podczas przesiewu ibrutynibu. Aktywność kinaz ABL1 (kinaza nieistotna), BTK (cel kanoniczny) oraz ERBB4 (potencjalny nowy cel) pokazano na Rysunku 4D. Dane sugerują, że ERBB4 może być hamowany przez ibrutynib w sposób zależny od dawki. Hamowanie to zostało potwierdzone in vitro oraz w testach komórkowych11, co demonstruje skuteczność tej platformy.

Wszystkie te dane sugerują, że platforma mikroarray NAPPA-kinase może być wykorzystana do bezstronnego przesiewania inhibitorów TK. Ponadto badanie przesiewowe jest szybkie i można je łatwo dostosować tak, aby objęło dowolne warianty interesujących nas kinaz białkowych.

Schemat procesu autofosforylacji ze ścieżką ATP; detekcja fosforylacji; układ przesiewania leków.
Rysunek 1: Schematyczna reprezentacja kontroli jakości i przesiewania inhibitorów kinaz tyrozynowych w matrycach NAPPA. Matryce NAPPA są drukowane z cDNA kodującym białko docelowe połączone z tagiem i przeciwciałem wychwytującym. Podczas reakcji transkrypcji i translacji in vitro (IVTT) syntetyzowane białka są wychwytywane na powierzchni mikromacierzy poprzez tag za pomocą przeciwciała wychwytującego. Kontrola jakości (QC) matryc jest przeprowadzana poprzez pomiar poziomu DNA nadrukowanego na szkiełku, przy użyciu fluorescencyjnego barwnika przerywającego DNA, oraz poziomu białek wykazanych na matrycy przy użyciu przeciwciał specyficznych dla tagu. W celu przesiewania kinaz mikromacierze są traktowane DNazą i fosfatazą po reakcji IVTT, aby usunąć nadrukowane DNA oraz wszelkie fosforylacje, które mogły zajść podczas syntezy białek. Odfosforylowane matryce są teraz gotowe do użycia w przesiewaniu leków. Dla każdego testu rutynowo stosuje się trzy zestawy kontrolne: (I) matryce odfosforylowane, w których reakcja autofosforylacji jest przeprowadzana bez ATP; (II) mikromacierze autofosforylowane, w których reakcja autofosforylacji jest przeprowadzana w obecności ATP; oraz (III) matryca traktowana DMSO (nośnik), w której reakcja autofosforylacji jest przeprowadzana z ATP i DMSO. Szkiełka traktowane różnymi stężeniami inhibitorów kinaz podlegają dokładnie temu samemu protokołowi, który stosuje się dla matryc traktowanych DMSO. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Analiza mikromacierzy: barwienie DNA, detekcja białek i wykres rozrzutu dla korelacji ekspresji.
Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki kontroli jakości dla samoorganizujących się macierzy NAPPA-kinase. Przedstawiono zawartość DNA zmierzoną za pomocą fluorescencyjnego barwnika przerwanego do DNA (po lewej) oraz poziomy białek obecnych na mikromacierzy zmierzone za pomocą przeciwciała anty-Flag (środek). Po prawej stronie znajduje się wykres korelacji poziomów białek obecnych na dwóch macierzach NAPPA-kinase wydrukowanych w osobnych partiach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Eksperyment fosforylacji; autofosforylacja z ATP; schemat western blot; analiza przebiegu czasowego.
Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki aktywności kinazy w matrycach NAPPA-kinase. Do badania aktywności kinaz białkowych w matrycy wykorzystano mikrozespoły zawierające kinazy białkowe w czterech powtórzeniach; aktywność mierzono poprzez oznaczanie fosforylacji białek z użyciem przeciwciała anty-pTyr, a następnie przeciwciała anty-mysiego znakowanego cy3. Matryce kontrolne, które nie były poddane działaniu fosfatazy/DNazy i w których podczas reakcji autofosforylacji pominięto ATP, posłużyły do pomiaru fosforylacji tła po ekspresji białek (post-expression). Pozostałe mikrozespoły potraktowano fosfatazą/DNA, a następnie przeprowadzono reakcję autofosforylacji bez ATP (mikrozespół defosforylowany, kontrola negatywna) lub z ATP (mikrozespoły autofosforylowane). W przypadku mikrozespołów autofosforylowanych reakcję autofosforylacji przeprowadzono przez 15 min, 30 min, 45 min lub 60 min, zgodnie z oznaczeniem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki testu inhibicji kinazy; siatka i wykresy aktywności dla zależności dawka-odpowiedź dla imatynibu i ibrutynibu.
Rysunek 4: Reprezentatywne dane z przesiewu kinaz tyrozynowych na matrycach NAPPA-kinase. (A) Matryce NAPPA-kinase traktowane fosfatazą/DNazą inkubowano z rosnącymi stężeniami imatynibu podczas reakcji autofosforylacji, a aktywność kinazy zmierzono za pomocą przeciwciała anty-fosfotyrozynowego. (B) Ilościowe oznaczenie aktywności kinazy zaobserwowanej na matrycach NAPPA-kinase wystawionych na działanie imatynibu. Dane znormalizowano względem sygnału z matryc kontroli negatywnej (defosforylowanych) i przedstawiono jako procent matryc kontroli pozytywnej (reakcja autofosforylacji przeprowadzona w obecności DMSO). Podobne dane przedstawiono dla przesiewu ibrutynibu (C,D). Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Rauf et al.11. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1. Alternatywny protokół przesiewania inhibitorów tyrozynokinaz w macierzach NAPPA z wykorzystaniem zautomatyzowanej stacji hybrydyzacji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów
Podczas fazy optymalizacji badania aktywności kinaz na matrycach NAPPA, jednym z głównych źródeł zaobserwowanego tła i niskiego zakresu dynamiki był BSA zastosowany w mieszance drukarskiej. BSA dostarczało pierwszorzędowe aminy niezbędne do sieciowania z powierzchnią aminozelanu i na miejscu wychwytywało DNA i przeciwciało wychwytujące. Jednak BSA jest silnie ufosforylowany, co utrudnia wykrycie sygnału autofosforylacji na tablicy powyżej szumu tła. Aby rozwiązać ten problem, przetestowano kilka alternatyw dla BSA w mieszance drukarskiej i zidentyfikowano polilizynę jako dobry substytut. Polilizyna nie ma żadnego miejsca fosforylacji; W związku z tym tło z tablic niewyrażonych jest bardzo minimalne. Co więcej, mikromacierze wydrukowane za pomocą polilizyny są powtarzalne i wykazują dobry poziom białek (ryc. 2).

Kolejną krytyczną modyfikacją przeprowadzoną w standardowym teście NAPPA było dodanie etapu leczenia fosfatazą/DNazą. Traktowanie mikromacierzy fosfatazą pozwala na usunięcie fosforylacji, która wystąpiła w mieszaninie IVTT podczas syntezy i wychwytywania białek (ryc. 3). Źródłem tej fosforylacji może być wewnętrzna aktywność autofosforylacji lub aktywność kinaz obecnych w mieszaninie IVTT. Usunięcie całej fosforylacji po ekspresji umożliwiło łatwą identyfikację kinaz, które są aktywne i mogą ulegać autofosforylacji (ryc. 3).

Krytyczne kroki w ramach protokołu
NAPPA to solidna technologia, ale zgodnie z oczekiwaniami istnieje kilka krytycznych kroków. Pierwszym z nich jest pozyskanie wysokiej jakości DNA w odpowiednim stężeniu. Użycie DNA o niskiej jakości lub w niskich stężeniach spowoduje wygenerowanie niskiej jakości mikromacierzy z kilkoma cechami, które nie są wyrażane i wyświetlane na odpowiednich poziomach, zmniejszając liczbę analizowanych białek w macierzy. Drugim krytycznym krokiem jest ekspresja białek w mikromacierzy. Zastosowanie systemu IVTT, który będzie wyrażał wysoki poziom funkcjonalnego białka, jest niezbędne do badania aktywności kinazy w macierzy.

Kolejnym krytycznym krokiem w procesie przesiewowym TKI jest sposób postępowania z mikromacierzami. Mikromacierze nie powinny wysychać na żadnym etapie protokołu i zaleca się delikatne obchodzenie się z nimi, aby zapobiec zadrapaniom, które mogą zwiększyć sygnał tła. Ponieważ tablice z całego eksperymentu zostaną porównane ze sobą, ważne jest, aby upewnić się, że każdy etap inkubacji jest równy na wszystkich szkiełkach. Na przykład czas wymagany do wykonania jednego kroku w pojedynczej macierzy powinien być brany pod uwagę, gdy przetwarzana jest partia 20 tablic, aby zapobiec różnicom w długości inkubacji między macierzami.

Wreszcie, projekt eksperymentu i włączenie zarówno kontroli pozytywnych, jak i ujemnych ma kluczowe znaczenie dla kontroli jakości i analizy danych. Pierwszy zestaw kontroli to te wydrukowane w każdej tablicy i obejmuje kontrole ujemne [tj. puste miejsca (bez wydrukowanego materiału), wodę lub pusty wektor (wyrażają tylko znacznik)], a także kontrolę pozytywną (tj. oczyszczoną IgG, która jest wykrywana przez przeciwciało drugorzędowe i jest obojętna na zmiany poziomów fosforylacji). Łącznie mierzą one poziomy tła mikromacierzy, możliwe przeniesienie podczas drukowania oraz intensywność sygnału metody detekcji.

Kolejnym zestawem kontroli są kontrole przesiewowe leków i obejmują odfosforylowane i autofosforylowane mikromacierze (w obecności lub bez DMSO). Jak wspomniano wcześniej, zdefosforylowana mikromacierz mierzy poziom fosforylacji po traktowaniu fosfatazą, a tym samym poziom wyjściowy dla wszystkich innych eksperymentów. Im niższy jest poziom podstawowy, tym wyższy jest zakres dynamiczny testów. Układy autofosforylowane prezentują maksymalne poziomy fosforylacji ze wszystkich macierzy, a sygnał powinien być silny i wyraźny. Służy do analizy danych, ale także jako kontrola, czy wszystkie reakcje zostały pomyślnie przeprowadzone na tablicy.

Ograniczenia techniki
Obecnie jednym z ograniczeń przedstawionych tutaj badań przesiewowych leków jest ich zdolność do badania przesiewowego tylko kinaz białkowych, które mogą ulegać autofosforylacji. Jednym z możliwych sposobów przezwyciężenia tego problemu jest wydrukowanie kinazy i znanego substratu w tym samym miejscu. Udało się przeprowadzić jednoczesne drukowanie DNA dla dwóch odrębnych białek15, co sugeruje wykonalność tego podejścia. Co więcej, białko wyświetlane na tablicy może nie być prawidłowo złożone, co skutkuje nieaktywnym białkiem. Zastosowanie systemu ekspresji opartego na człowieku spowodowało znaczną poprawę aktywności kinazy mierzonej na matrycy; Jednak niektóre białka nadal nie mogą być analizowane na macierzy ze względu na jej nieaktywność.

Drugim ograniczeniem jest pomiar fosforylacji za pomocą przeciwciała anty-fosfo-tyrowego. Pomimo braku swoistości w odniesieniu do motywu miejsca fosforylacji, wszystkie zmierzone fosforylacje wystąpiły na resztach tyrozyny, pozostawiając seryny i treoniny oraz ich odpowiednie kinazy. Do tej pory bez powodzenia przetestowano ponad 10 przeciwciał Pan Pho-Ser/Thr, pomimo kilku prób optymalizacji warunków inkubacji i mycia. Nowy system wykrywania, który jest niezależny od przeciwciał, może być najlepszą opcją do rozszerzenia liczby kinaz białkowych, które mogą być badane pod kątem hamowania leków. W tym kontekście dostępnych jest kilka opcji, w tym radioaktywność lub podejścia chemiczne, takie jak koniugacja kliknięć. Wymagana jest seria optymalizacji, aby zminimalizować sygnał tła i zapewnić dobry zakres dynamiki dla testów.

Trzecim ograniczeniem jest pozyskiwanie klonów cDNA, które mają zostać wydrukowane na tablicy. Klony cDNA mogą być generowane przy użyciu dowolnej techniki klonowania, w tym systemów rekombinacji specyficznych dla danego miejsca, takich jak Creator lub Gateway23. Inną opcją jest zakup klonów z biblioteki DNAsu znajdującej się w , gdzie ponad 17 000 klonów cDNAs, w tym cały ludzki kinom, jest łatwo dostępnych do wykorzystania do budowy macierzy NAPPA24.

Czwartym ograniczeniem jest to, że nie każde laboratorium jest wyposażone w odpowiedni sprzęt do wytwarzania i badania przesiewowego własnych macierzy NAPPA. Protokół ten zapewnia alternatywne metody generowania DNA do wydrukowania na mikromacierzy, bez potrzeby stosowania sprzętu o wysokiej przepustowości, oraz protokoły do ręcznego wykonywania wszystkich etapów hybrydyzacji. Jednak dostęp do macierz i skanera mikromacierzy jest nadal konieczny. Jedną z opcji rozwiązania tego problemu jest skorzystanie z podstawowej usługi i obiektu NAPPA, które można znaleźć pod adresem , który dystrybuuje niestandardowe mikromacierze NAPPA po cenie akademickiej non-profit. Wreszcie, podobnie jak w przypadku każdej metodyki badań przesiewowych, dane uzyskane na tablicach są podatne na artefakty (dodatnie lub negatywne) i dlatego powinny być walidowane za pomocą testów ortogonalnych.

Znaczenie w odniesieniu do istniejących metod
Na rynku dostępnych jest kilka platform do badań przesiewowych kinaz białkowych. Jednym z rutynowo stosowanych podejść są testy wiązania, które można przeprowadzić z fragmentami białka, domeną kinazy, większymi fragmentami białek z domeną kinazy i niektórymi regionami regulatorowymi, a nawet białkami o pełnej długości. Białka są zwykle ulegane ekspresji w systemach bakteryjnych ze względu na koszt i prostotę protokołów ekspresji i oczyszczania. Interakcja między lekiem będącym przedmiotem zainteresowania a białkiem jest następnie mierzona za pomocą pewnego rodzaju testu raportowego, takiego jak na przykład fluorescencja lub obecność znaczników. Głównym ograniczeniem tego zestawu podejść jest fakt, że białko niekoniecznie jest aktywne podczas interakcji z lekiem, co może skutkować identyfikacją interakcji fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych. Fragmenty białek są szczególnie podatne na zmiany w konformacji i braku aktywności, a wszystkie uzyskane dane powinny zostać zwalidowane przy użyciu aktywnych białek, najlepiej w ich pełnej długości. Kolejnym ograniczeniem niektórych platform jest możliwość ekranowania tylko analogów ATP, co ogranicza jego ogólne zastosowanie.

Większość dostępnych na rynku usług w zakresie badań przesiewowych TKI przy użyciu metod enzymatycznych wykorzystuje tylko dzikie wersje kinazy będącej przedmiotem zainteresowania, a czasami tylko kilka wybranych mutantów. Wiedząc, że oporność na leki jest bardzo powszechna u pacjentów leczonych TKI, ważne jest, aby móc mierzyć odpowiedź na lek u różnych mutantów w celu wyboru najbardziej odpowiedniego inhibitora. Ze względu na charakter NAPPA, badanie przesiewowe mutantów kinazy jest proste i można je łatwo przeprowadzić, a jedynym wymaganym narzędziem jest włączenie mutanta kinazy do kolekcji cDNA NAPPA, co można przeprowadzić na przykład poprzez mutagenezę specyficzną dla miejsca.

Przyszłe zastosowania
Jedną z najczęstszych form leczenia w leczeniu nowotworów z wykorzystaniem inhibitorów kinaz jest nabywanie mutacji w celu leku w trakcie leczenia. Badania przesiewowe tych mutantów pod kątem ich odpowiedzi na inhibitory kinaz mają kluczowe znaczenie dla wyboru drugiej/trzeciej generacji TKI w celu uzyskania spersonalizowanego leczenia dla każdego pacjenta. Przedstawione tutaj podejście do badań przesiewowych leków zapewnia bezstronną platformę przesiewową, w której każdy inhibitor kinazy tyrozynowej może być testowany na panelu kinaz tyrozynowych obecnych w ludzkim genomie. Ponieważ białka wyświetlane na macierzach NAPPA ulegają ekspresji in vitro z cDNA wydrukowanego na szkiełku, każdy zmutowany wariant może być łatwo włączony do kolekcji cDNA w celu wyświetlenia na tablicy. Obiekt, w którym mutanty kinazy mogą być generowane i wyrażane na macierzy, w połączeniu z wysoką przepustowością techniki NAPPA, zapewnia unikalne środowisko do badania mutantów kinaz i ich reakcji na leki, dzięki czemu NAPPA nadaje się do spersonalizowanych badań przesiewowych leków, co jest jednym z celów medycyny precyzyjnej.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować wszystkim w laboratorium LaBaera za pomoc i krytykę podczas rozwoju projektu. Projekt ten był wspierany przez U01CA117374 grantowe NIH, U01AI077883 i Fundację Virginii G. Piper.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
odczynnik/materiał
płytki dołkowe 364 (do układu)Genetixx7020
800 µ L 96-dołkowa płytka zbiorczaAbgeneAB-0859
96-pinowe urządzenieBoekel140500
Kwas octowyMillipore-Sigma1.00066
Aceton 99,9%Millipore Sigma650501
Aluminiowa uszczelka do płytek 96-dołkowychVWR76004-236
Aminosilan (3-aminopropylotrietoksysilan)PiercePrzeciwciało 80370
ANTI-FLAG M2 wytwarzane u myszyMillipore SigmaF3165
Anti-Flag królicze przeciwciało (poliklonalne)Millipore SigmaF7425
ATP 10 mMSygnalizacja komórkowa9804S
β-glicerofosforan sól disodowa hydrat agarMillipore-SigmaG9422
VWR97064-336
Bufor blokującyThermoFisher/Pierce37535
Brij 35ThermoFisher/PierceBP345-500
BS3 (bis-sulfosuccinimidyl)ThermoFisher/Pierce21580
BSA (albumina surowicy bydlęcej)Millipore SigmaA2153
Szkiełko nakrywkowe 24 x 60 mmVWR48393-106
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-165-150
DeepWell Block, skrzynka 50ThermoFisher/AbGeneAB-0661
DEPC wodaAmbion9906
DMSO (Dimethyl Sulfoxide)Millipore-SigmaD8418
Barwnik interkalujący DNAInvitrogenP11495
DNase IMillipore-SigmaAMPD1-1KT
DTTMillipore-Sigma43816
EDTAMillipore-SigmaEDS
Etanol 200 proofMillipore-SigmaE7023
Płyty filtracyjneMillipore-SigmaWHA77002804
Uszczelki przepuszczalne dla gazu, pudełko 50sztuk ThermoFisher/AbGeneAB-0718
Szklane pudełkoWheaton900201
Szkiełka szklaneVWR48300-047
GlicerolMillipore-SigmaG5516
HCl (kwas solny)Milipore-SigmaH1758
Roztwór buforowy HEPESMillipore-Sigma83264
System IVTT oparty na człowiekuThermo Scientific88882
ImmunoPure Mouse IgG cała cząsteczkaThermoFisher/Pierce31202
IsopropanolMillipore-SigmaI9516
KCl (chlorek potasu)Millipore-SigmaP9333
KH2PO4(Fosforan potasu jednozasadowy)Millipore-SigmaP5655
Bufor kinazySygnalizacja komórkowa9802
KOAc (octan potasu)Millipore-SigmaP1190
Fosfataza białkowa lambdaNew England BiolabsP0753
Lifterslips, 24 x 60 mmThermoFisher Scientific25X60I24789001LS
Metalowy 30-suwakowy stojak bez uchwytówWheaton900234
MgCL2 (chlorek magnezu)Millipore-SigmaM8266
Na3VO4 (orthovanadan sodu)Millipore-SigmaS6508
NaCl (chlorek sodu)Millipore-SigmaS3014
NaOAc (octan sodu)Millipore-SigmaS2889
NaOH (wodorotlenek sodu)Millipore-SigmaS8045
NucleoBond Xtra Midi / MaxiMacherey-Nagel740410.10 / 740414.10
Anion Nucleoprep IIMacherey Nagel740503.1
Kwas fosforowyMilipore-Sigma79617
Roztwór poli-L-lizyny (0,01%)Millipore-SigmaA-005-C
(Lambda)New England BiolabsP0753
RNAzyInvitrogen12091021
SDS (dodecylosiarczan sodu)Millipore-SigmaL6026
SDS (dodecylosiarczan sodu)Millipore-Sigma05030
UszczelkaGrace Bio-Labs, Inc44904
Pakiety krzemionkoweVWR100489-246
Płytka jednodołkowaThermoFisher/Nalge Nunc242811
Octan sodu (3M, pH 5,5)Pożywka Millipore-Sigma71196
TB (Terrific Broth)Millipore-SigmaT0918
TrisIBI IB70144
Triton X-100Millipore-SigmaT8787
TryptonMillipore-SigmaT7293
Tween 20Millipore-SigmaP9416
Ekstrakt drożdżowyMillipore-SigmaY1625
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
>UdogodnieniaMaker/ model
Programowalny inkubator chłodzącyInkubator Torrey Pines IN30 z wytrząsarką chłodzącą
do rozwoju bakteriiWytrząsarka
Kolektor próżniowy z pułapką na odpadypłynne MultiScreenVacuum Manifold 96 well
96 well autopippetor/cieczGenmate lub Biomek FX
Dozownik cieczyMikromacierz DNA Wellmate
Genetix QArray2
Automatyczna stacja hybrydyzującaTecan HS4800 Pro Skaner
mikromacierzyTecan PowerScanner
Kwantyfikacja danych z mikromacierzyTecan Array-ProAnalyzer 6.3
bakteriologiczny Fosfataza białkowa naukowejATR Multitron

Bibliografia

  1. Melnikova, I., Golden, J. Targeting protein kinases. Nature Review Drug Discovery. 3 (12), 993-994 (2004).
  2. Patterson, H., Nibbs, R., McInnes, I., Siebert, S. Protein kinase inhibitors in the treatment of inflammatory and autoimmune diseases. Clinical and Experimental Immunology. 176 (1), 1-10 (2014).
  3. Wu, P., Nielsen, T. E., Clausen, M. H. FDA-approved small-molecule kinase inhibitors. Trends Pharmacological Sciencies. 36 (7), 422-439 (2015).
  4. Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nature Medicine. 2 (5), 561-566 (1996).
  5. Heinrich, M. C., et al. Inhibition of c-kit receptor tyrosine kinase activity by STI 571, a selective tyrosine kinase inhibitor. Blood. 96 (3), 925-932 (2000).
  6. Stagno, F., et al. Imatinib mesylate in chronic myeloid leukemia: frontline treatment and long-term outcomes. Expert Review Anticancer Therapy. 16 (3), 273-278 (2016).
  7. Ben Ami, E., Demetri, G. D. A safety evaluation of imatinib mesylate in the treatment of gastrointestinal stromal tumor. Expert Opinions in Drug Safety. 15 (4), 571-578 (2016).
  8. Ramachandran, N., et al. Self-assembling protein microarrays. Science. 305 (5680), 86-90 (2004).
  9. Festa, F., et al. Robust microarray production of freshly expressed proteins in a human milieu. Proteomics Clinical Applications. 7 (5-6), 372-377 (2013).
  10. Yazaki, J., et al. Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (29), E4238-E4247 (2016).
  11. Rauf, F., et al. Ibrutinib inhibition of ERBB4 reduces cell growth in a WNT5A-dependent manner. Oncogene. 37 (17), 2237-2250 (2018).
  12. Anderson, K. S., et al. Protein microarray signature of autoantibody biomarkers for the early detection of breast cancer. Journal of Proteome Research. 10 (1), 85-96 (2011).
  13. Wang, J., et al. Plasma Autoantibodies Associated with Basal-like Breast Cancers. Cancer Epidemiol Biomarkers Prevention. 24 (9), 1332-1340 (2015).
  14. Bian, X., et al. Tracking the Antibody Immunome in Type 1 Diabetes Using Protein Arrays. Journal of Proteome Research. 16 (1), 195-203 (2017).
  15. Song, L., et al. Identification of Antibody Targets for Tuberculosis Serology using High-Density Nucleic Acid Programmable Protein Arrays. Molecular and Cellular Proteomics. 16 (4 suppl 1), S277-S289 (2017).
  16. Wang, J., et al. Comparative Study of Autoantibody Responses between Lung Adenocarcinoma and Benign Pulmonary Nodules. Journal of Thoracic Oncology. 11 (3), 334-345 (2016).
  17. Montor, W. R., et al. Genome-wide study of Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein immunogenicity using self-assembling protein microarrays. Infection and Immunity. 77 (11), 4877-4886 (2009).
  18. Tang, Y., Qiu, J., Machner, M., LaBaer, J. Discovering Protein-Protein Interactions Using Nucleic Acid Programmable Protein Arrays. Current Protocols in Cell Biology. 74, 11-15 (2017).
  19. Yu, X., et al. Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (click chemistry)-based detection of global pathogen-host AMPylation on self-assembled human protein microarrays. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (11), 3164-3176 (2014).
  20. Anderson, K. S., et al. Autoantibody signature for the serologic detection of ovarian cancer. Journal of Proteome Research. 14 (1), 578-586 (2015).
  21. Woyach, J. A., Johnson, A. J., Byrd, J. C. The B-cell receptor signaling pathway as a therapeutic target in CLL. Blood. 120 (6), 1175-1184 (2012).
  22. Smith, M. R. Ibrutinib in B lymphoid malignancies. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 16 (12), 1879-1887 (2015).
  23. Festa, F., Steel, J., Bian, X., Labaer, J. High-throughput cloning and expression library creation for functional proteomics. Proteomics. 13 (9), 1381-1399 (2013).
  24. Seiler, C. Y., et al. DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research. Nucleic Acids Research. 42, D1253-D1260 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

macierze NAPPAwysokoprzepustowe przesiewanietest aktywno ci kinazytranskrypcja in vitrosystem ekspresji bia ekidentyfikacja celu terapeutycznegofosforylacja bia ekkwantyfikacja sygna u
Badania przesiewowe inhibitorów kinaz w samoorganizujących się mikromacierzach białek ludzkich
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.