Artykuł metodologiczny

Analiza zawartości kropelek lipidów w drożdżach rozszczepialnych i pączkujących przy użyciu zautomatyzowanego przetwarzania obrazu

DOI:

10.3791/59889

⸱

17 lipca 2019

 ,  ,  , 
1Faculty of Science, Charles University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy implementację MATLAB automatycznego wykrywania i ilościowego opisu kropelek lipidów w obrazach mikroskopii fluorescencyjnej rozszczepienia i pączkowania komórek drożdży.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metabolizm lipidów i jego regulacja są przedmiotem zainteresowania zarówno podstawowych, jak i stosowanych nauk przyrodniczych oraz biotechnologii. W związku z tym różne gatunki drożdży są wykorzystywane jako modele w badaniach metabolizmu lipidów lub do przemysłowej produkcji lipidów. Kropelki lipidów są wysoce dynamicznymi ciałami spichrzowymi, a ich zawartość komórkowa stanowi wygodny odczyt stanu metabolicznego lipidów. Mikroskopia fluorescencyjna jest metodą z wyboru do analizy ilościowej kropelek lipidów komórkowych, ponieważ opiera się na powszechnie dostępnym sprzęcie i umożliwia analizę pojedynczych kropelek lipidów. Co więcej, mikroskopową analizę obrazu można zautomatyzować, co znacznie zwiększa ogólną wydajność analizy. W tym miejscu opisujemy eksperymentalny i analityczny proces automatycznego wykrywania i ilościowego opisu pojedynczych kropelek lipidów w trzech różnych modelowych gatunkach drożdży: drożdżach rozszczepialnych Schizosaccharomyces pombe i Schizosaccharomyces japonicus oraz pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Kropelki lipidów są wizualizowane za pomocą BODIPY 493/503, a nieprzepuszczalny dla komórek dekstran fluorescencyjny jest dodawany do pożywki hodowlanej, aby pomóc w identyfikacji granic komórkowych. Komórki są poddawane mikroskopii epifluorescencyjnej 3D w kanałach zielonym i niebieskim, a uzyskane obrazy z-stack są przetwarzane automatycznie przez potok MATLAB. Procedura generuje bogate dane ilościowe dotyczące zawartości kropelek lipidów w komórkach i charakterystyki poszczególnych kropelek lipidów w formacie tabelarycznym odpowiednim do dalszych analiz w głównych arkuszach kalkulacyjnych lub pakietach statystycznych. Przedstawiamy przykładowe analizy zawartości kropelek lipidów w różnych warunkach, które wpływają na komórkowy metabolizm lipidów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipidy odgrywają kluczową rolę w metabolizmie energii komórkowej i węgla, syntezie składników błony i produkcji substancji bioaktywnych. Metabolizm lipidów jest precyzyjnie dostrojony w zależności od warunków środowiskowych, dostępności składników odżywczych i fazy cyklu komórkowego1. U ludzi metabolizm lipidów jest powiązany z chorobami, takimi jak otyłość, cukrzyca typu II i rak2. W przemyśle lipidy wytwarzane przez mikroorganizmy, takie jak drożdże, stanowią obiecujące źródło odnawialnych olejów napędowych3. Komórki przechowują obojętne lipidy w tak zwanych kropelkach lipidowych (LD). Te ewolucyjnie zachowane ciała składają się z triacylogliceroli, estrów sterylowych, zewnętrznej monowarstwy fosfolipidowej i powiązanych białek1. LD pochodzą z retikulum endoplazmatycznego, wywierają dynamikę cyklu komórkowego lub fazy wzrostu i są ważne dla homeostazy lipidów komórkowych1. Liczba LD i morfologia mogą być używane jako wygodne wskaźniki zastępcze podczas oznaczania metabolizmu lipidów w różnych warunkach wzrostu lub podczas badań przesiewowych panelu mutantów. Ze względu na ich dynamiczny charakter, techniki zdolne do analizy właściwości poszczególnych LD są szczególnie interesujące w badaniach metabolizmu lipidów.

Różne gatunki drożdży były używane do opisywania szlaków metabolicznych związanych z lipidami i ich regulacji, lub używane w biotechnologii do produkcji interesujących związków lub paliw1. Ponadto dla drożdży modelowych, takich jak pączkujące drożdże Saccharomyces cerevisiae lub daleko spokrewnione drożdże rozszczepialne Schizosaccharomyces pombe, dostępne są biblioteki szczepów delecyjnych całego genomu, które można wykorzystać do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości4,5. Ostatnio skład i dynamika LD zostały opisane w S. pombe6,7,8,9, a mutanty związane z metabolizmem lipidów zostały wyizolowane w powstającym modelu drożdży Schizosaccharomyces japonicus10.

Liczne techniki są dostępne do badania treści i dynamiki LD. Większość z nich stosuje jakiś rodzaj barwienia LD barwnikami lipofilowymi, takimi jak czerwień nilowa lub BODIPY 493/503. Ten ostatni wykazuje węższe widma wzbudzenia i emisji oraz zwiększoną specyficzność w stosunku do neutralnych lipidów (LD) w przeciwieństwie do fosfolipidów (błon)11. Metody fluorymetryczne i cytometrii przepływowej są z powodzeniem stosowane u różnych gatunków grzybów w celu odkrycia genów i warunków wzrostu, które wpływają na zawartość lipidów magazynujących12,13,14,15. Chociaż metody te są odpowiednie do zastosowań o wysokiej przepustowości, nie mogą mierzyć liczby i morfologii poszczególnych LD w komórkach, które mogą się znacznie różnić w zależności od warunków wzrostu i genotypów. Koherentne rozpraszanie Ramana lub cyfrowa mikroskopia holograficzna to metody bez etykiet, które dają dane na poziomie LD, ale wymagają specjalistycznego, drogiego sprzętu16,17,18. Z drugiej strony mikroskopia fluorescencyjna może dostarczyć szczegółowych danych na temat zawartości LD, wykorzystując powszechnie dostępne instrumenty i narzędzia do analizy obrazu. Istnieje kilka procedur analizy, które charakteryzują się różnym stopniem zaawansowania i automatyzacji wykrywania komórek/LD na podstawie danych obrazowych i są zoptymalizowane pod kątem różnych typów komórek, takich jak komórki metazoan z dużymi LDs19,20,21, lub pączkujące drożdże17,22,23. Niektóre z tych podejść działają tylko w 2D (np. na obrazach o maksymalnej projekcji), które mogą nie być w stanie wiarygodnie opisać zawartości LD w komórkach. O ile nam wiadomo, nie istnieją żadne narzędzia do oznaczania zawartości LD i morfologii na podstawie danych mikroskopowych drożdży rozszczepialnych. Opracowanie zautomatyzowanych i niezawodnych analiz na poziomie LD przyniosłoby większą czułość i zwiększoną moc statystyczną, a także dostarczyłoby bogatych informacji na temat zawartości neutralnych lipidów, najlepiej w przypadku wielu gatunków drożdży.

Opracowaliśmy przepływ pracy do analizy zawartości LD na podstawie obrazów 3D z mikroskopii fluorescencyjnej komórek drożdży. Żywe komórki są barwione BODIPY 493/503 i dekstranem Cascade Blue w celu wizualizacji LD i określenia granic komórek. Komórki są unieruchamiane na szkiełkach podstawowych i poddawane obrazowaniu z-stack przy użyciu standardowego mikroskopu epifluorescencyjnego. Obrazy są następnie przetwarzane przez zautomatyzowany potok zaimplementowany w MATLAB, szeroko stosowanym (komercyjnym) pakiecie do analiz statystycznych. Potok wykonuje wstępne przetwarzanie obrazu, segmentację (komórki vs. tło, usuwanie martwych komórek) i identyfikację LD. Bogate dane na poziomie LD, takie jak rozmiar LD i intensywność fluorescencji, są następnie dostarczane w formacie tabelarycznym zgodnym z głównymi narzędziami oprogramowania do obsługi arkuszy kalkulacyjnych. Przepływ pracy został z powodzeniem wykorzystany do określenia wpływu dostępności źródła azotu na metabolizm lipidów w S. pombe24. Teraz demonstrujemy funkcjonalność przepływu pracy u S. pombe, S. japonicus i S. cerevisiae, wykorzystując warunki wzrostu lub mutanty, które wpływają na zawartość LD w komórkach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie rozwiązań i mediów

  1. Przygotuj roztwór do barwienia lipidów.
    1. W celu przygotowania podstawowego roztworu do barwienia lipidów rozpuścić 10 mg BODIPY 493/503 w 10 ml bezwodnego DMSO (stężenie końcowe 1 mg/ml). Rozpuścić całą zawartość fiolki 10 mg BODIPY 493/503, aby zapobiec utracie materiału podczas ważenia.
      ostrożność: DMSO może przenikać przez skórę. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
    2. Przygotować roboczy roztwór do barwienia lipidów, mieszając 100 μl roztworu podstawowego BODIPY 493/503 o stężeniu 1 mg/ml i 900 μl bezwodnego DMSO (stężenie końcowe 0,1 mg/ml).
    3. Roztwory podstawowe i robocze należy rozdzielić i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      nuta: Rozpuszczony BODIPY 493/503 jest stabilny przez kilka lat w temperaturze -20 °C. Roztwór należy jednak chronić przed wilgocią i światłem.
  2. Aby przygotować roztwór podstawowy do wizualizacji granic komórek, rozpuść 25 mg dekstranu Cascade Blue (cała fiolka) w 2,5 ml wody dejonizowanej (końcowe stężenie 10 mg/ml). Porcjować roztwór podstawowy i przechowywać w temperaturze -20 °C, chronić przed światłem.
  3. Aby przygotować roztwór powlekający szkiełko mikroskopowe, rozpuść 5 mg lektyny sojowej w 5 ml wody dejonizowanej (stężenie końcowe 1 mg/ml). Roztwór lektyny należy rozdzielić i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    nuta: Roztwór lektyny jest stabilny przez kilka lat w temperaturze -80 °C. Obecnie stosowane porcje mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.
  4. Przygotuj podłoże uprawowe.
    1. Aby przygotować 400 ml złożonego podłoża hodowlanego YES dla S. pombe i S. japonicus, rozpuść 2 g ekstraktu drożdżowego i 0,1 g suplementów SP (jeśli jest to wymagane dla mutantów auksotroficznych) w 340 ml wody dejonizowanej w butelce o pojemności 500 ml i autoklawie. Dodać 60 ml 20% (w/v) oddzielnie sterylizowanej w autoklawie lub sterylizowanej przez filtr glukozy w warunkach aseptycznych.
    2. Aby przygotować 400 ml określonego podłoża hodowlanego EMM dla S. pombe i S. japonicus, rozpuść 4,9 g bulionu EMM bez dekstrozy w 360 ml wody dejonizowanej w butelce o pojemności 500 ml i przeprowadź autoklaw. Dodać 40 ml 20% (w/v) oddzielnie sterylizowanej w autoklawie lub sterylizowanej filtrem glukozy w warunkach aseptycznych.
      nuta: Ogólne wytyczne dotyczące uprawy S. pombe i S. japonicus można znaleźć odpowiednio w 25 i 26.
    3. Aby przygotować 300 ml złożonego podłoża hodowlanego YPAD dla Saccharomyces cerevisiae, rozpuść 3 g ekstraktu drożdżowego, 6 g peptonu i 30 mg siarczanu adeniny w 270 ml wody dejonizowanej w butelce o pojemności 500 ml i autoklawie. Dodać 30 ml 20% (w/v) oddzielnie sterylizowanej w autoklawie lub sterylizowanej przez filtr glukozy w warunkach aseptycznych.
    4. Aby przygotować 300 ml określonej minimalnej pożywki dla S. cerevisiae, rozpuść 2 g zasady azotowej drożdży (bez aminokwasów) w 270 ml wody dejonizowanej w butelce o pojemności 500 ml i przeprowadź autoklaw. Dodać 30 ml 20% (w/v) oddzielnie sterylizowanej w autoklawie lub sterylizowanej przez filtr glukozy w warunkach aseptycznych.
      nuta: Ogólne wytyczne dotyczące uprawy S. cerevisiae można znaleźć na stronie27.

2. Hodowla komórek

  1. Uprawa S. pombe lub S. japonicus do fazy wykładniczej lub wczesnej stacjonarnej.
    1. Rano zaszczepić 5 ml pożywki YES świeżą biomasą drożdży rozszczepialnych. Inkubować w temperaturze 32 °C z wytrząsaniem (180 obr./min) przez kilka godzin.
      nuta: Do wszystkich upraw należy używać kolb Erlenmeyera o 10-krotnie większej objętości kultury, aby zapewnić prawidłowe napowietrzenie. Niektóre laboratoria preferują hodowlę drożdży rozszczepialnych w temperaturze 30 °C, ale temperatura hodowli 32 °C powoduje skrócenie czasu podwajania bez szkodliwego wpływu na komórki, skracając w ten sposób całkowity czas potrzebny do przeprowadzenia eksperymentu25,28.
    2. Późnym popołudniem tego samego dnia (po co najmniej 6 godzinach uprawy) rozcieńczyć kulturę świeżym podłożem YES do 10 ml końcowej objętości hodowli, tak aby osiągnęła pożądaną gęstość optyczną (OD) (lub liczbę komórek/ml) następnego ranka, a następnie inkubować w temperaturze 32 °C z wytrząsaniem (180 obr./min). Korzystne jest poznanie czasu podwojenia każdego użytego szczepu w celu dokładnego określenia współczynnika rozcieńczenia (użyj równania 1).
      figure-protocol-1
      gdzie V kultura jest objętością prekultury potrzebną do rozcieńczenia, Vfinal jest całkowitą objętością nowej kultury (10 ml dla upraw standardowych), ODfinal jest pożądaną OD, która ma być osiągnięta następnego ranka, prąd OD jest aktualnie zmierzoną OD kultury wstępnej, t jest czasem wzrostu komórek do zbioru, tlag to czas trwania fazy opóźnienia (zależy od warunków laboratoryjnych, musi być empirycznie zdefiniowany), a tDT to czas podwojenia szczepu.
      nuta: Kiedy mają być analizowane komórki w fazie wykładniczej, nie należy dopuścić do tego, aby prekultury osiągnęły fazę stacjonarną, ponieważ radykalnie zmienia to fizjologię komórki (w tym zawartość LD) przez kilka kolejnych pokoleń.
    3. Rano w dniu obrazowania, jeśli hodowla osiągnęła nieco wyższy OD niż jest to wymagane (w przypadku komórek o fazie wykładniczej), należy ją rozcieńczyć świeżym TAK i kontynuować inkubację przez co najmniej dwa kolejne razy przed barwieniem LDs. W przeciwnym razie przejdź bezpośrednio do barwienia (sekcja 3).
  2. Uprawa S. cerevisiae do fazy wykładniczej i stacjonarnej.
    1. Po południu zaszczepić 10 ml pożywki YPAD niewielką ilością świeżej biomasy drożdży pączkujących i inkubować przez noc w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem (180 obr./min).
    2. Rano w dniu obrazowania rozcieńczyć kulturę do OD 0,1 w 10 ml pożywki YPAD i wyhodować do wymaganego OD (np. OD 1 dla fazy wykładniczej). Wykonać dowolne rozcieńczenia kultur zgodnie z opisem w kroku 2.1.2. Przejdź do barwienia (sekcja 3).

3. Barwienie kropelkami lipidów

  1. Przygotuj szkiełko nakrywkowe mikroskopu dla każdej próbki, która ma być zobrazowana. Rozprowadzić 1 μl szkiełka powlekającego na czystym szkiełku nakrywkowym, używając dłuższego boku poziomo umieszczonej końcówki pipety. Poczekaj, aż roztwór powlekający całkowicie wyschnie i przechowuj szkiełka nakrywkowe w środowisku wolnym od kurzu.
    nuta: Szkiełka podstawowe i nakrywkowe można w razie potrzeby wyczyścić przed użyciem. Procedura czyszczenia polega na umyciu płynem do mycia naczyń, spłukaniu wodą, namoczeniu przez noc w 3% kwasie solnym i umyciu wodą destylowaną. Oczyszczone szkiełka podstawowe i nakrywkowe są przechowywane w czystym etanolu do czasu użycia.
  2. Zmierz OD hodowli komórkowej lub liczbę komórek/ml, zgodnie z wymaganiami. Postaraj się osiągnąć podobne wartości wśród wszystkich badanych szczepów, aby zapewnić porównywalne warunki eksperymentalne.
  3. Odpipetować 1 ml każdej kultury komórkowej do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Tylko w przypadku S. cerevisiae dodać 5 μl roztworu do powlekania szkiełka, krótko zwirować i inkubować w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przez 5 minut.
  4. Dodać 1 μl roztworu do barwienia lipidów do każdej podwielokrotności kultury i krótko przetrząsnąć. Następnie dodać 10 μl roztworu do wizualizacji granic komórek i krótko odwirować.
    nuta: Nie należy przygotowywać wstępnie zmieszanych roztworów obu plam, ponieważ prowadzi to do wygaszania fluorescencji BODIPY 493/503.
  5. Zebrać komórki przez odwirowanie (1 000 x g, 3 min, RT) i usunąć prawie cały supernatant (~950 μL). Zawiesić komórki w pozostałym supernatancie.
  6. Pobrać pipetę 2 μl gęstej zawiesiny komórek na szkiełko nakrywkowe pokryte lektyną i umieścić na czystym szkiełku mikroskopowym. Komórki powinny tworzyć monowarstwę. Przystąp do mikroskopii (sekcja 4) tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować artefakty w obrazowaniu; przetwarzać maksymalnie dwie próbki jednocześnie.

4. Konfiguracja mikroskopu i obrazowania

  1. Zoptymalizuj warunki obrazowania.
    UWAGA:     Ustawienie mikroskopu wymaga długiej ekspozycji na silne źródła światła, które mogą spowodować uszkodzenie próbki i zniekształcenie wyników. W związku z tym należy skonfigurować warunki obrazowania za pomocą dedykowanego szkiełka do próbki, które nie będzie dalej wykorzystywane do oznaczania ilościowego LD.
    1. Skoncentruj się na komórkach za pomocą kontrastu fazowego lub różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC).
      nuta: Obrazy kontrastu fazowego lub DIC mogą być wykonywane w celach informacyjnych, ale nie są one używane na etapie automatycznej analizy obrazu.
    2. Ustaw ustawienia stosu z tak, aby obejmowały cały wolumin komórki. Całkowita odległość w pionie zależy od rozmiaru komórki; Liczba warstw optycznych zależy od apertury numerycznej obiektywu (funkcja rozproszenia punktów w osi Z). Ustaw ostrość tak, aby poruszała się względem centralnej płaszczyzny ogniskowej.
      nuta: Optymalna liczba plastrów jest często ustawiana przez oprogramowanie sterujące mikroskopem i nie trzeba jej obliczać ręcznie. Typowe szerokości komórek wynoszą 3-5 μm dla S. pombe, 4-7 μm dla S. japonicus i 3-7 μm dla S. cerevisiae.
    3. Aby zobrazować LD, ustaw natężenie światła i czas ekspozycji w kanale zielonym (maksima wzbudzenia i emisji BODIPY wynoszą odpowiednio 493 i 503 nm).
      nuta: BODIPY 493/503 jest bardzo jasnym fluorochromem; Może jednak szybko ulec wybieleniu przy zbyt dużym natężeniu światła. Co więcej, LD są mobilne w żywych komórkach, co minimalizuje czas ekspozycji i najpierw przechwytuje cały stos z-kanału zielonego (przed przełączeniem na kanał niebieski), aby zapobiec artefaktom rozmycia. Weź również pod uwagę liniowy zakres kamery dla intensywności sygnału, aby uniknąć nasyconych pikseli.
    4. Aby zobrazować granice komórek, ustaw natężenie światła i czas ekspozycji w kanale niebieskim (maksima wzbudzenia i emisji dekstranu Cascade Blue wynoszą odpowiednio 400 i 420 nm).
      nuta: Natężenie sygnału w kanale niebieskim jest wymagane do segmentacji obrazu, ale nie jest używane do samej kwantyfikacji LD. Dlatego optymalne ustawienia w tym kanale nie są kluczowe dla analizy.
    5. Jeśli to możliwe, utwórz zautomatyzowany eksperymentalny przepływ pracy w oprogramowaniu sterującym mikroskopem, aby ułatwić obrazowanie wielu próbek w standardowych warunkach.
  2. Po zoptymalizowaniu warunków obrazowania, próbki obrazu, które zostaną wykorzystane do oceny ilościowej. Skoncentruj się na komórkach i zobrazuj je w kanałach zielonym i niebieskim, zgodnie z opisem w kroku 4.1.
    nuta: Wszystkie obrazy muszą być uzyskane przy użyciu tych samych ustawień, aby umożliwić porównanie między próbkami. Obrazuj wiele pól widzenia dla każdej próbki, aby uzyskać solidne, reprezentatywne dane.
  3. Zapisz obrazy z-stack z kanałem niebieskim i zielonym jako 16-bitowe wielowarstwowe pliki TIFF (tj. dwa pliki na pole widzenia). Dołącz słowa "zielony" lub "niebieski" w odpowiednich nazwach plików. Kontynuuj analizę obrazu (sekcja 5).

5. Analiza obrazu

  1. Sprawdź wizualnie jakość pozyskanych obrazów.
    1. Otwórz obrazy mikroskopowe w ImageJ29,30 lub innym odpowiednim oprogramowaniu do analizy obrazu.
    2. Usuń wszystkie stosy obrazów zawierające znaczną liczbę komórek, które poruszały się podczas akwizycji (a tym samym tworzyły artefakty rozmycia).
    3. Usuń wszelkie stosy obrazów zawierające wysoce fluorescencyjne cząstki niekomórkowe w kanale niebieskim (np. brud na szkiełku mikroskopowym lub szkiełku nakrywkowym, zanieczyszczenia w podłożu uprawowym).
      nuta: Bardzo jasne obiekty niebędące komórkami w kanale niebieskim mogą tworzyć artefakty wykrywania komórek lub mogą zakłócać wykrywanie komórek w ich pobliżu.
    4. Usuń wszystkie stosy obrazów zawierające dużą część martwych komórek (tj. komórek o zwiększonej niebieskiej fluorescencji w porównaniu z żywymi komórkami).
      nuta: Podczas gdy obecność niewielkiej części martwych komórek w próbce zazwyczaj nie stanowi problemu, a komórki te są automatycznie odrzucane podczas analizy, niektóre martwe lub umierające komórki mogą czasami zostać rozpoznane jako żywe komórki przez algorytm segmentacji, a tym samym zniekształcić zgłoszone wyniki.
  2. Analizuj obrazy w oprogramowaniu MATLAB.
    1. Utwórz folder główny i skopiuj wszystkie skrypty MATLAB do tej lokalizacji.
    2. Utwórz podfolder ("pombe", "cerevisiae" lub "japonicus") i skopiuj wejściowe pliki obrazów TIFF do tej lokalizacji.
    3. Uruchom MATLAB, otwórz skrypt MAIN.m i uruchom go. W menu wybierz gatunki drożdży do analizy i rozpocznij przetwarzanie obrazu.
      nuta: Niektóre parametry wymagane do detekcji komórek i LD są wstępnie ustawione dla poszczególnych gatunków, inne są określane automatycznie podczas przetwarzania obrazu. Wstępnie ustawione wartości zostały określone empirycznie i zależą od kilku czynników, takich jak powiększenie obiektywu, typ i czułość kamery oraz ustawienia obrazowania. W razie potrzeby użytkownicy mogą edytować pliki skryptów, aby zmienić ustawienia wstępne specyficzne dla organizmu, aby lepiej odzwierciedlić ich eksperymentalną konfigurację. Mianowicie, podczas rozpoznawania komórek dopuszczalne rozmiary obiektów są podane przez parametry "minArea" i "maxArea", a minimalny udział wypełnionej objętości w granicach obiektu jest określony przez parametr "Solidity". Dla rozpoznania LD próg jasności jest podawany przez parametr "th" (na jego wartość wpływa przede wszystkim głębia bitowa obrazu i natężenie sygnału fluorescencji), a maksymalny dopuszczalny rozmiar LD jest podawany przez parametr "MaxArea".
    4. Sprawdź i przetwórz pliki wyjściowe zgodnie z wymaganiami za pomocą edytora arkuszy kalkulacyjnych lub pakietu statystycznego; przepływ pracy tworzy pliki CSV rozdzielone średnikami oraz segmentowane pliki TIFF z wykrytymi obiektami komórek i LDs.
      nuta: Obieg pracy dzieli obrazy na obiekty tła i komórki, przy czym każdy obiekt komórki może składać się z wielu sąsiadujących komórek. W związku z tym dane wyjściowe w plikach "xxxx_cells.csv" nie reprezentują danych jednokomórkowych i powinny być używane tylko do obliczania metryk na jednostkę woluminu komórki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cała procedura jest podsumowana w Rysunek 1 dla drożdży rozszczepiających (proces pączkowania drożdży jest analogiczny), a poniżej podajemy przykłady jak można wykorzystać przepływ pracy do badania zawartości LD w trzech różnych gatunkach drożdży w różnych warunkach, o których wiadomo, że wpływają na zawartość LD w komórkach. Każdy przykład reprezentuje pojedynczy eksperyment biologiczny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie metabolizmu lipidów i jego regulacji jest ważne zarówno dla podstawowej biologii, jak i zastosowań klinicznych i biotechnologicznych. Zawartość LD stanowi wygodny odczyt stanu metabolizmu lipidów w komórce, a mikroskopia fluorescencyjna jest jedną z głównych metod stosowanych do oznaczania zawartości LD. Przedstawiony protokół pozwala na zautomatyzowane wykrycie i ilościowy opis poszczególnych LD w trzech różnych i morfologicznie odrębnych gatunkach drożdży. O ile nam wiadomo, nie istnieją podobne narzędzia d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty Uniwersytetu Karola PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 i SVV 260310. Dziękujemy Ondřejowi Šebestie za pomoc w mikroskopii i opracowaniu procesu analizy obrazu. Dziękujemy laboratorium ReGenEx za szczepy S. cerevisiae oraz laboratorium JapoNet i Hironori Niki za szczepy S. japonicus. Szczep ppc1-88 został dostarczony przez The Yeast Genetic Resource Center Japan. Mikroskopię wykonano w Laboratorium Mikroskopii Konfokalnej i Fluorescencyjnej współfinansowanym ze środków Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego i budżetu państwa Republiki Czeskiej (nr projektu). CZ.1.05/4.1.00/16.0347 oraz CZ.2.16/3.1.00/21515).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
12-bitowa monochromatyczna kamera CCD Hamamatsu ORCA C4742-80-12AGHamamatsu lub równoważne
Sól półsiarczanu adeniny, ≥ 99%MerckA9126-25G 
BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene)Thermo Fisher ScientificD3922do barwienia obojętnymi lipidami
D-(+) - Glukoza, ≥ 99.5%MerckG7021 
Dekstran, Cascade Blue, 10 000 MW, Anionowy, Lizyna FixableThermo Fisher ScientificD1976do ujemnego barwienia komórek
Dimetylosulfotlenek, ≥ 99,5%MerckD4540lub wyższej czystości, utrzymuj bezwodny na sitach molekularnych
Rosół EMM bez dekstrozyFormediumPMD0405pożywkę można również przygotować z poszczególnych składników
Oprogramowanie Fiji/ImageJNIH lub równoważny; do kontroli wzrokowej danych mikroskopowych
Szkła nakrywkowe o wysokiej precyzji, 22 mm x 22 mm, nr 1.5VWR630-2186użyj dowolnego szkła osłonowego # 1.5
Image Processing Toolbox dla MATLAB, wersja 10.0Mathworks  
Lektyna z Glycine max (soja)MerckL1395do unieruchamiania komórek na preparatach
Oprogramowanie MATLAB, wersja 9.2Mathworks  
Szkiełko mikroskopowe, 26 mm x 76 mm, grubość 1 mmKnittel GlassL762601.2użyj dowolnego szkiełka mikroskopowego pasującego do stolika mikroskopu, dokładnie wyczyść przed załadowaniem komórek
Mikroskop Olympus CellR z automatycznym ruchem obiektywu w osi ZOlympus lub równoważne
Zestaw filtrów PentabandSemrockF66-985jasne pole, kanały zielony i niebieski są wystarczające
Signal Processing Toolbox dla MATLAB, wersja 7.4Mathworks  
SP suplementyFormediumPSU0101 
Standardowy komputer biurowy z możliwością uruchomienia MATLAB   
Zestaw narzędzi do statystyki i uczenia maszynowego dla MATLAB, wersja 11.1Mathworks  
Uniwersalny pepton M66 do mikrobiologiiMerck1070431000 
Obiektyw UPLSAPO 60XOOlympus lub równoważne
Ekstrakt drożdżowyFormediumYEA03 
Drożdżowa baza azotowa bez aminokwasówFormediumCYN0405 

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).
  2. Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
  3. Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica. Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).
  4. Kim, D. U., et al. Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).
  5. Giaever, G., Nislow, C. The yeast deletion collection: a decade of functional genomics. Genetics. 197 (2), 451-465 (2014).
  6. Meyers, A., et al. The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe. Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).
  7. Meyers, A., et al. Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe. Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).
  8. Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).
  9. Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival. Biology Open. , 8(2016).
  10. Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus. Genes To Cells: Devoted To Molecular & Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).
  11. Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins. Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).
  12. Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PloS One. 5 (10), e13692(2010).
  13. Sitepu, I. R., et al. An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species. Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).
  14. Rostron, K. A., Lawrence, C. L. Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).
  15. Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).
  16. Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. Quantitative imaging of lipid droplets in single cells. The Analyst. , (2018).
  17. Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries. Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).
  18. Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy. Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).
  19. Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene. BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).
  20. Schnitzler, J. G., et al. Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy. Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).
  21. Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., Wählby, C. Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models. Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).
  22. Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant’Anna, C. Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production. Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).
  23. Lv, X., et al. Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis. Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).
  24. Zach, R., Tvarůžková, J., Schätz, M., Ťupa, O., Grallert, B., Převorovský, M. Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism “cut” mutants are suppressed by ammonium chloride. FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).
  25. Petersen, J., Russell, P. Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).
  26. Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).
  27. Curran, B. P. G., Bugeja, V. Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).
  28. Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).
  29. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  30. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  31. Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA. Open Biology. 2 (9), 120117(2012).
  32. Furuya, K., Niki, H. Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus. Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).
  33. Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
  34. Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).
  35. Graml, V., et al. A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression. Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza kropel lipidowychmetabolizm lipid w dro d ymikroskopia fluorescencyjnadro d e rozdzielaj ce sidro d e p czkuj cebarwienie BODIPYanaliza obrazu w programie MATLABobrazowanie w stosie Z Z stackkwantyfikacja zapas w lipid w

Powiązane artykuły