Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wyprowadzanie i leczenie guza z pierwotnych komórek nowotworowych wyizolowanych z mięsaków prążkowanokomórkowych myszy

6.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59897

⸱

13 września 2019

 , 
1Graduate School of Biomedical Sciences, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 2Development, Aging and Regeneration Program, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 3Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Sciences, Division of Female Pelvic Medicine and Reconstructive Surgery, University California San Diego

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje powtarzalną metodę izolacji komórek pierwotnych mięsaka prążkowanokomórkowego u myszy, tworzenia i leczenia guza oraz przeszczepu allogenicznego, zaczynając od hodowli guzów.

Streszczenie

Mięsak prążkowanokomórkowy (RMS) jest najczęstszym mięsakiem tkanek miękkich u dzieci. Chociaż znaczne wysiłki umożliwiły identyfikację powszechnych mutacji związanych z RMS i umożliwiły rozróżnienie różnych podtypów RMS, nadal istnieją poważne wyzwania związane z opracowaniem nowych metod leczenia w celu dalszej poprawy rokowania. Chociaż zidentyfikowano go na podstawie ekspresji markerów miogennych, nadal istnieją poważne kontrowersje co do tego, czy RMS ma pochodzenie miogenne czy niemiogenne, ponieważ komórka pochodzenia jest nadal słabo poznana. W niniejszym badaniu przedstawiono wiarygodną metodę oznaczania guza dla myszy RMS. Test opiera się na właściwościach funkcjonalnych komórek nowotworowych i umożliwia identyfikację rzadkich populacji w guzie o funkcjach rakotwórczych. Opisano również procedury testowania białek rekombinowanych, integracji protokołów transfekcji z testem guza oraz oceny genów kandydujących zaangażowanych w rozwój i wzrost guza. Dalej opisano procedurę przeszczepu allogenicznego guzów myszom biorcom w celu potwierdzenia funkcji nowotworowej in vivo. Ogólnie rzecz biorąc, opisana metoda pozwala na wiarygodną identyfikację i badanie rzadkich populacji rakotwórczych RMS, które można zastosować do RMS powstających w różnych kontekstach. Wreszcie, protokół może być wykorzystany jako platforma do badań przesiewowych leków i przyszłego rozwoju środków terapeutycznych.

Wprowadzenie

Rak jest chorobą niejednorodną; ponadto, ten sam typ nowotworu może wykazywać różne mutacje genetyczne u różnych pacjentów, a u jednego pacjenta guz składa się z wielu populacji komórek1. Heterogeniczność stanowi wyzwanie w identyfikacji komórek odpowiedzialnych za inicjowanie i rozprzestrzenianie się raka, ale ich charakterystyka jest niezbędna do opracowania skutecznych metod leczenia. Pojęcie komórek rozmnażających się nowotwory (TPC), rzadkiej populacji komórek, które przyczyniają się do rozwoju nowotworu, było wcześniej szeroko analizowane2. Pomimo faktu, że TPC zostały scharakteryzowane w wielu typach nowotworów, identyfikacja markerów do ich niezawodnej izolacji pozostaje wyzwaniem dla kilku typów nowotworów3,4,5,6,7,8,9. Tak więc metoda, która nie opiera się na markerach molekularnych, ale raczej na właściwościach funkcjonalnych TPC (wysoka samoodnowa i zdolność do wzrostu w warunkach niskiego przyłączenia), znana jako test tworzenia się guza, może być szeroko stosowana do identyfikacji TPC z większości nowotworów. Co ważne, test ten może być również wykorzystany do ekspansji TPC, a tym samym bezpośrednio zastosowany do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych i badań nad opornością na raka1,10.

Mięsak prążkowanokomórkowy (RMS) to rzadka forma mięsaka tkanek miękkich, najczęściej występująca u małych dzieci11. Chociaż RMS można zidentyfikować histologicznie poprzez ocenę ekspresji markerów miogennych, komórka RMS, z której pochodzi, nie została jednoznacznie scharakteryzowana ze względu na wiele podtypów guza i wysoką heterogeniczność bodźców rozwojowych guza. Rzeczywiście, ostatnie badania wywołały znaczącą dyskusję naukową na temat tego, czy RMS jest pochodzenia miogennego czy niemiogennego, co sugeruje, że RMS może pochodzić z różnych typów komórek w zależności od kontekstu12,13,14,15,16,17. Przeprowadzono liczne badania na liniach komórkowych RMS z wykorzystaniem testu tworzenia nowotworów w celu identyfikacji szlaków zaangażowanych w rozwój guza i charakterystyki markerów związanych z populacjami o wysokim stopniu samoodnawiania się18,19,20,21.

Jednakże, pomimo potencjału testu tworzenia się guza do identyfikacji komórek RMS pochodzenia, nie opisano jeszcze niezawodnej metody, która może być zastosowana na pierwotnych komórkach RMS. W tym kontekście, w niedawnym badaniu przeprowadzonym przez naszą grupę zastosowano zoptymalizowany test tworzenia guza w celu identyfikacji komórek RMS pochodzenia w mysim modelu dystrofii mięśniowej Duchenne'a (DMD)22. Wiele typów komórek przednowotworowych, wyizolowanych z tkanek mięśniowych, jest testowanych pod kątem ich zdolności do wzrostu w warunkach niskiego przywiązania, co pozwala na identyfikację komórek macierzystych mięśni jako komórek pochodzenia RMS w kontekstach dystroficznych. Opisany tutaj jest powtarzalny i wiarygodny protokół testu tworzenia się guza (Rysunek 1), który został z powodzeniem zastosowany do identyfikacji niezwykle rzadkich populacji komórek, które są odpowiedzialne za rozwój RMS myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Hodowla, leczenie i ofiarowanie myszy zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym protokołem IACUC Instytutu Odkryć Medycznych Sanford Burnham Prebys.

1. Przygotowanie odczynnika

  1. Przygotuj 100 ml pożywki do izolacji komórek: pożywka F10 uzupełniona 10% surowicą końską (HS).
  2. Przygotować 50 ml roztworu kolagenazy typu II: rozpuścić 1 g proszku kolagenazy typu II w 50 ml pożywki do izolacji komórek (zwrócić uwagę na jednostki enzymu na 1 ml pożywki, ponieważ liczba jednostek zmienia się w zależności od partii). Roztwór należy podzielić na porcje i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C do momentu przygotowania do użycia.
    UWAGA: Każda partia kolagenazy powinna zostać przetestowana przed użyciem, ponieważ aktywność enzymu może się zmieniać w różnych partiach.
  3. Przygotować 10 ml na próbkę drugiego roztworu wytrawiającego: pożywka do izolacji komórek ze 100 jednostkami/ml roztworu kolagenazy typu II i 2 jednostki/ml świeżo ważonej dypazy II. Przygotować bezpośrednio przed użyciem.
  4. Przygotuj 500 ml pożywki z komórkami nowotworowymi: DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionej 20% FBS i 1% pióra / paciorkowca.
  5. Przygotuj 500 ml buforu FACS: 1x PBS uzupełniony 2,5% v/v normalną surowicą kozią i 1 mM EDTA.
  6. Przygotuj 500 ml pożywki nowotworowej: DMEM/F12 uzupełnionej 1% wstrzykiwaczem/paciorkowiec. Tuż przed użyciem dodaj następujące czynniki wzrostu: 1% suplement N2, 10 ng/ml EGF i 10 ng/ml β-FGF.

2. Izolacja komórek i hodowla

  1. Przygotować 10-centymetrową płytkę zawierającą 5 ml pożywki do izolacji komórek (jedna płytka na próbkę guza) i umieścić ją w inkubatorze w temperaturze 37 °C do momentu przygotowania do pobrania tkanki nowotworowej.
  2. Doniesiono, że RMS spontanicznie rozwija się zarówno u samców, jak i samic myszy z dystrofią mięśniową Duchenne'a, takich jak myszy B10 mdx w wieku około 18 miesięcy i u myszy B6 mdx/mTR w wieku 9 miesięcy22,23. Znieczulić mysz, u której rozwija się guz RMS, za pomocą izofluranu i uśmiercić zwierzę poprzez zwichnięcie szyjki macicy lub zgodnie z wytycznymi IACUC instytucji. Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie na skórze w obszarze, w którym zlokalizowany jest guz, i (za pomocą pęsety) odciągnij skórę od obszaru zainteresowania. Za pomocą żyletki wytnij guz ze zwierzęcia.
  3. Zważ 500–1000 mg tkanki nowotworowej i umieść ją na płytce przygotowanej w kroku 2.1 (Rysunek 1A).
    UWAGA: Większe ilości tkanek negatywnie wpływają na etapy trawienia i zmniejszają ogólną wydajność. Jeśli pobrany guz jest większy niż 1000 mg, podziel go na części i pobieraj losowo próbki, aż do osiągnięcia pożądanej masy. Wyrywkowe pobieranie próbek jest niezbędne do oceny niejednorodności tkanek.
  4. Umieść płytkę zawierającą tkanki nowotworowe w sterylnym kapturze do hodowli komórek i zmiel ją żyletką. Tkanka nowotworowa z RMS jest niejednorodna; W związku z tym różne obszary mogą wykazywać różną odporność na przecięcia. Upewnij się, że rozmiary powstałych kawałków mięsa są jednolite, aby zapewnić optymalne trawienie.
    UWAGA: RMS występuje jako mieszanina różnych typów tkanek (głównie tkanki zwłóknieniowej, unaczynionej i tłuszczowej), które można zidentyfikować w każdym guzie. Aby 1) wyizolować heterogeniczną populację komórek, dokładnie rekapitulując skład pierwotnego guza i 2) nie zaburzając procedury izolacji, należy wykonać losowe pobieranie próbek pobranej tkanki. Komórki z różnych obszarów guza powinny być trawione i badane równolegle in vitro w teście opisanym w punkcie 3.
  5. Przenieść zmielone tkanki i pożywkę do izolacji komórek w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml, umyć płytkę 4 ml pożywki do izolacji komórek i umieścić ją w probówce.
  6. Dodać 700 jednostek/ml roztworu kolagenazy do strawienia tkanki i inkubować w łaźni wodnej z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez 1,5 godziny.
  7. Po inkubacji odwirowywać tkankę przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant bez naruszania osadu, ponownie zawiesić osad w 10 ml drugiego roztworu do wytrawiania (dispaza) i inkubować w wytrząsającej łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  8. Po zakończeniu drugiego trawienia pipetować w górę i w dół, a następnie przepuścić zawiesinę komórkową przez nylonowy filtr 70 μm na probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Następnie dodać 10 ml pożywki do izolacji komórek, aby przemyć filtr i rozcieńczyć roztwór wytrawiający, a następnie wirować tkankę w temperaturze 300 x g i RT przez 5 minut.
  9. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 20 ml pożywki z komórek nowotworowych. Następnie przenieść zawiesinę komórkową na 15-centymetrową płytkę do hodowli komórkowej. Umieścić komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na noc. Ta tabliczka będzie oznaczona jako P0.
  10. Dzień po izolacji zmień pożywkę. Ten krok jest niezbędny, aby zapewnić usunięcie zanieczyszczeń i martwych komórek, które mogą negatywnie wpływać na przeżycie komórek.
  11. Oceń konfluencję komórek po zmianie pożywki, która waha się od 30% do 60% w zależności od ilości materiału wyjściowego i wielkości komórki. Pozostaw komórki rosnące w inkubatorze, aż osiągną 90% zbieżności. Monitoruj komórki codziennie i zmieniaj nośniki co 2 dni. Czas potrzebny do zrostu komórek nowotworowych różni się w zależności od wielu parametrów: agresywności guza, genotypu guza, wieku myszy, niejednorodności tkanki.
  12. W przypadku pasażu komórek wykonaj następujące czynności:
    1. Roztwór do odłączania komórek i pożywkę z komórkami nowotworowymi należy wstępnie ogrzać w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
    2. Umyj komórki 1x sterylnym PBS i inkubuj je w temperaturze 37 °C w 10 ml roztworu do odrywania ciepłych komórek przez 5-10 minut.
    3. Gdy wszystkie komórki zostaną odłączone od płytki, dodaj 10 ml ciepłej pożywki z komórek nowotworowych, przenieś roztwór do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i wiruj komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Ponownie zawiesić komórki w 5-10 ml pożywki z komórkami nowotworowymi, w zależności od wielkości osadu, i policzyć żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego (rozcieńczenie 1:5), aby wykluczyć martwe komórki.
    5. Talerz 105 komórek w talerzach 10 cm lub 3 x 105 komórek w talerzach 15 cm. Czas podwajania komórek różni się w zależności od czynników wyszczególnionych w kroku 2.10.

3. Pochodzenie guza

  1. Użyj komórek nowotworowych w pasażu P1 lub P2, aby uniknąć selekcji komórek przez wiele pasaży (Rysunek 1B). Aby oderwać komórki od płytki, najpierw umyj naczynie 1x PBS, nie naruszając komórek, a następnie przykryj je roztworem do odklejania komórek (5 ml na płytkę 10 cm lub 10 ml na płytkę 15 cm) i umieść je w inkubatorze na 5–10 minut.
  2. Potwierdź, że komórki są odłączone, patrząc na płytkę pod mikroskopem jasnego pola, dodaj objętość pożywki z komórkami nowotworowymi w stosunku 1:1 (roztwór do odklejania komórek: pożywka z komórek nowotworowych), umieść zawiesinę komórek w probówce wirówkowej i wiruj komórki w dół przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Zawiesić komórki w buforze FACS (sekcja 3.4) lub pożywce guzowej (sekcja 3.5), zgodnie z metodą zastosowaną do posiewu.
  4. Posiewanie komórek za pomocą cytometru przepływowego
    1. Ponownie zawieś komórki w buforze FACS (ilość zależy od wielkości osadu) i ręcznie zlicz żywe komórki przy użyciu wykluczenia błękitu Trypana. Upewnij się, że końcowe stężenie komórek wynosi 107 komórek/ml (100 μl buforu FACS na 106 komórek). Dodaj 1 μl fioletowej barwie Fx Cycle na 106 komórek, aby odróżnić żywe komórki od martwych podczas sortowania komórek. Przygotuj niebarwioną kontrolę, w której fioletowa plama Fx Cycle nie jest dodawana do komórek.
      UWAGA: Stężenie jest zoptymalizowane pod kątem wydajnego barwienia i szybkości podczas sortowania. Niższe stężenie komórek spowoduje dłuższy czas sortowania, podczas gdy wyższe stężenie wpłynie na barwienie.
    2. Wykorzystując niebarwioną kontrolę, ustaw bramkę FACS oddzielającą żywe (Fx Cycle Violet-) od martwych (Fx Cycle Violet+) komórek. Następnie zastosuj sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (z przepustem pasmowym filtra 450/50) do separacji i liczenia żywych/martwych komórek oraz do posiewu żądanej liczby żywych komórek w każdym dołku z 96 dołków o niskim przyczepie. Każda studzienka płytki musi być wypełniona 200 μl pożywki nowotworowej przed rozpoczęciem sortowania.
      UWAGA: Biorąc pod uwagę, że TPC są rzadką subpopulacją w całym guzie, zoptymalizuj protokół, posiewając 100 komórek / studzienkę z mysiego RMS, aby obserwować tworzenie się guzów w hodowli zawiesiny. Liczba komórek w każdym dołku powinna być dostosowana do konkretnego badanego nowotworu.
    3. Umieść komórki w inkubatorze do końca eksperymentu. Staraj się nie naruszać talerza, chyba że jest to konieczne. W przypadku 30-dniowego eksperymentu każda studzienka powinna być co tydzień uzupełniana pożywką i odpowiednią proporcją czynników wzrostu (pożywka ma tendencję do parowania, a czynniki wzrostu nie są skuteczne po 1 tygodniu).
    4. Po zakończeniu eksperymentu należy ręcznie przesiać płytki pod mikroskopem jasnego pola w celu identyfikacji guzów (patrz krok 3.6).
      UWAGA: Punkt czasowy wynoszący 30 dni został zoptymalizowany, aby łatwo wykrywać guzy RMS myszy o rozmiarach od 50 do 300 μm średnicy. Punkt czasowy należy dostosować w zależności od agresywności badanego guza i jego tempa proliferacji.
  5. Ręczne powlekanie komórek
    1. Ponownie zawiesić komórki w pożywce guza (ilość zależy od osadu) i ręcznie zliczyć żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego (rozcieńczenie 1:10). Oblicz stężenie komórek w probówce i umieść odpowiednią liczbę komórek w 96-dołkowej płytce o niskim mocowaniu. Umieść komórki w inkubatorze do końca eksperymentu. Staraj się nie naruszać płytki, chyba że jest to konieczne do uzupełnienia podłoża i czynników wzrostu, jak opisano w kroku 3.4.3.
    2. Po zakończeniu eksperymentu, należy ręcznie przesiać płytki pod mikroskopem jasnego pola w celu identyfikacji guzów lub za pomocą oprogramowania Celigo, jak opisano wcześniej w Kessel et al.24 Patrz krok 3.6 poniżej.
  6. Należy pamiętać, że w wyniku tego testu można ocenić dwa oddzielne odczyty: liczbę i rozmiar utworzonych guzów.
    UWAGA: Gdy w studzience posieje się więcej niż jedną komórkę, mogą powstać guzy lub skupiska komórek (Rysunek 1C, trzeci i czwarty panel). Klastry komórkowe to małe agregaty komórkowe, które tworzą się w kulturze zawiesinowej, która zwiększa przeżywalność komórek i charakteryzuje się nieregularnym kształtem. Guzy są duże i mają bardziej zwartą strukturę o sferoidalnym kształcie. Pochodzą one z pojedynczej komórki, która ma zdolność przetrwania w sposób niezależny od zakotwiczenia i rozmnaża się w szybkim tempie25. Posiewanie komórek za pomocą cytometru przepływowego lub ręcznie może być stosowane zamiennie, w zależności od możliwości dostępnych w laboratorium. Co więcej, możliwe jest zastosowanie płytek o niskim stopniu przylegania o rozmiarach innych niż 96-dołkowe, w zależności od wymaganego wyniku. Rzeczywiście, ocena częstości występowania guza powinna być przeprowadzona przy użyciu 96 dołków z niskimi płytkami przyłączeniowymi, podczas gdy wstępne badania przesiewowe w celu oceny potencjału rakotwórczego komórek przyniosą szybsze i wiarygodne wyniki na 6 dołkach o niskim przyłączeniu.

4. Leczenie nowotworów za pomocą białek rekombinowanych

  1. Powtórz kroki 3.1 i 3.2.
  2. W przypadku przygotowania leczenia białkami rekombinowanymi, należy najpierw określić najlepsze stężenie do zastosowania zgodnie z punktem 4.3 lub, jeśli optymalne stężenie zostało wcześniej określone, przejść do punktu 4.4.
  3. Określić stężenie białka rekombinowanego.
    1. Ponownie zawiesić komórki w pożywce guzowej (objętość zależy od wielkości osadu) i ręcznie zliczyć żywe komórki przy użyciu wykluczenia błękitu trypana. Oblicz stężenie komórek w probówce i płytce 100 000 komórek w 6-dołkowej płytce o niskim mocowaniu. Umieść dwie studzienki na każde badane stężenie i dwie studzienki dla nieleczonych kontroli (Rysunek 2). Stężenia białek, które mają być badane, opierają się na poszukiwaniach w literaturze.
    2. Każdą studzienkę zawiesiny komórek należy traktować innym stężeniem białka i umieścić komórki w inkubatorze na 48 godzin (czas niezbędny do oceny wpływu leczenia zarówno na żywotność komórek, jak i na ekspresję dalszych genów docelowych). Następnie oceń następujące parametry:
      1. Przeżywalność komórek: za pomocą mikroskopu jasnego pola, a także porównania z nieleczonymi kontrolami, sprawdź morfologię komórek. Zdrowe komórki wydają się jasne i odbijają światło pod mikroskopem, podczas gdy nadmierna śmierć komórek spowoduje gromadzenie się zanieczyszczeń w pożywce. W celu ilościowego określenia śmierci komórki można zastosować wykluczenie błękitu trypanowego, barwienie fioletem krystalicznym, MTT lub test TUNEL (w tym przypadku dodać jedną studzienkę do oryginalnego posiewu).
      2. Wpływ białek rekombinowanych na dalsze szlaki: przeszukaj literaturę za pomocą PubMed w celu identyfikacji genów, o których wiadomo, że są dotknięte badanym białkiem. Zaprojektuj startery qRT-PCR dla docelowych genów i przeprowadź analizę qRT-PCR na RNA wyizolowanym z leczonych komórek (Rysunek 2).
  4. Traktuj rekombinowanym białkiem.
    1. Ponownie zawiesić komórki w pożywce guzowej (objętość zależy od wielkości osadu) i ręcznie zliczyć żywe komórki przy użyciu wykluczenia błękitu trypana. Określ całkowitą liczbę komórek potrzebnych do pożądanego eksperymentu (100 komórek na każdą studzienkę 96-dołkowej płytki o niskim przyłączeniu) i rozcieńcz je w odpowiedniej objętości pożywki nowotworowej. W przypadku wykonywania więcej niż jednego zabiegu należy przygotować osobne rurki komórkowe.
    2. Potraktuj każdą probówkę odpowiednim stężeniem rekombinowanego białka i umieść komórki w oddzielnej studzience z 96-dołkową płytką o niskim przyłączeniu. Zabieg zostanie powtórzony na każdym dołku w zależności od okresu półtrwania rekombinowanego białka do 30-dniowego punktu końcowego eksperymentu.
    3. Na końcu eksperymentu wykonaj kroki 3.4.4 i 3.6, aby przeanalizować dane.

5. Leczenie nowotworów plazmidami z nadekspresją

  1. Powtórz kroki 3.1 i 3.2.
  2. Jeśli konfigurujesz leczenie na nowym typie nowotworu, najpierw określ najlepsze stężenie plazmidu do użycia zgodnie z punktem 5.3 lub, jeśli optymalne stężenie DNA zostało wcześniej określone, przejdź do punktu 5.4.
  3. Określ optymalne stężenie plazmidu.
    1. Ponownie zawieś komórki w pożywce dla komórek nowotworowych (objętość zależy od wielkości osadu) i ręcznie zlicz żywe komórki przy użyciu wykluczenia błękitu trypanowego. Policz policzone komórki, aby osiągnąć konfluencję od 70% do 90% (liczba komórek jest wysoce zależna od wielkości i morfologii komórki). Plazmid GFP zostanie zastosowany do przetestowania skuteczności transfekcji zgodnie z protokołem producenta odczynnika do transfekcji dla komórek przylegających. Równolegle przetestuj również nieleczoną kontrolę (Rysunek 3A). Wykonaj test wydajności na płytce 24-dołkowej.
      UWAGA: Komórki adherentne są używane w celu zwiększenia wydajności transfekcji, ponieważ transfekcja wykonywana na komórkach zawiesinowych nie jest wydajna i negatywnie wpływa na żywotność komórek.
    2. 48 godzin po transfekcji oceń komórki pod kątem następujących parametrów:
      1. Przeżycie komórek: za pomocą mikroskopu jasnego pola porównaj liczbę komórek obecnych w każdej studzience i porównaj ją z komórkami nieleczonymi.
      2. Wyrażenie GFP: policz procent komórek, które są dodatnie GFP w stosunku do całkowitej liczby komórek w każdym dołku (Rysunek 3B).
  4. Leczenie nadekspresji plazmidu
    1. Ponownie zawiesić komórki w pożywce z komórkami nowotworowymi (objętość zależy od wielkości osadu) i ręcznie zliczyć żywe komórki przy użyciu wykluczenia błękitu trypanowego. Płytka 200 000 komórek na dołek płytki 6-dołkowej. Każda studnia zostanie wykorzystana do niezależnego wydarzenia transfekcji. Każda studzienka zostanie przetransfekowana przy użyciu zestawu opracowanego dla określonego typu nowotworu (Rysunek 3A).
    2. 24 godziny po transfekcji przemyć każdą studzienkę 1x PBS i inkubować komórki w ciepłym roztworze do oddzielania komórek (wystarczającym do przykrycia dołka). Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 5–10 minut, w zależności od czynników wyszczególnionych w sekcji 2.15.
    3. Po odłączeniu komórek należy policzyć komórki pochodzące z każdej pojedynczej studzienki niezależnie, stosując wykluczenie błękitu trypanowego. Umieść 100 000 komórek w dołku na 6-dołkowej płytce o niskim przyłączeniu, uważając, aby nie mieszać komórek pochodzących z różnych dołków. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i pozostawić w spokoju na tydzień.
      UWAGA: Czas trwania tego testu wynosi 7 dni, co jest wystarczającym czasem, aby umożliwić utworzenie się guza, jednocześnie zapobiegając fuzji guza. Fuzja guza jest zjawiskiem, które staje się oczywiste, gdy 100 000 lub więcej komórek jest sianych razem w zawiesinie przez ponad 1 tydzień, co może wpływać na ocenę zdolności do tworzenia guza. W przypadku, gdy eksperyment wymaga dłuższego czasu inkubacji, należy dostosować gęstość komórek lub zastosować rusztowania polimerowe, aby uniknąć fuzji guza26.
    4. Na końcu eksperymentu wykonaj kroki 3.5.2 i 3.6, aby przeanalizować dane.

6. Przygotowanie guza do przeszczepu allogenicznego

  1. Roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) (50 μl na alloprzeszczep) i pożywkę z komórek nowotworowych (50 μl na alloprzeszczep) umieścić na lodzie.
  2. Guzy mogą być używane do przeszczepów alloprzeszczepów. Zbierz wszystkie guzy uzyskane z określonego typu komórek lub leczenia do probówki o pojemności 15 ml lub 50 ml (w zależności od całkowitej objętości pożywki) (Rysunek 1D). Wirować guzy w dół przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant nad guzami i umyć je 10 ml sterylnego 1x PBS.
  3. Ponownie odwiruj guzy w dół przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odessać 1x PBS i dodać 500 μl do 1 ml roztworu odłączającego komórki na wierzchu osadu komórkowego, co rozpoczyna proces dysocjacji. Inkubować guzy w roztworze trawiennym w wytrząsającej łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i sprawdzać postęp trawienia co 10 minut. Aby pomóc w dysocjacji guzów w roztworze jednokomórkowym, pipetuj komórki w górę iw dół w celu mechanicznego zakłócenia. Proces trawienia może trwać do 30 min.
    UWAGA: Pomimo faktu, że czas inkubacji różni się znacznie, gdy guzy pochodzą z różnych pierwotnych komórek RMS, nigdy nie zaobserwowano znacznego spadku żywotności komórek w stosunku do czasu trawienia.
  4. Po otrzymaniu roztworu jednokomórkowego dodać objętość pożywki z komórkami nowotworowymi (1:1, roztwór do odrywania komórek: pożywka dla komórek nowotworowych) i wirować w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Od tego momentu wszystkie kroki należy wykonywać na lodzie. Po wirowaniu guzy nie tworzą stabilnego osadu, tak jak robią to roztwory jednokomórkowe. Aby upewnić się, że guz nie zostanie usunięty ani zassany, użyj pipety o pojemności 1 ml i delikatnie zassaj płyn. Przejdź do pipety o pojemności 200 μl, gdy pozostał tylko 1 ml.
  5. Ponownie zawieś komórki w pożywce z zimnymi komórkami nowotworowymi (objętość będzie zależeć od wielkości osadu), umieść komórki na lodzie i policz żywe komórki za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego. Po ustaleniu odpowiedniej ilości komórek do wykorzystania do przeszczepu allogenicznego, należy je ponownie zawiesić w łącznej objętości 50 μl pożywki z zimnych komórek nowotworowych. Ostudzić końcówkę pipety w zimnym podłożu z komórek nowotworowych. Gdy końcówka jest zimna, użyj jej, aby pobrać 50 μl roztworu ECM i dodać go do probówki zawierającej komórki. Nie wyjmuj probówek z lodu podczas tego procesu.
    UWAGA: Liczba komórek do wykorzystania do przeszczepu powinna być określona zgodnie z badanym guzem i celem eksperymentalnym: większa liczba przeszczepionych komórek skróci czas rozwoju guza (wykazano, że 20 000 komórek z mysich guzów RMS rozwija się w guz 6 tygodni po wstrzyknięciu). Aby móc porównać różne linie komórkowe lub różne metody leczenia, ważne jest, aby zacząć od tej samej liczby komórek.
  6. Ponieważ komórki są teraz gotowe do przeszczepu, należy je przechowywać na lodzie aż do wstrzyknięcia. Umieść na lodzie zakrytą strzykawkę insulinową o pojemności 0,5 ml z igłą 29 g, aby zapobiec zestaleniu się roztworu komórkowego podczas aspiracji.
  7. Włącz przepływomierz na 200 ml/min tlenu, a parownik izofluranu na 2,5%. Znieczulij 2-miesięcznego samca myszy NOD/SCID, umieszczając go w komorze indukcyjnej. Odczekaj 2–3 minuty, aż mysz zacznie spać, a rozmnażanie zwolni. Przed rozpoczęciem zabiegu najpierw upewnij się, że mysz śpi, a następnie nałóż maść weterynaryjną na oczy. Ogolić prawą stronę zwierzęcia, odessać roztwór komórek do wstępnie schłodzonej strzykawki i wstrzyknąć je podskórnie w ogolone miejsce. Widoczny guzek pod skórą powstanie, jeśli wstrzyknięcie zostanie wykonane prawidłowo.
    UWAGA: Przeszczepy allogeniczne komórek można wykonać w tym samym szczepie myszy, co przeszczepione komórki. Na przykład, jeśli komórki RMS zostały pierwotnie wyizolowane z myszy C57BL/6, przeszczep allogeniczny można wykonać u myszy C57BL/6. Jeśli szczep jest inny, należy wykorzystać myszy biorców z niedoborem odporności, aby uniknąć odrzucenia. Wiek myszy biorców można również dostosować w zależności od celu eksperymentu.
  8. Monitoruj myszy pod kątem powstawania guza raz w tygodniu.
    UWAGA: Aby potwierdzić tożsamość guza uzyskanego z przeszczepu allogenicznego, należy go porównać z pierwotnym guzem, z którego wyizolowano komórki. W tym celu można przeprowadzić analizę histologiczną cech morfologicznych i ekspresji markerów miogennych, a także bardziej kompleksowy RNAseq.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykrywanie tumorsfer
Izolację komórek zoptymalizowano tak, aby uzyskać maksymalną heterogenność populacji komórkowych obecnych w tkance nowotworowej. Po pierwsze, ponieważ izolowane tkanki wykazywały morfologicznie odmienne obszary, w celu zwiększenia szans na wyizolowanie jednorodnych, rzadkich populacji komórek, pobieranie próbek przeprowadzano z wielu obszarów guza (Rycina 1A, pierwszy panel od lewej). Po drugie, mechaniczną dysocjację...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Do izolacji i charakterystyki TPC z heterogenicznych populacji komórek nowotworowych zastosowano wiele metod: testy klonogenne guza, izolację FACS i test tworzenia guza. Test klonogenny guza został po raz pierwszy opisany w 1971 roku, wykorzystany do badań nad komórkami macierzystymi, a dopiero później zastosowany w biologii raka29,30. Metoda ta opiera się na wewnętrznej właściwości rakowych komórek macierzystych do niekontrolowanego namnażania się w kulturach mi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant Fundacji Medycznej Ellison AG-NS-0843-11, oraz Grant Pilotażowy NIH w ramach Grantu Wsparcia Centrum Raka NCI P30CA030199 dla A.S.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynnik do dysocjacji komórek AccutaseGibcoA1110501Odłącz przylegające komórki i zdysocjuj guzy
CeligoNexcelomCeligo Microwellcytometr obrazowy na płytce do komórek przylegających i zawiesinowych
Kolagenaza, typ IILife Technologies17101015Enzym trawienia tkanek
Dispase II, proteazaLife Technologies17105041Enzym trawienia tkankowego
DMEM pożywka o wysokiej zawartości glukozyGibco11965092Składnik pożywki dla komórek nowotworowych
DMEM/F12 MediaGibco11320033Składnik pożywki tumosferowej
EDTAThermoFisherS312500Składnik buforu FACS
Rekombinowane białko myszy EGFGibcoPMG8041Składnik pożywki
tumosferyFACSAria II Cytometria przepływowaBD Biosciences650033Sortownik komórek aktywowany fluorescencyjnie
Surowica bydlęcapłodu Omega ScientificFB-11Składnik pożywki dla komórek nowotworowych
Fluriso (izofluory) środek znieczulającyMWI Vet Supply502017Odczynnik znieczulający dla zwierząt
FxCycle Violet StainLife TechnologiesF10347Rozróżnianie żywych i martwych komórek
Goat SerumLife Technologies16210072Składnik buforu FACS
Ham's F10 MediaLife Technologies11550043Składnik buforu FACS
Horse SerumLife Technologies16050114Składnik pożywki do izolacji komórek
Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 3000Odczynnik
do transfekcji ThermoFisher L3000015Matrigel membrane matrixCorningCB40234Zapewnia wsparcie dla komórek przesiewanych
N-2 Supplemtns (100X)Gibco17502048Składnik pożywki tumosferycznej
Neomycyna-Siarczany polimyksyny B-Bacytracyna MaśćMWI Vet Supply701008Maść do oczu
PBSGibco10010023Składnik bufora FACS i stosowany do mycia komórek
pEGFP-C1Addgene6084-1Plazmid GFP
Penicylina - StreptomyocinLife Technologies15140163Składnik pożywki dla komórek nowotworowych i tumosfery
Rekombinowany człowiek i beta; FGF-basicPeprotech10018BSkładnik pożywki tumosfery
Rekombinowane mysie białko ligandu Flt-3R& D Systems427-FL-005Rekombinowane białko
błękit trypanowyThermoFisher15250061Rozróżnianie żywych i martwych komórek
cynkowa

Bibliografia

  1. Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
  2. Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. Cancer stem cells: an old idea--a paradigm shift. Cancer Research. 66 (4), 1883-1890 (2006).
  3. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  4. Oishi, N., Yamashita, T., Kaneko, S. Molecular biology of liver cancer stem cells. Liver Cancer. 3 (2), 71-84 (2014).
  5. Crous, A. M., Abrahamse, H. Lung cancer stem cells and low-intensity laser irradiation: a potential future therapy. Stem Cell Research & Therapy. 4 (5), 129(2013).
  6. Tomao, F., et al. Investigating molecular profiles of ovarian cancer: an update on cancer stem cells. Journal of Cancer. 5 (5), 301-310 (2014).
  7. Zhan, H. X., Xu, J. W., Wu, D., Zhang, T. P., Hu, S. Y. Pancreatic cancer stem cells: new insight into a stubborn disease. Cancer Letters. 357 (2), 429-437 (2015).
  8. Sharpe, B., Beresford, M., Bowen, R., Mitchard, J., Chalmers, A. D. Searching for prostate cancer stem cells: markers and methods. Stem Cell Reviews and Reports. 9 (5), 721-730 (2013).
  9. Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
  10. Lee, C. -H., Yu, C. -C., Wang, B. -Y., Chang, W. -W. Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti- cancer stem cell drugs. Oncotarget. 7 (2), 1215-1226 (2015).
  11. Sultan, I., Qaddoumi, I., Yaser, S., Rodriguez-Galindo, C., Ferrari, A. Comparing adult and pediatric rhabdomyosarcoma in the surveillance, epidemiology and end results program. Journal of Clinical Oncology. 27 (20), 3391-3397 (1973).
  12. Blum, J. M., et al. Distinct and overlapping sarcoma subtypes initiated from muscle stem and progenitor cells. Cell Reports. 5 (4), 933-940 (2013).
  13. Rubin, B. P., et al. Evidence for an unanticipated relationship between undifferentiated pleomorphic sarcoma and embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 19 (2), 177-191 (2011).
  14. Keller, C., et al. Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice: cooperativity. of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function. Genes & Development. 18 (21), 2614-2626 (2004).
  15. Tremblay, A. M., et al. The Hippo transducer YAP1 transforms activated satellite cells and is a potent effector of embryonal rhabdomyosarcoma formation. Cancer Cell. 26 (2), 273-287 (2014).
  16. Hatley, M. E., et al. A mouse model of rhabdomyosarcoma originating from the adipocyte lineage. Cancer Cell. 22 (4), 536-546 (2012).
  17. Drummond, C. J., et al. Hedgehog Pathway Drives Fusion-Negative Rhabdomyosarcoma Initiated From Non-myogenic Endothelial Progenitors. Cancer Cell. 33 (1), 108-124 (2018).
  18. Almazan-Moga, A., et al. Hedgehog Pathway Inhibition Hampers Sphere and Holoclone Formation in Rhabdomyosarcoma. Stem Cells International. , (2017).
  19. Walter, D., et al. CD133 positive embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population is enriched in rhabdospheres. PLoS One. 6 (5), (2011).
  20. Ciccarelli, C., et al. Key role of MEK/ERK pathway in sustaining tumorigenicity and in vitro radioresistance of embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population. Molecular Cancer. 15, (2016).
  21. Deel, M. D., et al. The Transcriptional Coactivator TAZ Is a Potent Mediator of Alveolar Rhabdomyosarcoma Tumorigenesis. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2616-2630 (2018).
  22. Boscolo Sesillo, F., Fox, D., Sacco, A. Muscle Stem Cells Give Rise to Rhabdomyosarcomas in a Severe Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy. Cell Reports. 26 (3), 689-701 (2019).
  23. Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D., Faulkner, J. A. Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma. The FASEB Journal. 21 (9), 2195-2204 (2007).
  24. Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. SLAS Technology. 22 (4), 454-465 (2017).
  25. Johnson, S., Chen, H., Lo, P. K. In vitro Tumorsphere Formation Assays. Bio-Protocol. 3 (3), (2013).
  26. Zhu, Z. W., et al. A novel three-dimensional tumorsphere culture system for the efficient and low-cost enrichment of cancer stem cells with natural polymers. Experimental and Therapeutic. 15 (1), 85-92 (2018).
  27. Takahashi, S. Downstream molecular pathways of FLT3 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia: biology and therapeutic implications. Jornal of Hematology and Oncology. 4, (2011).
  28. Laouar, Y., Welte, T., Fu, X. Y., Flavell, R. A. STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell differentiation. Immunity. 19 (6), 903-912 (2003).
  29. Ogawa, M., Bergsagel, D. E., McCulloch, E. A. Differential effects of melphalan on mouse myeloma (adj. PC-5) and hemopoietic stem cells. Cancer Research. 31 (12), 2116-2119 (1971).
  30. Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197 (4302), 461-463 (1977).
  31. Hamburger, A. W. The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology. The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).
  32. Jimenez-Hernandez, L. E., et al. NRP1-positive lung cancer cells possess tumor-initiating properties. Oncology Reports. 39 (1), 349-357 (2018).
  33. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
  34. Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
  35. Salerno, M., et al. Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas. International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tworzenie tumorsferizolacja komórek nowotworowychtrawienie tkankiroztwór kolagenazypłytka o niskim stopniu przyleganialiczenie metodą błękitu trypanutransplantacja allogenicznapożywka do tumorsferplazmid reporterowy GFPprzesiewanie leków
Wyprowadzanie i leczenie guza z pierwotnych komórek nowotworowych wyizolowanych z mięsaków prążkowanokomórkowych myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.