Ujawnienie zbierania hemolimfy i inokulacji blastospor Metarhizium do kleszczy Rhipicephalus microplus w kierunku badań patologii bezkręgowców

Podsumowanie

Analiza hemolimfy kleszczowej stanowi ważne źródło informacji o tym, jak niektóre patogeny wywołują choroby i jak kleszcze reagują immunologicznie na tę infekcję. Niniejsze badanie pokazuje, jak zaszczepić propagule grzybów i zebrać hemolimfę od nabrzmiałych samic Rhipicephalus microplus.

Streszczenie

Kleszcze są obowiązkowymi hematofagicznymi ektopasożytami, a Rhipicephalus microplus ma duże znaczenie w medycynie weterynaryjnej, ponieważ powoduje anemię, utratę wagi, deprecjację skóry zwierząt, a także może działać jako wektor wielu patogenów. Ze względu na wygórowane koszty zwalczania tych pasożytów, szkody w środowisku spowodowane niewłaściwym stosowaniem chemicznych akarycydów oraz zwiększoną odporność na tradycyjne środki pasożytobójcze, alternatywne zwalczanie kleszczy, na przykład za pomocą grzybów entomopatogenicznych, zostało uznane za interesujące podejście. Niemniej jednak niewiele badań wykazało, w jaki sposób układ odpornościowy kleszcza działa w walce z tymi entomopatogenami. Dlatego protokół ten demonstruje dwie metody stosowane do inokulacji entomopatogenów u nabrzmiałych samic oraz dwie techniki stosowane do zbierania hemolimfy i hemocytów. Inokulacja patogenów w miejscu wprowadzenia nogi do ciała samicy kleszcza pozwala na ocenę parametrów biologicznych samic, w przeciwieństwie do inokulacji między scutum a capitulum, która często uszkadza narząd Gené. Kolekcjonowanie hemolimfy grzbietowej przyniosło większy odzysk objętości niż pobieranie przez nogi. Niektóre ograniczenia w zbieraniu i przetwarzaniu hemolimfy kleszczowej obejmują i) wysokie wskaźniki rozerwania hemocytów, ii) zanieczyszczenie hemolimfy z zakłóconym jelitem środkowym oraz iii) niski odzysk objętości hemolimfy. Kiedy hemolimfa jest zbierana przez cięcie nogi, hemolimfa potrzebuje czasu, aby zgromadzić się w otworze nogi, sprzyjając procesowi krzepnięcia. Ponadto w kolekcji przez nogę uzyskuje się mniej hemocytów w porównaniu z kolekcją grzbietową, mimo że pierwsza metoda jest uważana za łatwiejszą do wykonania. Zrozumienie odpowiedzi immunologicznej u kleszczy, w której pośredniczą czynniki entomopatogeniczne, pomaga odkryć ich patogenezę i opracować nowe cele do zwalczania kleszczy. Opisane tu procesy inokulacji wymagają bardzo niskich zasobów technologicznych i mogą być wykorzystywane nie tylko do wystawiania kleszczy na działanie mikroorganizmów chorobotwórczych. Podobnie, pobranie hemolimfy kleszczowej może stanowić pierwszy krok dla wielu badań fizjologicznych.

Wprowadzenie

Kleszcz bydlęcy, Rhipicephalus microplus, jest ektopasożytem hematophagu o ogromnym negatywnym wpływie na zwierzęta gospodarskie w obszarach tropikalnych. Kleszcz ten jest wektorem czynników chorobotwórczych, takich jak Babesia bovis, Babesia bigemina i Anaplasma marginale, które w połączeniu z bezpośrednim uszkodzeniem hemoodżywiania mogą zmniejszyć produkcję mleka i mięsa, spowodować anemię i ostatecznie śmierć. Straty spowodowane przez tego ektopasożyta oszacowano na 3,24 miliarda dolarów rocznie w Brazil¹. Potrzebne są zrównoważone metody, a stosowanie czynników entomopatogenicznych jest uważane za obiecującą alternatywę dla ograniczenia stosowania chemicznych akarycydów^2,3,4.

Grzyby entomopatogeniczne, takie jak Metarhizium spp., są naturalnymi wrogami stawonogów, w tym kleszczy, a niektóre izolaty mogą być używane jako biokontrolery. Patogeny te aktywnie infekują żywiciela przez naskórek i kolonizują jego ciało^2,5,6. W miarę rozwoju infekcji w odpowiedziach komórkowych i humoralnych pośredniczy układ odpornościowy kleszcza. Analiza hemolimfy kleszczowej jest przedstawiana jako użyteczne narzędzie do oceny odpowiedzi immunologicznej po zmaganiach z patogenami^7,8.

Odpowiedź immunologiczna stawonogów dzieli się na humoralną i komórkową. Odpowiedź humoralna obejmuje procesy hemaglutynacji i produkcję białek/peptydów przeciwdrobnoustrojowych, podczas gdy komórkowa odpowiedź immunologiczna odbywa się za pośrednictwem hemocytów. Komórki te są obecne w hemolimfie od wszystkich stawonogów i doniesiono, że rozwijają ekspresyjną rolę w badaniach dotyczących wrodzonej odpowiedzi immunologicznej⁹, ponieważ jest to bezpośrednio związane z procesami fagocytozy i enkapsulacji. W związku z tym badania nad hemocytami mogą pomóc w zbadaniu szlaku śmierci i zrozumieniu procesów takich jak autofagia, apoptoza i martwica. U niektórych bezkręgowców jako małży kolekcja hemocytów napotyka ograniczenia, takie jak rozerwanie komórek, niska uzyskana objętość hemolimfy i niska koncentracja odzyskanych komórek¹⁰. Bardzo często, w zależności od zastosowanej metodyki, uzyskuje się obniżoną koncentrację komórek, co ma bezpośredni wpływ na kwantyfikację i analizę komórek.

Liczba hemocytów krążących w hemolimfie jest zmienna u różnych stawonogów i może się zmieniać u tego samego gatunku ze względu na różne etapy fizjologiczne, takie jak płeć, wiek i stadium rozwoju stawonoga¹¹. Hemocyty można również znaleźć przyległe do niektórych narządów i być uwalniane do krążenia zaraz po procesie infekcji¹¹. Niemniej jednak większość badań wykazała, że wykorzystuje się owady, podczas gdy kleszcze pozostają mniej zbadane pod względem ich fizjologii i patologii. Pomimo tego, że inokulacja patogenów i zbieranie hemolimfy u kleszczy są mniej stosowanymi technikami, ustalenie standardowych metod pomaga w opracowaniu dokładniejszych badań.

Celem niniejszego badania było porównanie najczęściej stosowanych metod zbierania hemolimfy i inokulacji patogenów u kleszczy R. microplus, oceniając skuteczność w pozyskiwaniu hemocymfy i koncentracji hemocytów.

Protokół

Kleszcze użyte w niniejszym badaniu zostały uzyskane ze sztucznej kolonii, prowadzonej na Federalnym Uniwersytecie Wiejskim w Rio de Janeiro, której metody zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki Wykorzystania Zwierząt Kręgowych (CEUA-IV/UFRRJ #037/2014).

1. Kleszcz nabrzmiałe samice

1. Po zebraniu kleszczy umyj nabrzmiałe samice wodą z kranu i zanurz je w 0,5% (v/v) roztworze podchlorynu sodu na 3 minuty w szklanej zlewce o pojemności 500 ml w celu higieny skórek (Rysunek 1), a następnie osusz wszystkie samice za pomocą sterylnych ręczników papierowych (Rysunek 2).
2. Podziel samice na jednorodne grupy ważone (po 20 samic każda): jedna grupa bez żadnego leczenia, jedna grupa kontrolna zaszczepiona 5 μl 0,1% wodnego roztworu monooleinianu polioksyetylenosorbitanu (v/v) i jedna grupa zakażona zaszczepiona 5 μl w 1,0 x 10 7 blastospory ^mL-1,
   UWAGA: Tylko nieleczone kleszcze były używane do pomiaru objętości i stężenia hemocytów. Wykonano trzy powtórzenia każdej grupy.

2. Inokulacja patogenów między tarczką a główką

UWAGA: W niniejszym badaniu, entomopatogeniczne zawiesiny grzybów zostały użyte jako przykład.

1. Zawiesić blastospory grzybów w 1 ml 0,1% wodnego roztworu monooleinianu polioksyetylenosorbitanu (v/v) i dostosować do końcowego stężenia 1,0 x 10⁷ blastospor ^mL-1. Dodać porcję 5 μl zawiesiny blastospor Metarhizium (Rysunek 3) na powierzchnię folii parafinowej z tworzywa sztucznego.
   UWAGA: Zawiesinę blastospor Metarhizium dostosowano za pomocą komory Neubauera. Aby przyspieszyć proces zaszczepiania, do powierzchni folii parafinowej z tworzywa sztucznego można dodać wiele pęcherzyków, z których każdy odpowiada 5 μl.
2. Użyj ultracienkiej strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml i igły 0,3 mm, aby pobrać zawiesinę i wprowadzić ją do kleszcza. Należy pamiętać, aby przed użyciem strzykawki usunąć całe powietrze.
3. Zaszczepić 5 μl zawiesiny grzybów w samicy kleszcza między scutum a capitulum. Zaszczepić samice z grupy kontrolnej 5 μl 0,1% wodnego roztworu monooleinianu polioksyetylenosorbitanu (v/v) bez grzyba.
   UWAGA: Niewielka objętość hemolimfy może być obecna na otworze po wkłuciu igły. Uważaj, aby nie zaszczepić powietrza.

3. Inokulacja grzybów entomopatogenicznych między udem nogi a ciałem samicy kleszcza

1. Zaszczepić samice zawiesiną grzybów (5 μl przy 1,0 x 10⁷ blastosporach ^mL-1) między nogą a ciałem samicy, używając ultracienkiej strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml połączonej z igłą 0,3 mm. Zaszczepić samice z grupy kontrolnej 5 μl 0,1% wodnego roztworu monooleinianu polioksyetylenosorbitolu (v/v).
   UWAGA: Gdy inokulacja blastospor Metarhizium jest wykonywana między nogą tigh a ciałem samicy kleszcza, niewielka objętość hemolimfy może być obecna na tigh po wkłuciu igły. Uważaj, aby nie zaszczepić powietrza.

4. Grzbietowa kolekcja hemolimfy

1. Użyj gumowej części zestawu do infuzji ze skrzydełkami, rurki kapilarnej 0,3 mm i końcówki z filtrem, aby wykonać pobranie hemolimfy.
2. Rozciąć żeński naskórek grzbietowy za pomocą igły 0,3 mm.
3. Po przerwaniu należy delikatnie uciskać przednią część ciała kleszcza. Obserwuj, jak prawie przezroczysta ciecz wydostaje się z miejsca zakłócenia. Zebrać hemolimfę, zasysając płyn przez końcówkę filtra sprzężoną z gumową częścią zestawu do infuzji ze skrzydełkami i rurką kapilarną 0,3 mm.
   UWAGA: Nie naciskaj mocno ciała kleszcza podczas jego unieruchomienia, ponieważ może to zakłócić pracę jelita środkowego i zanieczyścić hemolimfę. Poczekaj, aż delikatne ciśnienie usunie płyn bez zanieczyszczenia.

5. Kolekcja hemolimfy z nogi kleszcza

1. Unieruchom kleszcza, odetnij kawałek przedniej nogi nożyczkami.
   UWAGA: Można przyciąć jedną lub więcej nóg, a także tę samą nogę można przyciąć więcej niż jeden raz.
2. Delikatnie uciskaj tylną część ciała kleszcza. Obserwuj przezroczysty pęcherzyk cieczy, który pojawia się w miejscu cięcia i zbierz go rurką kapilarną, jak opisano w kroku 4.3.
   UWAGA: Nie naciskaj mocno ciała kleszcza podczas jego unieruchomienia, ponieważ może to zakłócić pracę jelita środkowego i zanieczyścić hemolimfę. Poczekaj, aż delikatne ciśnienie usunie płyn bez zanieczyszczenia.

6. Przetwarzanie hemolimfy

1. Po pobraniu hemolimfy umieść ją w mikroprobówkach o pojemności 1,5 ml uprzednio wypełnionych 30 μl koktajlu proteazy i 82 μl buforu soli fizjologicznej. Trzymaj mikroprobówki na lodzie przez cały czas trwania kolekcji hemolimfy.
2. Odwirować próbki (500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C). Po odwirowaniu hemocyfy utworzy się miękka osada hemocytów.
   UWAGA: W celu ilościowego oznaczania hemolimfy należy określić ilościowo objętość hemolimfy uzyskaną przez zliczenie całkowitej objętości wewnątrz mikroprobówki i odjęcie objętości koktajlu proteazy i buforu soli fizjologicznej.
3. Ostrożnie usunąć supernatant (hemolimfę bezkomórkową). Delikatnie zawieś komórki, na przykład w kulturze L-15 firmy Leibovitz dostosowanej do pH 7,0-7,2. Określ ilościowo hemocyty, umieszczając 10 μl zawieszonych hemocytów w komorze Neubauera.

7. Przygotowanie preparatu do pobierania próbek hemocytu

1. Odetnij przednią nogę kleszcza nożyczkami.
2. Delikatnie uciskaj tylną część ciała kleszcza. Obserwuj przezroczysty pęcherzyk cieczy, który pojawia się w miejscu cięcia.
3. Nałóż krople hemolimfy bezpośrednio na czyste szkiełka mikroskopowe, a następnie użyj odpowiednich metod do barwienia komórek.
   1. Aby wybarwić hemocyty za pomocą Giemsy, wysusz hemolimfę na szkiełku na powietrzu przez 30 minut, utrwal ją w temperaturze pokojowej metanolem przez 3 minuty i zabarwij w roztworze Giemsy (stosunek 1:9 roztworu buforowego Sorensena, pH 7,2) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka pod bieżącą wodą, aby usunąć nadmiar barwnika, wysusz szkiełko na powietrzu i oceń komórki pod kątem 400x w mikroskopie optycznym.

Wyniki

Niniejszy artykuł przedstawia metody inokulacji i pobierania hemolimfy stosowane u kleszczy. Po wykonaniu inokulacji pomiędzy podstawą odnóża a ciałem samicy kleszcza, w trakcie procesu może dojść do wydzielenia niewielkiej ilości płynu (hemolimfy); należy jednak zauważyć, że po zakończeniu inokulacji na końcówce igły oraz w miejscu wkłucia nie powinno znajdować się żadne ciecze ani tkanki, co zapewnia całkowite wprowadzenie zawiesiny grzybowej. Przy prawidłowym przeprowadzeniu procesu in...

Dyskusja

Inokulacja patogenów jest przydatna, gdy badanie ma na celu zbadanie działania mikroorganizmów in vivo w eksperymentalnych modelach stawonogów, ponieważ zapewnia, że patogen znajduje się wewnątrz gospodarza. Technika ta może być również stosowana do inokulacji cząsteczek, takich jak interferencja RNA (RNAi). Inokulacja między scutum a capitulum jest uważana za łatwiejszą do przeprowadzenia, ale często uszkadza narząd Genégo, pogarszając żywotność jaj^12,13. Narząd...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Alkaliczny roztwór podchlorynu	Sigma-Aldrich	A1727
D-(+)-Glukoza	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
EDTA	Synth	2706
Płodowa surowica bydlęca	Gibco	16000036
Elastyczna guma	BD
Barwnik Giemsa	Sigma-Aldrich	48900-500ML-F
Szklana kapilarna	CTechGlass	CT95-02
Strzykawka insulinowa (igła)	BD	SKU:  324910
KH2PO4	Vetec	60REAVET014512
Pożywka hodowlana L-15 firmy Leibovitz	Gibco	11415-064
Metanol	Sigma-Aldrich	34860-1L-R Szkiełka
mikroskopowe	Kasvi	K5-7105
Mikrorurki	BRAND	Z336769-1PAK
Na2HPO4	Vetec	60REAVET014593
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
Komora Neubauera	Kasvi	K5-0111
Penicylina	Gibco	15140163
Koktajl inhibitorów proteazy	Sigma-Aldrich	P2714
Tween 80	Vetec	60REAVET003662