Artykuł metodologiczny

Kompletny potok do izolowania i sekwencjonowania mikroRNA oraz analizowania ich przy użyciu narzędzi open source

DOI:

10.3791/59901

⸱

21 sierpnia 2019

 ,  , 
1Division of Medical Genetics, University of Washington School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy krok po kroku strategię izolowania małych RNA, wzbogacania mikroRNA i przygotowywania próbek do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Następnie opisujemy, jak przetwarzać odczyty sekwencji i dopasowywać je do mikroRNA za pomocą narzędzi open source.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uważa się, że połowa wszystkich ludzkich transkryptów jest regulowana przez mikroRNA. W związku z tym ilościowe określenie ekspresji mikroRNA może ujawnić mechanizmy leżące u podstaw stanów chorobowych oraz zapewnić cele terapeutyczne i biomarkery. W tym miejscu szczegółowo opisujemy, jak dokładnie określić ilościowo mikroRNA. Krótko mówiąc, metoda ta opisuje izolację mikroRNA, ligowanie ich do adaptorów odpowiednich do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, amplifikację produktów końcowych i przygotowanie biblioteki próbek. Następnie wyjaśniamy, jak wyrównać uzyskane odczyty sekwencjonowania do spinek do włosów mikroRNA oraz określić ilościowo, znormalizować i obliczyć ich różnicową ekspresję. Wszechstronny i solidny, połączony eksperymentalny przepływ pracy i analiza bioinformatyczna umożliwiają użytkownikom rozpoczęcie od ekstrakcji tkanek, a zakończenie kwantyfikacji mikroRNA.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po raz pierwszy odkryty w 1993 roku1, obecnie szacuje się, że prawie 2000 mikroRNA jest obecnych w ludzkim genomie2. MikroRNA to małe niekodujące RNA, które zwykle mają długość 21-24 nukleotydów. Są one potranskrypcyjnymi regulatorami ekspresji genów, często wiążącymi się z komplementarnymi miejscami w regionie 3-nieulegającym translacji (3-UTR) docelowych genów w celu tłumienia ekspresji białek i degradacji mRNA. Kwantyfikacja mikroRNA może dostarczyć cennych informacji na temat ekspresji genów i w tym celu opracowano kilka protokołów3.

Opracowaliśmy zdefiniowany, powtarzalny i długotrwały protokół do sekwencjonowania małych RNA oraz do analizy znormalizowanych odczytów za pomocą narzędzi bioinformatycznych open source. Co ważne, nasz protokół umożliwia jednoczesną identyfikację zarówno endogennych mikroRNA, jak i egzogennie dostarczanych konstruktów, które wytwarzają gatunki podobne do mikroRNA, przy jednoczesnej minimalizacji odczytów, które mapują się na inne małe gatunki RNA, w tym rybosomalne RNA (rRNA), małe RNA pochodzące z transferu RNA (tsRNA), małe RNA pochodzące z powtórzeń i produkty degradacji mRNA. Na szczęście mikroRNA są 5-fosforylowane i 2-3 hydroksylowane4, cecha, którą można wykorzystać do oddzielenia ich od innych małych RNA i produktów degradacji mRNA. Istnieje kilka komercyjnych opcji klonowania i sekwencjonowania mikroRNA, które są często szybsze i łatwiejsze do multipleksowania; Jednak zastrzeżony charakter odczynników w zestawach i ich częste modyfikacje sprawiają, że porównywanie prób jest wyzwaniem. Nasza strategia optymalizuje zbieranie tylko odpowiedniej wielkości mikroRNA poprzez etapy oczyszczania z akrylamidu i żelu agarozowego. W tym protokole opisujemy również procedurę dopasowywania odczytów sekwencji do mikroRNA za pomocą narzędzi open source. Ten zestaw instrukcji będzie szczególnie przydatny dla początkujących użytkowników informatyki, niezależnie od tego, czy stosowana jest nasza metoda przygotowania biblioteki, czy metoda komercyjna.

Ten protokół został wykorzystany w kilku opublikowanych badaniach. Na przykład wykorzystano go do zidentyfikowania mechanizmu, za pomocą którego enzym Dicer rozszczepia małe RNA spinki do włosów w odległości dwóch nukleotydów od wewnętrznej pętli struktury pętli macierzystej - tak zwana "reguła zliczania pętli"5. Postępowaliśmy również zgodnie z tymi metodami, aby zidentyfikować względną obfitość dostarczonych małych RNA spinki do włosów (shRNA) wyrażonych z rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adenowirusem (rAAV), aby określić próg ekspresji shRNA, który może być tolerowany przed toksycznością wątroby związaną z nadmierną ekspresją shRNA6. Korzystając z tego protokołu, zidentyfikowaliśmy również mikroRNA w wątrobie, które reagują na brak mikroRNA-122 - wysoce eksprymowanego mikroRNA wątrobowego - jednocześnie charakteryzując wzorzec degradacji tego mikroRNA7. Ponieważ konsekwentnie stosowaliśmy nasz protokół w licznych eksperymentach, byliśmy w stanie obserwować preparaty próbek wzdłużnie i zobaczyć, że nie ma zauważalnych efektów wsadowych.

Udostępniając ten protokół, naszym celem jest umożliwienie użytkownikom generowania wysokiej jakości, powtarzalnej kwantyfikacji mikroRNA w praktycznie każdej tkance lub linii komórkowej, przy użyciu niedrogiego sprzętu i odczynników oraz darmowych narzędzi bioinformatycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Waszyngtońskiego.

Przygotowanie małej biblioteki RNA

1. Izolacja RNA

  1. Wyizoluj RNA ze źródła biologicznego za pomocą standardowego odczynnika do izolacji RNA lub zestawu wzbogacającego o mikroRNA. W przypadku tkanek najlepiej jest zacząć od próbek zamrożonych w ciekłym azocie i zmielonych na proszek za pomocą wstępnie schłodzonego moździerza i tłuczka.
  2. Zmierz integralność RNA każdej próbki na urządzeniu, które może określić ilościowo RNA i podać liczbę integralności RNA (RIN). Numery RIN powinny wynosić >7.

2. Podwiązanie adaptera 3'

  1. Przygotować reakcję ligacji w probówkach paskowych PCR, łącząc 11 μl RNA (1-3 μg, przy użyciu tej samej ilości dla każdej próbki), 1,5 μl 10x buforu reakcyjnego ligazy RNA T4, wolnego od ATP, 1 μl glikolu polietylenowego (PEG) i 0,5 μl łącznika 3' (100 μM uniwersalny łącznik do klonowania miRNA).
    UWAGA: Brak ATP pomaga wzbogacić miRNA i minimalizuje klonowanie produktów degradacji mRNA. PEG działa jako molekularny środek tłumiący, wzmacniając skuteczną ligację. Uniwersalny łącznik klonowania miRNA ma grupę blokującą 3' (aminę), aby zapobiec samoligacji, cyrkularyzacji i ligacji do RNA na końcu 5'.
  2. Podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C na termocyklerze przez 30-40 s. Schłodzić na lodzie przez 1 minutę. Dodać 1 μl ligazy T4 RNA 2 i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Przygotować żel (krok 2.3) podczas inkubacji próbek.
    UWAGA: Inkubacja w temperaturze pokojowej pomaga zapobiegać podwiązaniu łącznika-łącznika. Z powodzeniem zastosowaliśmy również ligazę T4 RNA 1.
  3. Przygotuj 30 ml 15% żelu poliakryloamidowego z 8 M mocznikiem (na żel 20x20 cm): 14,4 g mocznika, 3 ml 10x tris-buforowanego kwasu etylenodiaminotetraoctowego (TBE), 11,2 ml 40% 19:1 akrylamidu iH2Odo 30 ml. Roztwór najlepiej rozpuścić w temperaturze 42 °C. Bezpośrednio przed odlewaniem dodać 150 μl 10% nadsiarczanu amonu (APS) i 30 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) do polimeryzacji.
  4. Wlej między oddzielone od siebie szklane płytki o grubości 0,8 mm w plastikowym odlewie i włóż grzebień. Po zestaleniu się żelu (około 20 min) dodać 0,5 x TBE do zbiornika i energicznie przepłukać studzienki z resztek mocznika.
  5. Wstępnie uruchom żel przy stałym napięciu 375 V przez 25 minut bez próbek, aby mocznik mógł dostać się do żelu, a następnie ponownie umyj studzienki.
    UWAGA: Ilość voltage może być konieczne zmniejszenie w zależności od rodzaju używanego zasilacza i systemu elektroforezy.
  6. Po zakończeniu ligacji próbek dodać do nich 15 μl barwnika ładującego akryloamid (w stosunku 1:1), a następnie poddać je denaturacji przez 5 minut w temperaturze 95 °C na termocyklerze.
  7. Przygotować 25 ng/μl markerów o wielkości 37 i 44 pz, rozcieńczonych jedną częścią barwnika obciążającego akrylamidem. Sekwencje są wymienione w tabeli 1.
  8. Załadować próbki na żel poliakrylamidowy, pozostawiając co najmniej jeden pas między każdą próbką. Załaduj 20 μl co najmniej dwóch zestawów markerów w asymetryczny wzór, aby śledzić orientację żelu.
  9. Uruchom żel przy stałym napięciu 375 V przez pierwsze 15 minut, a następnie zwiększ do stałego 425 V przez pozostały cykl. Biegnij, aż błękit bromofenolowy znajdzie się około 1-4 cm od dna, co zajmuje około 2 godz.
    UWAGA: W razie potrzeby żel można uruchamiać przy niższym stałym napięciu przez dłuższy czas, aż błękit bromofenolowy znajdzie się około 1-4 cm od dna.
  10. Usuń żel ze szklanych płytek za pomocą separatora płytkowego i umieść żel na plastikowym ochraniaczu strony. Rozcieńczyć 5 μl bromku etydyny w 500 μl wody destylowanej i pipetować na pasy znacznika tuż nad górnym jasnoniebieskim znacznikiem (patrz Rysunek 1A).
    UWAGA: Używaj rękawic do bromku etydyny i utylizuj odpady zgodnie z lokalnymi przepisami. Odstaw na 5 minut.
  11. W świetle ultrafioletowym (UV) przetnij żele od górnego do dolnego znacznika na każdym pasie za pomocą czystej żyletki (patrz Rysunek 1A). Przenieś na kwadrat o wymiarach 4 x 4 cm z laboratoryjnej folii uszczelniającej, a następnie pokrój żel z około 4 nacięciami w poziomie i 3 w pionie, aby uzyskać 12 małych kwadratów (patrz Rysunek 1B).
  12. Odpipetować 400 μl 0,3 M NaCl na kwadrat folii uszczelniającej i przelać kawałki żelu do silikonowanych probówek o pojemności 1,5 ml (patrz Rysunek 1C). Mieszać próbki na nutatorze w temperaturze 4 °C przez noc.
    UWAGA: Inne probówki o niskiej retencji 1,5 ml można zastąpić probówkami silikonowanymi.
  13. Po co najmniej 12 godzinach mieszania w temperaturze 4 °C pobrać próbki i umieścić je na lodzie wraz ze stożkową rurką ze 100% etanolem.
  14. Przenieść 400 μl supernatantu do nowej probówki, a następnie dodać 1 ml 100% etanolu i 1 μl 15 mg/ml komrecipitantu glikogenu. Upewnij się, że zebrano jak najwięcej supernatantu, odkręcając w temperaturze 4 °C i pipetując więcej, jeśli to konieczne. Umieszczać w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę lub -20 °C przez 2 godziny lub dłużej. Glikogen koprecypitacyjny poprawia widoczność i odzysk granulek.
  15. Wirować w temperaturze 4 °C przy 17 000 x g przez 20-30 min. Usunąć wszelkie ślady etanolu i pozostawić granulat do wyschnięcia na powietrzu przez 5 minut.

3. 5' podwiązanie łącznika

  1. Ponownie zawiesić osad, pipetując w 6,5 μl wody wolnej od nukleaz. Pozostawienie granulatu w wodzie na kilka minut pomoże w ponownym zawieszeniu.
  2. Po odwirowaniu osadu i ponownym zatopieniu w wodzie, dodać 0,5 μl 100 μM 5'-linker (z kodami kreskowymi; patrz tabela 1), 1 μl buforu ligazy T4 RNA, 1 μl 10 mM ATP i 1 μl PEG. Podgrzewać w temperaturze 90 °C przez 30 s, a następnie umieścić na lodzie. Dodać 1 μl ligazy T4 RNA 1 i pozostawić do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  3. Dodać 400 μl 0,3 M NaCl, a następnie 400 μl kwaśnego fenolu/chloroformu. Wirować 30 s - 1 min (roztwór będzie wyglądał na mętny), a następnie wirować w temperaturze 4 °C przez 10-15 min z maksymalną prędkością w mikrowirówce (~17 000 x g). Zdejmij wierzchnią warstwę i umieść w nowej probówce o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Unikaj pipetowania dolnej warstwy.
  4. Dodać 350 μl chloroformu, krótko zwirować, a następnie wirować w temperaturze 4 °C przez 10 minut na maksymalnej prędkości (~17 000 x g). Odciągnij wierzch później i umieść w nowej probówce o pojemności 1,5 ml. Dodać 1,5 μl glikogenu i 1 ml 100% etanolu.
    UWAGA: Również w tym przypadku należy unikać pipetowania dolnej warstwy.
  5. Krótko przemieszać, a następnie umieścić w temperaturze -80 °C na co najmniej 1 godzinę lub -20 °C na noc.

4. Odwrotna transkrypcja (RT)

  1. Włącz blok grzewczy o temperaturze 42 °C. Wirować próbki w temperaturze 4 °C i ~17 000 x g przez 20-30 minut. Usuń cały supernatant i pozostaw granulki do wyschnięcia na powietrzu przez 5 minut.
  2. Ponownie zawiesić granulowaną próbkę w 8,25 μl wody wolnej od nukleaz, a następnie dodać: 0,5 μl 100 μM startera RT (Tabela 1) i 5 μL 2x RT Reaction Mix z zestawu do syntezy cDNA. Inkubować w temperaturze 42 °C przez 3 minuty.
  3. Dodać 1,5 μl 10x enzymu RT do każdej próbki i inkubować w temperaturze 42 °C przez 30 minut w termocyklerze. Umieścić w temperaturze -20 °C lub kontynuować hydrolizę i neutralizację.
    UWAGA: W krokach 4.2 i 4.3 można wykorzystać kilka zestawów RT.
  4. Przeprowadzić hydrolizę i neutralizację alkaliczną: Przygotować 1 ml 150 ml roztworu wodorotlenku potasu (KOH) (150 μl 1 M KOH, 20 μl 1 M Tris Base pH 7,5 i 830 μLH2O) i 1 ml 150 mM kwasu solnego (HCl) (150 μL 1 M HCl i 850 μLH2O).
  5. Przed dodaniem do próbek należy określić ilość HCl potrzebną do zneutralizowania roztworu KOH. Ogólnie rzecz biorąc, około 20-24 μl HCl zneutralizuje 25 μl KOH. Sprawdź kombinację na pasku pH, aby upewnić się, że mieści się we właściwym zakresie (pH od 7,0 do 9,5).
  6. Hydrolizować próbki, dodając 25 μl 150 mM roztworu KOH i inkubować przez 10 minut w temperaturze 95 °C.
  7. Zneutralizować próbki, dodając ilość 150 mM HCl oznaczoną w kroku 4.4, aby uzyskać pH próbki końcowej między 7,0 a 9,5.

5. Amplifikacja PCR

  1. Po neutralizacji przygotuj reakcję PCR z: 29,5 μl wody, 5 μl 10x buforu Taq, 1 μl dNTP, 2 μL startera 25 μM do przodu (Tabela 1), 2 μL 25 μM startera odwrotnego (Tabela 1), 0,5 μL Taq i 10 μL odwrotnie transkrybowanego cDNA z kroku 4.6.
  2. Uruchom następującą reakcję PCR: 94 °C przez 2 minuty, następnie 20 cykli 94 °C przez 45 s, 50 °C przez 75 s i 72 °C przez 60 s.
  3. Przeprowadź drugą reakcję PCR trwającą około 2-4 kolejne cykle, używając 5 μl produktu z kroku 5.2. Mieszać: 34,8 μl wody, 5 μl 10x buforu Taq, 1 μl dNTP, 1 μl 25 μM startera do przodu (tabela 1), 1 μl 25 μM startera wstecznego (tabela 1) i 0,2 μl polimerazy Taq. Postępuj zgodnie z tymi samymi parametrami termocyklera, które opisano w kroku 5.2.
    UWAGA: Celem przeprowadzenia dwóch reakcji PCR – z których pierwsza trwa 20 cykli, a druga tylko 2-4 więcej – jest upewnienie się, że ilość amplifikowanego cDNA mieści się w zakresie dynamicznym (tj. Nie jest to ilość nasycona).

6. Oczyszczanie żelem agarozowym

  1. Przygotuj 4% żel agarozowy z niskotopliwą agarozą. Załaduj 40 μl lub więcej produktu PCR na żel wraz z barwnikiem. Załaduj znaczniki rozmiaru 100 pz i 25 pz.
    UWAGA: Drabinka 25 pz pomaga odróżnić produkt amplifikowany od produktów ligacji łącznik-łącznik. Niskotopliwe żele agarozowe należy odlewać z większą starannością niż tradycyjne żele agarozowe, dlatego ściśle przestrzegaj instrukcji producenta.
  2. W przypadku ekstrakcji żelu wybierz numer cyklu, który jest widoczny na żelu, ale nie jest nasycony (zwykle 22–24 cykle). Wybierz podobne pasma intensywności podczas uruchamiania wielu próbek.
  3. Przetnij pasmo, które znajduje się powyżej pasma 125 pz (ciemniejsze pasmo na drabinie 25 pz; patrz Rysunek 1D). Korzystając z zestawu do ekstrakcji żelu, postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi dodawania buforu na bazie 4% żelu, a następnie wstrząśnij, aby rozpuścić agarozę w buforze w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Rozpuszczanie w temperaturze 55 °C zwiększa potencjał ligacji łącznik-łącznik.
  4. Postępuj zgodnie z instrukcją ekstrakcji żelu producenta i eluuj w 30 μl buforu elucyjnego lub wody. Jeśli produkt wyglądał słabo na żelu, zmniejsz elucję do 20 μl.
  5. Zmierz stężenie cDNA za pomocą czułej techniki i przygotuj bibliotekę próbek do sekwencjonowania. Przygotowanie będzie zależało od rodzaju zastosowanego sekwencjonowania.
    UWAGA: Minimalne wymagania dotyczące biblioteki sekwencjonowania to zazwyczaj objętość 10 μl produktu o objętości 10 μM. Jeśli stężenia są zbyt niskie, próbki należy wytrącić w kałużu i etanolu, aby doprowadzić bibliotekę do pożądanego stężenia.
  6. Sekwencjonowanie próbek przy użyciu dostępnego sprzętu. Typowym przykładem może być uruchamianie próbek przy użyciu zestawu do pojedynczych odczytów 50 bp, aby uzyskać około 15-25 milionów odczytów w formacie wyjściowym FASTQ.

Wyrównanie małej sekwencji RNA i bioinformatyka

7. Przesyłanie danych

  1. Pobierz pliki FASTQ wygenerowane z każdego przebiegu sekwencjonowania. Pobierz listę sekwencji spinek do włosów mikroRNA z miRbase.org8,9,10.
  2. Wygeneruj konto Galaxy na www.usegalaxy.org i prześlij plik FASTQ z odczytami sekwencji na to konto.
  3. Prześlij plik tekstowy z sekwencjami kodów kreskowych na konto Galaxy, taki jak barcodes.txt, który jest dostępny jako plik tekstowy (Tabela uzupełniająca 1).
  4. Prześlij plik FASTA z spinkami do włosów z mikroRNA na konto Galaxy z bazy danych takiej jak miRBase.org. Przykłady mysich (mousehairpins.fa) lub ludzkich (humanhairpins.fa) prekursorów mikroRNA podano w Tabeli Uzupełniającej 2 i Tabeli Uzupełniającej 3.

8. Wyjmowanie adaptera, sortowanie kodów kreskowych i przycinanie

  1. Na karcie po lewej stronie przejdź do opcji Manipulacja plikami genomicznymi > sekwencjami adaptera FASTA/FASTQ > Clip.
  2. W polu Plik wejściowy w formacie FASTA lub FASTQ wprowadź plik FASTQ z listy rozwijanej. Zmień Minimalna długość sekwencji na 18. Zmień źródło, aby wprowadzić sekwencję niestandardową. Wprowadź CTGTAGGC. Zachowaj wszystkie inne parametry domyślne. Kliknij przycisk Execute.
    UWAGA: Odczyty sekwencji, które są krótsze niż 18 nukleotydów, są trudne do jednoznacznego odwzorowania na mikroRNA i zawierają wiele produktów degradacji.
  3. Na karcie po lewej stronie przejdź do Manipulacja plikami genomicznymi > FASTA/FASTQ > Barcode Splitter.
    UWAGA: Funkcje Galaxy i nagłówki są okresowo aktualizowane, więc funkcja wyszukiwania może być konieczna do znalezienia równoważnego narzędzia lub jego lokalizacji. Zestawy komercyjne wykorzystujące indeksowane startery są często już posortowane według kodów kreskowych. Dlatego ten krok i etap przycinania kodu kreskowego nie są konieczne, jeśli zaczynasz od zestawu komercyjnego.
  4. W polu Kody kreskowe, które mają być używane, wskaż barcodes.txt. Aby podzielić bibliotekę, użyj opcji Przytnij do pliku danych utworzonego w poprzednim kroku. W polu Liczba dozwolonych niezgodności wprowadź wartość 1. Kliknij przycisk Execute (Wykonaj).
  5. Przytnij pierwsze 4 nukleotydy: przejdź do Manipulacje tekstem > Przycinanie znaków wiodących lub końcowych. W polu Wejściowy zestaw danych kliknij ikonę folderu, który jest kolekcją zestawów danych. Wybierz plik wsadowy próbek, który zawiera etykietę Rozdzielacz kodów kreskowych na danych. W polu Przytnij od początku do tej pozycji wprowadź wartość 5. W polu Czy wejściowy zestaw danych jest w formacie FASTQ? wprowadź wartość Tak. Kliknij przycisk Execute (Wykonaj). Wykonanie może potrwać kilka minut.

9. Wyrównanie odczytów do mikroRNA

  1. W Galaxy przejdź do Genomics Analysis > RNA-Seq > Sailfish transcript quantification11.
  2. W odpowiedzi na pytanie Wybierz transkryptom referencyjny z historii lub użyj wbudowanego indeksu? wybierz opcję Użyj jednego z historii. Wprowadź przesłany plik mousehairpins.fa z listy rozwijanej. W pliku FASTA/Q kliknij ikonę folderu, aby użyć kolekcji zestawów danych, a następnie wybierz plik, który zawiera opcję Przytnij przy kolekcji. Kliknij przycisk Execute (Wykonaj). Wykonanie może potrwać kilka minut.
  3. W zakładce historia po prawej stronie kliknij na Sailfish na kolekcji... która jest listą z 19 pozycjami. Kliknij każdy pojedynczy plik i kliknij ikonę dysku, aby zapisać go na komputerze lokalnym. Pojedynczo pobrane pliki należy najpierw rozpakować. Może być również konieczne ich ponowne zapisanie z rozszerzeniem .txt w celu zaimportowania do arkusza kalkulacyjnego.
  4. Otwórz każdy plik arkusza kalkulacyjnego w programie i zmień nazwę kolumny NumReads na warunek leczenia. Połącz kolumny ze sobą, aby wygenerować matrycę mikroRNA w pierwszej kolumnie i odczytać liczby dla każdego warunku w kolejnych kolumnach.
  5. Aby obliczyć mikroRNA o zróżnicowanej ekspresji dla każdego warunku leczenia, użyj pliku z surowymi liczbami odczytu mikroRNA jako danymi wejściowymi dla programów takich jak DESeq212. DESeq2 jest obecny w Galaxy w Genomics Analysis > RNA-seq > zakładce DESeq2.
  6. Konwertuj surowe odczyty na znormalizowane liczby odczytów mikroRNA. Liczby są normalizowane do głębokości sekwencji biblioteki za pomocą następujących obliczeń: [(odczyty surowe/łączna liczba odczytów mikroRNA) * (1 000 000 – liczba zliczonych mikroRNA) + 1].
    UWAGA: To obliczenie zapewnia znormalizowane odczyty na milion (RPM) zmapowanych mikroRNA, które można porównać w różnych zestawach danych i warunkach biologicznych. Dane wyjściowe to plik rozdzielany tabulatorami. Sailfish zapewnia kolumnę wyjściową tpm, chociaż wartość ta jest znormalizowana przez długość spinki do włosów mikroRNA, co nie jest konieczne w tym kontekście.
  7. W razie potrzeby powtórz wyrównanie z niestandardowymi sekwencjami wejściowymi (np. wektorem), aby zidentyfikować odczyty, które są mapowane na dostarczone konstrukcje, takie jak shRNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schemat kroków związanych z przygotowaniem biblioteki
Ogólny schemat ekstrakcji, sekwencjonowania i wyrównywania małych RNA jest przedstawiony w Rysunek 2.
Pobrano próbki wątroby od jednego samca i jednej samicy myszy i zamrożono je w ciekłym azocie. Całkowite RNA wyekstrahowano i oceniono pod kątem jakości i stężenia.

Sekwencjonowanie małych RNA daje wystarczającą i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomimo identyfikacji mikroRNA ponad 20 lattemu13, proces sekwencjonowania mikroRNA pozostaje pracochłonny i wymaga specjalistycznego sprzętu, co utrudnia laboratoriom rutynowe stosowanie wewnętrznych protokołów14. Inne techniki mogą jednocześnie oceniać mikroRNA, takie jak mikromacierze mikroRNA i multipleksowane panele ekspresyjne; jednak podejścia te są ograniczone, ponieważ określają ilościowo tylko mikroRNA obecne w ich zestawie sond. Z tego powodu brakuje im ważnych ce...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować członkom laboratoriów Andrew Fire i Marka Kaya za wskazówki i sugestie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100 pz drabinka DNANEBN3231
19:1 bis-akrylamidMillipore SigmaA9926
25 bp drabinka schodkowa DNAPromegaG4511
Kwas fenol/chloroformThermoFisherAM9720
Akrylamid Barwnik ładujący RNAThermoFisherR0641
Nadsiarczan amonu (APS)Biorad161-0700
BioanalizatorAgilentG2991AADo oceny jakości i stężenia RNA
ChloroformFisher ScientificC298-500
Etanol (100%)SigmaE7023
Bufor do ładowania żelu IIThermoFisherAM8547
GlycoBlueThermoFisherAM9516Kolor niebieski pomaga w wizualizacji granulatu
HClSigma 320331
KOHSigmaP5958
Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cmGenesee45-109
miRVana zestaw do izolacji mikroRNAThermoFisherAM1560
IlluminaSY-410-1003Do generowania małych danych
NaClFisher ScientificS271-500
Nusieve niskotopliwa agarozaLonza50081
Parafilm (laboratoryjna folia uszczelniająca)Millipore SigmaP7793
Glikol polietylenowy 8000NEBw zestawie z M0204
ProtoScript II Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNANEBE6560S
QIAquick Gel Zestaw do ekstrakcjiQiagen28704
Fluorometr kubitowyThermoFisherQ33226Do ilościowego określania stężenia DNA
Zestaw testowy Qubit RNA HS ThermoFisherQ32855
ŻyletkiFisher Scientific12640
Silikonowane probówki o niskiej retencji 1,5 mlFisher Scientific02-681-331
T4 RNA ligaza 1NEBM0204
T4 RNA Ligaza 2, ścięta K227QNEBM0351S
TapeStationAgilentG2939BADo oceny jakości i stężenia RNA
Polimeraza DNA TaqNEBM0273X
TEMEDBiorad161-0800
Tris Base pH 7,5Sigma10708976001
Tris-buforowany EDTASigmaT9285
TrizolThermoFisher15596026
Ultraczysty bromek etydyny (10 mg / ml)Invitrogen15585-011
Uniwersalny łącznik do klonowania miRNANEBS1315S
MocznikSigmaU5378
System miSeq sekwencjonowania RNA

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
  2. Bartel, D. P. Metazoan MicroRNAs. Cell. 173 (1), 20-51 (2018).
  3. Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
  4. Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C. Biogenesis of small RNAs in animals. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (2), 126-139 (2009).
  5. Gu, S., et al. The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo. Cell. 151 (4), 900-911 (2012).
  6. Valdmanis, P. N., et al. RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice. Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).
  7. Valdmanis, P. N., et al. miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression. Nature Communications. 9 (1), 5321(2018).
  8. Griffiths-Jones, S. The microRNA Registry. Nucleic Acids Research. 32, D109-D111 (2004).
  9. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).
  10. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).
  11. Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms. Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).
  12. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550(2014).
  13. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  14. Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids. Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).
  15. Yamane, D., et al. Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).
  16. Giraldez, M. D., et al. Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling. Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).
  17. Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19 (1), 118(2018).
  18. Yeri, A., et al. Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA. BMC Genomics. 19 (1), 331(2018).
  19. Coenen-Stass, A. M. L., et al. Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing. RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).
  20. Baran-Gale, J., et al. Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods. Frontiers in Genetics. 6, 352(2015).
  21. Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), e141(2011).
  22. Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6 (10), e26969(2011).
  23. Valdmanis, P. N., et al. Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma. Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).
  24. Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification. Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).
  25. Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis. BMC Biotechnology. 11, 72(2011).
  26. Chiang, H. R., et al. Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes. Genes & Development. 24 (10), 992-1009 (2010).
  27. Fromm, B., et al. A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome. Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja mikroRNAsekwencjonowanie RNAoczyszczanie w eluligacja adapter wodwrotna transkrypcjaamplifikacja PCRoczyszczanie w elu agarozowymanaliza bioinformatycznadopasowanie sekwencjiekspresja r nicowa

Powiązane artykuły