Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Fluorescencyjnie znakowane bakterie jako znacznik w celu ujawnienia nowych szlaków przepływu węgla organicznego w ekosystemach wodnych

6.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59903

⸱

13 września 2019

 , 
1Department of Aquatic Microbial Ecology, Institute of Hydrobiology, Biology Centre CAS

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół dla techniki opartej na mikroskopii epifluorescencyjnej dla pojedynczej komórki, do ilościowego określania wskaźników wypasu u wodnych drapieżnych eukariontów z wysoką precyzją i rozdzielczością taksonomiczną.

Streszczenie

Wyjaśnienie interakcji troficznych, takich jak drapieżnictwo i jego skutki, jest częstym zadaniem dla wielu badaczy ekologii. Badanie społeczności drobnoustrojów ma wiele ograniczeń, a określenie liczby drapieżników, ofiar i drapieżników jest często trudne. Przedstawiono zoptymalizowaną metodę opartą na dodaniu fluorescencyjnie znakowanej zdobyczy jako znacznika, co pozwala na wiarygodne określenie ilościowe wskaźników wypasu wodnych drapieżnych eukariontów i oszacowanie transferu składników odżywczych do wyższych poziomów troficznych.

Wprowadzenie

Heterotroficzne prokariota są kluczowym składnikiem biologicznym w systemach wodnych i stanowią znaczącą część biomasy planktonu1,2,3. Czynniki, które kontrolują ich obfitość, różnorodność i aktywność, są kluczowe dla zrozumienia ich roli w cyklach biogeochemicznych (tj. losie węgla organicznego i innych składników odżywczych oraz przepływu energii od prokariontów do wyższych poziomów troficznych). Jednym z tych ważnych czynników jest wypas pierwotniaków. Bakteriożerność heterotroficznych nanowiciowców i orzęsków narzuca silną odgórną kontrolę nad liczebnością prokariotyczne, funkcją społeczności, strukturą, różnorodnością, a nawet morfologią komórkową i tempem wzrostu poszczególnych grup bakterii4,5,6. W niektórych systemach protisty są główną przyczyną śmiertelności bakterii6,7.

Standardowe podejście używane do oceny bakteriożerności pierwotniaków, które jest stosowane już od jakiegoś czasu, obejmuje użycie fluorescencyjnie znakowanych bakterii (FLB) jako analogów ofiar i mikroskopii epifluorescencyjnej. Wskaźniki wychwytu specyficzne dla komórek można określić poprzez ilościowe określenie liczby znakowanych cząstek ofiary w wakuolach pokarmowych protistan w wybranym przebiegu czasowym8. Takie podejście ma kilka zalet. Smuga jest dodawana do naturalnych próbek z naturalnymi zbiorowiskami drapieżników i ofiar. Manipulacja próbką przed inkubacją jest minimalna, minimalna zmiana próbki przez dodany znacznik FLB, a czas inkubacji jest krótki, aby zapewnić dobre wyniki uzyskane w warunkach zbliżonych do in situ. Alternatywnie, w środowiskach o małej liczbie bakteriożernych protistów lub zooplanktonu (np. Morskie systemy morskie), wskaźniki zaniku FLB dodanego do próbek w małych ilościach (2%-3% znacznika) można wykryć za pomocą cytometrii przepływowej w długoterminowych (12-24 godzin) eksperymentach inkubacyjnych. Następnie liczby FLB w punkcie początkowym i końcowym (całkujące wpływ wszystkich bakteriożerców) są określane ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej (szczegóły w poprzedniej publikacji9). Jednak taki parametr reprezentuje tylko całkowite zagregowane wskaźniki bakteriożerności, których nie można bezpośrednio przypisać do żadnej konkretnej grupy lub gatunków pasących się protistanów i zooplanktonu.

Ogólnie rzecz biorąc, dokładne i ekologiczne określenie śmiertelności bakterii w środowisku wodnym dla gatunków protistanów lub morfotypów może być wyzwaniem. Niektóre protisty są selektywnie pasące się, a rozmiar i kształt komórki dodanego znacznika FLB może zniekształcać naturalne tempo połykania zdobyczy10,11. Co więcej, aktywność i metabolizm protistanu są bardzo wrażliwe na temperaturę12; w związku z tym ilość dodanego znacznika FLB musi być ostrożnie manipulowana dla każdego indywidualnego typu próbki (nie tylko w oparciu o naturalną liczebność, wielkość i morfologię bakterii i dominujących typów bakteriożerców, ale także na temperaturę). Większość badań koncentruje się na masowym wypasie protistanu; Jednak bakteriożerność określonych gatunków Protistan często ma znacznie wyższą wartość informacyjną i może być preferowana. W takim przypadku potrzebna jest wiedza taksonomiczna na temat gatunków protistów obecnych w próbce i zrozumienie ich zachowania. W związku z tym potrzeba znacznych ilości czasu i pracy, aby uzyskać rzetelne wyniki dotyczące specyficznych dla gatunku wskaźników bakteriożerności, które można przypisać określonej grupie protistanu lub gatunkowi.

Pomimo tych trudności, to podejście pozostaje obecnie najbardziej odpowiednim narzędziem do oceny bakteriożerności protistan w warunkach naturalnych. Przedstawiono kompleksową, łatwą do naśladowania metodę wykorzystania FLB jako znacznika w badaniach ekologii mikroorganizmów wodnych. Uwzględniono wszystkie wymienione problematyczne aspekty podejścia i opisano ulepszony przepływ pracy, z przykładami dwóch eksperymentów z kontrastujących środowisk, a także kontrastujących gatunków orzęsków.

Pierwsze studium przypadku zostało przeprowadzone w środowisku epilimnetycznym z mezotroficznego zbiornika wodnego Římov w Czechach, które wykazuje obfitość wypasów i bakterii porównywalną z większością powierzchniowych zbiorników słodkowodnych (por. 5,7). Drugie studium przypadku przeprowadzono w wysoce specyficznym środowisku wewnątrz pułapek wodnej rośliny mięsożernej Utricularia reflexa, w której występuje niezwykle duża liczba zarówno pasących się orzęsków miksotroficznych (Tetrahymena utriculariae), jak i komórek bakteryjnych. Przedstawiono obliczenia dotyczące wskaźników wypasu specyficznych dla komórek i stad bakterii w obu typach próbek. Następnie omówiono szereg ekologicznych interpretacji wyników, a na koniec zasugerowano przykłady możliwych badań uzupełniających.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Pobieranie próbek

  1. Pobieranie próbki wody ze zbiornika: pierwsze studium przypadku (Exp I; niższy naturalny system obfitości drapieżników i ofiar in situ)
    1. Pobrać próbki wody z żądanego miejsca na odpowiedniej głębokości. Próbki należy przechowywać w chłodziarce o kontrolowanej temperaturze, napełnionej temperaturą in situ (unikając szoku temperaturowego; należy zauważyć, że wskaźniki wychwytu protistów są zależne od temperatury) podczas transportu do laboratorium.
      UWAGA: Nasze próbki zostały przeprowadzone w mezoeutroficznym zbiorniku Římov w kształcie kanionu (Czechy Południowe, objętość 34,5 x 106 m3, maksymalna głębokość 43 m, średni czas retencji 100 dni, dimik). Miejsce pobierania próbek znajdowało się na głębokości 30 m, w pobliżu zapory. Próbka mieszana na głębokości 0,5 m została pobrana za pomocą 2-litrowego próbnika Friedingera.
    2. Przejdź do sekcji 1.2 tak szybko, jak to możliwe.
  2. Pobieranie płynu z pułapek mięsożernych roślin Utricularia reflexa: drugie studium przypadku (Exp II; system o dużej liczebności drapieżników i ofiar, wyjątkowo mała objętość próbki)
    1. Delikatnie potrząśnij roślinami pod wodą, wyjmij je z pojemnika uprawowego i umieść je na materiale chłonnym, aby wchłonąć nadmiar wody. W zależności od wytrzymałości roślin i wielkości pułapek wybierz 8-10 osobników roślin.
    2. Podziel każdy pęd na mniej więcej równe części, licząc węzły liściowe zawierające organy pułapkowe. Każdy segment pędu posłuży do zebrania mieszanych próbek reprezentujących młode, w średnim i starym wieku pułapki.
    3. Podłączyć cienką szklaną kapilarnę i fiolkę Eppendorf do pobierania próbek do pompy perystaltycznej. Przystąp do wkładania końcówki kapilarnej do otworu pułapki. Za pomocą pompy próżniowej odessać cały płyn z każdej pułapki, aż do zebrania 900 ± 100 μl płynu pułapkowego dla każdej kategorii wiekowej pułapki.
    4. Do eksperymentów z wypasem protistanu należy użyć trzech podpróbek zawierających 200 μl płynu pułapkowego. Przetwarzaj je natychmiast, jak opisano w sekcji 3. Pozostałe ±300 μl próbki należy zachować do wszystkich innych analiz składników mikrobiologicznych żyjących w płynie, jak opisano poniżej (sekcja 2).
    5. Przejdź natychmiast do sekcji 2.

2. Utrwalenie pobranych próbek

  1. Exp I i II: utrwalić podpróbki wody/płynu pułapkowego do oznaczania liczby bakterii (sekcja 4; odpowiednio około 20 ml i 0,3 ml) formaldehydem przez co najmniej 1 godzinę, aby uzyskać 2% końcowe stężenie objętościowo-objętościowe w każdej próbce.
    UWAGA: Z formaldehydem należy obchodzić się wyłącznie w dygestoriach i zawsze nosić rękawiczki podczas manipulowania próbkami.

3. Filtracja próbki

  1. Rozcieńczenie próbki (Exp I): nie jest wymagane rozcieńczanie próbek wody w zbiorniku. (Exp II): rozcieńczyć próbkę płynu pułapkowego 10x-100x wodą MQ wolną od cząstek, aby uzyskać odpowiedni rozkład docelowych drobnoustrojów na powierzchniach filtra przed zliczeniem za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej.
  2. Przefiltrować 1-2 ml (Exp I) wody w zbiorniku lub 10-30 μl (Exp II) podpróbki płynu pułapki do zliczania bakterii na czarne filtry o wielkości porów 0,2 μm, używając lejka filtracyjnego (średnica 25 mm).
  3. Zabarwić filtry DAPI (dichlorowodorek 4',6-diamidino-2'-fenyloindolu, 0,2% stężenie końcowe) przez 4 min.
    UWAGA: Unikaj zanieczyszczenia skóry i powierzchni roboczej oraz noś rękawice.
  4. Umieść filtr ze skoncentrowanymi drobnoustrojami na kropli olejku immersyjnego (do mikroskopii fluorescencyjnej) na szkiełku mikroskopowym. Umieść kolejną kroplę oleju na środku filtra i przykryj szkiełkiem nakrywkowym, upewniając się, że olej jest równomiernie rozprowadzony.
  5. Na tym etapie najlepiej natychmiast przetworzyć próbki lub przechowywać je w zamrażarce (-20 °C) przez kilka tygodni do miesięcy do czasu dalszej analizy.

4. Wyliczanie liczby bakterii na filtrach

  1. Umieść szkiełko pod mikroskopem epifluorescencyjnym (z zestawem filtrów odpowiadającym fluorochromowi DAPI). Umieść siatkę liczącą 10 x 10 w jednej z lornetek. Przesuń slajd w losowe miejsce.
  2. Określ ilościowo komórki bakteryjne (niebieska fluorescencja) w obszarze siatki zliczającej (pod powiększeniem 1000x). W zliczeniach uwzględnij komórki przecinające lewą i górną krawędź siatki zliczania, wykluczając komórki znajdujące się wzdłuż prawej i dolnej krawędzi.
  3. Przejdź do innej losowej pozycji i powtórz wyliczanie na co najmniej 10-15 siatkach zliczających, co daje w sumie 500 zliczonych komórek.
  4. Ustal współczynnik konwersji dla danego mikroskopu i powiększenia, w oparciu o wiedzę na temat stosunku powierzchni jednej siatki do całkowitej efektywnej powierzchni filtracji filtra. Następnie podziel całkowitą liczbę zliczonych komórek przez liczbę zliczonych siatek, uzyskując średnią liczbę bakterii na siatkę.
  5. Pomnóż ten ostatni parametr przez ustalony współczynnik konwersji i znormalizuj otrzymaną liczbę na ml próbki (w zależności od objętości przefiltrowanej próbki), aby uzyskać całkowitą liczebność bakterii na ml.

5. Określanie obfitości protistan

  1. Utrwalić próbkę wody (Exp I) lub podpróbki płynu pułapkowego (Exp II) za pomocą aldehydu glutarowego (1% stężenia końcowego, bardziej odpowiedniego dla próbek z obecnością cząstek zawierających chlorofil, które mają być przetworzone od kilku dni do tygodni po utrwaleniu) lub przy użyciu techniki odbarwiania formolowo-tiosiarczanowej określonej poniżej.
    UWAGA: Obie techniki konserwacji zapobiegają wydostawaniu się połkniętego materiału z wakuoli pokarmowych protistów8.
  2. Jeśli chodzi o technikę odbarwiania formolowo-tiosiarczanowego, należy dodać 100 μL/1 μL płynu Lugola do 20 ml/200 μL podpróbki wody/płynu pułapkowego (odpowiednio Exp I/Exp II).
  3. Natychmiast dodaj 0,5 ml/50 μl formaliny buforowanej boranem, a następnie 20 μl/2 μl 3% tiosiarczanu sodu (odpowiednio Exp I/Exp II).
    UWAGA: Tiosiarczan sodu odbarwia żółty kolor płynu Lugola, aby umożliwić obserwację komórek pod mikroskopem epifluorescencyjnym8.
  4. Przefiltruj znaną objętość próbki (w zależności od liczby docelowych protistów) na czarne filtry poliwęglanowe o wielkości porów 1 μm.
  5. Oszacuj liczbę gatunków protistów poprzez zliczenie co najmniej 200 komórek w powiększeniu 600x przy użyciu siatki zliczającej (patrz wyżej).
  6. Zmniejszyć objętość próbki pod próżnią w lejku filtracyjnym za pomocą niskiej próżni do około 2 ml. Następnie zwolnij podciśnienie i dodaj fluorochrom DAPI (dichlorowodorek 4',6-diamidino-2-fenyloindolu13, 0,2% stężenie końcowe) przez 2 min.

6. Określanie struktury orzęsków w próbkach planktonu

UWAGA: Zbiorowiska orzęsków w siedliskach słodkowodnych są bardzo zróżnicowane14,15,16,18, a ich mikroskopowe określenie jest trudne. Sortowanie grup orzęsków na funkcjonalne gildie10,14,16,17 pozwala na bardziej szczegółową analizę różnych grup orzęsków jako bakteriożerców pelagicznych.

  1. Oceń strukturę społeczności orzęsków, łącząc następujące elementy:
    1. Próbki barwione DAPI w mikroskopii epifluorescencyjnej (w celu zlokalizowania komórek orzęsków za pomocą jasnej fluorescencji makro- i mikrojąder o różnych rozmiarach i morfologii) w połączeniu z wychwytem bakterii znakowanych fluorescencyjnie (FLB8; szczegóły poniżej), śledząc zdolność orzęsków do odżywiania się bakteriami.
    2. Obserwacja próbki na żywo w wybranych przypadkach17,19. Więcej szczegółów na temat powyższych podejść i kryteriów stosowanych do grupowania orzęsków w różne kategorie taksonomiczne można znaleźć w poprzednich publikacjach16,17.
      UWAGA: Cytowane badania wykazały, że wśród orzęsków wszystkożerne gatunki z Stichotrichia (rodzaje Halteria i Pelagohalteria) i Oligotrichia (czyli Rimostrombidium spp.) są najważniejszymi pelagicznymi konsumentami bakterioplanktonu w zdecydowanej większości siedlisk słodkowodnych10,17,18.

7. Szacowanie wskaźników wypasu orzęsków

  1. Oblicz tempo wchłaniania orzęsków na bakteriach na podstawie zmian w średniej liczbie znaczników [tj. FLB8 na orzęsek w odniesieniu do czasu inkubacji (5-15 min)] i ilości znacznika dodanego FLB, co stanowi co najwyżej 5%-15% wszystkich bakterii.
  2. Aby porównać wskaźniki wychwytu między różnymi gatunkami protistanu, znormalizuj wskaźniki wychwytu jako liczbę bakterii na orzęsek na godzinę, z obliczeniami opartymi na rzeczywistym czasie inkubacji i proporcji znacznika FLB dodanego.
    UWAGA: Ogólny schemat zastosowania metody FLB do szacowania zarówno specyficznych dla komórek lub gatunków, jak i masowych wskaźników bakteriożerności w próbkach naturalnych jest przedstawiony w Rysunek 1.
  3. Przygotowanie FLB ze szczepów bakteryjnych występujących w środowisku słodkowodnym8
    1. Należy dobrać odpowiednią wielkość (średnia objętość komórek = MCV) i morfologię bakterii, tak aby skutecznie naśladowały typowe rozmiary bakterioplanktonu/komórek bakteryjnych w badanym systemie wodnym.
      UWAGA: Dla Exp I użyto mieszaniny wyizolowanych szczepów z badanego miejsca rodzaju Limnohabitans i Polynucleobacter (tj. typowego, bardzo obfitego bakterioplanktonu w jeziorach i stawach)20. Szczegółowe informacje na temat morfologii i rozmiarów szczepów można znaleźć w poprzednich publikacjach3,17,18,21.
    2. Zebrać komórki bakteryjne z hodowli przez odwirowanie (5 000 x g) przez 15 minut we wczesnej fazie stacjonarnej i wymieszać je w stosunku liczbowym, który daje MCV ± SD komórek w mieszaninie odpowiadających typowemu MCV bakterii w wybranym miejscu.
    3. Zawiesić granulki w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; pH = 9).
    4. Dodać 2 mg żółto-zielonego barwnika fluorescencyjnego 5-(4,6-dichlorotriazyno-2-ylo) aminofluoresceiny (DTAF, wiąże się z białkami) do zawiesiny komórkowej w buforze fosforanowo-solnym i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C przez 2 godziny.
    5. Po inkubacji odwirować komórki, zdekantować roztwór DTAF, a następnie przemyć i odwirować 3x PBS.
    6. Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić komórki w 20 ml buforuPP i-solankowego.
    7. Zawiesinę FLB i pipetować 1,5 ml porcji do fiolek kriogenicznych o pojemności 2 ml, a następnie przechowywać w stanie zamrożonym (w temperaturze -20 °C) w buforze PPdo soli fizjologicznej do czasu użycia.
    8. Wstępny filtr buforowy PP i-soli fizjologicznej przez filtr poliwęglanowy 0,2 μm do użycia w następnym kroku.
    9. Aby określić stężenie FLB, przenieś małą podwielokrotność (zwykle 20-40 μl) do 2 ml wolnego od cząstek buforu i-soli PP, poddaj sonifikacji przy 30 W przez kilka 2 serii i przefiltruj na filtr poliwęglanowy 0,2 μm w celu wyliczenia za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej (powiększenie 1,000x) przy ustawieniach filtra optycznego dla DTAF (448 nm/520-540 nm).
  4. Technika znacznikowa do oceny bakteriożerności orzęsków
    1. W przypadku eksperymentów z wypasem w naturalnych siedliskach planktonowych należy rozlać 300 ml próbek do dobrze wypłukanych kolb o pojemności 1 litra i inkubować w temperaturze in situ przez 15 minut (aby protisty mogły dojść do siebie po szoku związanym z obchodzeniem się).
    2. Dodaj znaczniki FLB, aby stanowiły 5%-15% wszystkich bakterii, przy czym ilości dodawane są w zależności od pory roku i temperatury wody.
      UWAGA: Istnieje bardzo szerokie, zależne od pory roku spektrum wskaźników wchłaniania specyficznych dla gatunków orzęsków, obejmujące kilka rzędów wielkości (tj. od 10 1-10 4 bakterii orzęsków-1 na godzinę)10,16,17,18,22,23,24.
    3. W okresach zwiększonego występowania orzęsków o wysokich wskaźnikach wychwytu (zwykle latem) należy również przeprowadzić równoległą inkubację z bardzo niskimi dodatkami FLB, stanowiącymi tylko 2%-4% wszystkich bakterii, aby uniknąć nadmiernego obciążenia wakuoli rzęsek przez znacznik FLB (patrz przykłady w Rysunek 2).
    4. Próbki orzęsków/planktonu należy inkubować z FLB przez 5-15 minut.
    5. Istnieją dwie możliwości utrwalenia próbki, aby zapobiec wydostaniu się połkniętego materiału z wakuoli pokarmowych protistów8. Zakończyć inkubację przez dodanie 1% aldehydu glutarowego (końcowe stężenie, które jest bardziej odpowiednie dla próbek z cząstkami zawierającymi chlorofil, takich jak glony). Alternatywnie należy użyć 100 μl/10 μl płynu Lugola do 20 ml/200 μl wody/płynu pułapkowego, a następnie natychmiast dodać 0,5 ml/10 μl formaliny buforowanej boranem, a następnie 200 μl/2 μl 3% tiosiarczanu sodu (odpowiednio Exp I/Exp II).
  5. Po dodaniu utrwalacza pozostawić próbki na co najmniej 1 godzinę w ciemności w temperaturze 4 °C, aby zapewnić dokładne zachowanie komórek orzęsków.
  6. Pobrać podpróbki naturalnego planktonu o objętości 4-30 ml/10-30 μl (odpowiednio Exp I/Exp II; objętość zależy od obfitości orzęsków) i zabarwić DAPI (stężenie końcowe 0,2% wag./obj.; szczegółowe informacje znajdują się w kroku 3.2 powyżej).
  7. Przepuść przez czarne filtry 1 μm i sprawdź za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej, aby policzyć orzęski (powiększenie 600x) i wyliczyć liczbę pobranych znaczników FLB (głównie przy powiększeniu 1000x), jak opisano w poprzednich publikacjach2,17. Sprawdź próbki w ciągu 7 dni po konserwacji.
  8. Aby oszacować całkowity wypas pierwotniaków/gatunków, należy pomnożyć średnie wskaźniki wypasu wszystkich orzęsków lub tylko gatunków orzęsków wykrytych na podstawie liczebności in situ.
  9. Przykład obliczenia wskaźników wychwytu na komórkę na podstawie danych in situ ze zbiornika wodnego Římov opisano w następujący sposób:
    1. Załóżmy, że stężenie bakterii wynosi 3,55 x 106 bakterii/ml, a dodany znacznik FLB wynosi 0,25 x 106 FLB/ml, co daje sumę 3,8 x 106 bakterii/ml całkowitych cząstek bakteryjnych (naturalne bakterie + FLB = 100% cząstek ofiary) dostępnych dla fagotroficznych protistów w naturalnej próbce.
      UWAGA: Dodane znaczniki FLB stanowią zatem 6,58% (projekt 0,25/0,038) całkowitych cząstek bakteryjnych. Średnia liczba FLB na Halteria sp. wynosi 6,2 FLB w 5-minutowych inkubacjach.
    2. Aby znormalizować wychwyt na godzinę, użyj następującego obliczenia: (6,2 x 12)/(6,58/100) = 1131 bakterii na komórkę Halteria/h,
      UWAGA: Aby uzyskać więcej przykładów rozkładów indywidualnych wskaźników wchłaniania Halteria sp. wykrytych w zmiennych temperaturach wody, ilości (w procentach) dodanego znacznika FLB i różnych czasach inkubacji z FLB, zobacz Rysunek 3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przykład eksperymentu I przeprowadzono w zbiorniku wodnym Římov (Bohemia Południowa, CZ), który jest stanowiskiem naturalnym o niższej naturalnej liczebności drapieżników i ofiar in situ. Przedstawiono reprezentatywne dane dla wszystkożernego gatunku rzęskowca Halteria grandinella, który jest licznym i wydajnym konsumentem cząstek pikoplanktonu (<2 µm)10,16,17,18

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Rozszyfrowanie interakcji troficznych w systemach wodnych jestzawsze wyzwaniem, zwłaszcza w przypadku skal nanoplanktonu obejmujących protisty i ich ofiary, bakterie. Jeśli chodzi o szlaki wchłaniania składników odżywczych i kwantyfikację, zastosowanie metod z powodzeniem stosowanych na wyższych poziomach troficznych jest mniej możliwe ze względu na wysoką złożoność interakcji biotycznych. Należą do nich na przykład podejścia do znakowania stabilnymi izotopami. Protokół ten pokazuje zalety stosowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Czeską Fundację Naukową w ramach grantu badawczego 13-00243S i 19-16554S przyznanego odpowiednio K. Š. i D. S. Artykuł powstał również przy wsparciu finansowym projektu "Biomanipulacja jako narzędzie poprawy jakości wody w zbiornikach zaporowych" (nr CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_025/0007417), finansowanego ze środków Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego, w ramach Programu Operacyjnego Badania, Rozwój i Edukacja.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

i
Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2-&mikro; m Filtry o wielkości porów SPI dostarcza, https://www.2spi.com/B0225-MBCzarne, poliwęglanowe filtry membranowe do wytrawiania ścieżek, średnica odpowiednia do zastosowanej aparatury filtrującej
5-(4,6-dichlorotriazyno-2-ylo)aminofluoresceina (DTAF)Dowolna marka
Pipety automatyczne o regulowanej objętości Dowolna marka, różne rozmiary
Wirówka22 000 x g
KriowialeDowolna marka, rozmiar
DAPI (4&ostrego;,6-Diamidino-2&ostrego;-dichlorowodorku fenyloindolu)Dowolna marka 1 mg ml-1
Mikroskop epiflorescencyjnyPowiększenie od 400 x do 1000 x
Filtry odpowiednie do oglądania w zakresie
Siatka zliczająca w jednej z lornetek
Aparatura filtrującaZwykle o średnicy 25 mm 
FormaldehydMarka do mikroskopii
Aldehyd glutarowyMarka do mikroskopii
Olejek immersyjny do mikroskopiiSpecyficzny olejek o niskiej fluorescencji
Lugol´ s roztwórDowolna marka lub zobacz komentarzPrzygotuj alkaliczny płyn Lugola w następujący sposób: Roztwór 1 - rozpuść 10 g jodku potasu w 20 ml w wodzie MQ, następnie dodaj 5 g jodu. Roztwór 2 - dodać 5 g octanu sodu  do 50 ml wody MQ. Dodaj roztwór 2 do roztworu 1 i dokładnie wymieszaj
formalinę stabilizowaną metanolemDowolna marka dostępna do celów
Szkiełka mikroskopowe i szkiełka nakrywkoweDowolna marka wyprodukowana do celów mikroskopowych 
Woda MQ do rozcieńczania próbekDowolna marka
 
Roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS; pH = 9)Dowolna marka0,05 M 0,05 M Na2HPO4-NaCl roztwór dostosowany do pH 9
0,02 M roztwór Na4P2O7-NaCl. Dodać 0,53 g Na4P2O7 do 100 ml wody MQ plus 0,85 g NaCl 
Urządzenie do pobierania próbek Odpowiednie do uzyskania reprezentatywnej próby np. próbnik Friedingera do planktonu jeziornego
Roztwór tiosiarczanu sodudowolny roztwór3%
SonicatorDowolna marka30 W
VortexDowolna marka pozwalająca  dokładne mieszanie substancji rozpuszczonych i próbek
Łaźnia wodnaDowolna marka pozwalająca na utrzymanie temperatury na poziomie 60 & stopni; Z
2 ml DAPI i DTAF mikroskopowychPP-solny Dowolnej marki W protokole stosuje się

Bibliografia

  1. Azam, F., et al. The ecological role of water-column microbes in the sea. Marine Ecology Progress Series. 10, 257-263 (1983).
  2. Šimek, K., et al. A finely tuned symphony of factors modulates the microbial food web of a freshwater reservoir in spring. Limnology & Oceanography. 59, 1477-1492 (2014).
  3. Šimek, K., et al. Bacterial prey food characteristics modulate community growth response of freshwater bacterivorous flagellates. Limnology & Oceanography. 63, 484-502 (2018).
  4. Šimek, K., et al. Changes in bacterial community composition, dynamics and viral mortality rates associated with enhanced flagellate grazing in a meso-eutrophic reservoir. Applied & Environmental Microbiology. 67, 2723-2733 (2001).
  5. Jürgens, K., Matz, C. Predation as a shaping force for the phenotypic and genotypic composition of planktonic bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek. 81, 413-434 (2002).
  6. Pernthaler, J. Predation on prokaryotes in the water column and its ecological implications. Nature Reviews Microbiology. 3, 537-546 (2005).
  7. Berninger, U. B., Finlay, J., Kuuppo-Leinikki, P. Protozoan control of bacterial abundances in freshwaters. Limnology and Oceanography. 36, 139-147 (1991).
  8. Sherr, E. B., Sherr, B. F. Protistan grazing rates via uptake of fluorescently labeled prey. Handbook of Methods in Aquatic Microbial Ecology. Kemp, P. F., Sherr, B. F., Sherr, E. B., Cole, J. J. , Lewis Publishers. Boca Raton, Florida. 695-701 (1993).
  9. Vazquez-Dominguez, E., Peters, F., Gasol, J. M., Vaqué, D. Measuring the grazing losses of picoplankton: methodological improvements in the use of fluorescently tracers combined with flow cytometry. Aquatic Microbial Ecology. 20, 119-128 (1999).
  10. Šimek, K., et al. Ecological role and bacterial grazing of Halteria spp.: Small oligotrichs as dominant pelagic ciliate bacterivores. Aquatic Microbial Ecology. 22, 43-56 (2000).
  11. Montagnes, D. J. S., et al. Selective feeding behaviour of key free-living protists: avenues for continued study. Aquatic Microbial Ecology. 53, 83-98 (2008).
  12. Kirchman, D. L. Processes in Microbial Ecology. 2nd Edition. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2018).
  13. Porter, K. G., Feig, Y. S. The use of DAPI for identifying and counting aquatic microflora. Limnology and Oceanography. 25, 943-948 (1980).
  14. Foissner, W., Berger, H. A user-friendly guide to the ciliates (Protozoa, Ciliophora) commonly used by hydrobiologists as bioindicators in rivers, lakes, and waste waters, with notes on their ecology. Freshwater Biology. 35, 375-482 (1996).
  15. Foissner, W., Berger, H., Schaumburg, J. Identification and ecology of limnetic plankton ciliates. Informationsberichte des Bayer Landesamtes für Wasserwirtschaft Heft. , 3-99 (1999).
  16. Šimek, K., et al. Ciliate grazing on picoplankton in a eutrophic reservoir during the summer phytoplankton maximum: a study at the species and community level. Limnology & Oceanography. 40, 1077-1090 (1995).
  17. Skibbe, O. An improved quantitative protargol stain for ciliates and other planktonic protists. Archiv für. Hydrobiolgie. 130, 339-347 (1994).
  18. Macek, M., et al. Growth rates of dominant planktonic ciliates in two freshwater bodies of different trophic degree. Journal of Plankton Research. 18, 463-481 (1996).
  19. Šimek, K., et al. Microbial food webs in hypertrophic fishponds: omnivorous ciliate taxa are major protistan bacterivores. Limnology & Oceanography. , in press (2019).
  20. Jezbera, J., et al. Major freshwater bacterioplankton groups: Contrasting trends in distribution of Limnohabitans and Polynucleobacter lineages along a pH gradient of 72 habitats. FEMS Microbiology Ecology. 81, 467-479 (2012).
  21. Kasalický, V., et al. The diversity of the Limnohabitans genus, an important group of freshwater bacterioplankton, by characterization of 35 isolated strains. PLoS One. 8, 58209(2013).
  22. Stabell, T. Ciliate bacterivory in epilimnetic waters. Aquatic Microbial Ecology. 10, 265-272 (1996).
  23. Zingel, P., et al. Ciliates are the dominant grazers on pico- and nanoplankton in a shallow, naturally highly eutrophic lake. Microbial Ecology. 53, 134-142 (2007).
  24. Bickel, S. L., Tang, K. W., Grossart, H. P. Ciliate epibionts associated with crustacean zooplankton in german lakes: distribution, motility, and bacterivory. Frontiers in Microbiology. 3 (243), (2012).
  25. Sirová, D., et al. Hunters or gardeners? Linking community structure and function of trap-associated microbes to the nutrient acquisition strategy of a carnivorous plant. Microbiome. 6, 225(2018).
  26. Šimek, K., et al. Ecological traits of a zoochlorellae-bearing Tetrahymena sp. (Ciliophora) living in traps of the carnivorous aquatic plant Utricularia reflexa. Journal of Eukaryotic Microbiology. 64, 336-348 (2017).
  27. Pitsch, G., et al. The green Tetrahymena utriculariae n. sp. (Ciliophora, Oligohymenophorea) with its endosymbiotic algae (Micractinium sp.), living in the feeding traps of a carnivorous aquatic plant. Journal of Eukaryotic Microbiology. 64, 322-335 (2017).
  28. Nielsen, J. M., Clare, E. L., Hayden, B., Brett, M. T., Kratina, P. Diet tracing in ecology: Method comparison and selection. Methods in Ecology and Evaluation. 9, 278-291 (2018).
  29. Beisner, B. E., Grossart, H. P., Gasol, J. M. A guide to methods for estimating phago-mixotrophy in nanophytoplankton. Journal of Plankton Research. , 1-13 (2019).
  30. Dolan, J. D., Šimek, K. Processing of ingested matter in Strombidium sulcatum, a marine ciliate (Oligotrichida). Limnology and Oceanography. 42, 393-397 (1997).
  31. Massana, R., et al. Grazing rates and functional diversity of uncultured heterotrophic flagellates. The ISME Journal. 3, 588-596 (2009).
  32. Grujčić, V., et al. Cryptophyta as major freshwater bacterivores in experiments with manipulated bacterial prey. The ISME Journal. 12, 1668-1681 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Bakterie fluorescencyjneznacznik bakteryjnywypas protistówmikroskopia epifluorescencyjnaanaliza pojedynczych komórektransfer węgla organicznegomikrobialne sieci pokarmoweinterakcje troficzne
Fluorescencyjnie znakowane bakterie jako znacznik w celu ujawnienia nowych szlaków przepływu węgla organicznego w ekosystemach wodnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.