Artykuł metodologiczny

Test in vitro w celu zbadania interakcji między guzem a makrofagami

7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59907

⸱

1 sierpnia 2019

 , 
1Department of Neurology, University of California, San Francisco, 2Helen Diller Family Comprehensive Cancer Center, University of California, San Francisco, 3Departments of Pediatrics and Neurological Surgery, University of California, San Francisco

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia użyteczny test in vitro do oceny zdolności kondycjonowanej pożywki z komórek nowotworowych do przyciągania makrofagów.

Streszczenie

Makrofagi związane z nowotworem (TAM) stanowią duży procent komórek w masie guza dla różnych typów nowotworów. Glejak wielopostaciowy (GBM), złośliwy guz mózgu, na który nie ma lekarstwa, ma do połowy masy guza TAM. TAM mogą być pronowotworowe lub przeciwnowotworowe, w zależności od aktywacji określonych genów w komórkach. Mutacje genetyczne w nowotworach, poprzez regulację ekspresji cytokin, mogą wpływać na rekrutację TAM do mikrośrodowiska guza. W tym miejscu opisujemy ilościowy test komórkowy do oceny rekrutacji makrofagów przez kondycjonowane podłoże z komórek nowotworowych. Test ten wykorzystuje ludzką linię komórkową makrofagów MV-4-11 do badania przyciągania makrofagów przez kondycjonowaną pożywkę z glejaka, co pozwala na wysoką odtwarzalność i niską zmienność. Dane uzyskane za pomocą tego testu mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia interakcji między guzem a mikrośrodowiskiem guza. Podobny test można zastosować do oceny interakcji między komórkami nowotworowymi a innymi komórkami odpornościowymi, w tym limfocytami T i komórkami NK (natural killer).

Wprowadzenie

Makrofagi to komórki odpornościowe o wysokiej heterogeniczności fenotypowej i funkcjonalnej1. Odgrywają ważną rolę w systemach obronnych gospodarza, naprawie tkanek, rozwoju i progresji guza1. TAM to makrofagi w mikrośrodowisku guzów litych. Niektóre TAM mogą promować wzrost guza poprzez hamowanie aktywności cytotoksycznej za pośrednictwem limfocytów T, modulowanie mikrośrodowiska guza (TME), promowanie angiogenezy, inwazji i przerzutów2,3,4,5. TAM są jednymi z najliczniejszych typów komórek w TME, a większa liczba TAM na ogół koreluje z gorszym przeżyciem pacjentów w wielu typach guzów litych6. Wyraźne sygnatury genetyczne komórek nowotworowych wpływają na ich zdolność do rekrutacji makrofagów. W GBM, agresywnym guzie mózgu, na który nie ma lekarstwa, makrofagi mogą stanowić nawet połowę masy guza7. W GBM często obserwuje się koamplifikację receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) i jego mutanta skracającego EGFRvIII, co daje korzyści we wzroście guza8. Komórki wykazujące współekspresję EGFR i EGFRvIII przyciągają więcej makrofagów w porównaniu z komórkami wykazującymi ekspresję EGFRvIII pojedynczo7.

Chemokin to rodzina małych cytokin, które odgrywają znaczącą rolę w regulacji składu immunologicznego w TME6,9. Komórki ludzkie wyrażają ponad 50 cytokin10. Infiltracja immunologiczna w nowotworach jest w dużej mierze realizowana przez interakcję między cytokinami a receptorami cytokin11. Każdy typ komórek odpornościowych wyraża odrębne receptory chemokin/chemokiny i może być rekrutowany przez komórki wydzielające określone chemokiny/receptory chemokin12. Komórki nowotworowe mogą zwiększać ekspresję niektórych chemokin w celu rekrutacji komórek odpornościowych, takich jak TAM, limfocyty T regulatorowe i komórki supresorowe pochodzenia mieloidalnego (MDSC)6. Blokada specyficznej chemokiny wydzielanej przez guzy może być obiecującym sposobem hamowania infiltracji komórek odpornościowych do masy guza.

Tutaj opisujemy protokół, który pozwala na ocenę in vitro interakcji guz-makrofag, przy użyciu kondycjonowanych pożywek z komórek nowotworowych zawierających chemokiny i linie komórkowe makrofagów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie podłoża

  1. Przygotowanie pożywki z komórek macierzystych bez surowicy
    1. Rozmrozić 50x suplement B27, naskórkowy czynnik wzrostu (EGF, 20 μg/ml w 10 mM kwasu octowego z 0,1% BSA) i czynnik wzrostu fibroblastów (FGF, 20 μg/ml w 10 mM kwas octowy z 0,1% BSA).
    2. Dodać 500 μl EGF (stężenie końcowe 20 ng/ml), 500 μl FGF (stężenie końcowe 20 ng/ml), 10 ml 50x B27 do 500 ml zmodyfikowanej mieszanki Eagle Medium / Nutrient Blend F-12 firmy Dulbecco (DMEM/F12) i 5 ml 100x penicylina/streptomycyna (długopis/paciorkowiec). Odwróć butelkę 4-6 razy, aby wymieszać, przefiltruj i wysterylizuj przez kubek filtracyjny o pojemności 500 ml 0,1 μm. Oznaczyć butelkę i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      nuta: Pożywkę można stosować przez okres do miesiąca w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotuj pożywkę hodowlaną MV-4-11: Dodaj 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do 500 ml zmodyfikowanej pożywki Dulbecco (IMDM) firmy Iscove. Odwróć butelkę 4-6 razy, aby wymieszać, przefiltruj i wysterylizuj przez kubek filtracyjny o pojemności 500 ml 0,1 μm. Oznaczyć butelkę i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    nuta: Pożywkę można stosować przez okres do miesiąca w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotuj pożywkę podtrzymującą komórki nowotworowe: Dodaj 50 ml FBS do 500 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco. Odwróć butelkę 4-6 razy, aby wymieszać, przefiltruj i wysterylizuj przez kubek filtracyjny o pojemności 500 ml 0,1 μm. Oznaczyć butelkę i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    nuta: Pożywkę można stosować przez okres do miesiąca w temperaturze 4 °C.

2. Przygotowanie komórek

Dzień 1:

  1. Rozmrażanie komórek nowotworowych
  2. Rozgrzać pożywkę do konserwacji komórek nowotworowych (jak opisano w kroku 1.3) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 minut.
  3. Weź zamrożone ogniwa U87, U87:EGFR, U87:EGFRvIII i U87:EGFR+EGFRvIII ze zbiornika ciekłego azotu. Rozmrażać komórki w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 2 min.
    UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas wyjmowania ogniw ze zbiornika ciekłego azotu. W razie potrzeby nosić rękawice z ochroną termiczną i okulary ochronne.
  4. Spryskaj powierzchnię kaptura do hodowli tkankowych 70% etanolem i zetrzyj 70% etanolu z powierzchni ręcznikami papierowymi.
  5. Spryskaj fiolki kriogeniczne zawierające komórki i pożywkę butelką 70% etanolem, zetrzyj 70% etanolu z powierzchni ręcznikami papierowymi i przenieś je do kaptura do hodowli tkankowej.
  6. Odpipetować 5 ml pożywki do utrzymania komórek nowotworowych do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwróć probówkę zawierającą komórki nowotworowe 4-6 razy, aby wymieszać. Odpipetować wszystkie komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwróć probówkę wirówkową 4-6 razy, aby wymieszać.
  7. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant.
  8. Umyj komórki 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant.
  9. Ponownie zawiesić komórki w 12 ml pożywki podtrzymującej komórki nowotworowe (zgodnie z opisem w kroku 1.3). Pipetować w górę i w dół 3-5 razy, aby wymieszać. Przenieść komórki do kolby do hodowli komórek T75.
  10. Hodować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Włóż pożywkę do konserwacji komórek nowotworowych z powrotem do lodówki o temperaturze 4 °C.

Dzień 2:

  1. Sprawdź komórki pod mikroskopem. W razie potrzeby zmień nośnik. Komórki powinny rosnąć w monowarstwie w hodowli.

Dzień 3:

  1. Rozmrażanie ogniw MV-4-11
    1. Rozgrzać pożywkę hodowlaną MV-4-11 (zgodnie z opisem w kroku 1.2) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 minut
      nuta: MV-4-11 można zmienić na pierwotne makrofagi lub inne linie komórkowe makrofagów, w zależności od potrzeb konkretnego badania.
    2. Weź zamrożone ogniwa MV-4-11 ze zbiornika ciekłego azotu. Rozmrażać komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 2 min.
      ostrożność: Zachowaj ostrożność podczas wyjmowania komórek ze zbiornika ciekłego azotu. W razie potrzeby nosić rękawice z ochroną termiczną i okulary ochronne.
    3. Spryskaj powierzchnię kaptura do hodowli tkankowych 70% etanolem i zetrzyj 70% etanolu z powierzchni ręcznikami papierowymi.
    4. Spryskaj fiolki kriogeniczne zawierające komórki i pożywkę butelką 70% etanolem, zetrzyj 70% etanolu z powierzchni ręcznikami papierowymi i przenieś je do kaptura do hodowli tkankowej.
    5. Odpipetować 5 ml pożywki hodowlanej MV-4-11 (zgodnie z opisem w kroku 1.2) do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwróć probówkę zawierającą komórki nowotworowe 4-6 razy, aby wymieszać. Odpipetować wszystkie komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwróć probówkę wirówkową 4-6 razy, aby wymieszać.
    6. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant.
    7. Przemyć komórki w 10 ml PBS i odwirować komórki w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant.
    8. Ponownie zawiesić komórki w 12 ml pożywki hodowlanej MV-4-11 (jak opisano w kroku 1.2). Delikatnie pipetuj w górę i w dół 3-5 razy, aby wymieszać. Przenieść komórki do kolby do hodowli komórek T75.
    9. Hodować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  2. Podział komórek nowotworowych
    1. Podgrzej pożywkę z komórkami macierzystymi bez surowicy (zgodnie z opisem w kroku 1.1) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 minut.
    2. Spryskaj powierzchnię kaptura do hodowli tkankowych 70% etanolem i zetrzyj 70% etanolu z powierzchni ręcznikami papierowymi. Wyjmij roztwór do oddzielania komórek z lodówki. Spryskaj butelki z roztworem do odwarstwiania pożywki i komórek 70% etanolem, zetrzyj 70% etanolu z powierzchni ręcznikami papierowymi i włóż je do kaptura do hodowli tkankowych.
      nuta: Nie podgrzewać wstępnie roztworu do oddzielania komórek akutazy.
    3. Przenieś hodowlę komórek nowotworowych z inkubatora do kaptura do hodowli tkankowej. Odessać pożywkę, dodać 2 ml roztworu do oddzielania komórek do kolby.
      nuta: Płukanie PBS przed dodaniem akutazy jest tutaj opcjonalne.
    4. Umieść kolbę w okapie. Sprawdź, czy komórki nowotworowe zaokrąglają się co minutę. Gdy komórki nowotworowe zaokrąglą się, delikatnie postukaj w bok kolby, aby pomóc komórkom odłączyć się od kolby.
    5. Odpipetować 8 ml pożywki z komórek macierzystych bez surowicy do kolby, pipetować 3 razy w górę i w dół, aby wymieszać, a następnie przenieść komórki do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant.
    6. Umyj komórki w 10 ml PBS. Pipetować w górę i w dół 3-5 razy, aby wymieszać. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant.
      nuta: Ten krok jest opcjonalny.
    7. Zawiesić komórki w 10 ml pożywki z komórkami macierzystymi bez surowicy (jak opisano w kroku 1.1). Pipetować w górę i w dół 3-5 razy, aby wymieszać. Weź 10 μl komórek i wymieszaj z 10 μl roztworu błękitu trypanowego. Odpipetować 10 μl mieszaniny do szkiełka zliczającego, określić ilościowo liczbę żywych komórek za pomocą automatycznego licznika komórek.
    8. Dostosuj gęstość komórek do 2,5 x 105 komórek/ml za pomocą pożywki z komórkami macierzystymi bez surowicy (jak opisano w kroku 1.1) i zamieść 2 ml komórek do każdego dołka 6-dołkowej płytki do hodowli komórek. Dla każdego rodzaju komórek należy zasiać 3 dołki (potrójna próbka). W tym samym czasie przygotuj 6 studzienek z 2 ml pożywki z komórkami macierzystymi bez surowicy (bez komórek).
      nuta: Próbki te zostaną wykorzystane: 1) jako kontrole ujemne i 2) do dostosowania objętości kondycjonowanej pożywki na podstawie liczby komórek.
    9. Umieścić płytki 6-dołkowe w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Pozwól komórkom rosnąć przez 24 godziny.

3. Test przyciągania makrofagów in vitro

  1. Przygotowanie kondycjonowanych pożywek
    1. Rozgrzać pożywkę do konserwacji komórek nowotworowych (jak opisano w kroku 1.3) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 minut.
    2. Spryskaj powierzchnię kaptura do hodowli tkankowych 70% etanolem i zetrzyj 70% etanolu z powierzchni ręcznikami papierowymi. Wyjmij roztwór do oddzielania komórek z lodówki. Spryskaj butelki z pożywką i roztworem do oddzielania komórek 70% etanolem, zetrzyj 70% etanolu z powierzchni ręcznikami papierowymi i wprowadź je do kaptura do hodowli tkankowej.
    3. Wyjąć płytki 6-dołkowe z inkubatora. Ostrożnie odpipetować kondycjonowaną pożywkę do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml. Połóż rurki na lodzie. Odpipetować pożywkę znajdującą się w "samym pożywce" do oddzielnej sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
      nuta: Przed tym krokiem sprawdź pod mikroskopem, czy komórki się przyczepiają. Jeśli nie, można użyć powlekanych płytek w kroku 2.4.8, aby umożliwić lepsze mocowanie lub uwzględnić pływające komórki na etapie liczenia.
    4. Dodaj 0,5 ml roztworu do oddzielania komórek do każdego dołka płytki 6-dołkowej. Sprawdź, czy komórki nowotworowe zaokrąglają się co minutę. Gdy komórki nowotworowe zaokrąglą się, delikatnie postukaj w bok płytki, aby pomóc komórkom się odłączyć.
    5. Odpipetować 2,5 ml pożywki do utrzymania komórek nowotworowych do studzienki, pipetować w górę iw dół 3 razy, aby wymieszać i przenieść komórki do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Weź 10 μl komórek i wymieszaj z 10 μl roztworu błękitu trypanowego. Odpipetować 10 μl mieszaniny na szkiełko liczące i określić ilościowo liczbę żywych komórek za pomocą automatycznego licznika komórek.
    6. Dostosuj objętość kondycjonowanej pożywki w zależności od liczby komórek, używając pożywki z komórkami macierzystymi wolnymi od surowicy (inkubacja w temperaturze 37 °C przez noc). Na przykład, jeśli studnia A ma 3 razy więcej żywych komórek niż studnia z najmniejszą liczbą komórek, rozcieńczyć jej kondycjonowane podłoże w stosunku 1:3. Ten krok służy do kontrolowania różnicy spowodowanej szybkością proliferacji komórek.
      nuta: Powodem, dla którego zaleca się stosowanie pożywki z komórkami macierzystymi bez surowicy w inkubacji w temperaturze 37 °C przez noc, jest kontrola możliwej zmiany w pożywce przy długotrwałej ekspozycji na 37 °C.
    7. Przefiltruj kondycjonowane media przez filtry 0,45 μm. Umieść kondycjonowane podłoże na lodzie.
      nuta: Ten etap usuwa komórki i resztki komórek w kondycjonowanym pożywce.
  2. Przygotowanie ogniw MV-4-11
    1. Podgrzej pożywkę IMDM (bez FBS) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 minut.
    2. Spryskaj powierzchnię kaptura do hodowli tkankowych 70% etanolem i zetrzyj 70% etanolu z powierzchni ręcznikami papierowymi. Spryskaj pożywkę butelką 70% etanolem, zetrzyj 70% etanolu z powierzchni ręcznikami papierowymi i włóż je do kaptura do hodowli tkankowej.
    3. Przenieść kolbę komórek MV-4-11 do okapu do hodowli tkankowej. Pobrać pipetą 10 ml komórek do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Weź 10 μl komórek i wymieszaj z 10 μl roztworu błękitu trypanowego. Odpipetować 10 μl mieszaniny na szkiełko liczące i określić ilościowo liczbę żywych komórek za pomocą automatycznego licznika komórek. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant.
    4. Przemyć komórki 10 ml PBS i odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant.
    5. Ponownie zawiesić komórki w pożywce IMDM (bez FBS), aby uzyskać końcową gęstość komórek 1x106 komórek/ml.
      nuta: Liczbę komórek użytych tutaj makrofagów można dostosować.
  3. Test Transwell
    nuta: Na tym etapie użyj zestawu do oznaczania migracji komórek lub kup odczynniki i włóż je osobno. W przypadku ogniw MV-4-11 wybierz wkładki Transwell o wielkości porów 5 μm. Aby wykryć migrację makrofagów, należy bezpośrednio określić ilościowo liczbę makrofagów w dolnej komorze lub użyć metod kolorymetrycznych/fluorymetrycznych. Tutaj demonstrujemy test za pomocą metody kolorymetrycznej.
    1. Doprowadzić płytkę 24-dołkową, wkładkę i odczynniki do temperatury pokojowej.
    2. Do każdej wkładki dodać 250 μl przygotowanych powyżej komórek MV-4-11.
    3. Dodać 400 μl kondycjonowanej pożywki/samej pożywki (przy całonocnej inkubacji w temperaturze 37 °C, próbki te służą jako kontrola ujemna) do dolnych komór płytki 24-dołkowej. Dla każdej linii nowotworowej lub kontroli należy użyć trzech próbek. Unikaj pęcherzyków powietrza między wkładką a kondycjonowanym medium. Bąbelki będą hamować migrację makrofagów do studzienek dennych.
    4. Inkubować płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 4 godziny
      nuta: Czas inkubacji można dostosować. Komórki migrujące do dolnych komór można zobaczyć pod mikroskopem.
    5. Delikatnie postukaj wkładką w wewnętrzną ścianę tej samej studzienki i wyrzuć wkładkę. Ponieważ komórki MV-4-11 rosną w zawiesinie, roztwór do odrywania komórek lub leczenie trypsyną nie jest tutaj potrzebne.
    6. Delikatnie odpipetuj komórki w studzienkach 3 razy w górę iw dół, aby wymieszać. Przenieść 225 μl zawiesiny komórek na czarnościenną 96-dołkową płytkę odpowiednią do pomiaru fluorescencyjnego.
    7. Rozcieńczyć barwnik CyQuant w stosunku 1:75 z 4x buforem do lizy. Krótko odwiruj i odkręć roztwór. Dodać 75 μl roztworu do każdego dołka na 96-dołkowej płytce. Inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Odczyt fluorescencji za pomocą zestawu filtrów 480/520 nm z czytnikiem płytek fluorescencyjnych.
    9. Analizuj dane, odejmując ślepą próbę i normalizując do linii komórek kontrolnych nowotworu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyniki są zazwyczaj przedstawiane za pomocą wykresów słupkowych (przykład pokazany w Rysunek 1). Próbki o wysokich wartościach 480/520 wskazują, że kondycjonowane podłoże ma wysoką zdolność do rekrutacji makrofagów. W zależności od potrzeb eksperymentalnych można dołączyć dodatkowe kontrole. Na przykład można użyć przeciwciał neutralizujących do leczenia kondycjonowanych pożywek w celu zniesienia chemotaksji makrofagów i wykonać ten sam test. Można również do...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym protokole jest kilka kluczowych kroków: 1) wybór wkładki Transwell. W przypadku linii komórkowej MV-4-11 dobrze sprawdzają się wkładki Transwell 5 μm. Jednak w przypadku innych linii komórkowych, takich jak powszechnie stosowana linia komórkowa monocytów THP-1, inna wielkość porów może działać lepiej. 2) Ponieważ różne linie komórkowe rosną z różnymi prędkościami, ważne jest, aby dostosować objętość kondycjonowanego podłoża do liczby komórek. W tym celu do rozcieńczenia kondycjonowanych pożywek można użyć pożywek b...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

William A. Weiss jest współzałożycielem StemSynergy Therapeutics. Żenij An nie ma nic do wyjawienia.

Podziękowania

Udziel wsparcia: Z. Otrzymał wsparcie od Alex's Lemonade Stand Foundation, American Brain Tumor Association, NIH T32CA108462 i Program for Breakthrough Biomedical Research, który jest częściowo finansowany przez Sandler Foundation. W. Weiss był wspierany przez granty NIH R01CA221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103; Fundacja Badań nad Rakiem im. Samuela G. Waxmana; oraz Przewodnicząca Evelyn i Mattie Anderson.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,1 μ m kubek filtracyjnyThermo fisher566-0010
0,45 μ m jednostka filtrującaMilliporeSLHA033SS
10 mlOlympus plastics12-104
15 ml sterylne probówki wirówkoweOlympus plastics28-103
Końcówka do pipety 1 mlART bioprodukty molekularne2779-RI
Pipeta aspiracyjna 2 mlFalcon357558
24-dołkowa płytkaMilliporeECM507Część ECM507 lub można ją kupić osobno
4x bufor do lizyMilliporeECM507Część ECM507 lub można ją kupić osobno
5 μ m Wkładka TranswellMilliporeECM507Część ECM507 lub można ją kupić osobno
75 cm2 kolbaCorning430641U
AccutaseInnowacyjne technologie ogniwAT-104
B27Gibco12587-010
CyQuant DyeMilliporeECM507Część ECM507 lub można je kupić osobno
DMEMGibco11965-092
DMEM: F12Gibco10565-018
EGFPeprotechAF-100-15
FBSGibco26140
FGFPeprotech100-18B
IMDMGibco12440-053
PBSGibco14190-144
Długopis StrepGibco15140-122
Trypan niebieskiBiorad1450021
Pipety serologiczne

Bibliografia

  1. Liu, Y., Cao, X. The origin and function of tumor-associated macrophages. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 1-4 (2015).
  2. Riabov, V., et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Frontiers in Physiology. 5, (2014).
  3. Coussens, L. M., Zitvogel, L., Palucka, A. K. Neutralizing tumor-promoting chronic inflammation: a magic bullet. Science. 339 (6117), 286-291 (2013).
  4. Tsukamoto, H., et al. Combined Blockade of IL6 and PD-1/PD-L1 Signaling Abrogates Mutual Regulation of Their Immunosuppressive Effects in the Tumor Microenvironment. Cancer Research. 78 (17), 5011-5022 (2018).
  5. Borgoni, S., et al. Depletion of tumor-associated macrophages switches the epigenetic profile of pancreatic cancer infiltrating T cells and restores their anti-tumor phenotype. Oncoimmunology. 7 (2), e1393596(2018).
  6. Argyle, D., Kitamura, T. Targeting Macrophage-Recruiting Chemokines as a Novel Therapeutic Strategy to Prevent the Progression of Solid Tumors. Frontiers in Immunology. 9, 2629(2018).
  7. An, Z., et al. EGFR cooperates with EGFRvIII to recruit macrophages in glioblastoma. Cancer Research. , (2018).
  8. Fan, Q. W., et al. EGFR phosphorylates tumor-derived EGFRvIII driving STAT3/5 and progression in glioblastoma. Cancer Cell. 24 (4), 438-449 (2013).
  9. Jacquelot, N., Duong, C. P. M., Belz, G. T., Zitvogel, L. Targeting Chemokines and Chemokine Receptors in Melanoma and Other Cancers. Frontiers in Immunology. 9, 2480(2018).
  10. Arimont, M., et al. Structural Analysis of Chemokine Receptor-Ligand Interactions. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (12), 4735-4779 (2017).
  11. Turner, M. D., Nedjai, B., Hurst, T., Pennington, D. J. Cytokines and chemokines: At the crossroads of cell signalling and inflammatory disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (11), 2563-2582 (2014).
  12. Sokol, C. L., Luster, A. D. The chemokine system in innate immunity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (5), (2015).
  13. Pathria, P., Louis, T. L., Varner, J. A. Targeting Tumor-Associated Macrophages in Cancer. Trends in Immunology. 40 (4), 310-327 (2019).
  14. Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 399-416 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza medium warunkowanegorekrutacja makrofag wkom rki glejaka wielopostaciowegokom rki MV 4 11roztw r do odrywania kom rekbarwienie b kitem trypanufluorescencyjny odczyt p ytekanaliza cytometrycznapotwierdzenie metod CyTOF

Powiązane artykuły