Czterowymiarowa wizualizacja dynamiki powierzchniowego receptora limfocytów T przy użyciu mikroskopii świetlnej kratowej

Summary

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak używać mikroskopii świetlnej do czterowymiarowej wizualizacji dynamiki receptorów powierzchniowych w żywych komórkach. Tutaj pokazano receptory limfocytów T na pierwotnych limfocytach T CD4 ⁺.

Abstract

Sygnalizacja i funkcja komórki są podyktowane dynamicznymi strukturami i interakcjami jej receptorów powierzchniowych. Aby naprawdę zrozumieć zależność struktura-funkcja tych receptorów in situ, musimy je wizualizować i śledzić na powierzchni żywej komórki z wystarczającą rozdzielczością czasoprzestrzenną. Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać niedawno opracowaną mikroskopię Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) do czterowymiarowego obrazowania receptorów komórek T (TCR) (4D, przestrzeń i czas) na żywej błonie komórkowej. Limfocyty T są jednymi z głównych komórek efektorowych adaptacyjnego układu odpornościowego, a tutaj użyliśmy limfocytów T jako przykładu, aby pokazać, że sygnalizacja i funkcja tych komórek są napędzane przez dynamikę i interakcje TCR. LLSM pozwala na obrazowanie 4D z niespotykaną dotąd rozdzielczością czasoprzestrzenną. Ta technika mikroskopowa może być zatem ogólnie stosowana do szerokiej gamy cząsteczek powierzchniowych lub wewnątrzkomórkowych różnych komórek w biologii.

Introduction

Precyzyjna dynamika molekuł przemieszczających się i dyfundujących na powierzchni trójwymiarowej komórki w czasie rzeczywistym była zagadką do rozwiązania. Mikroskopia zawsze była równowagą między szybkością, czułością i rozdzielczością; Jeśli jeden lub dwa są maksymalizowane, trzeci jest minimalizowany. Dlatego, ze względu na niewielkie rozmiary i ogromną prędkość, z jaką poruszają się receptory powierzchniowe, śledzenie ich dynamiki pozostało głównym wyzwaniem technologicznym w dziedzinie biologii komórki. Na przykład wiele badań przeprowadzono przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)^1,

Protocol

5C. C7 TCR-transgeniczne myszy z nokautem RAG2 w B10. W tym badaniu wykorzystano tło zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Chicago.

1. Zbieranie i aktywacja limfocytów T

UWAGA: Ta część protokołu jest oparta na poprzednich protokołach. Zobacz cytaty, aby uzyskać więcej informacji^20,21.

1. Poddaj eutanazji 10-12 tygodniowego 5C. Transgeniczna mysz C7 dowolnej płci (~20-25 g) zgodnie z zatwierdzonym protokołem IACUC (tj. komora CO₂, po której następuje zwichnięci....

Results

Tutaj opisujemy izolację, przygotowanie i obrazowanie myszy podstawowej 5C. Limfocyty T C7 przy użyciu siatkowego mikroskopu świetlnego. W sekcji 3 konieczne jest prawidłowe ustawienie mikroskopu i codzienne pobieranie PSF, za pomocą którego można zdekonwolucjonizować dane po pobraniu. W Rysunek 2, pokazujemy poprawne obrazy wyrównania, które będą widoczne podczas ustawiania mikroskopu. Rysunek 2A i Rysunek2 B pokazuje.......

Discussion

Prezentowany protokół został zoptymalizowany pod kątem wykorzystania limfocytów T CD4⁺ wyizolowanych z 5C. Myszy transgeniczne C7 na używanym instrumencie LLSM, a zatem inne systemy komórkowe i LLSM mogą wymagać innej optymalizacji. Jednak protokół ten pokazuje moc obrazowania 4D, ponieważ można go wykorzystać do ilościowego określenia dynamiki receptora powierzchniowego na całej komórce przy najmniejszych zniekształceniach w warunkach fizjologicznych. Dlatego istnieje wiele możliwych przyszłych zastosowań tej.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Strzykawka	BD	309659	Do pobierania komórek T
2-Merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148-25ML	Do hodowli komórek T
Okrągłe szkiełka nakrywkowe 5 mm	World Precision Instruments	502040	Do obrazowania
70um Sterylne sitko do komórek Corning		7201431	do zbierania komórek T
Alexa Fluor 488 przeciwciało przeciw myszemu TCR i łańcuchowi beta	BioLegend	109215	do obrazowania
płodowej surowicy bydlęcej (FBS)	X& Hodowla komórek Y	FBS-500	Do hodowli komórek T
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	Odczynnik gradientu Denisty do pobierania komórek T
Sól sodowa fluoresceiny	Sigma-Aldrich	F6377	Do wyrównania mikroskopu
FluoSpheres Mikrosfery modyfikowane karboksylanem	Thermo Fisher Scientific	F8810	Do wyrównania mikroskopu
Imaris	Bitplane	dotyczy	Oprogramowanie do śledzenia; Inne opcje oprogramowania śledzącego to Amira lub Trackmate (Fidżi).
Mikroskop kratowy z arkuszami świetlnymi	3i	Mikroskop N/A	Używany
Leibovitz L-15 Medium, bez czerwieni fenolowej	Thermo Fisher Scientific	21083027	do obrazowania
L-glutaminy	Thermo Fisher Scientific	25030-081	do hodowli komórek T
LLSpy	Janelia Research Campus	N/A	LLSpy był używany na podstawie licencji Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Skontaktuj się z innovation@janelia.hhmi.org, aby uzyskać dostęp. Inne metody dekonwolucji i deksowania są dostępne w programach do przetwarzania obrazu, takich jak Fiji, Slidebook, Amira i inne. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/
Moth Cytochrom C (MCC), sekwencja ANERADLIAYLKQATK	Niestandardowa synteza	Elimbio	do pozyskiwania limfocytów T
Penacylina/Streptamycyna	Life Technologies	15140122_3683884612	Do hodowli komórek
T Produkty badawcze Poly-L-Lizyna	Phenix	P8920-100ML	Do obrazowania
buforu do lizy RBC	eBioscience	00-4300-54	Do zbierania komórek T
Rekombinowana mysz IL-2	Sigma-Aldrich	I0523	Do hodowli komórek T
RPMI 1640 Medium	Corning	MT10040CV	do hodowli komórek
T Slidebook	3i	Oprogramowanie do obrazowania N/A	LLSM
Chirurgiczne narzędzia	do preparacjiNova-Tech International	DSET10	Do zbierania limfocytów T
Kolby T-25	Eppendorf	2231710126	Do hodowli komórek
T Thermo Scientific Pierce Fab Micro Zestawy przygotowawcze	Thermo Fisher Scientific	44685	Do przygotowania Fab