Method Article

Czterowymiarowa wizualizacja dynamiki powierzchniowego receptora limfocytów T przy użyciu mikroskopii świetlnej kratowej

DOI:

10.3791/59914

⸱

January 30th, 2020

 , 
1Committee on Cancer Biology, The University of Chicago, 2Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak używać mikroskopii świetlnej do czterowymiarowej wizualizacji dynamiki receptorów powierzchniowych w żywych komórkach. Tutaj pokazano receptory limfocytów T na pierwotnych limfocytach T CD4 +.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sygnalizacja i funkcja komórki są podyktowane dynamicznymi strukturami i interakcjami jej receptorów powierzchniowych. Aby naprawdę zrozumieć zależność struktura-funkcja tych receptorów in situ, musimy je wizualizować i śledzić na powierzchni żywej komórki z wystarczającą rozdzielczością czasoprzestrzenną. Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać niedawno opracowaną mikroskopię Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) do czterowymiarowego obrazowania receptorów komórek T (TCR) (4D, przestrzeń i czas) na żywej błonie komórkowej. Limfocyty T są jednymi z głównych komórek efektorowych adaptacyjnego układu odpornościowego, a tutaj użyliśmy limfocytów T jako przykładu, aby pokazać, że sygnalizacja i funkcja tych komórek są napędzane przez dynamikę i interakcje TCR. LLSM pozwala na obrazowanie 4D z niespotykaną dotąd rozdzielczością czasoprzestrzenną. Ta technika mikroskopowa może być zatem ogólnie stosowana do szerokiej gamy cząsteczek powierzchniowych lub wewnątrzkomórkowych różnych komórek w biologii.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Precyzyjna dynamika molekuł przemieszczających się i dyfundujących na powierzchni trójwymiarowej komórki w czasie rzeczywistym była zagadką do rozwiązania. Mikroskopia zawsze była równowagą między szybkością, czułością i rozdzielczością; Jeśli jeden lub dwa są maksymalizowane, trzeci jest minimalizowany. Dlatego, ze względu na niewielkie rozmiary i ogromną prędkość, z jaką poruszają się receptory powierzchniowe, śledzenie ich dynamiki pozostało głównym wyzwaniem technologicznym w dziedzinie biologii komórki. Na przykład wiele badań przeprowadzono przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)1,2,3, który ma wysoką rozdzielczość czasową, ale może obrazować tylko bardzo cienki wycinek błony komórek T (~100 nm), a zatem pomija zdarzenia dziejące się dalej w komórce. Te obrazy TIRF również pokazują tylko dwuwymiarowy wycinek komórki. Z kolei techniki superrozdzielcze, takie jak stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM)4, mikroskopia lokalizacyjna aktywowana fotoaktywowaną (PALM)5 i mikroskopia zubożenia emisji stymulowanej (STED)6, mogą pokonać limit dyfrakcji światła Abbego. Techniki te mają wysoką rozdzielczość przestrzenną (rozdzielczość ~20 nm)4,5,6,7, ale często potrzebują wielu minut, aby uzyskać pełny obraz dwuwymiarowy (2D) lub trójwymiarowy (3D), a zatem rozdzielczość czasowa jest tracona. Ponadto techniki takie jak STORM i PALM, które opierają się na sygnałach, mogą mieć niedokładności w liczeniu8,9. Mikroskopia elektronowa ma zdecydowanie najwyższą rozdzielczość (do 50 pm rozdzielczość)10; może być nawet przeprowadzany trójwymiarowo za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej ze skupioną wiązką jonów (FIB-SEM), co daje rozdzielczość do 3 nm XY i 500 nm Z11. Jednak każda forma mikroskopii elektronowej wymaga surowego przygotowania próbki i może być przeprowadzana tylko z nieruchomymi komórkami lub tkankami, co eliminuje możliwość obrazowania żywych próbek w czasie.

Techniki uzyskiwania wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej wymaganej do identyfikacji dynamiki molekuł powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych w żywych komórkach w ich prawdziwej fizjologicznej naturze 3D dopiero niedawno opracowane. Jedną z tych technik jest Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)12, która wykorzystuje strukturalny arkusz światła w celu drastycznego obniżenia fotowybielania. Opracowana w 2014 roku przez laureata Nagrody Nobla Erica Betziga, wysoka rozdzielczość osiowa, niski poziom fotobielenia i szumów tła oraz możliwość jednoczesnego obrazowania setek płaszczyzn na pole widzenia sprawiają, że mikroskopy LLS są lepsze od mikroskopów szerokokątnych, TIRF i konfokalnych12,13,14,15,16,17,18,19. Ta czterowymiarowa (x, y, z i czasowa) technika obrazowania, choć nadal ograniczona dyfrakcją (rozdzielczość XYZ ~200 nm), ma niesamowitą rozdzielczość czasową (osiągnęliśmy liczbę klatek na sekundę około 100 kl./s, co daje zrekonstruowany obraz komórki 3D z 0,85 sekundy na klatkę) do akwizycji przestrzennej 3D.

LLSM może być ogólnie używany do śledzenia dynamiki w czasie rzeczywistym dowolnych cząsteczek w dowolnej komórce na poziomie pojedynczej cząsteczki i pojedynczej komórki, szczególnie tych w wysoce ruchliwych komórkach, takich jak komórki odpornościowe. Na przykład pokazujemy tutaj, jak używać LLSM do wizualizacji dynamiki receptora komórek T (TCR). Limfocyty T są komórkami efektorowymi adaptacyjnego układu odpornościowego. TCR są odpowiedzialne za rozpoznawanie ligandów peptyd-MHC (pMHC) wyświetlanych na powierzchni komórek prezentujących antygen (APC), co decyduje o selekcji, rozwoju, różnicowaniu, losie i funkcji limfocytów T. To rozpoznanie zachodzi na granicy między limfocytami T i APC, co powoduje zlokalizowane grupowanie receptorów w celu utworzenia tak zwanej synapsy immunologicznej. Chociaż wiadomo, że TCR w synapsie immunologicznej są niezbędne do funkcjonowania efektora limfocytów T, nadal nieznane są mechanizmy leżące u podstaw transportu TCR w czasie rzeczywistym do synapsy. LLSM pozwolił nam zobrazować w czasie rzeczywistym dynamikę TCR przed i po przejściu do synapsy z wynikową interakcją pMHC-TCR (Rysunek 1). LLSM może być zatem wykorzystany do rozwiązania bieżących pytań dotyczących dynamiki formowania TCR i dostarczenia wglądu w to, w jaki sposób komórka odróżnia antygeny własne od obcych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

5C. C7 TCR-transgeniczne myszy z nokautem RAG2 w B10. W tym badaniu wykorzystano tło zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Chicago.

1. Zbieranie i aktywacja limfocytów T

UWAGA: Ta część protokołu jest oparta na poprzednich protokołach. Zobacz cytaty, aby uzyskać więcej informacji20,21.

  1. Poddaj eutanazji 10-12 tygodniowego 5C. Transgeniczna mysz C7 dowolnej płci (~20-25 g) zgodnie z zatwierdzonym protokołem IACUC (tj. komora CO2, po której następuje zwichnięcie szyjki macicy).
  2. Spryskaj tuszę myszy dokładnie 70% etanolem, aby namoczyć futro i umieścić w szafie bezpieczeństwa BSL-2.
  3. Obróć mysz na prawy bok i wykonaj małe nacięcie w jamie ciała nożyczkami chirurgicznymi. Usuń śledzionę za pomocą kleszczy chirurgicznych. W razie potrzeby odetnij tkankę łączną nożyczkami chirurgicznymi.
  4. Umieścić śledzionę w sitku do komórek z siatką o długości 70 μm i rozgnieść grzbietem tłoka strzykawki o pojemności 1 ml. Dokładnie przemyć sitko kompletnym RPMI (RPMI z 10% płodową surowicą bydlęcą [FBS], 2 mM L-glutaminy, 1% penicyliny/streptomycyny, 50 μM 2-merkaptoetanolu).
  5. Odwirować jednokomórkową zawiesinę splenocytów przy stężeniu 300 x g przez 5 min. Odrzucić supernatant.
    UWAGA: Granulka w tym momencie będzie czerwona.
  6. Ponownie zawiesić splenocyty w 5 ml buforu do lizy RBC. Inkubować przez 5 minut, a następnie schłodzić 5 ml pełnego RPMI.
  7. Odwirować jednokomórkową zawiesinę splenocytów przy stężeniu 300 x g przez 5 min. Odrzucić supernatant.
    UWAGA: Pellet w tym momencie powinien być biały, a nie czerwony.
  8. Zawiesić osad w 5 ml pełnego RPMI.
  9. Przenieść do kolby T-25 i dodać 10 μM cytochromu C (MCC, sekwencja ANERADLIAYLKQATK). Umieścić komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.
  10. Następnego dnia dodać rekombinowaną myszą IL-2 do końcowego stężenia 100 U/ml.
  11. Obserwuj przez kolejne dni, dodając nowe nośniki, gdy bieżące nośniki zmienią kolor na żółty. Limfocyty T umrą, jeśli zostaną pozostawione w żółtym podłożu bez nadzoru przez ponad 48 godzin. Komórki są gotowe do użycia 6-10 dni po zbiorach.

2. Przygotuj komórki

  1. Inkubować okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 5 mm z 0,1% poli-L-lizyną przez 10 minut. Odessać i pozostawić do naturalnego wyschnięcia.
  2. Użyj odczynnika gradientu gęstości (patrz Tabela materiałów), aby oddzielić martwe komórki i uzyskać 1 x 106 limfocytów T i 1 x 106 APC (komórki CH2721,22 transdukowany cytozolowym mCherry) oddzielnie.
    UWAGA: Komórki są liczone za pomocą hemocytometru.
    1. Dodaj 3 ml odczynnika do gradientu gęstości do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i ostrożnie dodawaj komórki kroplami do krawędzi probówki. Nie mieszać. Wirować przy 930 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C; użyj przyspieszania/zwalniania: WOLNY/WOLNY. Ostrożnie usuń cienką środkową warstwę komórek między całym podłożem a odczynnikiem gradientu gęstości, umieszczając każdy typ komórek w oddzielnych stożkowych rurkach.
      UWAGA: Konieczne jest przygotowanie większej liczby komórek niż jest to potrzebne do obrazowania, ponieważ okazuje się, że średnio 50% jest tracone podczas procesu. Im więcej komórek jest używanych w procesie, tym łatwiej jest je zebrać z gradientu gęstości. Używamy 4-8 ml obu typów komórek, aby zapewnić nadmiar komórek. W razie potrzeby komórki można policzyć przed tym krokiem, aby zapewnić potrzebną objętość. Wszelkie dodatkowe komórki są umieszczane z powrotem w odpowiednich kolbach.
    2. Umyj obie probówki limfocytów T i komórek CH27 trzykrotnie 5 ml pełnego RPMI (300 x g przez 5 minut). Supernatant należy wyrzucić za każdym razem podczas prania. Ponownie zawiesić każdą probówkę w 1 ml pełnego RPMI i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
  3. Zawieś 1 x 106 APC w 500 μl pełnej prędkości RPMI i dodaj 10 μM MCC. Inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Umyj komórki trzykrotnie 500 μl pełnego RPMI (300 x g przez 5 minut). Odrzucić supernatanty.
  4. Zawieś 1 x 106 limfocytów T w 500 μl pełnych RPMI. Dodaj 2 μg Fab znakowanego anty-TCRβ Alexa488 (klon H57) do 500 μl komórek. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Umyj komórki trzykrotnie 500 μl pełnego RPMI (300 x g przez 5 minut). Wyrzucić supernatant po każdym praniu.
    UWAGA: Dwuwartościowe przeciwciało anty-TCR pocięto na monowalentne Fab za pomocą zestawu do przygotowania Fab (patrz Tabela materiałów), aby uniknąć sieciowania receptorów limfocytów T przez przeciwciało dwuwartościowe (ten krok jest opcjonalny).
  5. Zawiesić oba typy komórek w 500 μl pożywki do obrazowania (pożywka L-15 Leibovitz bez czerwieni fenolowej z 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny, 2 mM L-glutaminy).

3. Przeprowadzanie codziennych wyrównań LLSM

UWAGA: (Ważne) Ten protokół wyrównania jest oparty na używanym przyrządzie LLSM (zobacz Tabelę Materiałów). Każdy LLSM może być inny i wymagać różnych strategii dostosowania, zwłaszcza tych, które są budowane w domu. Przeprowadzić odpowiednie rutynowe wyrównanie i przejść do sekcji 4.

  1. Dodaj 10 ml wody plus 30 μl fluoresceiny (1 mg/ml bulionu) do kąpieli LLSM (~10 ml objętości), naciśnij Obraz (Home), aby przesunąć obiektyw do pozycji obrazu i spójrz na pojedynczy wzór wiązki laserowej Bessela. Wyrównaj wiązkę laserową za pomocą prowadnic i wstępnie ustawionego obszaru zainteresowania (ROI), aby wiązka była cienkim wzorem zrównoważonym we wszystkich kierunkach.
    1. Wiązka powinna również wydawać się skupiona w aparacie szukacza. Do regulacji użyj dwóch regulatorów nachylenia lustra, górnego mikrometru, ostrości i kołnierza obiektywu emisyjnego. Zobacz Rysunek 2A,B dla prawidłowo wyrównanej belki.
  2. Umyj wannę i obiektywy co najmniej 200 ml wody, aby całkowicie usunąć fluoresceinę.
  3. Standardowe kulki fluorescencyjne obrazu w mediach obrazowych (przygotowane przez przyklejenie kulek do szkiełka nakrywkowego o średnicy 5 mm z poli-L-lizyną, patrz Tabela materiałów; można je wstępnie przygotować i ponownie wykorzystać) do funkcji fizycznego rozproszenia punktowego (PSF) w podłożach obrazowych.
    UWAGA: W polu widzenia może być tylko jeden koralik do późniejszego przetworzenia, więc spróbuj znaleźć koralik, który jest sam w przeglądarce lub można go łatwo przyciąć, aby uzyskać pojedynczy koralik.
    1. Włącz roztrząsanie, ustawiając wartość 3 w polu "Zakres X Galvo". Naciśnij przycisk Na żywo, aby wyświetlić bieżące pole. Przesuń się wzdłuż kierunku Z, aby znaleźć szkiełko nakrywkowe i ściegi. Znajdź środek ściegu, przesuwając się wzdłuż Z, naciśnij Stop, aby zatrzymać laser. Zaznacz pole wyboru 3D, naciśnij przycisk Środek, a następnie naciśnij przycisk Execute (Wykonaj). Spowoduje to zebranie danych.
    2. Ręcznie wyreguluj lustro pochylone, kołnierz obiektywu i mikrometr ostrości, aby uzyskać najwyższe wartości szarości, a następnie wyreguluj w razie potrzeby, aby uzyskać odpowiednie wzorce dla trybów skanowania obiektywu, z galvo, z+obiektyw (totPSF) i skanowania próbki (samplePSF). Zobacz Rysunek 2C-F dla prawidłowo dostosowanych projekcji maksymalnej intensywności (MIP).
      UWAGA: Różne tryby przechwytywania (skanowanie obiektywne, z galvo, z+obiektyw i skanowanie próbki) zmieniają sposób, w jaki arkusz świetlny porusza się po próbce. Do wyrównania należy używać wszystkich trybów skanowania.
    3. Przykładowy skan pokazuje, w jaki sposób dane będą zbierane podczas eksperymentu. Pobrać próbkę PSF, naciskając przycisk Execute (Wykonaj) w trybie skanowania próbki w celu prostowania i dekonwolucji (patrz punkt 5). Przełącz lasery na tryb trzech kolorów (488, 560, 647) i ponownie naciśnij przycisk Wykonaj.
      UWAGA: Ponieważ obrazy LLSM są ustawione pod kątem (57,2°), obrazy przechwycone w trybie "skanowania próbki" są zbierane pod tym kątem, a zatem są "przekrzywione". Korekcja przekrzywienia to proces korekcji pod tym kątem i "ponownego wyrównania" obrazu do prawdziwego stosu z. Dane te muszą być zebrane na nośnikach obrazowania i we wszystkich kanałach, które będą obrazowane podczas eksperymentu. Jeśli nie zostanie to prawidłowo zebrane, dane nie zostaną prawidłowo skorygowane. Podobnie, upewnij się, że podłoże zostało podgrzane do 37 °C (lub żądanej temperatury eksperymentalnej).

4. Konfiguracja komórek za pomocą LLSM

  1. Dodaj 100 000 APC (50 μl) z kroku 2.5 do okrągłego szkiełka nakrywkowego o średnicy 5 mm z kroku 2.1 i pozwól im osiąść przez 10 minut.
  2. Nasmaruj uchwyt próbki, a następnie dodaj do niego szkiełko nakrywkowe komórką do góry. Dodaj kroplę podłoża do obrazowania na odwrocie szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć pęcherzyków powietrza przed umieszczeniem w kąpieli. Przykręć uchwyt próbki do piezo i naciśnij Obraz (Strona główna).
  3. Znajdź APC do obrazu, aby upewnić się, że LLSM i oprogramowanie do obrazowania (patrz Tabela materiałów) działają prawidłowo.
    UWAGA: Obrazujemy w kroku co 0,4 μm z 60 krokami z i ekspozycją 10 ms dla dwóch kolorów z ditherem ustawionym na 3, co daje 1,54 s na klatkę obrazu 3D o rozdzielczości XY ~200 nm i 400 nm Z. Ustawienia te mogą wymagać dostosowania w zależności od rozmiaru komórki, pożądanej rozdzielczości z i siły sygnału z zastosowanej techniki znakowania fluorescencyjnego. Zużycie energii lasera będzie się również różnić w zależności od zastosowanej techniki znakowania fluorescencyjnego.
    1. Naciśnij przycisk Na żywo, aby wyświetlić bieżący obraz. Przesuń wzdłuż punktu Z, aby znaleźć szkiełko nakrywkowe i komórki.
    2. Znajdź środek transportera opancerzonego, przesuwając się w kierunku Z, a następnie naciśnij przycisk Stop, aby zatrzymać działanie lasera. Sprawdź 3D i wprowadź żądane ustawienia (patrz krok 4.3.1), naciśnij Środek, a następnie naciśnij Wykonaj. Spowoduje to zebranie danych.
  4. Obniż stolik do pozycji ładowania i dodaj 50 μl limfocytów T do podłoża obrazowego (100 000 komórek, od kroku 2.5) kroplami bezpośrednio nad szkiełkiem nakrywkowym. Najlepiej pozwolić, aby kropla utworzyła się na końcu końcówki pipety, a następnie przyłożyć końcówkę do płynu do kąpieli. Podnieś scenę z powrotem, klikając "Obraz (Powrót)".
  5. Rozpocznij obrazowanie. Pamiętaj, aby ustawić żądany rozmiar stosu i długość upływu czasu. Na przykład zobrazuj 60 stosów z krokiem 0,4 μm i wprowadź 500 ramek czasowych. (Zazwyczaj) zatrzymaj nagrywanie przed osiągnięciem 500 klatek, aby uniknąć fotowybielania. Użyj trybu Na żywo, aby wyszukać pary komórek, a gdy zostaną wprowadzone gotowe i żądane ustawienia, naciśnij Wykonaj, aby zebrać dane. Zobacz film 1 i Rysunek 1 dla przykładu.

5. Dynamika nawierzchni toru

  1. Wyeksportuj dane z oprogramowania do obrazowania (patrz tabela materiałów). Spowoduje to utworzenie plików TIF z-stack dla każdego punktu czasowego w każdym kolorze.
  2. Najpierw przeprostuj i zdekonwolucjonizuj dane.
    UWAGA: Używamy potoku LLSpy na licencji udzielonej przez HHMI's Janelia Research Campus18, ale prostowanie i dekonwolucja są również dostępne w wielu programach do obrazowania (patrz Tabela materiałów).
  3. Usuń dane.
    UWAGA: Używamy funkcji debleach Fidżi z dopasowaniem histogramu (Fiji Pathway: Image | Dostosuj | Korekcja wybielacza | Dopasowanie histogramu | Dobrze).
  4. Zaimportuj do oprogramowania śledzącego (patrz tabela materiałów). Śledź klastry zgodnie ze specyfikacją oprogramowania. Zobacz film 2, aby zobaczyć przykład.
    UWAGA: Wyniki śledzenia będą zależeć od używanego oprogramowania śledzącego, wybranego algorytmu, wybranych żądanych parametrów wyjściowych itp. Na przykład w oprogramowaniu do śledzenia, z którego korzystaliśmy (patrz Tabela materiałów), zdecydowaliśmy się zezwolić oprogramowaniu na śledzenie nieregularnych kształtów, zamiast przypisywać każdej funkcji jedno miejsce, ponieważ klastry TCR nie są zorganizowane w idealne sfery. Ponadto zdecydowaliśmy się zebrać 35 parametrów, w tym prędkość, kierunek, głośność, intensywność, obszar, lokalizację i informacje o czasie trwania ścieżki. Jednak różne metody lub parametry będą korzystne, aby odpowiedzieć na różne pytania.
    1. Jeśli śledzenie nie jest pożądane, użyj wtyczki ClearVolume dla Fidżi do wizualizacji i tworzenia filmów na podstawie danych hyperstack.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy izolację, przygotowanie i obrazowanie myszy podstawowej 5C. Limfocyty T C7 przy użyciu siatkowego mikroskopu świetlnego. W sekcji 3 konieczne jest prawidłowe ustawienie mikroskopu i codzienne pobieranie PSF, za pomocą którego można zdekonwolucjonizować dane po pobraniu. W Rysunek 2, pokazujemy poprawne obrazy wyrównania, które będą widoczne podczas ustawiania mikroskopu. Rysunek 2A i Rysunek2 B pokazuje...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany protokół został zoptymalizowany pod kątem wykorzystania limfocytów T CD4+ wyizolowanych z 5C. Myszy transgeniczne C7 na używanym instrumencie LLSM, a zatem inne systemy komórkowe i LLSM mogą wymagać innej optymalizacji. Jednak protokół ten pokazuje moc obrazowania 4D, ponieważ można go wykorzystać do ilościowego określenia dynamiki receptora powierzchniowego na całej komórce przy najmniejszych zniekształceniach w warunkach fizjologicznych. Dlatego istnieje wiele możliwych przyszłych zastosowań tej...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować za rady i wskazówki od dr Vytasa Bindokasa z Uniwersytetu w Chicago. Dziękujemy Integrated Light Microscopy Core Facility na Uniwersytecie w Chicago za wsparcie i konserwację mikroskopu siatkowego z arkuszami świetlnymi. Praca ta była wspierana przez NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 i NSF Career Award 1653782 (dla J.H.). J.R. jest wspierany przez program stypendialny dla absolwentów NSF.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 ml StrzykawkaBD309659Do pobierania komórek T
2-MerkaptoetanolSigma-AldrichM3148-25MLDo hodowli komórek T
Okrągłe szkiełka nakrywkowe 5 mmWorld Precision Instruments502040Do obrazowania
70um Sterylne sitko do komórek Corning7201431do zbierania komórek T
Alexa Fluor 488 przeciwciało przeciw myszemu TCR i łańcuchowi betaBioLegend109215do obrazowania
płodowej surowicy bydlęcej (FBS)X& Hodowla komórek YFBS-500Do hodowli komórek T
FicollGE Healthcare17-1440-02Odczynnik gradientu Denisty do pobierania komórek T
Sól sodowa fluoresceinySigma-AldrichF6377Do wyrównania mikroskopu
FluoSpheres Mikrosfery modyfikowane karboksylanemThermo Fisher ScientificF8810Do wyrównania mikroskopu
ImarisBitplanedotyczyOprogramowanie do śledzenia; Inne opcje oprogramowania śledzącego to Amira lub Trackmate (Fidżi).
Mikroskop kratowy z arkuszami świetlnymi3iMikroskop N/AUżywany
Leibovitz L-15 Medium, bez czerwieni fenolowejThermo Fisher Scientific21083027do obrazowania
L-glutaminyThermo Fisher Scientific25030-081do hodowli komórek T
LLSpyJanelia Research CampusN/ALLSpy był używany na podstawie licencji Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Skontaktuj się z innovation@janelia.hhmi.org, aby uzyskać dostęp. Inne metody dekonwolucji i deksowania są dostępne w programach do przetwarzania obrazu, takich jak Fiji, Slidebook, Amira i inne. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/
Moth Cytochrom C (MCC), sekwencja ANERADLIAYLKQATKNiestandardowa syntezaElimbiodo pozyskiwania limfocytów T
Penacylina/StreptamycynaLife Technologies15140122_3683884612Do hodowli komórek
T Produkty badawcze Poly-L-LizynaPhenixP8920-100MLDo obrazowania
buforu do lizy RBCeBioscience00-4300-54Do zbierania komórek T
Rekombinowana mysz IL-2Sigma-AldrichI0523Do hodowli komórek T
RPMI 1640 MediumCorningMT10040CVdo hodowli komórek
T Slidebook3iOprogramowanie do obrazowania N/ALLSM
Chirurgiczne narzędziado preparacjiNova-Tech InternationalDSET10Do zbierania limfocytów T
Kolby T-25Eppendorf2231710126Do hodowli komórek
T Thermo Scientific Pierce Fab Micro Zestawy przygotowawczeThermo Fisher Scientific44685Do przygotowania Fab
Nie

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications. Methods in Molecular Biology. 1251, Clifton, N.J. 1-23 (2015).
  2. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123, Pt 21 3621-3628 (2010).
  3. Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 89, Chapter 7 169-221 (2008).
  4. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  5. Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  6. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780(1994).
  7. Shroff, H., White, H., Betzig, E. Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).
  8. Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level. Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
  9. Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. Advances in the speed and resolution of light microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).
  10. Erni, R., Rossell, M. D., Kisielowski, C., Dahmen, U. Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe. , Available from: https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr (2019).
  11. Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).
  12. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. , (2014).
  13. Ni, J., et al. Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help. Oncoimmunology. 5 (9), 1219009(2016).
  14. Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface. Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).
  15. Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules. PLoS pathogens. 10 (5), 1004161(2014).
  16. Schöneberg, J., et al. 4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids. Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).
  17. Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), New York, N.Y. 8302(2019).
  18. Cai, E., et al. Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells. Science. 356 (6338), New York, N.Y. 3118(2017).
  19. Ritter, A. T., et al. Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse. Immunity. , (2015).
  20. Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596(2016).
  21. Huang, J., et al. A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells. Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).
  22. Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).
  23. Jansson, A. A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides. Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).
  24. Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lattice Light Sheet MicroscopyT Cell Receptor DynamicsFour Dimensional ImagingLive Cell ImagingSpatiotemporal ResolutionCell Surface ReceptorsFluorescent LabelingDensity Gradient CentrifugationBeam Alignment ProtocolPSF Collection

Related Articles