Artykuł metodologiczny

Ocena stanu zapłodnienia poprzez śledzenie morfologii jądra plemnika w podwójnym zapłodnieniu Arabidopsis

DOI:

10.3791/59916

⸱

29 sierpnia 2019

 , 
1Graduate School of Horticulture, Chiba University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazujemy metodę określania udanego lub nieudanego zapłodnienia na podstawie morfologii jądra plemnika w podwójnym zapłodnieniu Arabidopsis za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rośliny kwitnące mają unikalny system rozmnażania płciowego zwany 'podwójnym zapłodnieniem', w którym każda z plemników precyzyjnie łączy się z komórką jajową lub komórką centralną. W ten sposób dwa niezależne zdarzenia zapłodnienia odbywają się prawie jednocześnie. Zapłodniona komórka jajowa i komórka centralna rozwijają się odpowiednio w zygotę i bielmo. Dlatego precyzyjna kontrola podwójnego nawożenia jest niezbędna dla późniejszego rozwoju nasion. Podwójne zapłodnienie zachodzi w żeńskim gametoficie (woreczku zarodkowym), który jest głęboko ukryty i pokryty grubymi tkankami zalążka i jajnika. Ta budowa tkanki słupkowej sprawia, że obserwacja i analiza podwójnego zapłodnienia jest dość trudna i stworzyła obecną sytuację, w której wiele pytań dotyczących mechanizmu podwójnego zapłodnienia pozostaje bez odpowiedzi. Dla funkcjonalnej oceny potencjalnego kandydata na regulator nawożenia ważna jest analiza fenotypowa nawożenia. Aby ocenić zakończenie zapłodnienia u Arabidopsis thaliana, jako wskaźniki stosuje się kształty sygnałów fluorescencyjnych znakujących jądra plemników. Plemnik, który nie zapłodni, jest wskazywany przez skondensowany sygnał fluorescencyjny poza żeńskimi gametami, podczas gdy plemnik, który pomyślnie zapładnia, jest wskazywany przez zdekondensowany sygnał z powodu kariogamii z jądrem gamet żeńskich. Opisana tutaj metoda stanowi narzędzie do określenia udanego lub nieudanego nawożenia w warunkach in vivo.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kwitnące rośliny wytwarzają nasiona poprzez podwójne zapłodnienie, proces, który jest bezpośrednio kontrolowany przez interakcje między białkami zlokalizowanymi na błonie plazmatycznej gamet1,2. Kwitnące męskie gamety rośliny, para plemników, rozwijają się w pyłku. Łagiewka pyłkowa, która rośnie po zapyleniu, dostarcza parę plemników do żeńskich gamet, komórki jajowej i komórki centralnej, które rozwijają się w woreczku zarodkowym. Po spotkaniu gamet męskich i żeńskich białka na powierzchni gamet sprzyjają rozpoznawaniu, przyłączaniu i fuzji w celu zakończenia podwójnego zapłodnienia. W poprzednich badaniach męskie białka błony gametowej GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2)3,4 i GAMETE EXPRESSED 2 (GEX2)5 zostały zidentyfikowane jako regulatory zapłodnienia zaangażowane odpowiednio w fuzję i przyłączanie gamet. Niedawno zidentyfikowaliśmy męskie białko błonowe specyficzne dla gamet, DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9), jako regulator zapłodnienia zaangażowany w interakcję gamet. Odkryliśmy, że spadek ekspresji DMP9 powoduje znaczne zahamowanie zapłodnienia komórek jajowych podczas podwójnego zapłodnienia u A. thaliana6.

Ponieważ podwójne zapłodnienie występuje w woreczku zarodkowym, który jest osadzony w zalążku, który jest dalej owinięty tkanką jajnika, trudno jest obserwować i analizować stany procesów podwójnego zapłodnienia. Z tego powodu nadal istnieje wiele niejasnych punktów, które utrudniają pełne zrozumienie całego mechanizmu podwójnej kontroli nawożenia. Opracowanie technik obserwacyjnych w celu śledzenia zachowania gamet podczas podwójnego zapłodnienia w warunkach in vivo jest niezbędne do analizy funkcjonalnej potencjalnych kandydatów na regulatory zapłodnienia. Ostatnie badania przyniosły linie markerowe, w których struktury subkomórkowe gamet są znakowane białkami fluorescencyjnymi. W tym artykule przedstawiamy prosty i szybki protokół obserwacji podwójnego zapłodnienia, które nastąpiło w woreczku zarodkowym pochodzącym ze sztucznie zapylonych słupków. Korzystając z linii markera jądra plemnika plemnika HTR10-mRFP7, można rozróżnić stan zapłodnienia każdej żeńskiej gamety na podstawie morfologii sygnału jądrowego plemnika. Nasz protokół skupiający się na takiej zmianie morfologicznej jąder plemników podczas zapłodnienia może skutecznie uzyskać wystarczającą ilość danych do dowodu statystycznego. Linia DMP9-knockdown z tłem HTR10-mRFP (DMP9KD/HTR10-mRFP) została użyta jako rośliny męskie, aby pokazać pojedynczy wzór nawożenia. Protokół nadaje się również do analizy funkcjonalnej innych regulatorów nawożenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sztuczne zapylanie

UWAGA: Przed rozpoczęciem procesu wymagana jest para kleszczyków nr 5.

  1. Hoduj A. thaliana (Col-0) w temperaturze 22 °C w 16-godzinnym cyklu światła/8-godzinnym ciemnym cyklu w komorze wzrostowej.
    nuta: Wytnij i usuń pierwszą rozwiniętą łodygę kwiatową nożyczkami, aby wspomóc rozwój pąków pachowych. Do analizy nadają się rośliny silnie rosnące (2-3 tygodnie po ścięciu pierwszej łodygi; wysokość rośliny około 25 cm).
  2. Aby wykastrować, usuń działkę kielicha (Rycina 1B), płatek (Rycina 1C) i pręcik (Rycina 1D) pąków kwiatowych na etapie 118 (Rycina 1A) za pomocą kleszczyków nr 5. Najlepszy jest pączek z kawałkami płatków widocznymi na górze.
    nuta: Użyj odpowiedniej linii markera gamet żeńskich. W tym protokole użyliśmy rośliny typu dzikiego jako żeńskiego rodzica.
  3. Piętnaście do osiemnastu godzin po kastracji weź pręcik kwiatu DMP9KD / HTR10-mRFP na etapie 138, ściskając włókno kleszczami.
  4. Aby zapylić, delikatnie poklep kilkakrotnie piętno wykastrowanego słupka rozchodzącym się pylnikiem.

2. Przygotowanie zalążka do obserwacji

UWAGA: Wymagane są następujące elementy: szkło szkiełkowe z dołączoną taśmą dwustronną, kleszczyki nr 5, igła do iniekcji 27 G oraz mikroskop preparacyjny.

  1. 7 do 8 godzin po zapyleniu (HAP) zbierz słupek i umieść go na taśmie dwustronnej, a następnie delikatnie dociśnij kleszczami, aby przymocować słupek do taśmy (Rysunek 2A,A').
    nuta: Większość zalążków w słupku otrzymuje co najmniej jedną łagiewkę pyłkową 10 HAP9. Jeśli oba plemniki lub którykolwiek z nich z pierwszej łagiewki pyłkowej nie zostanie zapłodniony, druga łagiewka pyłkowa zostanie przyciągnięta przez zalążek ze względu na system odzyskiwania zapłodnienia10. Aby przeanalizować morfologię jąder plemników z pierwszej łagiewki pyłkowej, zaleca się zakończenie przygotowania zalążka najpóźniej do 10 HAP.
  2. Odetnij górny i dolny koniec jajnika za pomocą igły do wstrzykiwań pod mikroskopem preparacyjnym (Ryc. 2B,B').
  3. Rozciąć ścianę jajnika po obu stronach otworu (Rysunek 2C,C'), przesuwając końcówkę igły do wstrzykiwań.
    nuta: Igłę do wstrzykiwań należy wprowadzić płytko, aby zapobiec oddzieleniu się zalążka od przegrody.
  4. Obierz ścianę jajnika za pomocą igły do wstrzykiwań (Rysunek 2D,D').
  5. Ściśnij podstawę przegrody, do której połączone są zalążki, i ostrożnie podnieś ją kleszczami (Ryc. 2E).
  6. Przenieś zalążki do kropli wody na szkiełku podstawowym i delikatnie przykryj szkłem nakrywkowym do obserwacji pod mikroskopem fluorescencyjnym (Rysunek 2E,E').

3. Mikroskopia

UWAGA: W tym protokole użyliśmy mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w kostkę filtra fluorescencyjnego (patrz Tabela materiałów), aparat cyfrowy i dołączone oprogramowanie.

  1. Uzyskaj obrazy zalążków zawierających jądra plemników znakowane mRFP za pomocą obiektywu 20x lub 40x i wyposażonego aparatu cyfrowego.
  2. Potwierdź liczbę jąder plemników znakowanych mRFP w woreczku zarodkowym.
    nuta: Zalążki zawierające dwa jądra plemników znakowane mRFP można włączyć do wielkości populacji w celu analizy statystycznej.
  3. Potwierdź kształt i położenie każdego jądra plemnika znakowanego mRFP w woreczku zarodkowym.
    nuta: Natychmiast po uwolnieniu z łagiewki pyłkowej para skondensowanych jąder plemników znakowanych mRFP jest zlokalizowana między komórką jajową a komórką centralną. Zdekondensowane jądro plemnika znakowane mRFP wykryte z boku końca gradówki wskazuje na przykład na zapłodnienie komórek centralnych. Używając odpowiedniej linii markera błony błony żeńskiej gamet, jak pokazano w Uzupełniającym Rysunek 1, można wyraźnie monitorować, czy plemnik przechodzi plazmogamię (po fuzji błonowej, ale przed kariogamią).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zalążki ze słupka zapylonego DMP9KD/HTR10-mRFP zebrano w 7-8 HAP i zaobserwowano.

Większość zalążków zawierała dwa zdekondensowane, znakowane mRFP jądra plemnika odpowiednio w pozycji jądra komórki jajowej (strona mikropylarna) i komórki centralnej (strona końcowa charazala), odpowiednio (Rysunek 3A), co wskazuje na udane podwójne zapłodnienie. Ponadto zaobserwowano zalążki zawierające zde...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HTR10-mRFP znakuje ojcowską chromatynę (tj. wizualizuje jądra plemników), a dynamika podwójnego zapłodnienia została opisana7. Natychmiast po uwolnieniu z łagiewki pyłkowej jądra plemników znakowane HTR10-mRFP są nadal zagęszczone. Jednak każde z jąder plemników ulega dekondensacji po połączeniu się z zapłodnionym jądrem żeńskiej gamety podczas kariogamii trzy do czterech godzin po fuzji błony gamet7. Niezapłodnione plemniki pozostają skondensowane, jak pokazano w woreczku ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant KAKENHI Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (JP17H05832 do T. I.) oraz przez finansowanie z Programu Promocji Badań Priorytetowych w Fitochemicznych Naukach Molekularnych, Uniwersytet Chiba (Japonia).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BX51OlympusMikroskop epifluorescencyjny
Szkło osłonoweSzkło MatsunamiC018181
DMP9KD/HTR10-mRFPArabidopsis thaliana, HTR10-mRFP tło
Takahashi et al. (2018)6
TaśmadwustronnaNichibanNW-15SSzerokość 15 mm
DP72OlympusDegital
KleszczeVigorDostępne są dowolne kleszcze nr 5
Komora wzrostowaNihonikaLPH-411PFQDT-SP
em>HTR10-mRFPArabidopsis thaliana, ekotyp Columbia-0 (Col-0) tło
Ingouff i in. ( 2007)7
Igła iniekcyjnaTerumoNN-2719S27 G
Szkłoślizgowe Szkło MatsunamiS9443
SZX9preparacyjnyOlympus
U-MRFPHQOlympusKostka filtra fluorescencyjnego (wzbudzenie: BP535-555, emisja: BA570-625, Lustro dichromatyczne: DM565)
UPlanFL N 40xOlympusSoczewka obiektywu (NA 1.3), zanurzenie w oleju
UPlanSApo 20xOlympusSoczewka obiektywowa (NA 0.75), sucha
< Mikroskop

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. Gamete dialogs in green lineages. Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).
  2. Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Current Biology. 26, R125-R139 (2016).
  3. Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization. Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).
  4. von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization. Development. 133, 4761-4769 (2006).
  5. Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis. Current Biology. 24, 170-175 (2014).
  6. Takahashi, T., et al. The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants. Development. 145, dev170076(2018).
  7. Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants. Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).
  8. Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
  9. Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants. Plant Signaling & Behavior. 8, e23690(2013).
  10. Kasahara, R. D., et al. Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis. Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).
  11. Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21, 497-502 (2011).
  12. Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis. Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Arabidopsis thalianamikroskopia fluorescencyjnaanaliza zal k wwzrost rurek py kowychocena kariogamiiobrazowanie woreczka zasadniczegofenotyp zap odnieniamarker HTR10 mRFP

Powiązane artykuły