Ocena uszkodzeń oksydacyjnych w pierwotnych komórkach powierzchni oka/komórkach macierzystych myszy w odpowiedzi na uszkodzenie ultrafioletem-C (UV-C)

Podsumowanie

Ten protokół demonstruje jednoczesne wykrywanie reaktywnych form tlenu (ROS), żywych komórek i martwych komórek w żywych hodowlach pierwotnych z komórek powierzchni oka myszy. 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetat, jodek propidyny i barwienie Hoechst są używane do oceny ROS, martwych komórek i żywych komórek, odpowiednio, a następnie obrazowania i analizy.

Streszczenie

Powierzchnia oka jest narażona na regularne zużycie z powodu różnych czynników środowiskowych. Narażenie na promieniowanie UV-C stanowi zagrożenie dla zdrowia w miejscu pracy. Tutaj pokazujemy ekspozycję pierwotnych komórek macierzystych z powierzchni oka myszy na promieniowanie UV-C. Powstawanie reaktywnych form tlenu (ROS) to odczyt zakresu stresu/uszkodzeń oksydacyjnych. W warunkach eksperymentalnych in vitro niezbędna jest również ocena odsetka martwych komórek powstałych w wyniku stresu oksydacyjnego. W tym artykule zademonstrujemy barwienie 2',7'-dichlorofluoresceindioctanu (DCFDA) pierwotnych komórek macierzystych myszy wystawionych na działanie promieniowania UV-C oraz ich kwantyfikację na podstawie fluorescencyjnych obrazów barwienia DCFDA. Barwienie DCFDA bezpośrednio odpowiada generacji ROS. Pokazujemy również kwantyfikację martwych i żywych komórek poprzez jednoczesne barwienie jodkiem propidyny (PI) i Hoechst 3332 odpowiednio oraz odsetek komórek DCFDA (ROS dodatnich) i PI dodatnich.

Wprowadzenie

Powierzchnia oka (OS) to jednostka funkcjonalna składająca się głównie z zewnętrznej warstwy i nabłonka gruczołowego rogówki, gruczołu łzowego, gruczołu Meiboma, spojówki, części brzegów powiek i unerwienia, które przekazują sygnały¹. Przezroczysta warstwa rogówki w kształcie kopuły skupia światło na siatkówce. Ta beznaczynkowa tkanka składa się ze składników komórkowych, takich jak komórki nabłonkowe, keratocyty i komórki śródbłonka oraz składników bezkomórkowych, takich jak kolagen i glikozaminoglikany². Obszar ten jest drenowany przez łzy, które również dostarczają większość składników odżywczych. Anatomiczne położenie systemu operacyjnego zmusza go do bezpośredniego kontaktu ze środowiskiem zewnętrznym, często narażając go na różne ostre elementy, takie jak jasne światło, drobnoustroje, cząsteczki kurzu i chemikalia. Czynnik ten predysponuje OS do urazów fizycznych i sprawia, że jest podatny na różne choroby.

Stres oksydacyjny jest spowodowany brakiem równowagi między produkcją reaktywnych form tlenu (ROS) a mechanizmami obrony antyoksydacyjnej endogennej³. ROS są klasyfikowane jako cząsteczki reaktywne i wolne rodniki, z których oba pochodzą z tlenu cząsteczkowego (O₂) poprzez mitochondrialną fosforylację oksydacyjną⁴. Pierwsza grupa składa się z form nierodnikowych, takich jak nadtlenek wodoru (_H2O2), tlen singletowy (^1O2), a druga obejmuje między innymi takie gatunki, jak aniony ponadtlenkowe (_O2^-) i rodniki hydroksylowe (^•OH). Cząsteczki te są produktami ubocznymi normalnych procesów komórkowych, a ich rola jest związana z ważnymi funkcjami fizjologicznymi, takimi jak transdukcja sygnału, ekspresja genów i obrona gospodarza⁵. Wiadomo, że zwiększona produkcja ROS jest generowana w odpowiedzi na takie czynniki, jak inwazja patogenów, ksenobiotyki i ekspozycja na promieniowanie ultrafioletowe (UV)⁴. Ta nadprodukcja ROS powoduje stres oksydacyjny, który prowadzi do uszkodzenia cząsteczek, takich jak kwasy nukleinowe, białka i lipidy⁶.

Naturalne światło słoneczne, najbardziej dominujące źródło promieniowania UV, składa się z UV-A (400-320 nm), UV-B (320-290 nm) i UV-C (290-200 nm)⁷. Odnotowano odwrotną korelację między długością fali a energiami spektralnymi. Chociaż naturalne promieniowanie UV-C jest pochłaniane przez atmosferę, sztuczne źródła, takie jak lampy rtęciowe i przyrządy spawalnicze, emitują je, a zatem stanowią zagrożenie zawodowe. Objawy ekspozycji na oczy obejmują fotokeratitis i fotorogówkowe zapalenie spojówek⁸. Produkcja ROS jest jednym z głównych mechanizmów powodowania uszkodzeń komórek wywołanych promieniowaniem UV⁹. W obecnym badaniu pokazujemy wykrywanie ROS za pomocą metody barwienia dioctanu 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFDA) w pierwotnych komórkach powierzchni oka myszy / komórkach macierzystych wystawionych na działanie UV-C. Zielona fluorescencja została uchwycona za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Komórki przebarwiono przeciwstawnie dwoma barwnikami, Hoechst 33342 i czerwonym jodkiem propidyny, w celu zabarwienia odpowiednio żywych i martwych komórek.

Protokół

Eksperyment został przeprowadzony na pierwotnych komórkach oka/komórkach macierzystych pochodzących z oka szwajcarskiej myszy albinosa. Wykorzystanie zwierząt do pobierania oczu w tym eksperymencie zostało zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Etyki Zwierząt, Yenepoya (Uznany za Uniwersytet) (numer zatwierdzenia IEAC, 6a/19.10.2016).

1. Przygotowanie odczynników

UWAGA: Pobieranie komórek pierwotnych/komórek macierzystych z powierzchni oka myszy wykracza poza zakres tego protokołu. W związku z tym demonstrujemy dawki ekspozycji na promieniowanie UV-C, przygotowanie odczynnika do oceny ROS, żywych i martwych komórek oraz ich ilościowe określenie. Proszę zapoznać się z Tabelą 1 dla odpowiednich objętości odczynników (10% płodowa surowica bydlęca, DCFDA, Hoechst i roztwory podstawowe jodku propidyny, które należy dodać w celu uzyskania końcowego roztworu barwiącego).

1. Przygotować roztwór podstawowy 10 mM DCFDA, rozpuszczając 25 mg proszku DCFDA w 5,13 ml DMSO. Podamy po 250 μl w bursztynowych probówkach o pojemności 1,5 ml i przechowujemy w temperaturze -20 °C.
2. Przygotować roztwór podstawowy 10 mg/ml (16,23 mM roztwór) Hoechst 33342, rozpuszczając całą zawartość fiolki 25 mg w 2,5 ml wody dejonizowanej. Porcje 100 μl należy rozlać do mikrowirówek w kolorze bursztynowym i przechowywać w temperaturze 2-6 °C przez okres do 6 miesięcy. W przypadku dłuższego przechowywania przechowywać w temperaturze -20 °C.
3. Przygotować roztwór podstawowy 1 mg/ml jodku propidyny w wodzie dejonizowanej, po 1 ml w bursztynowych probówkach o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Posiewanie komórek i leczenie promieniowaniem UV-C

1. Przed posiewem należy zdysocjować pierwotne komórki powierzchni oka myszy wyizolowane w naszym laboratorium (wyniki niepublikowane; takie komórki są mieszaniną komórek nabłonka rogówki, komórek zrębu i keratocytów) za pomocą delikatnego środka dysocjacji komórek (tabela materiałów).
2. Płytka 0,2 x 10⁶ pierwotnych komórek powierzchni oka myszy w 35 mm 0,2% macierzy błony podstawnej pokryte szalkami do hodowli komórkowych w 2,5 ml kompletnej pożywki. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w 5% nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5%_CO2.
   UWAGA: Kompletna pożywka do hodowli komórek pierwotnych z powierzchni oka myszy składa się z DMEM o wysokiej zawartości glukozy zawierającej 20% FBS, 1% Pen-strep, 1% Glutamax, 1% aminokwasów endogennych (NEAA), 1% pirogronianu sodu i 0,1% β-merkaptoetanolu.
3. Przed wystawieniem komórek na działanie różnych dawek UV-C należy wyrzucić maksymalną objętość pożywki i pozwolić, aby tylko cienka warstwa pożywki (~500 μL) pozostała w kontakcie z komórkami, tylko tyle, aby je pokryć.
4. Zabierz naczynia, pojedynczo do źródła/komory UV-C (dolna komora pieca do hybrydyzacji/sieciownika UV; Tabela materiałów). Umieść naczynie w komorze i zdejmij pokrywkę naczynia. Otwarta pokrywka naczynia zapewnia, że komórki otrzymują maksymalną dawkę UV-C podczas ekspozycji na UV-C.
5. Wystaw komórki na działanie różnych stopni/dawek UV-C: 1 J/^m2, 100J/^m2, 1,000 J/^m2 i 10,000 J/^m2.
6. Po ekspozycji na promieniowanie UV-C należy natychmiast założyć pokrywę każdej z naczyń i wyjąć je z komory źródła UV-C.
7. Przynieś każdą z naczyń do okapu z laminarnym przepływem powietrza i uzupełnij każde z naczyń 2 ml świeżej, kompletnej pożywki.
8. Inkubować komórki przez 3 godziny w inkubatorze CO₂ o temperaturze 37 °C. Trzy godziny inkubacji po ekspozycji na promieniowanie UV-C są optymalne do wizualizacji i ilościowego określenia wczesnych efektów.

3. Przygotowanie pożywki do barwienia żywych komórek

1. Przygotować podłoże barwiące na świeżo w ciągu ostatnich 15 minut 3-godzinnej inkubacji komórek po ekspozycji na promieniowanie UV-C.
2. Podgrzej 10 ml podłoża barwiącego zawierającego 10% FBS-DMEM, uzupełnionego 1% Pen-Strep do temperatury 37 °C.
3. Dodać 5 μl 10 mM DCFDA, 5 μl 10 mg/ml roztworu Hoechsta i 200 μl 1 mg/ml jodku propidyny. Końcowe stężenia DCFDA, Hoechst i PI wynoszą odpowiednio 5 μM, 5 μg/ml i 20 μg/ml w 10 ml podłoża barwiącyego.

4. Barwienie DCFDA pierwotnych komórek oka myszy narażonych na promieniowanie UV-C

1. Po 3 godzinach inkubacji pierwotnych komórek oka myszy wystawionych na działanie promieniowania UV-C w różnych dawkach, należy odessać pożywkę z szalek o średnicy 35 mm.
2. Uzupełnij 2 ml świeżo przygotowanego barwnika DCFDA do każdej z potraw delikatnie z boków.
3. Inkubować komórki z pożywką barwiącą przez 15 minut w ciemności w inkubatorze CO₂ o temperaturze 37 °C do barwienia żywych komórek.

5. Przeglądanie komórek barwionych DCFDA (ROS), Hoechst i PI

1. Po zakończeniu inkubacji wyrzuć podłoże barwiące.
2. Dodaj świeże, kompletne podłoże do komórek i obserwuj komórki pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym/kamerą komórkową (tabela materiałów). Sfotografuj żądane pola: jasne pole, niebieska fluorescencja, czerwona fluorescencja, zielona fluorescencja.
   UWAGA: Niebieskie fluorescencyjnie zabarwione komórki to jądra, zielona fluorescencja jest przeznaczona dla komórek generujących ROS, a czerwona fluorescencja wskazuje na martwe komórki PI dodatnie.

6. Kwantyfikacja barwionych komórek (Hoechst-Blue, PI-Dead i Green-ROS) przy użyciu technik obrazowania

1. Eksportuj obrazy zarejestrowane pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym/kamerą komórkową do ImageJ w celu oceny ilościowej.
2. Otwórz każdy z obrazów pojedynczo, używając każdego kanału (tj. niebieskiego (Nuclei/Hoechst), zielonego (ROS), czerwonego (Dead/PI dodatni)) sekwencyjnie, do zliczania. Zacznij od nienaświetlonej kontroli i kolejno przechodź do 1, 100, 1 000 i 10 000 J/^m-2.
3. Policz komórki za pomocą narzędzia do liczenia komórek oznaczonych jako krzyżyk w menu oprogramowania dla każdego z pól [niebieski dodatni (dodatni wynik Hoechsta; jądra), czerwony dodatni (dodatni PI; martwe komórki); zielony dodatni (ROS)] na każdym z obrazów odpowiadających każdemu z zabiegów.
4. Policz, klikając każdy z określonych sygnałów w każdym z pól. Na przykład, kliknięcie na jądra wybarwione na niebiesko/Hoechst da całkowitą liczbę jąder w danym polu.
5. Oblicz wyniki jako procent śmierci komórek w wyniku uszkodzenia UV (liczba komórek PI dodatnich x 100 podzielona przez liczbę komórek dodatnich Hoechst) i procent produkcji ROS przez uszkodzenie UV (liczba komórek dodatnich DCFDA x 100 podzielona przez liczbę komórek dodatnich Hoechst).

Wyniki

DCFDA to bezbarwny barwnik, który jest chemicznie zredukowaną formą fluoresceiny używaną jako wskaźnik do wykrywania ROS w komórkach. Barwnik ten zostaje uwięziony w komórkach i łatwo utlenia się do fluorescencyjnej dichlorodihydrofluoresceiny (DCF), która emituje zieloną fluorescencję. Tę fluorescencję można wykryć za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Komórki można wizualizować i korelować z akumulacją ROS w następujący sposób: (i) żywe komórki bez ROS emitują wysoką niebieską fluorescencję; (ii) żywe komórki z akumu...

Dyskusja

Opisana tutaj metoda barwienia DCFDA umożliwia wizualizację ROS w pierwotnych żywych komórkach oka myszy poddanych działaniu promieniowania UV-C. Zaletą tej metody barwienia jest to, że pozwala ona również naukowcom na badanie natychmiastowego wpływu promieniowania UV-C (3 godziny po ekspozycji na UVC) na żywe komórki i ich jednoczesne zliczenie pod kątem odsetka komórek dodatnich i martwych ROS. Ponadto, ponieważ metoda barwienia jest stosowana na żywych komórkach, komórki mogą być dalej inkubowane w tym samym pożywce p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dioctan 2',7'-dichlorofluoresceiny (DCFDA)	Sigma	D6883	Dioctan 2',7'-dichlorofluoresceiny jest sondą fluorogenną i jest przepuszczalny dla komórek. Służy do ilościowego oznaczania reaktywnych form tlenu.
Naczynie do hodowli komórkowych (35 mm)	Eppendorf	SA 003700112	Sterylne naczynia do hodowli komórek.
DMEM High Glucose	HiMedia	AT007	Najczęściej stosowana pożywka do hodowli komórkowych, zawiera 4500 mg/L glukozy.
Surowica bydlęca płodu, pochodząca z UE	HiMedia	RM99955	Jeden z najważniejszych składników pożywek do hodowli komórkowych. Dostarcza czynników wzrostu, aminokwasów, białek, witamin rozpuszczalnych w tłuszczach, takich jak A, D, E i K, węglowodanów, lipidów, hormonów, minerałów i pierwiastków śladowych.
GlutMax	Gibco, Thermo Fisher Scientific	35050061	Stosowany jako suplement i alternatywa dla L-glutaminy. Pomaga w poprawie żywotności i wzrostu komórek.
HL-2000 Hybrilinker	UVP		Piec do hybrydyzacji/sieciownik UV
Hoechst 33342	Sigma	B2261	Barwnik Hoechst jest przepuszczalny zarówno dla żywych, jak i martwych komórek. Wiąże się z podwójnie wygładzonym DNA niezależnie od tego, czy komórka jest martwa, czy żywa.
Matrigel	Corning		Matrix Podstawna matryca błony MEM
Aminokwasy endogenne (100X)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11140050	Stosowany jako suplement zwiększający wzrost i żywotność komórek.
Penicylina-Streptomycyna (Pen-Strep)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15140122	Penicylina i streptomycyna są stosowane w celu zapobiegania skażeniu bakteryjnemu w hodowli.
Jodek propidium	Sigma	P4170	Barwnik fluorescencyjny, który jest przepuszczalny tylko dla martwych komórek. Wiąże się z DNA i pomaga w rozróżnianiu żywych i martwych komórek.
TryplE Express	Thermo Fisher Scientific		Delikatny środek do dysocjacji komórek
ZOE Fluorescencyjny obrazownik komórek	Bio-rad