Artykuł metodologiczny

Pomiar interakcji między sondami fluorescencyjnymi a ligniną w skrawkach roślin za pomocą sFLIM w oparciu o natywną autofluorescencję

DOI:

10.3791/59925

⸱

2 stycznia 2020

 ,  ,  , 
1PICT Platform, Université de Reims Champagne-Ardenne, 2Fractionation of AgroResources and Environment (FARE) Laboratory, INRA, Université de Reims Champagne-Ardenne, 3Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle, Université de Lille

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje oryginalną konfigurację łączącą pomiary czasu życia widma i fluorescencji w celu oceny transferu energii rezonansu Förstera (FRET) między sondami fluorescencyjnymi na bazie rodaminy a polimerem ligniny bezpośrednio w grubych sekcjach rośliny.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W biomasie lignocelulozowej (LB) aktywność enzymów jest ograniczona przez pojawienie się niespecyficznych interakcji z ligniną podczas procesu hydrolizy, co utrzymuje enzymy z dala od ich substratu. Charakterystyka tych złożonych oddziaływań jest zatem wyzwaniem w przypadku złożonych substratów, takich jak LB. Metoda ta mierzy interakcje molekularne między cząsteczkami znakowanymi fluoroforem a natywną ligniną autofluorescencyjną, które zostaną ujawnione przez rezonansowy transfer energii Förstera (FRET). W przeciwieństwie do pomiarów FRET w żywych komórkach przy użyciu dwóch egzogennych fluoroforów, pomiary FRET w roślinach wykorzystujących ligninę nie są trywialne ze względu na jej złożoną autofluorescencję. Opracowaliśmy autorski potok akwizycji i analizy ze skorelowaną obserwacją dwóch uzupełniających się właściwości fluorescencji: emisji fluorescencji i czasu życia. sFLIM (spectral and fluorescent lifetime imaging microscopy) zapewnia ilościowe określenie tych interakcji z wysoką czułością, ujawniając różne poziomy interakcji między biomolekułami a ligniną.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hydroliza lignocelulozy do cukrów monomerycznych, takich jak glukoza, wymaga enzymów. Wiadomo, że ich aktywność jest ograniczona przez ustanowienie niespecyficznych interakcji między enzymami a ligniną1,2, przy czym ten ostatni jest hydrofobowym polimerem i głównym składnikiem lignocelulozy3. W związku z tym ilościowy pomiar takich interakcji bezpośrednio na skali komórkowej jest wyzwaniem, z którym należy się zmierzyć, aby zoptymalizować aktywność katalityczną enzymu i wstępną obróbkę lignocelulozą4.

Förster (lub fluorescencyjny) pomiar rezonansowego transferu energii (FRET) jest metodą z wyboru do oceny interakcji biomolekuł in situ. Ten nieradiacyjny transfer energii może zachodzić między dawcą a akceptorem fluoroforu, jeśli spełniają one różne warunki. Widmo emisji donorowej musi się pokrywać, przynajmniej częściowo, na widmo wzbudzenia akceptorów. Wybór fluoroforów jest więc kluczowy dla takich eksperymentów. Następnie wydajność transferu zmniejsza się wraz z szóstą potęgą ich odległości5 i występuje tylko wtedy, gdy obie cząsteczki znajdują się w bliskim sąsiedztwie (zwykle w zakresie nanometrów). Inne nieprzewidziane sytuacje mogą zmienić wydajność transferu, takie jak orientacja dipol-dipol, ale są łagodzone, jeśli fluorofory mają elastyczność.

FRET można mierzyć różnymi technikami, a szczegółowe opisy można znaleźć w literaturze6,7. Krótko mówiąc, główne metody opierają się na: i) emisji uczulonej, w której śledzi się zmianę fluorescencji emisji akceptorowej i które zapewniają głównie wyniki jakościowe; ii) fotowybielanie akceptorowe, w którym mierzy się fluorescencję emisji donorowej przed i po fotowybielaniu akceptorowym (w tym przypadku można uzyskać bardziej precyzyjne oszacowania FRET, ale wymagają one zastosowania dużej mocy lasera do utrwalonych próbek); oraz iii) pomiar czasu życia, który zmniejsza się dla dawcy w obecności akceptora. Metoda ta wymaga specjalnych przyrządów i pozwala na precyzyjne i czułe pomiary interakcji między fluoroforami. Biorąc pod uwagę pomiar FRET między sondami fluorescencyjnymi a lignocelulozą, główna trudność polega na tym, że lignoceluloza nie jest pojedynczym, dobrze scharakteryzowanym fluoroforem: ma silną natywną i spektralnie szeroką autofluorescencję, pochodzącą głównie z ligniny i zależną od gatunków biomasy8,9.

W tym artykule proponujemy nową i oryginalną procedurę dostosowaną do przekrojów próbek drewna/roślin. Ta metoda oparta na sFLIM otwiera drogę do ilościowych pomiarów FRET między sondami fluorescencyjnymi a ligniną w natywnych próbkach lignocelulozy.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbki

UWAGA: Kolejne kroki przygotowania próbek są opisane w Rysunek 1.

  1. Przygotowanie próbki rośliny
    1. Z pni lub fragmentów drewna wytnij żyletkami próbki o długości 1 cm, nie uszkadzając ich struktury.
    2. Próbki należy zatopić w podłożu z glikolu polietylenowego (PEG), zanurzając je w kolejnych roztworach o rosnącym stężeniu PEG rozcieńczonych w wodzie aż do osiągnięcia 100% PEG.
      1. Umieść próbkę w próżni, aby usunąć wodę.
      2. Delikatnie mieszaj próbki w 30% v/v PEG przez 24 godziny.
      3. Delikatnie mieszaj próbki w 50% v/v PEG przez 24 godziny.
      4. Delikatnie mieszaj próbki w 100% PEG przez 24 godziny w temperaturze 70 °C (czysty PEG jest stały w temperaturze pokojowej).
    3. Umieścić próbki w kapsułkach w temperaturze 70 °C (na płycie grzejnej) i stopniowo zmniejszać temperaturę, aż do osiągnięcia temperatury pokojowej.
    4. Starannie przygotuj płaskie odcinki o grubości 30-60 μm z tych bloków PEG za pomocą mikrotomu i jednorazowych ostrzy.
    5. Zbierz i umyj sekcje w trzech kolejnych kąpielach wodnych przez 5 minut, aby usunąć PEG z sekcji.
  2. Przygotowanie sondy fluorescencyjnej
    1. Przygotować roztwór buforowy 30 mM fosforanu o pH 6,0.
    2. Zważ proszek sondy rodaminy PEG rhand dekstranu.
    3. Rozpuścić proszek z sondy w buforze, ciągle mieszając w szklanej fiolce przez 1 godzinę w ciemności, w końcowym stężeniu 0,1 g/l.
  3. Barwienie próbek roślin
    1. Inkubować sekcje z 500 μl sondy fluorescencyjnej (patrz 1.2.3) przez 72 godziny (bez mieszania) w plastikowej probówce (nie więcej niż 3 sekcje na probówkę) w ciemności.
    2. Podnieś sekcję za pomocą pędzla, zaadsorbuj bufor czystym arkuszem (unikaj wysuszenia sekcji), a następnie zamontuj inkubowane sekcje między szkłem nakrywkowym a szkiełkiem nakrywkowym #1.5H.

2. Czas życia fluorescencji i kalibracja systemu pomiarów spektralnych

UWAGA: Pełny przebieg pomiaru sFLIM jest przedstawiony w Rysunek 2.

  1. Określ szerokość okna widmowego detektora sFLIM.
    1. Umieść kryształy mocznika w pudełku hodowlanym ze szklanym dnem 0,17 μm.
    2. Umieść pudełko hodowlane na uchwycie na próbkę mikroskopu i wybierz obiektyw 20x.
    3. Wybierz laser Ti:Sa o długości fali 900 nm i mocy 2% i włącz skanowanie.
    4. Zbierz drugi sygnał harmonicznej na detektorze sFLIM.
      UWAGA: Sygnał drugiej harmonicznej jest emitowany dokładnie przy połowie długości fali wzbudzenia 450 nm; Środek ten, choć natychmiastowy, zapewnia również funkcję odpowiedzi instrumentalnej systemu.
    5. Stopniowo dostosowuj długość fali wzbudzenia lasera od 900 do 980 nm, aż sygnał drugiej harmonicznej zostanie zebrany w drugim kanale widmowym (462,5 nm).
    6. Określ długość okna widmowego (12,5 nm).
    7. Jeśli zakres widmowy różni się od oczekiwanego, rozwiąż problem, wykonując następujące czynności.
      1. Ustaw laser na 910 nm.
      2. Przesuń pozycję siatki za pomocą kółka przewijania, aby zmierzyć drugi sygnał harmoniczny tylko na pierwszym kanale (granica pierwszego kanału).
      3. Ustaw laser na 935 nm.
      4. Przesuń pozycję siatki za pomocą kółka przewijania, aby zmierzyć drugi sygnał harmoniczny tylko na pierwszym kanale (granica drugiego kanału).
  2. Kalibracja wszystkich kanałów spektrometru
    1. Włóż lustro do stolika mikroskopu.
    2. Wybierz widzialny laser ciągły (458 nm, 1% mocy).
    3. Zbierz sygnał odbicia na detektorze sFLIM i sprawdź, czy fotony są mierzone w odpowiednim kanale widmowym.
    4. Powtórzyć kroki 2.2.2 i 2.2.3 dla wszystkich dostępnych laserów ciągłych (514 nm, 561 nm i 633 nm).
    5. Jeśli kanał widmowy różni się od oczekiwanego, przesuń pozycję siatki za pomocą kółka przewijania i powtórz kroki 2.1 i 2.2.

3. Charakterystyka fluorescencji próbki

  1. W spektrofluorometrze wyposażonym w akcesorium do mocowania filmu (np. przyrząd Jasco FP-8500) umieścić próbkę z wycinka rośliny (nie inkubowaną za pomocą sondy fluorescencyjnej).
  2. Mierz emisję fluorescencji zwykle w zakresie 300-600 nm, jednocześnie wzbudzając próbkę zwykle w zakresie 250-550 nm.
  3. Wykreśl intensywność fluorescencji w funkcji długości fal wzbudzenia i emisji, aby narysować mapę fluorescencji 3D.
  4. Określić maksymalną powierzchnię wzbudzenia/emisji z powierzchni.

4. Pomiar spektralny FRET

  1. Kalibracja autofluorescencji
    1. Wybierz obiektyw 20x (NA: 0.8).
    2. Ustaw wzbudzenie lasera dwufotonowego na 750 nm.
    3. Umieść samą sekcję rośliny słomy pszennej (WS) między szkiełkiem a szkiełkiem nakrywkowym.
    4. Zastosuj następujące parametry w oprogramowaniu. Przełącz w tryb lambda. Wybierz detektor spektralny ChS o rozdzielczości 9,7 nm. Wybierz zakres spektralny od 420 do 722 nm.
    5. Uzyskaj obraz.
    6. Określić szczyt emisji donorowej (470 nm w tej konfiguracji).
  2. Kalibracja akceptora
    1. Umieść sondy fluorescencyjne na bazie rodaminy w pudełku hodowlanym ze szklanym dnem 0,17 μm.
    2. Uzyskaj obraz z tym samym ustawieniem.
    3. Określ szczyt emisji akceptora (570 nm w tej konfiguracji).
  3. Określ zakres widmowy z maksymalnym sygnałem "sam WS" i bez sygnału akceptora jako emisja tylko donorowa dla pomiarów sFLIM (460-490 nm przy tej konfiguracji).
  4. Pomiar próbki
    1. Umieść poplamioną część rośliny między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym.
    2. Uzyskaj obraz z tym samym ustawieniem.
    3. Zapisz plik lsm.
    4. Jakościowo powiąż silne zdarzenie FRET ze spadkiem piku emisji dawcy w porównaniu z "samą próbką WS" i wzrostem piku emisji akceptora w porównaniu z próbką rodaminy.

5. pomiary sFLIM

UWAGA: Dla konfiguracji sFLIM używany jest system sFLIM w dziedzinie czasu, jak opisano wcześniej10. Można użyć mikroskopu pionowego i różnych skorelowanych czasowo kart do liczenia pojedynczych fotonów i producentów mikroskopów konfokalnych, a protokół należy odpowiednio dostosować.

  1. Przełącz system w tryb sFLIM.
    1. Ustawić mikroskop konfokalny zgodnie z opisem w 4.1.1 i 4.1.2.
    2. Przełącz się w tryb Non-Descanned w oprogramowaniu, aby wysłać fotony fluorescencyjne do detektora sFLIM.
    3. Ustaw akwizycję sFLIM w trybie Włącz, aby zezwolić na zliczanie fotonów w SPC150.
    4. Wybierz zbieranie czasu 30 s na SPC150.
    5. Sprawdź, czy CFD mieści się w przedziale od 1 x 105 do 1 x 106.
      UWAGA: Upewnij się, że liczba fotonów mierzona na karcie TCSPC jest zawsze mniejsza niż 1% częstotliwości wzbudzenia lasera (w tej konfiguracji częstotliwość wzbudzenia lasera wynosi 80 Mhz, a szybkość wykrywania nie może przekraczać 800 kHz w dowolnym pikselu, aby uniknąć efektu nawarstwiania się11).
  2. Umieść sekcję rośliny "WS sam" między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym.
    1. Ustaw oprogramowanie w trybie ciągłym, aby umożliwić skanowanie laserowe.
    2. Wybierz obszar pomiaru na próbce.
    3. Kliknij przycisk Start w SPC150.
    4. Zapisz plik sdt.
    5. Powtórz proces dla co najmniej 10 próbek na warunek.
  3. Umieść poplamioną część rośliny między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym.
    1. Powtórz kroki 5.2.1 - 5.2.5.

6. analiza sFLIM

  1. Wybierz plik pozyskanych danych sFLIM na "WS sam" i zaimportuj je do oprogramowania SPCImage za pomocą Plik | Import.
  2. Wybierz parametry pasowania.
    1. Z opcji | Model, wybierz Niekompletne liczby wielowykładnicze: 12,5 ns.
    2. Z opcji | Preferencje, wybierz opcję Oblicz odpowiedź instrumentalną automatycznie.
    3. Z menu po prawej stronie panelu głównego wybierz model dopasowania 2 wykładniczo:
      figure-protocol-1
  3. Dla każdego kanału zastosuj model dopasowania i zapisz parametry dopasowania w arkuszu kalkulacyjnym (a1, a2, t1, t2).
  4. W celu porównania kanałów i eksperymentów oblicz średni czas trwania fluorescencji w arkuszu kalkulacyjnym (Tm):
    figure-protocol-2
  5. Obliczyć średni czas życia dla wszystkich próbek (co najmniej 10) we wszystkich kanałach.
    1. Przeanalizuj Tm na kanałach donorowych (od kanału 1 do 3: 460-490 nm) i wyznacz dedykowany kanał (kanał 2 odpowiadający 467,5 - 480 nm), który wykazuje najwyższą liczbę fotonów i odpowiada maksymalnej emisji ligniny. W kroku 6.7 należy użyć wartości z kanału 2.
  6. Wybierz plik z danymi pobranymi sFLIM na poplamionym WS i zaimportuj je do oprogramowania SPCImage.
    1. Powtórz kroki 6.1-6.4.
  7. Obliczyć skuteczność FRET EFRET dla dawcy w poprzednio wybranym kanale WS Alone (TmD) i z barwionej próbki rośliny (TmDA):
    figure-protocol-3
  8. Porównaj wartości sFLIM i EFRET między WS a próbką.
    1. Rozważ dodatni EFRET związany z jednorodnym spadkiem czasu życia między WS a próbką, która ma być analizowana, jako zdarzenie FRET (zobacz reprezentatywne wyniki i prace Spriet et al.12 i Terryn et al.10 w celu uzyskania szczegółowych informacji).
    2. Rozważ, że spadek czasu życia rozłożony w różny sposób jest spowodowany mieszanką poziomu zagęszczenia FRET i ligniny i nie interpretuj go jako oddziaływań molekularnych.
    3. Rozważ brak modyfikacji czasu życia jako brak mierzalnego sygnału FRET, ale nie jako brak interakcji z ligniną

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zademonstrować zdolność sFLIM do analizowania molekularnych interakcji między ligniną a cząsteczkami znakowanymi fluorescencyjnie, najpierw użyliśmy trzech różnych próbek (Rysunek 3): rodzima słoma pszenna (WS), rodzima słoma pszenna inkubowana z PEG oznaczona rodaminą (PR10) oraz rodzima słoma pszenna z dekstranem oznaczona rodaminą (DR10). Wiadomo, że PR10 oddziałuje z ligniną, podczas gdy DR10 ma być obojętny13,14,15. Krzywe sFLIM (Rysunek 3, góra) pokazują pewne modyfikacje, które można osiągnąć między próbką referencyjną (WS) a dwoma przypadkami interakcji (DR10 i PR10). Rzeczywiście, po raz pierwszy można łatwo zauważyć wzrost fluorescencji w obszarach widmowych odpowiadających zakresowi emisji rodaminy. Dokładna obserwacja trzech krzywych rozpadu fotonów w pierwszym kanale również ujawnia silniejsze przegięcie dla DR10 niż dla PR10. Po dopasowaniu krzywych rozpadu fotonów i obliczeniu średniego czasu życia fluorescencji każdego kanału, sygnatura FRET staje się bardziej oczywista (Rysunek 3, na dole). Rzeczywiście, podczas gdy czas życia fluorescencji naprzemiennie zwiększa się i maleje wzdłuż widma fluorescencji dla próbki WS, obserwuje się wyraźną sygnaturę FRET zarówno dla PR10, jak i DR10 z: 1) stałą wartością czasu życia w kanale emisyjnym tylko dla dawcy (3 pierwsze kanały, na niebiesko); oraz 2) wydłużający się czas życia fluorescencji w kanale widmowym odpowiadający rosnącemu udziałowi fluoroforu dawcy o długim czasie życia.

Po jednoznacznym ustaleniu FRET, porównanie czasu życia fluorescencji ligniny (kanał 2) pozwala na ilościowe określenie skrócenia czasu życia między WS (0,47 ns), DR10 (0,42 ns) i PR10 (0,36 ns), a tym samym ujawnia molekularne interakcje między ligniną a zarówno PR10, jak i DR10 o silniejszym powinowactwie do PR10.

Aby zilustrować znaczenie tej metody do ilościowego określania różnych poziomów interakcji, wybieramy trzy inne próbki, naśladując dostępność enzymów na próbkach roślinnych poddanych działaniu substancji: kwasowa WS (AWS), w połączeniu z PR o dwóch kontrastowych masach cząsteczkowych 5 kDa i 20 kDa (PR5 i PR20). Po dokładnym zbadaniu sygnatur sFLIM ekstrahuje się czas życia fluorescencji ligniny (Rysunek 4). Jak wspomniano wcześniej, czas życia fluorescencji ligniny może być zmieniany przez jej środowisko16,17. Po potraktowaniu kwasem pomiary czasu życia fluorescencji w AWS (0,28 ns) stają się niższe niż poprzednio mierzone dla WS (0,47 ns), co potwierdza wymóg procedury sFLIM dla jednoznacznej interpretacji skrócenia czasu życia oraz konieczność kontroli ujemnych dla każdego badanego stanu. Zgodnie z oczekiwaniami, po dodaniu PR do AWS obserwuje się znaczny spadek żywotności, podczas gdy wchodzi on w interakcję z ligniną. Ponadto oddziaływanie jest silniejsze z PR5 (0,14 ns) w porównaniu z PR20 (0,16 ns), co jest zgodne z ich pomiarem promienia hydrodynamicznego (odpowiednio 2,3 nm i 4,8 nm dla PR5 i PR20), indukując różne ograniczenia steryczne, a tym samym większą dostępność PR5 dla ligniny.

Oba eksperymenty pokazują przydatność tej metody do precyzyjnej oceny interakcji ligniny z enzymami, w zależności od ich wielkości i próbek roślinnych poddanych wstępnej obróbce.

figure-results-1
Rysunek 1: Różne etapy przygotowania próbek. Słoma pszenna (WS) (A) jest najpierw zmniejszana pod względem wielkości (B), aby zostać osadzona w podłożu PEG (C). Blok jest cięty za pomocą mikrotomu wyposażonego w jednorazowe ostrza (D). Po umyciu powstałe skrawki (E) umieszcza się do inkubacji w roztworze rodaminy znakowanym PEG lub dekstranem (F). Oznaczone sekcje są montowane do pomiarów sFLIM (G). Podziałki mają 2 cm (A), 1 cm (B i C), 200 μm (E i G). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Kompletny przebieg pomiarów oddziaływań spektralnych opartych na FRET. Rysunek przedstawia układ łączący pomiary intensywności fluorescencji spektralnej i czasu życia. Spektralne obrazy fluorescencyjne są pozyskiwane za pomocą mikroskopu konfokalnego, a sekwencyjnie mierzone są czasy życia fluorescencji dla każdego zakresu spektralnego za pomocą detektora sFLIM. Analiza krzywych rozpadu fotonów pozwala na dokładne określenie oddziaływań między próbką a cząsteczkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Kalibracje muszą być przetwarzane, aby uniknąć artefaktów. Po pierwsze, detektor sFLIM musi zostać skalibrowany spektralnie i musi zostać sprawdzona jego funkcja odpowiedzi instrumentalnej. Po drugie, złożony sygnał autofluorescencji musi być precyzyjnie skalibrowany dla każdej próbki, aby określić czas życia fluorescencji w każdym kanale przed dodaniem cząsteczki akceptora. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Reprezentatywne pomiary sFLIM. Krzywe sFLIM (górny panel) uzyskano na rodzimej słomie pszennej (WS), WS inkubowanej z PEG znakowanym rodaminą (WS+PEG) oraz natywnej słomie pszennej z dekstranem znakowanym rodaminą (WS+DEX). Dla każdej próbki krzywe sFLIM wyposażono w model rozpadu dwuwykładniczego, a średni czas trwania fluorescencji obliczono dla każdego kanału (dolny panel). Próbki WS+PEG i WS+DEX wykazują zmniejszenie czasu życia fluorescencji w kanale odpowiadającym tylko autofluorescencji (trzy pierwsze kreski) związane ze wzrostem czasu życia kanału odpowiadającym mieszanej emisji autofluorescencji i rodaminy. To zachowanie jest charakterystyczne dla zdarzenia FRET między cząsteczkami znakowanymi ligniną i rodaminą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Analiza czasu życia fluorescencji kanału odpowiadającego autofluorescencji ligniny. Po walidacji zdarzenia FRET na podstawie sygnatury sFLIM, średni czas trwania fluorescencji zmierzono na WS potraktowanym kwasem (AWS), w połączeniu z PR5 lub PR20 (odpowiednio 5 kDa i 20 kDa). Podczas gdy obie próbki PR wykazują skrócenie czasu życia, mniejsza charakteryzuje się silniejszym skróceniem czasu życia, ujawniając silniejszą interakcję molekularną z ligniną. Metoda jest zatem wystarczająco czuła, aby rozróżnić oba te czynniki (reprezentowana jest wartość średnia i błąd standardowy, n>10 na warunek). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korelacja czasu życia fluorescencji i pomiarów widma emisyjnego pozwala na połączenie zalet obu metod. Rzeczywiście, same pomiary spektralne nie są czułe i pozostają jakościowe. Z drugiej strony, czas trwania fluorescencji jest metodą z wyboru dla tradycyjnych ilościowych pomiarów FRET, ale wykazano, że autofluorescencja ligniny może się różnić w zależności od składu ligniny i środowiska16. W związku z tym nie można rozróżnić interakcji ligniny z akceptorem lub zmian strukturalnych ligniny, ponieważ oba powodują skrócenie czasu życia. Jak wykazano, opracowana metoda zapewnia jednoznaczny, czuły i ilościowy pomiar oddziaływań między ligniną a cząsteczkami akceptorowymi w sekcjach roślinnych. Nawet jeśli poszczególne etapy metody zostały rygorystycznie zoptymalizowane, należy szczególnie zachować ostrożność w odniesieniu do następujących punktów.

Jeśli chodzi o próbki, jakość sekcji roślinnej ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia obrazowania w ostrości. Należy ściśle przestrzegać różnych kroków osadzania PEG. Ostatni etap mycia jest niezbędny, aby upewnić się, że PEG nie pozostaje w próbkach. Ponadto stężenie buforu i pH powinny być ściśle takie same dla wszystkich pomiarów, ponieważ każda zmiana może mieć silny wpływ na właściwości fluorescencyjne.

Pomiar żywotności może być również delikatny. Czas życia fluorescencji dawcy może być niestabilny, na przykład z powodu dużego wzbudzenia. W takim przypadku dostrojenie mocy lasera i zoomu może rozwiązać problem. Innym dobrze znanym źródłem artefaktów w pomiarach TCSPC jest nawarstwianie się impulsów fotonowych. Rzeczywiście, TCSPC nie może zmierzyć prędkości dwóch fotonów emitowanych między tymi samymi dwoma impulsami laserowymi. Podczas gdy próbki roślinne są wysoce ustrukturyzowane, fluorescencja nie jest jednorodna i może prowadzić do ukrytego efektu nawarstwiania się impulsów. Podczas gdy liczba fotonów na sekundę pozostaje poniżej 1% limitu wzbudzenia, może być wyższa w niektórych obszarach próbki. Aby upewnić się, że nie ma eksperymentów z pileupem, można rozważyć pomiar czasu życia fluorescencji dawcy przy innym strumieniu fotonów. Jeśli czas życia wzrasta, a strumień maleje, oznacza to, że pomiary zmieniają efekt pileup. Optymalny strumień fotonów jest osiągany przy stabilności życia donora.

Jeśli chodzi o analizę krzywej zaniku sFLIM, zalecamy poleganie na każdym indywidualnym dopasowaniu krzywej, aby upewnić się, że model dokładnie opisuje pomiary. Jeśli tak nie jest, najpierw upewnij się, że żaden z wcześniej wymienionych artefaktów nie uszkodził danych. Następnie, krok 2.1.4 zapewnia funkcję odpowiedzi instrumentalnej (IRF) systemu. Jeśli IRF wykazuje pewne anomalie, zoptymalizuj ścieżkę optyczną, aby je zminimalizować. Można również użyć zmierzonego IRF do montażu w kroku 6.2. Wreszcie, stopnie swobody modelu dopasowania można zwiększyć do trzywykładniczego rozpadu w kroku 6.2. Jednak liczba fotonów wymagana do indywidualnego czasu życia i określenia proporcji jest wysoka i dlatego zaleca się ich stosowanie wyłącznie w celu osiągnięcia bardziej stabilnego średniego czasu życia z kroku 6.4. Bardziej wyczerpujące informacje na temat FLIM, jego charakterystyki18, sFLIM i jego zastosowania12 , w szczególności do ligniny10, można znaleźć w literaturze.

Chociaż jest to trudne, pomiar FRET w tkankach roślinnych przy użyciu natywnej autofluorescencji wykazuje pewne zalety. W porównaniu z pomiarami FRET wykonywanymi na żywych tkankach, w których badania interakcji między biomolekułami często wymagają inżynierii genetycznej w celu ekspresji wewnętrznych markerów fluorescencyjnych, zdrewniałe tkanki roślinne, takie jak te przedstawione tutaj, oferują naturalną autofluorescencję, a zewnętrzne sondy fluorescencyjne mogą być łatwo dodane, oszczędzając dużo czasu. Jednak w zależności od analizowanych gatunków roślin i możliwych przeprowadzonych zabiegów wstępnych, autofluorescencja może zostać zmodyfikowana, tak że będzie musiała być dokładnie scharakteryzowana, a fluorofor używany jako sondy może wymagać adaptacji.

Metodę sFLIM należy stosować do sond fluorescencyjnych pozbawionych aktywności katalitycznej (PEG i dekstran). W ramach hydrolizy lignocelulozy roślinnej można przeprowadzić oddziaływania enzymów w różnych próbkach biomasy, co może prowadzić do określenia wpływu lokalizacji (komórek i tkanek) na siłę oddziaływania. Kolejnym krokiem optymalizacyjnym będzie automatyzacja kroku analizy. Rzeczywiście, przy wystarczającej ilości przeanalizowanych danych, procedura analizy oparta na uczeniu maszynowym może zostać wdrożona do zautomatyzowanej analizy fenotypu, co zwiększyłoby jej zdolność do szybkiego badania przesiewowego wydajności enzymów i biomasy. Ponadto sFLIM nie wymaga utrwalania próbki i może być łatwo stosowany do dynamicznych badań interakcji enzym-lignina. Taka unikalna metoda prawdopodobnie ukierunkuje strategię inżynierii enzymatycznej i wstępną obróbkę biomasy w celu optymalizacji waloryzacji lignocelulozy.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fanny Laurent (FARE) serdecznie dziękujemy za przygotowanie figurek. Federacja badawcza FRABio (Uniwersytet w Lille, CNRS) jest uznawana za zapewnienie środowiska technicznego sprzyjającego realizacji tych prac. Finansowanie uzyskano z Francuskiej Narodowej Agencji Badawczej (projekt LIGNOPROG ANR-14-CE05-0026).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop konfokalnyZEISSLSM 710 NLOdo obrazowania konfokalnego
cienka szczoteczkado pobierania skrawków
szklane fiolkido inkubacji
mikroskop o wysokiej precyzji okulary nakrywkowe 170 +/- 5 i mikro; m n° 1,5#Marienfeld0107032wystawiony przez Dutscher s.a. we Francji
Laser impulsowy na podczerwieńKOHERENTCHAMELEON VISIONDo wzbudzenia próbki
Mikropipeta Research Plus jednokanałowa 20-200&mikro; LEppendorfz odpowiednimi końcówkami
Mikropipeta Research Plus jednokanałowa 2-20µ LEppendorfz odpowiednimi
końcówkami Szkiełka mikroskopowe ok. 76 x 26 mm szlifowane krawędzie matowakońcówka Thermo Fisher ScientificLR45D
ostrza mikrotomu jednorazowe (opakowanie 50 szt.)Agar ScientificT5024sprzedany przez Oxford Instruments we Francji
mPEG-Rhodamine, 10 kDaCreative Peg WorksPSB-2263
mPEG-Rhodamine, 20 kDaCreative Peg WorksPSB-22642
mPEG-Rhodamine, 5 kDaCreative Peg WorksPSB-2264
lakierdo paznokci do montażu
pH-metru pięć easy plusMettlertoledo FEP20z elektrodą
poli(glikol etylenowy) średnia mol wt 1450Merck (sigma-Aldrich)P5402-1kgdo zatapiania próbki
żyletki, ostrza jednoostrzowe, stal nierdzewna, pudełko 100sztuk Agar ScientificT586do przygotowania fragmentów sprzedawany przez Oxford Instruments we Francji
mikrotom rotacyjnyMicrom MicrotechHM 360
sFLim detektorBECKER-HICKLSPC 150do dożywotniego pozyskiwania
diwodorofosforanu sodu dwuwodny NaH2PO4, 2H2OMerck (sigma-Aldrich)71500dla roztwór buforowy
fosforan sodu dwuzasadowy dwuwodny Na2HPO4,2H2OMerck (sigma-Aldrich)30435-1kgdo roztworu buforowego, stare odniesienie, nowe to 71643-1kg
izotiocyjanian tetrametylu rodaminy-dekstran 10 k DaMerck (sigma-Aldrich)R8881-100mg

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Inouye, H., et al. Multiscale deconstruction of molecular architecture in corn stover. Scientific Reports. 4, 3756(2014).
  2. Li, X., Zheng, Y. Lignin-enzyme interaction: Mechanism, mitigation approach, modeling, and research prospects. Biotechnology Advances. 35 (4), 466-489 (2017).
  3. Vogel, J. Unique aspects of the grass cell wall. Current Opinion in Plant Biology. 11 (3), 301-307 (2008).
  4. Lynd, L. R. The grand challenge of cellulosic biofuels. Nature Biotechnology. 35, 912(2017).
  5. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer. Current Opinion in Biotechnology. 6, 103-110 (1995).
  6. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  7. Pietraszewska-Bogiel, A., Gadella, T. W. J. FRET microscopy: from principle to routine technology in cell biology. Journal of Microscopy. 241 (2), 111-118 (2011).
  8. Herbaut, M., et al. Multimodal analysis of pretreated biomass species highlights generic markers of lignocellulose recalcitrance. Biotechnology for Biofuels. 11, 52(2018).
  9. Chabbert, B., et al. Fluorescence techniques can reveal cell wall organization and predict saccharification in pretreated wood biomass. Industrial Crops and Products. 123, 84-92 (2018).
  10. Terryn, C., Paës, G., Spriet, C. FRET-SLiM on native autofluorescence: a fast and reliable method to study interactions between fluorescent probes and lignin in plant cell wall. Plant Methods. 14 (1), 74(2018).
  11. Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Cell Structure and Function by Microspectrofluorometry. Kohen, E. , Academic Press. 99-117 (1989).
  12. Spriet, C., et al. Correlated fluorescence lifetime and spectral measurements in living cells. Microscopy Research and Technique. 70 (2), 85-94 (2007).
  13. Donaldson, L. A., Newman, R. H., Vaidya, A. Nanoscale interactions of polyethylene glycol with thermo-mechanically pre-treated Pinus radiata biofuel substrate. Biotechnology and Bioengineering. 111 (4), 719-725 (2014).
  14. Herbaut, M., Zoghlami, A., Paës, G. Dynamical assessment of fluorescent probes mobility in poplar cell walls reveals nanopores govern saccharification. Biotechnology for Biofuels. 11 (1), 271(2018).
  15. Paës, G., Chabbert, B. Characterization of arabinoxylan / cellulose nanocrystals gels to investigate fluorescent probes mobility in bio-inspired models of plant secondary cell wall. Biomacromolecules. 13, 206-214 (2012).
  16. Donaldson, L. A., Radotic, K. Fluorescence lifetime imaging of lignin autofluorescence in normal and compression wood. Journal of Microscopy. 251 (2), 178-187 (2013).
  17. Auxenfans, T., Terryn, C., Paës, G. Seeing biomass recalcitrance through fluorescence. Scientific Reports. 7, 8838(2017).
  18. Waharte, F., Spriet, C., Héliot, L. Setup and characterization of a multiphoton FLIM instrument for protein-protein interaction measurements in living cells. Cytometry A. 4, 299-306 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oddzia ywania ligninyobrazowanie sFLIManaliza FRETczas ycia fluorescencjiobrazowanie spektralnebiomasa lignocelulozowaoddzia ywania enzymatyczneobr bka PEG

Powiązane artykuły