Artykuł metodologiczny

Pomiar interakcji między sondami fluorescencyjnymi a ligniną w skrawkach roślin za pomocą sFLIM w oparciu o natywną autofluorescencję

5.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59925

⸱

2 stycznia 2020

 ,  ,  , 
1PICT Platform, Université de Reims Champagne-Ardenne, 2Fractionation of AgroResources and Environment (FARE) Laboratory, INRA, Université de Reims Champagne-Ardenne, 3Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle, Université de Lille

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje oryginalną konfigurację łączącą pomiary czasu życia widma i fluorescencji w celu oceny transferu energii rezonansu Förstera (FRET) między sondami fluorescencyjnymi na bazie rodaminy a polimerem ligniny bezpośrednio w grubych sekcjach rośliny.

Streszczenie

W biomasie lignocelulozowej (LB) aktywność enzymów jest ograniczona przez pojawienie się niespecyficznych interakcji z ligniną podczas procesu hydrolizy, co utrzymuje enzymy z dala od ich substratu. Charakterystyka tych złożonych oddziaływań jest zatem wyzwaniem w przypadku złożonych substratów, takich jak LB. Metoda ta mierzy interakcje molekularne między cząsteczkami znakowanymi fluoroforem a natywną ligniną autofluorescencyjną, które zostaną ujawnione przez rezonansowy transfer energii Förstera (FRET). W przeciwieństwie do pomiarów FRET w żywych komórkach przy użyciu dwóch egzogennych fluoroforów, pomiary FRET w roślinach wykorzystujących ligninę nie są trywialne ze względu na jej złożoną autofluorescencję. Opracowaliśmy autorski potok akwizycji i analizy ze skorelowaną obserwacją dwóch uzupełniających się właściwości fluorescencji: emisji fluorescencji i czasu życia. sFLIM (spectral and fluorescent lifetime imaging microscopy) zapewnia ilościowe określenie tych interakcji z wysoką czułością, ujawniając różne poziomy interakcji między biomolekułami a ligniną.

Wprowadzenie

Hydroliza lignocelulozy do cukrów monomerycznych, takich jak glukoza, wymaga enzymów. Wiadomo, że ich aktywność jest ograniczona przez ustanowienie niespecyficznych interakcji między enzymami a ligniną1,2, przy czym ten ostatni jest hydrofobowym polimerem i głównym składnikiem lignocelulozy3. W związku z tym ilościowy pomiar takich interakcji bezpośrednio na skali komórkowej jest wyzwaniem, z którym należy się zmierzyć, aby zoptymalizować aktywność katalityczną enzymu i wstępną obróbkę lignocelulozą4.

Förster (lub fluorescencyjny) pomiar rezonansowego transferu energii (FRET) jest metodą z wyboru do oceny interakcji biomolekuł in situ. Ten nieradiacyjny transfer energii może zachodzić między dawcą a akceptorem fluoroforu, jeśli spełniają one różne warunki. Widmo emisji donorowej musi się pokrywać, przynajmniej częściowo, na widmo wzbudzenia akceptorów. Wybór fluoroforów jest więc kluczowy dla takich eksperymentów. Następnie wydajność transferu zmniejsza się wraz z szóstą potęgą ich odległości5 i występuje tylko wtedy, gdy obie cząsteczki znajdują się w bliskim sąsiedztwie (zwykle w zakresie nanometrów). Inne nieprzewidziane sytuacje mogą zmienić wydajność transferu, takie jak orientacja dipol-dipol, ale są łagodzone, jeśli fluorofory mają elastyczność.

FRET można mierzyć różnymi technikami, a szczegółowe opisy można znaleźć w literaturze6,7. Krótko mówiąc, główne metody opierają się na: i) emisji uczulonej, w której śledzi się zmianę fluorescencji emisji akceptorowej i które zapewniają głównie wyniki jakościowe; ii) fotowybielanie akceptorowe, w którym mierzy się fluorescencję emisji donorowej przed i po fotowybielaniu akceptorowym (w tym przypadku można uzyskać bardziej precyzyjne oszacowania FRET, ale wymagają one zastosowania dużej mocy lasera do utrwalonych próbek); oraz iii) pomiar czasu życia, który zmniejsza się dla dawcy w obecności akceptora. Metoda ta wymaga specjalnych przyrządów i pozwala na precyzyjne i czułe pomiary interakcji między fluoroforami. Biorąc pod uwagę pomiar FRET między sondami fluorescencyjnymi a lignocelulozą, główna trudność polega na tym, że lignoceluloza nie jest pojedynczym, dobrze scharakteryzowanym fluoroforem: ma silną natywną i spektralnie szeroką autofluorescencję, pochodzącą głównie z ligniny i zależną od gatunków biomasy8,9.

W tym artykule proponujemy nową i oryginalną procedurę dostosowaną do przekrojów próbek drewna/roślin. Ta metoda oparta na sFLIM otwiera drogę do ilościowych pomiarów FRET między sondami fluorescencyjnymi a ligniną w natywnych próbkach lignocelulozy.

Protokół

1. Przygotowanie próbek

UWAGA: Kolejne etapy przygotowania próbek zostały przedstawione na Rysunku 1.

  1. Przygotowanie próbek roślinnych
    1. Z pni lub fragmentów drewna wyciąć za pomocą żyletek próbki o długości 1 cm, nie uszkadzając ich struktury.
    2. Zatopić próbki w medium z glikolem polietylenowym (PEG), zanurzając je w kolejnych roztworach o zwiększonym stężeniu PEG rozpuszczonego w wodzie, aż do osiągnięcia 100% PEG.
      1. Umieścić próbkę w próżni w celu usunięcia wody.
      2. Łagodnie mieszać próbki w 30% v/v PEG przez 24 h.
      3. Łagodnie mieszać próbki w 50% v/v PEG przez 24 h.
      4. Łagodnie mieszać próbki w 100% PEG przez 24 h w temperaturze 70 °C (czysty PEG jest ciałem stałym w temperaturze pokojowej).
    3. Umieścić próbki w kapsułkach w temperaturze 70 °C (na płycie grzewczej) i stopniowo obniżać temperaturę aż do osiągnięcia temperatury pokojowej.
    4. Starannie przygotować płaskie skrawki o grubości 30-60 µm z tych bloków PEG, używając mikrotomu i jednorazowych ostrzy.
    5. Zebrać skrawki i przemyć je w trzech kolejnych kąpielach wodnych po 5 min, aby usunąć PEG ze skrawków.
  2. Przygotowanie sondy fluorescencyjnej
    1. Przygotować roztwór buforu fosforanowego 30 mM o pH 6.0.
    2. Odważyć proszek sondy PEG-rodamina i dekstran-rodamina.
    3. Rozpuścić proszek sondy w buforze przy ciągłym mieszaniu w szklanej fiolce przez 1 h w ciemności do końcowego stężenia 0,1 g/L.
  3. Barwienie próbek roślinnych
    1. Inkubować skrawki z 500 µL sondy fluorescencyjnej (patrz 1.2.3) przez 72 h (bez mieszania) w plastikowej probówce (nie więcej niż 3 skrawki na probówkę) w ciemności.
    2. Podnieść skrawek pędzelkiem, odsączyć bufor czystym arkuszem (unikając wysuszenia skrawka), a następnie zamontować inkubowane skrawki między szkiełkiem podstawowym a lamelką #1.5H.

2. Kalibracja systemu pomiarowego czasu życia fluorescencji i widma

UWAGA: Pełny przebieg pomiaru sFLIM przedstawiono na Rysunku 2.

  1. Wyznaczenie szerokości okna widmowego detektora sFLIM.
    1. Umieść kryształy mocznika w pudełku hodowlanym z dnem szklanym o grubości 0,17 µm.
    2. Umieść pudełko hodowlane na uchwycie do próbek mikroskopu i wybierz obiektyw 20x.
    3. Wybierz laser Ti:Sa o długości fali 900 nm i mocy 2%, a następnie włącz skanowanie.
    4. Zbierz sygnał drugiej harmonicznej na detektorze sFLIM.
      UWAGA: Sygnał drugiej harmonicznej jest emitowany dokładnie przy połowie długości fali wzbudzenia, tj. 450 nm; pomiar ten, mimo że jest natychmiastowy, dostarcza również funkcji odpowiedzi instrumentalnej układu.
    5. Stopniowo dostrajaj długość fali wzbudzenia lasera od 900 do 980 nm, aż sygnał drugiej harmonicznej zostanie zarejestrowany w drugim kanale widmowym (462,5 nm).
    6. Wyznacz długość okna widmowego (12,5 nm).
    7. Jeśli zakres widmowy różni się od oczekiwanego, przeprowadź rozwiązywanie problemów w następujący sposób.
      1. Ustaw laser na 910 nm.
      2. Zmieniaj pozycję siatki za pomocą pokrętła, aby zmierzyć sygnał drugiej harmonicznej wyłącznie na pierwszym kanale (granica pierwszego kanału).
      3. Ustaw laser na 935 nm.
      4. Zmieniaj pozycję siatki za pomocą pokrętła, aby zmierzyć sygnał drugiej harmonicznej wyłącznie na pierwszym kanale (granica drugiego kanału).
  2. Kalibracja wszystkich kanałów spektrometru
    1. Wstaw lustro na stole mikroskopu.
    2. Wybierz laser ciągły z widzialnym zakresem (458 nm, moc 1%).
    3. Zbierz sygnał odbicia na detektorze sFLIM i sprawdź, czy fotony są mierzone w odpowiednim kanale widmowym.
    4. Powtórz kroki 2.2.2 i 2.2.3 dla wszystkich dostępnych laserów ciągłych (514 nm, 561 nm i 633 nm).
    5. Jeśli kanał widmowy różni się od oczekiwanego, zmień pozycję siatki za pomocą pokrętła i powtórz kroki 2.1 i 2.2.

3. Charakterystyka fluorescencji próbki

  1. W spektrofluorometrze wyposażonym w uchwyt do folii (np. urządzenie Jasco FP-8500) umieść próbkę przekroju rośliny (nieinkubowaną z sondą fluorescencyjną).
  2. Zmierz emisję fluorescencji, zazwyczaj w zakresie 300-600 nm, pobudzając próbkę zazwyczaj w zakresie 250-550 nm.
  3. Nanieś intensywność fluorescencji w funkcji długości fal pobudzenia i emisji, aby sporządzić trójwymiarową mapę fluorescencji.
  4. Na podstawie wykresu określ obszar maksymalnego pobudzenia i emisji.

4. Pomiar widmowy FRET

  1. Kalibracja autofluorescencji
    1. Wybierz obiektyw 20x (NA: 0.8).
    2. Ustaw wzbudzenie laserem dwufotonowym na 750 nm.
    3. Umieść samą sekcję rośliny słomy pszenicznej (WS) pomiędzy szkiełkiem a nakrywekciem.
    4. Wprowadź następujące parametry w oprogramowaniu. Przełącz do trybu lambda. Wybierz detektor spektralny ChS z rozdzielczością 9.7 nm. Wybierz zakres widmowy od 420 do 722 nm.
    5. Wykonaj obrazowanie.
    6. Wyznacz pik emisji donora (w tej konfiguracji 470 nm).
  2. Kalibracja akceptora
    1. Umieść sondy fluorescencyjne na bazie rhodaminy w kasecie hodowlanej z szklanym dnem o grubości 0.17 µm.
    2. Wykonaj obrazowanie przy tych samych ustawieniach.
    3. Wyznacz pik emisji akceptora (w tej konfiguracji 570 nm).
  3. Wyznacz zakres widmowy z maksymalnym sygnałem „samego WS” i brakiem sygnału akceptora jako emisję wyłącznie donora dla pomiarów sFLIM (w tej konfiguracji 460-490 nm).
  4. Pomiar próbek
    1. Umieść barwioną sekcję rośliny pomiędzy szkiełkiem a nakrywekciem.
    2. Wykonaj obrazowanie przy tych samych ustawieniach.
    3. Zapisz plik lsm.
    4. Jakościowo powiąż silne zdarzenie FRET ze spadkiem piku emisji donora w porównaniu z „próbką samego WS” oraz wzrostem piku emisji akceptora w porównaniu z próbką rhodaminy.

5. Pomiary sFLIM

UWAGA: W przypadku konfiguracji sFLIM zastosowano system sFLIM w dziedzinie czasu, opisany wcześniej10. Można użyć mikroskopu pionowego oraz różnych kart do zliczania pojedynczych fotonów skorelowanych w czasie i mikroskopów konfokalnych różnych producentów; w takim przypadku protokół należy odpowiednio dostosować.

  1. Przełącz system w tryb sFLIM.
    1. Skonfiguruj mikroskop konfokalny zgodnie z opisem w punktach 4.1.1 i 4.1.2.
    2. Przełącz na Bez skanowania (non-descanned) tryb w oprogramowaniu służący do przesyłania fotonów fluorescencyjnych do detektora sFLIM.
    3. Ustaw akwizycję sFLIM na Włącz tryb umożliwiający zliczanie fotonów w urządzeniu SPC150.
    4. Wybierz czas poboru prób 30 s w urządzeniu SPC150.
    5. Sprawdź, czy CFD mieści się w zakresie od 1 x 105 oraz 1 x 106.
      OSTRZEŻENIE: Należy upewnić się, że liczba fotonów mierzonych przez kartę TCSPC zawsze stanowi mniej niż 1% częstotliwości wzbudzenia lasera (w tej konfiguracji częstotliwość wzbudzenia lasera wynosi 80 MHz, a szybkość detekcji w żadnym pikselu nie może przekroczyć 800 kHz, aby uniknąć efektu spiętrzania impulsów).11).
  2. Umieść przekrój rośliny „WS alone” pomiędzy preparatem a szkiełkiem nakrywkowym.
    1. Skonfiguruj oprogramowanie na Ciągły tryb umożliwiający skanowanie laserem.
    2. Wybierz obszar pomiarowy na próbce.
    3. Kliknij Start na urządzeniu SPC150.
    4. Zapisz plik sdt.
    5. Powtórz proces dla co najmniej 10 próbek na każdą warunkiem.
  3. Umieść zbarwiony przekrój rośliny pomiędzy szkiełkiem a lamellką.
    1. Powtórz kroki 5.2.1 – 5.2.5.

6. Analiza sFLIM

  1. Wybierz plik z nabytymi danymi sFLIM dla „WS alone” i zaimportuj go do oprogramowania SPCImage, korzystając z opcji File | Import.
  2. Wybierz parametry dopasowania.
    1. Z menu Option | Model wybierz Incomplete multi-exponentials: 12.5 ns.
    2. Z menu Option | Preferences wybierz Calculate Instrumental Response automatically.
    3. Z menu prawego panelu głównego wybierz model dopasowania dwueksponencjalny:
      Wzór na absorpcję przejściową, \( F(t) = IRF \otimes \left( a_1 e^{-\frac{t}{t_1}} + a_2 e^{-\frac{t}{t_2}} \right) \), schemat.
  3. Dla każdego kanału zastosuj model dopasowania i zapisz parametry dopasowania w arkuszu kalkulacyjnym (a1, a2, t1, t2).
  4. W celu porównania kanałów i eksperymentów oblicz w arkuszu kalkulacyjnym średni czas życia fluorescencji (Tm):
    Wzór na równowagę termiczną, równanie Tm, obliczenia analityczne, schemat do badania.
  5. Oblicz średni czas życia dla wszystkich próbek (co najmniej 10) we wszystkich kanałach.
    1. Przeanalizuj Tm w kanałach donora (od kanału 1 do 3: 460-490 nm) i wyznacz dedykowany kanał (kanał 2 odpowiadający przedziałowi 467.5 - 480 nm), który wykazuje najwyższą liczbę fotonów i odpowiada maksimum emisji ligniny. Wartości z kanału 2 muszą zostać użyte w kroku 6.7.
  6. Wybierz plik z nabytymi danymi sFLIM dla barwionego WS i zaimportuj go do oprogramowania SPCImage.
    1. Powtórz kroki 6.1-6.4.
  7. Oblicz wydajność FRET EFRET dla donora w wcześniej wybranym kanale WS Alone (TmD) oraz dla barwionej próbki roślinnej (TmDA):
    Wzór na wydajność FRET, \(E_{\text{FRET}} = 1 - \frac{T_{mDA}}{T_{mD}}\), stosowany w badaniach fluorescencyjnych.
  8. Porównaj wartości sFLIM i EFRET pomiędzy WS a próbką.
    1. Pozytywną wartość EFRET powiązaną z jednorodnym spadkiem czasu życia pomiędzy WS a próbką należy analizować jako zdarzenie FRET (szczegóły znajdują się w reprezentatywnych wynikach oraz pracach Spriet i wsp.12 oraz Terryn i wsp.10).
    2. Spadek czasu życia rozłożony w inny sposób należy uznać za wynik mieszanki FRET i stopnia upakowania ligniny i nie interpretować go jako oddziaływań molekularnych.
    3. Brak modyfikacji czasu życia należy uznać za brak mierzalnego sygnału FRET, a nie za brak oddziaływania z ligniną.

Wyniki

Aby zademonstrować zdolność sFLIM do analizy oddziaływań molekularnych między ligniną a cząsteczkami znakowanymi fluorescencyjnie, w pierwszej kolejności wykorzystano trzy różne próbki (Rycina 3): natywną słomę pszenną (WS), natywną słomę pszenną inkubowaną z PEG znakowanym rodaminą (PR10) oraz natywną słomę pszenną z dekstranem znakowanym rodaminą (DR10). Wiadomo, że PR10 oddziałuje z ligniną, podczas gdy DR10 powinien być obojętny13,14,15. Krzywe sFLIM (Rycina 3, góra) wykazują pewne modyfikacje, jakie można zaobserwować między próbką referencyjną (WS) a dwoma przypadkami oddziaływań (DR10 i PR10). Rzeczywiście, w pierwszej kolejności można łatwo zauważyć wzrost fluorescencji w obszarach spektralnych odpowiadających zakresowi emisji rodaminy. Uważna obserwacja krzywych zaniku fotonów w trzech pierwszych kanałach ujawnia również silniejsze ugięcie dla DR10 niż dla PR10. Po dopasowaniu krzywych zaniku fotonów i obliczeniu średniego czasu życia fluorescencji dla każdego kanału, sygnatura FRET staje się bardziej wyraźna (Rycina 3, dół). W rzeczywistości, podczas gdy czas życia fluorescencji w próbce WS naprzemiennie rośnie i maleje wzdłuż widma fluorescencji, dla PR10 i DR10 obserwuje się wyraźną sygnaturę FRET z: 1) stałą wartością czasu życia w kanale emisji samego donora (3 pierwsze kanały, na niebiesko); oraz 2) rosnącym czasem życia fluorescencji w kanale spektralnym odpowiadającym rosnącemu wkładowi fluoroforu donora o długim czasie życia.

Po jednoznacznym określeniu FRET, porównanie czasu życia fluorescencji ligniny (kanał 2) pozwala na ilościowe określenie skrócenia czasu życia pomiędzy WS (0,47 ns), DR10 (0,42 ns) a PR10 (0,36 ns), co ujawnia oddziaływania molekularne między ligniną a PR10 i DR10, przy czym silniejsze powinowactwo wykazuje PR10.

Aby zilustrować przydatność tej metody do ilościowego określania różnych poziomów oddziaływań, wybraliśmy trzy inne próbki, imitujące dostępność enzymatyczną w potraktowanych próbkach roślinnych: WS poddany działaniu kwasu (AWS) oraz kombinacje PR o dwóch przeciwstawnych masach cząsteczkowych 5 kDa i 20 kDa (PR5 i PR20). Po dokładnej analizie sygnatur sFLIM wyznaczono czas życia fluorescencji ligniny (Rysunek 4). Jak stwierdzono wcześniej, czas życia fluorescencji ligniny może ulegać zmianom pod wpływem otoczenia16,17. Po traktowaniu kwasem czas życia fluorescencji zmierzony w AWS (0.28 ns) stał się niższy niż wcześniej zmierzony dla WS (0.47 ns), co potwierdza konieczność stosowania procedury sFLIM dla jednoznacznej interpretacji skrócenia czasu życia oraz potrzebę stosowania kontroli negatywnych dla każdego badanego warunku. Zgodnie z oczekiwaniami, po dodaniu PR do AWS zaobserwowano silny spadek czasu życia w wyniku oddziaływania z ligniną. Ponadto oddziaływanie jest silniejsze w przypadku PR5 (0.14 ns) w porównaniu do PR20 (0.16 ns), co jest zgodne z pomiarami ich promienia hydrodynamicznego (odpowiednio 2.3 nm dla PR5 i 4.8 nm dla PR20), co indukuje różne ograniczenia steryczne i tym samym zwiększa dostępność PR5 do ligniny.

Oba eksperymenty wykazują przydatność tej metody do precyzyjnej oceny oddziaływań ligniny z enzymami, w zależności od ich wielkości oraz od obróbki wstępnej próbek roślinnych.

Analiza tkanek roślinnych: mikroskopia i przygotowanie próbek do spektroskopii absorpcyjnej; przekroje histologiczne, probówka.
Rysunek 1: Różne etapy przygotowania próbek. Słoma pszenna (WS) (A) jest najpierw rozdrabniana (B), aby można było ją zatopić w medium PEG (C). Blok jest cięty za pomocą mikrotomu wyposażonego w jednorazowe ostrza (D). Po przemyciu otrzymane przekroje (E) są umieszczane do inkubacji w roztworze rhodaminy znakowanej PEG lub dekstranem (F). Znakowane przekroje są montowane do pomiarów sFLIM (G). Paski skali wynoszą 2 cm (A), 1 cm (B i C), 200 µm (E i G). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat obrazowania czasu życia widmowego: układ sFLIM, wielofotonowy mikroskop konfokalny, analiza fluorescencji.
Rysunek 2: Pełny schemat pomiarów oddziaływań opartych na spektralnym FRET.** Rysunek przedstawia układ łączący pomiary natężenia i czasu życia fluorescencji spektralnej. Obrazy fluorescencji spektralnej są pozyskiwane za pomocą mikroskopu konfokalnego, a następnie czasy życia fluorescencji dla każdego zakresu widmowego są mierzone detektorem sFLIM. Analiza krzywych zaniku fotonów pozwala na dokładne określenie oddziaływań między próbką a badanymi cząsteczkami. W celu uniknięcia artefaktów należy przeprowadzić kalibracje. Po pierwsze, detektor sFLIM musi zostać skalibrowany spektralnie, a jego instrumentalna funkcja odpowiedzi musi zostać sprawdzona. Po drugie, złożony sygnał autofluorescencji musi zostać precyzyjnie skalibrowany dla każdej próbki, aby określić czas życia fluorescencji w każdym kanale przed dodaniem cząsteczki akceptora. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza czasu życia fluorescencji; wykresy widm 3D; długość fali względem czasu; porównanie na wykresie słupkowym.
Rycina 3: Reprezentatywne pomiary sFLIM. Krzywe sFLIM (górny panel) uzyskano dla naturalnej słomy pszennej (WS), WS inkubowanej z PEG znakowanym rodaminą (WS+PEG) oraz naturalnej słomy pszennej z dekstranem znakowanym rodaminą (WS+DEX). Dla każdej próbki krzywe sFLIM dopasowano do modelu zaniku bieksponecjalnego i obliczono średni czas życia fluorescencji dla każdego kanału (dolny panel). Próbki WS+PEG i WS+DEX wykazują spadek czasu życia fluorescencji w kanale odpowiadającym wyłącznie autofluorescencji (trzy pierwsze słupki), co wiąże się ze wzrostem czasu życia w kanale odpowiadającym mieszanej emisji autofluorescencji i rodaminy. Zachowanie to jest charakterystyczne dla zjawiska FRET pomiędzy ligniną a cząsteczkami znakowanymi rodaminą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres analizy czasu życia fluorescencji, przedstawiający struktury molekularne i czasy życia dla wariantów AWS.
Rycina 4: Analiza czasu życia fluorescencji kanału odpowiadającego autofluorescencji ligniny. Po potwierdzeniu zdarzenia FRET na podstawie sygnatury sFLIM, zmierzono średni czas życia fluorescencji dla WS traktowanego kwasem (AWS) w kombinacji z PR5 lub PR20 (odpowiednio 5 kDa i 20 kDa). Podczas gdy obie próbki PR wykazują skrócenie czasu życia, mniejsza z nich charakteryzuje się silniejszą redukcją czasu życia, co wskazuje na silniejszą oddziaływanie molekularne z ligniną. Metoda ta jest zatem wystarczająco czuła, aby odróżnić obie próbki (przedstawiono wartość średnią i błąd standardowy, n>10 na warunek). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Korelacja czasu życia fluorescencji i pomiarów widma emisyjnego pozwala na połączenie zalet obu metod. Rzeczywiście, same pomiary spektralne nie są czułe i pozostają jakościowe. Z drugiej strony, czas trwania fluorescencji jest metodą z wyboru dla tradycyjnych ilościowych pomiarów FRET, ale wykazano, że autofluorescencja ligniny może się różnić w zależności od składu ligniny i środowiska16. W związku z tym nie można rozróżnić interakcji ligniny z akceptorem lub zmian strukturalnych ligniny, ponieważ oba powodują skrócenie czasu życia. Jak wykazano, opracowana metoda zapewnia jednoznaczny, czuły i ilościowy pomiar oddziaływań między ligniną a cząsteczkami akceptorowymi w sekcjach roślinnych. Nawet jeśli poszczególne etapy metody zostały rygorystycznie zoptymalizowane, należy szczególnie zachować ostrożność w odniesieniu do następujących punktów.

Jeśli chodzi o próbki, jakość sekcji roślinnej ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia obrazowania w ostrości. Należy ściśle przestrzegać różnych kroków osadzania PEG. Ostatni etap mycia jest niezbędny, aby upewnić się, że PEG nie pozostaje w próbkach. Ponadto stężenie buforu i pH powinny być ściśle takie same dla wszystkich pomiarów, ponieważ każda zmiana może mieć silny wpływ na właściwości fluorescencyjne.

Pomiar żywotności może być również delikatny. Czas życia fluorescencji dawcy może być niestabilny, na przykład z powodu dużego wzbudzenia. W takim przypadku dostrojenie mocy lasera i zoomu może rozwiązać problem. Innym dobrze znanym źródłem artefaktów w pomiarach TCSPC jest nawarstwianie się impulsów fotonowych. Rzeczywiście, TCSPC nie może zmierzyć prędkości dwóch fotonów emitowanych między tymi samymi dwoma impulsami laserowymi. Podczas gdy próbki roślinne są wysoce ustrukturyzowane, fluorescencja nie jest jednorodna i może prowadzić do ukrytego efektu nawarstwiania się impulsów. Podczas gdy liczba fotonów na sekundę pozostaje poniżej 1% limitu wzbudzenia, może być wyższa w niektórych obszarach próbki. Aby upewnić się, że nie ma eksperymentów z pileupem, można rozważyć pomiar czasu życia fluorescencji dawcy przy innym strumieniu fotonów. Jeśli czas życia wzrasta, a strumień maleje, oznacza to, że pomiary zmieniają efekt pileup. Optymalny strumień fotonów jest osiągany przy stabilności życia donora.

Jeśli chodzi o analizę krzywej zaniku sFLIM, zalecamy poleganie na każdym indywidualnym dopasowaniu krzywej, aby upewnić się, że model dokładnie opisuje pomiary. Jeśli tak nie jest, najpierw upewnij się, że żaden z wcześniej wymienionych artefaktów nie uszkodził danych. Następnie, krok 2.1.4 zapewnia funkcję odpowiedzi instrumentalnej (IRF) systemu. Jeśli IRF wykazuje pewne anomalie, zoptymalizuj ścieżkę optyczną, aby je zminimalizować. Można również użyć zmierzonego IRF do montażu w kroku 6.2. Wreszcie, stopnie swobody modelu dopasowania można zwiększyć do trzywykładniczego rozpadu w kroku 6.2. Jednak liczba fotonów wymagana do indywidualnego czasu życia i określenia proporcji jest wysoka i dlatego zaleca się ich stosowanie wyłącznie w celu osiągnięcia bardziej stabilnego średniego czasu życia z kroku 6.4. Bardziej wyczerpujące informacje na temat FLIM, jego charakterystyki18, sFLIM i jego zastosowania12 , w szczególności do ligniny10, można znaleźć w literaturze.

Chociaż jest to trudne, pomiar FRET w tkankach roślinnych przy użyciu natywnej autofluorescencji wykazuje pewne zalety. W porównaniu z pomiarami FRET wykonywanymi na żywych tkankach, w których badania interakcji między biomolekułami często wymagają inżynierii genetycznej w celu ekspresji wewnętrznych markerów fluorescencyjnych, zdrewniałe tkanki roślinne, takie jak te przedstawione tutaj, oferują naturalną autofluorescencję, a zewnętrzne sondy fluorescencyjne mogą być łatwo dodane, oszczędzając dużo czasu. Jednak w zależności od analizowanych gatunków roślin i możliwych przeprowadzonych zabiegów wstępnych, autofluorescencja może zostać zmodyfikowana, tak że będzie musiała być dokładnie scharakteryzowana, a fluorofor używany jako sondy może wymagać adaptacji.

Metodę sFLIM należy stosować do sond fluorescencyjnych pozbawionych aktywności katalitycznej (PEG i dekstran). W ramach hydrolizy lignocelulozy roślinnej można przeprowadzić oddziaływania enzymów w różnych próbkach biomasy, co może prowadzić do określenia wpływu lokalizacji (komórek i tkanek) na siłę oddziaływania. Kolejnym krokiem optymalizacyjnym będzie automatyzacja kroku analizy. Rzeczywiście, przy wystarczającej ilości przeanalizowanych danych, procedura analizy oparta na uczeniu maszynowym może zostać wdrożona do zautomatyzowanej analizy fenotypu, co zwiększyłoby jej zdolność do szybkiego badania przesiewowego wydajności enzymów i biomasy. Ponadto sFLIM nie wymaga utrwalania próbki i może być łatwo stosowany do dynamicznych badań interakcji enzym-lignina. Taka unikalna metoda prawdopodobnie ukierunkuje strategię inżynierii enzymatycznej i wstępną obróbkę biomasy w celu optymalizacji waloryzacji lignocelulozy.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Fanny Laurent (FARE) serdecznie dziękujemy za przygotowanie figurek. Federacja badawcza FRABio (Uniwersytet w Lille, CNRS) jest uznawana za zapewnienie środowiska technicznego sprzyjającego realizacji tych prac. Finansowanie uzyskano z Francuskiej Narodowej Agencji Badawczej (projekt LIGNOPROG ANR-14-CE05-0026).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop konfokalnyZEISSLSM 710 NLOdo obrazowania konfokalnego
cienka szczoteczkado pobierania skrawków
szklane fiolkido inkubacji
mikroskop o wysokiej precyzji okulary nakrywkowe 170 +/- 5 i mikro; m n° 1,5#Marienfeld0107032wystawiony przez Dutscher s.a. we Francji
Laser impulsowy na podczerwieńKOHERENTCHAMELEON VISIONDo wzbudzenia próbki
Mikropipeta Research Plus jednokanałowa 20-200&mikro; LEppendorfz odpowiednimi końcówkami
Mikropipeta Research Plus jednokanałowa 2-20µ LEppendorfz odpowiednimi
końcówkami Szkiełka mikroskopowe ok. 76 x 26 mm szlifowane krawędzie matowakońcówka Thermo Fisher ScientificLR45D
ostrza mikrotomu jednorazowe (opakowanie 50 szt.)Agar ScientificT5024sprzedany przez Oxford Instruments we Francji
mPEG-Rhodamine, 10 kDaCreative Peg WorksPSB-2263
mPEG-Rhodamine, 20 kDaCreative Peg WorksPSB-22642
mPEG-Rhodamine, 5 kDaCreative Peg WorksPSB-2264
lakierdo paznokci do montażu
pH-metru pięć easy plusMettlertoledo FEP20z elektrodą
poli(glikol etylenowy) średnia mol wt 1450Merck (sigma-Aldrich)P5402-1kgdo zatapiania próbki
żyletki, ostrza jednoostrzowe, stal nierdzewna, pudełko 100sztuk Agar ScientificT586do przygotowania fragmentów sprzedawany przez Oxford Instruments we Francji
mikrotom rotacyjnyMicrom MicrotechHM 360
sFLim detektorBECKER-HICKLSPC 150do dożywotniego pozyskiwania
diwodorofosforanu sodu dwuwodny NaH2PO4, 2H2OMerck (sigma-Aldrich)71500dla roztwór buforowy
fosforan sodu dwuzasadowy dwuwodny Na2HPO4,2H2OMerck (sigma-Aldrich)30435-1kgdo roztworu buforowego, stare odniesienie, nowe to 71643-1kg
izotiocyjanian tetrametylu rodaminy-dekstran 10 k DaMerck (sigma-Aldrich)R8881-100mg

Bibliografia

  1. Inouye, H., et al. Multiscale deconstruction of molecular architecture in corn stover. Scientific Reports. 4, 3756(2014).
  2. Li, X., Zheng, Y. Lignin-enzyme interaction: Mechanism, mitigation approach, modeling, and research prospects. Biotechnology Advances. 35 (4), 466-489 (2017).
  3. Vogel, J. Unique aspects of the grass cell wall. Current Opinion in Plant Biology. 11 (3), 301-307 (2008).
  4. Lynd, L. R. The grand challenge of cellulosic biofuels. Nature Biotechnology. 35, 912(2017).
  5. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer. Current Opinion in Biotechnology. 6, 103-110 (1995).
  6. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  7. Pietraszewska-Bogiel, A., Gadella, T. W. J. FRET microscopy: from principle to routine technology in cell biology. Journal of Microscopy. 241 (2), 111-118 (2011).
  8. Herbaut, M., et al. Multimodal analysis of pretreated biomass species highlights generic markers of lignocellulose recalcitrance. Biotechnology for Biofuels. 11, 52(2018).
  9. Chabbert, B., et al. Fluorescence techniques can reveal cell wall organization and predict saccharification in pretreated wood biomass. Industrial Crops and Products. 123, 84-92 (2018).
  10. Terryn, C., Paës, G., Spriet, C. FRET-SLiM on native autofluorescence: a fast and reliable method to study interactions between fluorescent probes and lignin in plant cell wall. Plant Methods. 14 (1), 74(2018).
  11. Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Cell Structure and Function by Microspectrofluorometry. Kohen, E. , Academic Press. 99-117 (1989).
  12. Spriet, C., et al. Correlated fluorescence lifetime and spectral measurements in living cells. Microscopy Research and Technique. 70 (2), 85-94 (2007).
  13. Donaldson, L. A., Newman, R. H., Vaidya, A. Nanoscale interactions of polyethylene glycol with thermo-mechanically pre-treated Pinus radiata biofuel substrate. Biotechnology and Bioengineering. 111 (4), 719-725 (2014).
  14. Herbaut, M., Zoghlami, A., Paës, G. Dynamical assessment of fluorescent probes mobility in poplar cell walls reveals nanopores govern saccharification. Biotechnology for Biofuels. 11 (1), 271(2018).
  15. Paës, G., Chabbert, B. Characterization of arabinoxylan / cellulose nanocrystals gels to investigate fluorescent probes mobility in bio-inspired models of plant secondary cell wall. Biomacromolecules. 13, 206-214 (2012).
  16. Donaldson, L. A., Radotic, K. Fluorescence lifetime imaging of lignin autofluorescence in normal and compression wood. Journal of Microscopy. 251 (2), 178-187 (2013).
  17. Auxenfans, T., Terryn, C., Paës, G. Seeing biomass recalcitrance through fluorescence. Scientific Reports. 7, 8838(2017).
  18. Waharte, F., Spriet, C., Héliot, L. Setup and characterization of a multiphoton FLIM instrument for protein-protein interaction measurements in living cells. Cytometry A. 4, 299-306 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oddzia ywania ligninyobrazowanie sFLIManaliza FRETczas ycia fluorescencjiobrazowanie spektralnebiomasa lignocelulozowaoddzia ywania enzymatyczneobr bka PEG
Pomiar interakcji między sondami fluorescencyjnymi a ligniną w skrawkach roślin za pomocą sFLIM w oparciu o natywną autofluorescencję
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.