Artykuł metodologiczny

Testy aktywności oparte na NMR do określania inhibicji związku, wartości IC50, aktywności artefaktów i aktywności całych komórek rybohydrolaz nukleozydowych

DOI:

10.3791/59928

⸱

30 czerwca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Adelphi University, 2Department of Chemistry, Washington University in St. Louis, 3Department of Chemistry, Boston University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testy aktywności oparte na NMR zostały opracowane w celu identyfikacji i scharakteryzowania inhibitorów dwóch nukleozydowych enzymów rybohydrolazy. Przedstawiono protokoły dla początkowych testów związków chemicznych przy 500 μM i 250 μM, testów dawka-odpowiedź do oznaczania wartości IC50, testów przesiewowych licznika detergentów, testów przesiewowych licznika rozcieńczeń skokowych oraz testów w całych komórkach E. coli.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spektroskopia NMR jest często używana do identyfikacji i charakterystyki inhibitorów enzymów w odkrywaniu leków, szczególnie w kontekście badań przesiewowych fragmentów. Testy aktywności oparte na NMR idealnie nadają się do pracy przy wyższych stężeniach badanych związków wymaganych do wykrycia tych słabszych inhibitorów. Zakres dynamiki i dyspersja przesunięcia chemicznego w eksperymencie NMR mogą z łatwością rozwiązać rezonanse z podłoża, produktu i związków testowych. Kontrastuje to z testami spektrofotometrycznymi, w których problemy z zakłóceniami odczytu często wynikają ze związków o nakładających się profilach absorpcji UV-vis. Ponadto, ponieważ brakuje im enzymów reporterowych, testy NMR z pojedynczym enzymem nie są podatne na fałszywie dodatnie wyniki testów sprzężonych. Ta cecha sprawia, że są one przydatne jako testy ortogonalne, uzupełniające tradycyjne wysokoprzepustowe testy przesiewowe i laboratoryjne testy triażowe. Przedstawiono szczegółowe protokoły dla wstępnych testów związków chemicznych przy 500 μM i 250 μM, testów dawka-odpowiedź do oznaczania wartości IC50, testów przesiewowych licznika detergentów, testów przesiewowych licznika rozcieńczeń skokowych oraz testów w całych komórkach E. coli. Metody te zademonstrowano przy użyciu dwóch enzymów rybohydrolazy nukleozydowej. Zastosowanie 1H NMR pokazano dla enzymu specyficznego dla puryny, podczas gdy 19F NMR pokazano dla enzymu specyficznego dla pirymidyny. Protokoły mają ogólne zastosowanie do każdego enzymu, w którym rezonanse substratu i produktu można zaobserwować i odróżnić za pomocą spektroskopii NMR. Aby być najbardziej użytecznym w kontekście odkrywania leków, końcowe stężenie substratu nie powinno przekraczać 2-3 razy jego wartości Km m. Wybór eksperymentu NMR zależy od dostępnej reakcji enzymatycznej i substratów, a także od dostępnego oprzyrządowania NMR.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) jest dobrze znana w charakterystyce i monitorowaniu reakcji enzymatycznych1,2. Różnice w przesunięciach chemicznych i wzorcach sprzężeń są wykorzystywane do rozróżnienia rezonansów substratu i produktu, a względne intensywności rezonansu są wykorzystywane do ilościowego określenia procentu reakcji. Zarówno zużycie substratu, jak i tworzenie produktu są bezpośrednio obserwowane w widmie NMR. Kontrastuje to ze spektrofotometrią lub spektroskopią fluorescencyjną, w których przebieg czasu reakcji jest wskazywany przez zmianę absorbancji, którą można przypisać zużyciu lub wytwarzaniu niektórych związków chemicznych. Podobnie jak w przypadku innych metod, NMR można wykorzystać do badania reakcji enzymatycznych w funkcji temperatury, pH lub innych warunków roztworu, a także można określić działanie inhibitorów.

Niedawno, testy aktywności enzymatycznej oparte na NMR zostały zademonstrowane dla badań przesiewowych fragmentów3,4. Testy oparte na NMR idealnie nadają się do pracy przy wyższych stężeniach badanych związków (często nawet 1 mM) wymaganych do wykrycia tych słabszych inhibitorów. Zakres dynamiki i dyspersja przesunięcia chemicznego w eksperymencie NMR mogą z łatwością rozwiązać rezonanse z podłoża, produktu i związków testowych. Wypada to korzystnie w porównaniu z testami spektrofotometrycznymi, w których problemy z zakłóceniami odczytu często wynikają ze związków o nakładających się profilach absorpcji UV-vis. Ponadto, ponieważ brakuje im enzymów reporterowych, testy NMR z pojedynczym enzymem nie są podatne na fałszywie dodatnie wyniki testów sprzężonych. Ta zaleta sprawia, że są one przydatne jako testy ortogonalne, uzupełniające tradycyjne wysokoprzepustowe testy przesiewowe i testy triażowe na stole5.

W naszym laboratorium badawczym, testy aktywności oparte na NMR są używane do identyfikacji i oceny inhibitorów rybohydrolaz nukleozydowych Trichomonas vaginalis. Pasożyt T. vaginalis powoduje najbardziej rozpowszechnioną niewirusową chorobę przenoszoną drogą płciową6. Rosnąca oporność na istniejące terapie7 napędza zapotrzebowanie na nowatorskie, oparte na mechanizmach terapie, z niezbędnymi enzymami szlaku ratunkowego nukleozydów reprezentującymi główne cele8. Testy aktywności oparte na NMR zostały opracowane zarówno dla enzymów specyficznych dla pirymidyny, jak i puryny, rybohydrolazy nukleozydowej urydyny (UNH)9 oraz adenozyny/guanozyny preferującej rybohydrolazę nukleozydową (AGNH)10. Reakcje katalizowane przez te dwa enzymy pokazano na rysunku 1. Testy NMR są wykorzystywane do przesiewania bibliotek fragmentów pod kątem chemicznych punktów początkowych, określania wartości IC50 i eliminowania inhibitorów wiązania opartego na agregacji lub kowalencyjności11. Te same testy są również tłumaczone w celu oceny aktywności enzymatycznej w całych komórkach12.

Szczegółowe protokoły są dostępne dla wstępnych testów związków chemicznych przy 500 μM i 250 μM, testów dawka-odpowiedź do określania wartości IC50, testów przesiewowych licznika detergentów, testów licznika rozcieńczeń skokowych i testów w całych komórkach E. coli. Protokoły mają ogólne zastosowanie do każdego enzymu, w którym rezonanse substratu i produktu można zaobserwować i odróżnić za pomocą spektroskopii NMR. Dla uproszczenia przyjęto trzy założenia. Po pierwsze, podłoże nie jest określone. Aby testy aktywności oparte na NMR były użyteczne, końcowe stężenie substratu nie powinno być większe niż 2-3 razy wartość Km < sup class="xref">4. W przedstawionych przykładach końcowe stężenia adenozyny i 5-fluorourydyny wynoszą odpowiednio 100 μM (Km = 54 μM) i 50 μM (Km = 15 μM). W protokołach osiągnięcie tych stężeń odpowiada 12 μl 5 mM adenozyny lub 12 μl 2,5 mM 5-fluorourydyny.

Po drugie, ilość enzymu przewidziana w protokołach, 5 μL, została wybrana tak, aby odpowiadała ilości wymaganej do uzyskania około 75% konwersji substratu do produktu w ciągu 30 minut. Ilość ta zazwyczaj odpowiada dużemu rozcieńczeniu z oczyszczonego preparatu enzymatycznego, a rozcieńczenie musi być określone z wyprzedzeniem dla każdego enzymu. Oczyszczone roztwory podstawowe enzymów AGNH i UNH są przechowywane w temperaturze -80 °C w podwielokrotnościach, które dostarczają wystarczającą ilość enzymu na kilka tysięcy reakcji. W związku z tym idealnie byłoby, gdyby współczynnik rozcieńczenia był określany lub zatwierdzany tylko co kilka miesięcy. Po trzecie, konkretny eksperyment 1D NMR nie jest określony. W reprezentatywnych wynikach 1H NMR jest pokazany dla AGNH10 i 19F NMR jest pokazany dla UNH9, z eksperymentem NMR opisanym w odpowiednich odniesieniach. Wybór eksperymentu NMR zależy od dostępnej reakcji enzymatycznej i substratów, a także od dostępnego oprzyrządowania NMR. Na koniec należy wskazać, że opisane podejście eksperymentalne nie spełnia ścisłych wymagań ilościowego NMR (qNMR)13,14. W protokole procentową reakcję określa się na podstawie względnych zmian intensywności tego samego rezonansu w każdym spektrum, a nie poprzez określenie stężeń bezwzględnych. Takie podejście eliminuje konieczność akwizycji i modyfikacji przetwarzania danych, a także wewnętrznych lub zewnętrznych standardów, które są wymagane dla qNMR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wstępne testy związków testowych przy 500 μM i 250 μM

  1. Przygotować substrat i związek badawczy do reakcji.
    1. Przygotować roztwory podstawowe substratu (adenozyny lub 5-fluorourydyny) w wodzie i 50 mM związku testowego w deuterowanym sulfotlenku dimetylu (DMSO). Zapoznaj się z sekcją wprowadzającą, aby uzyskać informacje na temat stężeń roztworu substratu, który należy zastosować.
    2. Dodaj 12 μl substratu (adenozyny lub 5-fluorourydyny) do każdej z czterech probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml, 1-4.
    3. Dodać 6 μl deuterowanego DMSO do probówek 1 (kontrola 0 min) i 4 (kontrola 30 min). Dodać 6 μl badanego związku do probówki 2. Dodać 3 μl badanego związku i 3 μl deuterowanego DMSO do probówki 3.
  2. Przygotować wystarczającą ilość roztworu reakcyjnego.
    UWAGA: Roztwór podstawowy jest przeznaczony do pięciu reakcji, z których każda zawiera 517 μl buforu, 60 μl tlenku deuteru i 5 μl roztworu enzymatycznego (AGNH lub UNH). Zapoznaj się z sekcją wprowadzającą, aby uzyskać informacje na temat stężeń roztworu enzymu, który należy zastosować.
    1. Dodać 2,59 ml buforu reakcyjnego (50 mM fosforanu potasu, 0,3 M KCl, pH 6,5) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodać 300 μl tlenku deuteru do stożkowej probówki. Dodać 25 μl roztworu enzymatycznego (AGNH lub UNH) do stożka.
    2. Delikatnie odwróć stożkową rurkę dwukrotnie, aby wymieszać.
  3. Jednocześnie zainicjować i wygasić 0-minutową reakcję kontrolną. Przenieść 582 μl reakcyjnego roztworu podstawowego do czystej probówki do mikrofuge. Dodaj 10 μl 1,5 M HCl do tej probówki do mikrofuge. Przenieś połączone 592 μl do probówki do mikrofugi 1. Odessać i dozować próbkę dwukrotnie, powoli, ale z rozmysłem.
  4. Zainicjuj i uruchom pozostałe trzy reakcje w sposób rozłożony w czasie. W czasie 0 min przenieść 582 μl reakcyjnego roztworu podstawowego do probówki do mikrofugi 2. Odessać i dozować próbkę dwukrotnie, powoli, ale z rozmysłem. Powtarzaj w odstępach 30 s dla probówek do mikrofug 3 i 4. Poczekaj 30 min.
  5. Ugasić reakcje. W czasie 30 minut dodaj 10 μl 1,5 M HCl do mikrofuge 2. Powtarzaj w odstępach 30 s dla probówek do mikrofug 3 i 4. Przenieś 600 μl roztworu z każdej mikrorurki do probówek NMR.
  6. Uzyskaj widmo 1D NMR na każdej próbce. Przetwarzaj dane, aby zapewnić prawidłowe etapy i płaskie linie bazowe.
  7. Obliczyć procentową konwersję substratu dla widm kontrolnych.
    1. Nałóż widma na kontrole 0 min i 30 min. Przeskaluj sygnał podłoża w kontrolce 0 min, aby dopasować ją do kontrolki 30 min. Zwróć uwagę na ten procent.
    2. Oblicz procentową konwersję jako (100 – wartość procentowa określona w kroku 1.7.1).
  8. Obliczyć procentową konwersję substratu dla reakcji zawierających badany związek.
    1. Widma nakładane dla 0-minutowej kontroli i pierwszej reakcji zawierające badany związek o wielkości 500 μM. Przeskaluj sygnał substratu w kontrolie 0 min, aby dopasować widmo do badanego związku. Zwróć uwagę na ten procent. Oblicz procentową konwersję jako (100 – określony procent).
    2. Powtórzyć dla drugiej reakcji zawierającej badany związek o wielkości 250 μM.
  9. Obliczyć procentową zawartość reakcji i procentową inhibicję dla każdego badanego stężenia związku.
    1. Obliczyć procentową reakcję jako (1.8.1/1.7.2) x 100.
    2. Oblicz procentową inhibicję jako (100 – procent określony w kroku 1.9.1).

2. Wyznaczanie wartości IC50

  1. Przygotować substrat i związek badawczy do reakcji.
    1. Przygotować roztwory podstawowe substratu (adenozyny lub 5-fluorourydyny) w wodzie i 10 mM związku testowego w deuterowanym DMSO. Zapoznaj się z sekcją wprowadzającą, aby uzyskać informacje na temat stężeń roztworu substratu, który należy zastosować.
  2. Przygotować seryjne rozcieńczenia 10 mM badanego związku (w deuterowanym DMSO).
    1. Dodaj 36 μl deuterowanego DMSO do pięciu probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml, 1–5.
    2. Dodać 12 μl 10 mM związku testowego do probówki 1 i lekko postukać, aby wymieszać. Badany związek ma teraz 2,5 mM.
    3. Przenieś 12 μl z probówki 1 do probówki 2 i lekko postukaj, aby wymieszać. Związek testowy wynosi teraz 0,63 mM. Przenieś 12 μl z probówki 2 do probówki 3 i lekko postukaj, aby wymieszać. Związek testowy wynosi teraz 0,16 mM. Przenieś 12 μl z probówki 3 do probówki 4 i lekko postukaj, aby wymieszać. Badany związek wynosi teraz 0,04 mM. Przenieś 12 μl z probówki 4 do probówki 5 i lekko postukaj, aby wymieszać. Związek testowy wynosi teraz 0,01 mM.
  3. Przygotuj 14 probówek do mikrofug o pojemności 1,5 ml do reakcji.
    1. Dodać 12 μl substratu (adenozyny lub 5-fluorourydyny) do każdej z 14 probówek do mikrofuge po 1,5 ml, 1-14.
    2. Dodać 12 μl deuterowanego DMSO do probówek 1 (kontrola 0 min) i 14 (kontrola 30 min).
    3. Dodać 12 μl 10 mM badanego związku do probówek 2 i 3. Dodać 12 μl 2,5 mM związku testowego do probówek 4 i 5. Dodać 12 μl 0,63 mM badanego związku do probówek 6 i 7. Dodać 12 μl 0,16 mM związku testowego do probówek 8 i 9. Dodać 12 μl 0,04 mM związku testowego do probówek 10 i 11. Dodać 12 μl 0,01 mM związku testowego do probówek 12 i 13.
  4. Przygotować wystarczającą ilość roztworu podstawowego do przeprowadzenia 15 reakcji, z których każda zawiera 511 μl buforu, 60 μl tlenku deuteru i 5 μl roztworu enzymatycznego (AGNH lub UNH). Zapoznaj się z sekcją wprowadzającą, aby uzyskać informacje na temat stężeń roztworu enzymu, który należy zastosować.
    1. Dodać 7,67 ml buforu reakcyjnego (50 mM fosforanu potasu, 0,3 M KCl, pH = 6,5) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodać 900 μl tlenku deuteru do stożkowej probówki. Dodać 75 μl roztworu enzymatycznego (AGNH lub UNH) do stożka.
    2. Delikatnie odwróć stożkową rurkę 2x, aby wymieszać.
  5. Postępować zgodnie z krokami opisanymi w krokach 1.3–1.9 do (przy użyciu 576 μl roztworu podstawowego do reakcji) w celu określenia procentowej reakcji dla każdego badanego stężenia związku.
  6. Oblicz wartość IC50 za pomocą GraphPad Prism.
    1. Utwórz tabelę danych korelującą log stężeń związków testowych reakcji (200 μM, 50 μM, 12,5 μM, 3,13 μM, 0,78 μM, 0,20 μM) z procentem reakcji (po dwie wartości).
    2. Użyj nieliniowego dopasowania krzywej, aby określić wartość IC50 i błąd standardowy.

3. Testy przesiewowe licznika detergentów przy 100 μM i 50 μM

  1. Przygotować substrat i związek badawczy do reakcji.
    1. Przygotować roztwory podstawowe substratu (adenozyny lub 5-fluorourydyny) w wodzie i 10 mM związku testowego w deuterowanym DMSO. Zapoznaj się z sekcją wprowadzającą, aby uzyskać informacje na temat stężeń roztworu substratu, który należy zastosować.
    2. Dodaj 12 μl substratu (adenozyny lub 5-fluorourydyny) do każdej z ośmiu probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml, 1–8.
    3. Dodaj 6 μl deuterowanego DMSO do probówek 1 i 5 (kontrole 0 min) oraz 4 i 8 (kontrole 30 min). Dodać 6 μl badanego związku do probówek 2 i 6. Dodać 3 μl badanego związku i 3 μl deuterowanego DMSO do probówek 3 i 7.
  2. Przygotować wystarczającą ilość roztworu podstawowego do przeprowadzenia pięciu reakcji, z których każda zawiera 517 μl buforu, 60 μl tlenku deuteru i 5 μl roztworu enzymatycznego (AGNH lub UNH). Zapoznaj się z sekcją wprowadzającą, aby uzyskać informacje na temat stężeń roztworu enzymu, który należy zastosować.
    1. Dodać 2,59 ml buforu reakcyjnego (50 mM fosforanu potasu, 0,3 M KCl, pH = 6,5) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodać 300 μl tlenku deuteru do stożkowej probówki. Dodać 25 μl roztworu enzymatycznego (AGNH lub UNH) do stożka.
    2. Delikatnie odwróć stożkową rurkę 2x, aby wymieszać.
  3. Przygotować wystarczającą ilość reakcyjnego roztworu podstawowego z 0,01% v/v detergentu Triton X-100, aby przeprowadzić pięć reakcji, które zawierają 517 μl buforu, 60 μl tlenku deuteru i 5 μl roztworu enzymatycznego (AGNH lub UNH) każda.
    1. Dodać 2 μl detergentu Triton X-100 do 20 ml buforu reakcyjnego (50 mM fosforanu potasu, 0,3 M KCl, pH = 6,5). Roztwory detergentów należy zużyć w ciągu 1 dnia.
    2. Dodać 2,59 ml buforu reakcyjnego zawierającego 0,01% detergentu Triton X-100 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodać 300 μl tlenku deuteru do stożkowej probówki. Dodać 25 μl roztworu enzymatycznego (AGNH lub UNH) do stożka.
    3. Delikatnie odwróć stożkową rurkę 2x, aby wymieszać.
  4. Dla probówek 1–4, przy użyciu roztworu podstawowego do reakcji BEZ detergentu, należy postępować zgodnie z krokami opisanymi w krokach 1.3–1.9 w celu określenia procentowej inhibicji dla każdego badanego stężenia związku.
  5. W przypadku probówek 5–8, używając roztworu podstawowego reakcji Z 0,01% v/v detergentu Triton X-100, należy postępować zgodnie z krokami opisanymi w krokach 1.3–1.9 w celu określenia procentowej inhibicji dla każdego badanego stężenia związku.

4. Testy licznika rozcieńczeń skokowych

  1. Przygotować substrat i badane związki do reakcji
    1. Przygotować roztwory podstawowe substratu (adenozyny lub 5-fluorourydyny) w wodzie i 10 mM związku testowego w deuterowanym DMSO. Zapoznaj się z sekcją wprowadzającą, aby uzyskać informacje na temat stężeń roztworu substratu, który należy zastosować.
    2. Dodać 53,8 μl buforu reakcyjnego (50 mM fosforanu potasu, 0,3 M KCl, pH = 6,5) do dwóch probówek do mikrofuge po 1,5 ml (każda), 1 i 2. Dodać 5 μl enzymu (AGNH lub UNH) do probówek 1 i 2.
    3. Dodać 511 μl buforu reakcyjnego do dwóch probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml, 3 i 4 (każda). Dodać 60 μl tlenku deuteru do probówek 3 i 4. Dodać 5 μl enzymu (AGNH lub UNH) do probówek 3 i 4.
    4. Dodać 1,2 μl deuterowanego DMSO do probówki 1 (kontrola 30 minut). Dodać 1,2 μl badanego związku do probówki 2. Dodać 12 μl deuterowanego DMSO do probówki 3 (kontrola 30 minut). Dodać 12 μl badanego związku do probówki 4. Inkubować przez 30 minut.
  2. Przygotować dwie probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml z roztworem rozcieńczającym.
    1. Dodać 468 μl buforu reakcyjnego do każdej z dwóch probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml, 5 i 6. Dodać 60 μl tlenku deuteru do każdej probówki (5 i 6).
  3. Przygotuj cztery probówki do mikrofug o pojemności 1,5 ml do przeprowadzenia reakcji.
    1. Dodaj 12 μl substratu (adenozyny lub 5-fluorourydyny) do każdej z czterech probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml, 7–10.
  4. Wykonaj skokowe rozcieńczenia i zainicjuj reakcje.
    1. Przenieść 528 μl roztworu z probówki 5 do probówki 1. Odessać i dozować próbkę dwukrotnie, powoli, ale z rozmysłem. Przenieść 528 μl roztworu z probówki 6 do probówki 2. Odessać i dozować próbkę dwukrotnie, powoli, ale z rozmysłem.
    2. W czasie 0 min przenieść 588 μl roztworu z probówki 1 do probówki 7. Zasysać i dozować próbkę 2x w powolny, ale przemyślany sposób. W odstępach 30 s przenieść 588 μl roztworu z probówki 2 do probówki 8, probówki 3 do probówki 9 i probówki 4 do probówki 10. Odessać i dozować próbkę dwukrotnie, powoli, ale z rozmysłem. Poczekaj 30 min.
  5. W przypadku probówek 7–10 należy postępować zgodnie z krokami opisanymi w krokach 1.5–1.9 w celu określenia procentowej inhibicji dla każdego badanego stężenia związku.

5. Testy złożone w całych komórkach E. coli

  1. Przygotuj 10 ml nocnej hodowli E. coli w dniu poprzedzającym eksperymenty.
  2. Przygotuj komórki E. coli do eksperymentów NMR.
    1. Odwirować komórki w podwielokrotnościach o pojemności 1 ml przez 10 minut przy 15 000 x g.
    2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić każdą podwielokrotność komórek w 1 ml buforu reakcyjnego (50 mM fosforanu potasu, 0,3 M KCl, pH = 6,5) przez wirowanie.
  3. Postępuj zgodnie z sekcjami 1 lub 2 dla żądanego testu z następującymi zmianami:
    1. Zastąp 280 μl buforu w roztworze podstawowym reakcji 280 μl zawieszonych komórek.
    2. Zastąp 5 μl enzymu (AGNH lub UNH) w roztworze podstawowym reakcji 5 μl buforu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 2 pokazuje wyniki testów dwóch związków przeciwko AGNH przy użyciu 1H NMR po sekcji 1. Reakcję enzymatyczną najłatwiej zaobserwować i określić ilościowo poprzez zanik rezonansów singletowych i dubletowych adenozyny odpowiednio przy 8,48 ppm i 6,09 ppm oraz pojawienie się rezonansu adeninowego singletu przy 8,33 ppm, jak obserwowano w 30-minutowym widmie kontrolnym. W obecności związku 500 μM 1 nie powstaje żaden produkt, o czym świadczy brak rezonansu adeninowego na poziom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane protokoły mają ogólne zastosowanie do wielu enzymów, pod warunkiem, że substraty i/lub produkty mają rozdzielalne sygnały w widmie NMR. Jednak bardzo ważne jest, aby stężenie substratu było bliskie wartości Km i wystarczająco wysokie, aby można je było wykryć w eksperymencie NMR w rozsądnym czasie. Stężenie substratu nie wyższe niż 2-3 razy wartość Km jest optymalne do wykrywania konkurencyjnych, niekonkurencyjnych i niekonkurencyjnych inhibitorów4. ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Deanowi Brownowi za dostarczenie związków z biblioteki fragmentów AstraZeneca oraz Dr. Davidowi Parkinowi za dostarczenie enzymów AGNH i UNH. Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach nagrody numer R15AI128585 dla B. J. S. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Institutes of Health.Badania były również wspierane przez Horace G. McDonell Summer Research Fellowship przyznane S. N. M., Landesberg Family Fellowship przyznane J. A. G. oraz Faculty Development Grants i Frederick Bettelheim Research Award od Adelphi University dla B. J. S.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AGNHOczyszczane we własnym zakresieNie dotyczyTVAG_213720
UNHOczyszczane we własnym zakresieNie dotyczyTVAG_092730
AdenozynaSigmaA9251
5-FluorourydynaSigmaF5130
Dimetylosulfotlenek-D6Cambridge Isotope LabsDLM-10-100D, 99,9%
Fosforan potasu jednozasadowySigmaP0662
Fosforan potasu dwuzasadowySigmaP3786
Chlorek potasuSigmaP9541
Tlenek deuteruCambridge Isotope LabsDLM-4-100D, 99,9%
Kwas solnyFisher ChemicalA144212
Triton X-100SigmaX100
Sól sodowa kwasu 3-(trimetylosililo)propiono-2,2,3,-d4 (TSP)Sigma269913D, 98%
2,2,2-trifluoroetanol-1,1-d2Sigma612197D, 99,5%
PipetaGilsonF123602Pipeta do PIPETMAN Classic P1000
PipetaGilsonF123601do pipety do PIPETMAN Classic P200
do pipetyGilsonF123600do pipety do pipet do pipet do herbaty z tworzywa sztucznego Pipetman Classic P20
Rurki do mikrofugeFisher Scientific05-408-129
Rurki stożkoweCorning352099
MikrowirówkaEppendorf5418
Mieszalnik wirowyFisher Scientific02215365
ProbówkiNMR Norell502-7Lub odpowiednio do
spektrometru NMR NMRBrukerN/ OprogramowanieAvanceIII500
PrismGraphPadN/AWersja 5.04
do pipety

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. NMR in Molecular Biology. , Academic Press. New York. (1981).
  2. Evans, J. N. S. Biomolecular NMR spectroscopy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1995).
  3. Dalvit, C., et al. A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening. Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).
  4. Dalvit, C. Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery. Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).
  5. Stockman, B. J., et al. Identification of allosteric PIF-pocket ligands for PDK1 using NMR-based fragment screening and 1H-15N TROSY experiments. Chemical Biology & Drug Design. 73, 179-188 (2009).
  6. Hirt, R. P., Sherrard, J. Trichomonas vaginalis origins, molecular pathobiology and clinical considerations. Current Opinion in Infectious Diseases. 28, 72-79 (2015).
  7. Conrad, M. D., Bradic, M., Warring, S. D., Gorman, A. W., Carlton, J. M. Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world. Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).
  8. Versées, W., Steyaert, J. Catalysis by nucleoside hydrolases. Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).
  9. Shea, T. A., et al. Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).
  10. Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).
  11. Muellers, S. N., et al. Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase. ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).
  12. Veronesi, M., et al. Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells. Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).
  13. Holzgrabe, U. Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications. Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).
  14. Bharti, S. K., Roy, R. Quantitative 1H NMR spectroscopy. Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).
  15. Dalvit, C., et al. Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications. Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).
  16. Lambruschini, C., et al. Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH. ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).
  17. Stockman, B. J. 2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening. Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).
  18. Aldrich, C., et al. The ecstasy and agony of assay interference compounds. ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).
  19. Feng, B. Y., Shoichet, B. K. A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors. Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).
  20. Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis. Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).
  21. Griveta, J. -P., Delort, A. -M. NMR for microbiology: In vivo and in situ applications. Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).
  22. Nijman, S. M. B. Functional genomics to uncover drug mechanism of action. Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kinetostatyczne analizy aktywno ci NMRhamowanie enzymatycznewyznaczanie IC50przeciwprzesiew z detergentemanaliza rozcie czenia skokowego jump dilutionNMR protonowyNMR fluorowykonwersja substratu

Powiązane artykuły