Artykuł metodologiczny

Pomiar proliferacji komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych za pomocą chemii Click

DOI:

10.3791/59930

⸱

30 października 2019

 ,  , 
1Department of Neuroscience, Cell Biology, and Physiology, Wright State University, 2Department of Surgery, Boonshoft School of Medicine, Wright State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proliferacja jest kluczowym elementem funkcji komórkowej i powszechnym odczytem używanym do oceny potencjalnej toksyczności nowych leków. Pomiar proliferacji jest zatem często stosowanym testem w biologii komórki. Poniżej przedstawiamy prostą, wszechstronną metodę pomiaru proliferacji, którą można zastosować w komórkach adherentnych i nieadherentnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność komórki do proliferacji jest integralną częścią normalnego funkcjonowania większości komórek, a rozregulowanie proliferacji jest sercem wielu procesów chorobowych. Z tych powodów pomiar proliferacji jest powszechnym narzędziem stosowanym do oceny funkcji komórek. Proliferację komórek można zmierzyć po prostu przez liczenie; Jest to jednak pośredni sposób pomiaru proliferacji. Jednym z powszechnych sposobów bezpośredniego wykrywania komórek przygotowujących się do podziału jest włączenie znakowanych analogów nukleozydów. Należą do nich radioaktywny analog nukleozydu 3H-tymidyna oraz nieradioaktywne analogi nukleozydów, takie jak 5-bromo-2' deoksyurydyna (BrdU) i 5-etynylo-2′-deoksyurydyna (EdU). Włączenie EdU jest wykrywane przez chemię kliknięć, która ma kilka zalet w porównaniu z BrdU. W tym raporcie przedstawiamy protokół pomiaru proliferacji przez włączenie EdU. Protokół ten zawiera opcje różnych odczytów, wraz z zaletami i wadami każdego z nich. Omawiamy również miejsca, w których protokół może zostać zoptymalizowany lub zmieniony w celu spełnienia konkretnych potrzeb planowanego eksperymentu. Na koniec poruszamy kwestię sposobów, w jakie ten podstawowy protokół może być modyfikowany w celu pomiaru innych metabolitów komórkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proliferacja jest kluczowym elementem funkcji komórkowej1,2. Kontrola proliferacji wpływa na normalne procesy, takie jak rozwój, i procesy patologiczne, takie jak rak i choroby układu krążenia. Na przykład hiperplastyczny wzrost komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych jest uważany za prekursor miażdżycy3. Zmiany w proliferacji komórek są również wykorzystywane do oceny potencjalnej toksyczności nowych leków. Biorąc pod uwagę jego szeroki wpływ, pomiar proliferacji jest podstawą wielu laboratoriów opartych na biologii komórki.

Proliferacja komórek może być mierzona poprzez proste liczenie komórek, jeśli interesująca nas populacja komórek dzieli się dość szybko. W przypadku wolniej rosnących komórek liczba komórek może być mniej wrażliwa. Proliferacja jest często mierzona przez włączenie znakowanych analogów nukleozydów. Chociaż złotym standardem jest inkorporacja 3H-tymidyny, wiele laboratoriów odchodzi od tej metody, biorąc pod uwagę dostępność nowszych, nieradioaktywnych alternatyw. Należą do nich cytoplazmatyczne barwniki fluorescencyjne, wykrywanie białek związanych z cyklem komórkowym oraz włączanie nieradioaktywnych analogów nukleozydów, takich jak 5-bromo-2' deoksyurydyna (BrdU) i 5-etynylo-2′-deoksyurydyna (EdU)4.

Barwniki cytoplazmatyczne, takie jak ester sukcynimidylowy dioctanu karboksyfluoresceiny (CFSE), wykrywają proliferację, ponieważ intensywność barwnika zmniejsza się o połowę za każdym razem, gdy komórka się dzieli5. Technika ta jest powszechnie stosowana w cytometrii przepływowej dla komórek nieprzylegających. Nie był on często stosowany w przypadku komórek przylegających, ale dzięki nowej generacji czytników płytek obrazowych może się to zmienić. Wykrywanie białek związanych z cyklem komórkowym za pomocą technik opartych na przeciwciałach (cytometria przepływowa, immunohistochemia itp.) jest często stosowane w przypadku tkanek lub komórek nieprzylegających. Te komórki/tkanki muszą być utrwalone i przepuszczalne przed barwieniem. Analogi nukleozydów BrdU i EdU są podobne w podejściu do 3H-tymidyny, ale bez niedogodności związanych z radioaktywnością. Włączenie BrdU jest wykrywane przez przeciwciała anty-BrdU, dlatego komórki muszą być utrwalone i przepuszczalne przed barwieniem. Ponadto komórki muszą być traktowane DNazą, aby odsłonić epitop BrdU.

Włączenie EdU jest wykrywane przez chemię kliknięć, w której grupy alkinowe i azydkowe "klikają" razem w obecności katalitycznej miedzi. Każda grupa może służyć jako cząsteczka inkorporowana biosyntetycznie lub cząsteczka wykrywająca4. Dostępne na rynku analogi nukleozydów mają przyłączoną grupę alkinową. Dlatego w testach proliferacji funkcjonalizowany alkinem analog nukleozydu jest wykrywany przez azydek sprzężony z barwnikiem fluorescencyjnym lub innym markerem. Włączenie EdU ma kilka zalet w porównaniu z BrdU. Po pierwsze, ponieważ grupy alkinowe i azydkowe nie występują w komórkach ssaków, ta interakcja jest wysoce specyficzna z niskim tłem6. Ponieważ obie grupy są małe, komórki nie muszą przechodzić denaturacji DNA, aby odsłonić analog nukleozydu, jak jest to wymagane dla BrdU7. Wreszcie, chemia kliknięć jest bardzo wszechstronna i może być używana do metabolicznego znakowania DNA, RNA, białka, kwasów tłuszczowych i węglowodanów8,9,10,11. Jeśli metabolicznie oznaczony cel zainteresowania znajduje się na powierzchni komórki, żywe komórki mogą być oznaczone jako 12. Ponadto komórki mogą być dalej przetwarzane w celu barwienia immunofluorescencyjnego przeciwciałami.

Poniższy protokół opisuje wykorzystanie inkorporacji EdU i chemii kliknięć do pomiaru proliferacji w ludzkich komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych (Rysunek 1). Pokazujemy trzy różne sposoby pomiaru inkorporacji EdU, reprezentatywne wyniki z każdego z nich oraz ich zalety i wady. Pomiar proliferacji za pomocą chemii kliknięć jest szczególnie przydatny w przypadku przylegających, wolniej rosnących komórek. Ponadto morfologia komórki jest dobrze zachowana i można również przeprowadzić barwienie na podstawie przeciwciał.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wykrywanie EdU za pomocą etykiety fluorescencyjnej

  1. Roztwory podstawowe
    1. Przygotować roztwór podstawowy EdU o stężeniu 5 mM, dodając 12,5 mg EdU do 10 ml podwójnie destylowanegoH2O.
    2. Przygotować składniki roztworu do znakowania: 200 mM tris(3-hydroksypropylotriolilometylometylo)aminy (THPTA) (100 mg w 1,15 ml H2O), 100 mM CuSO4 (15,95 mg w 1 ml H2O; przygotować świeże), 10 mM Cy3 pikolilo-azydku (1 mg w 95,3 ml H2O, przechowywany w 5 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C), i 1 M askorbinian sodu (200 mg w 1 ml H2O; świeży).
    3. Przygotować roztwór podstawowy rezazuryny o stężeniu 0,15 mg/ml. Przefiltrować, wysterylizować i przechowywać 1 ml porcji w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Azydek pikolilu jest dostępny w połączeniu z kilkoma różnymi fluorami, biotyną i peroksydazą chrzanową (HRP).
  2. Oznacz komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) za pomocą EdU.
    UWAGA: Ludzkie VSMC wyizolowano z tętnic biodrowych poprzez wyrostek z eksplantowanych kawałków tkanki. Hodowane w pożywce wolnej od surowicy z insuliną, transferyną, selenem, komórki te wyrażają markery VSMC: smoothelinę, łańcuch ciężki miozyny mięśni gładkich (SM-MHC) i SMC αaktynę13.
    1. Płytki komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych w 2 x 104/ml w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco w 96-dołkowej płytce.
      UWAGA: Komórki hoduje się w temperaturze 37 °C w pożywce z komórkami mięśni gładkich z 2% płodową surowicą bydlęcą.
    2. (Opcjonalnie) Odczekaj kilka godzin do nocy, aby upewnić się, że przestrzega się zaleceń. Dodaj 20 μl bulionu rezazurynowego do każdego dołka. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny. Odczyt sygnału fluorescencji w czytniku płytek (560ex, 594em). Zastąp nośnik nowym DMEM.
      UWAGA: Ten krok jest opcjonalny. Rezazuryna jest używana do normalizacji liczby komórek i uwzględniania zmienności między źródłami w posiewie14.
    3. Dodać buforowaną fosforanem sól fizjologiczną (PBS) lub płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF) 30 ng / ml do 3-6 dołków na zabieg na początku okresu hodowli i inkubować przez 72 godziny.
    4. Rozcieńczyć materiał EdU 5 mM do 1 mM. Dodać 2 μl do każdego dołka (końcowe stężenie 20 μM) przez ostatnie 24 godziny 72-godzinnego okresu hodowli. Nie należy dodawać EdU do jednego zestawu powtórzeń. Studnie te zostaną wykorzystane do wyznaczenia fluorescencji/luminescencji tła.
      UWAGA: Czas trwania hodowli i znakowania za pomocą EdU jest zoptymalizowany dla komórek mięśni gładkich, ale może wymagać modyfikacji w zależności od typu komórki.
  3. Utrwal komórki w paraformaldehydzie (PFA).
    1. Usuń pożywkę i dodaj 150 μl 4% PFA (w PBS) na studzienkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Usuń PFA i dodaj 150 μl 1% eteru tert-oktylofenylowego glikolu polietylenowego (TX-100) (w wodzie) do studzienki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Usuń TX-100, myjąc go trzykrotnie PBS.
      UWAGA: PFA jest toksyczny, należy obchodzić się z nim ostrożnie.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Stałe komórki mogą być przechowywane w PBS w temperaturze 4 °C.
  4. Wykryj wbudowany EdU.
    1. Przygotować roztwór do etykietowania (10 ml na płytkę 96-dołkową, używając wewnętrznych 60 dołków) tuż przed użyciem, dodając odczynniki z roztworów podstawowych w następującej kolejności: THPTA 20 μL, CuSO4 20 μL, Cy3 azydek pikolylu 5 μL, Askorbinian Na 100 μL do PBS dla całkowitej objętości 10 ml.
    2. Usunąć PBS ze studzienek i dodać 150 μl roztworu do etykietowania do każdej studzienki. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Aby wykryć wszystkie jądra, dodaj 4′,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) do każdego dołka. Odczyt na czytniku płytek fluorescencyjnych (Cy3 550ex, 570em; DAPI 350ex, 470em) lub obraz pod mikroskopem.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Utrwalone i wybarwione komórki mogą być przechowywane w PBS w temperaturze 4 °C i obrazowane w późniejszym czasie.

2. Wykrywanie EdU za pomocą luminescencji

  1. Proszę wypełnić sekcje 1.1–1.3.
  2. Przygotować sól fizjologiczną buforowaną trisem z 0,1% polisorbatem 20 (TBST).
  3. Studnie blokowe.
    1. Dodać 150 μl buforu blokującego (tabela materiałów) do każdego dołka i inkubować przez 90 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Usunąć bufor blokujący i przemyć trzykrotnie 200 μl PBS.
  4. Wykryj wbudowany EdU.
    1. Przygotuj roztwór do etykietowania zgodnie z zaleceniami w kroku 1.4.1, zastępując azydek pikolylu biotyny azydkiem pikolylu Cy3
      2. .
    2. Przemyć studzienki pięć razy 200 μl TBST, wstrząsając, 3 minuty na mycie.
    3. Ugasić endogenne peroksydazy 150 μl 0,3%H2O2przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    4. UsunąćH2O2i przemyć pięć razy 200 μl TBST, wstrząsając przez 3 minuty na pranie.
    5. Rozcieńczyć peroksydazę streptawidynowo-chrzanową (SA-HRP; 1:200) w TBST i dodać 50 μl do każdej studzienki. Inkubować 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    6. Umyć pięć razy 200 μl TBST, wstrząsając, 3 minuty na pranie.
    7. Dodać 50 μl substratu do testu immunoenzymatycznego (ELISA) (tabela materiałów) do każdego dołka.
    8. Odczyt natychmiastowy w czytniku płytek zdolny do wykrywania luminescencji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W Rysunek 2, pokazujemy wyniki trzech różnych eksperymentów mierzących proliferację VSMC w odpowiedzi na PDGF. Po wyhodowaniu komórek w pożywkach sformułowanych dla SMC, przeprowadziliśmy eksperyment na DMEM wolnym od surowicy, aby wyeliminować wszelkie potencjalne skutki surowicy lub czynników wzrostu na proliferację. W Rysunek 2A porównujemy wyniki z tego samego eksperymentu, używając odczytu fluorescencyjnego i luminescencyjnego. Do odczytu tych płytek użyliś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Włączenie EdU to prosty, nieskomplikowany sposób pomiaru proliferacji komórek; Jest szczególnie przydatny w przypadku komórek adherentnych13. Nasz protokół wykorzystuje komórki mięśni gładkich, ale ma zastosowanie do każdej przylegającej komórki (nabłonkowej, śródbłonka itp.). Chociaż protokół nie jest skomplikowany, jedynym krytycznym krokiem jest przygotowanie rozwiązania do etykietowania — składniki muszą być dodawane w podanej kolejności. Ponadto, podobnie jak w przypadku chemiluminescencyjnyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Katie Carroll za pomoc techniczną. Dziękujemy również dr Davidowi Cool i Laboratorium Analiz Proteomicznych za instrukcje i udostępnienie czytnika płytek obrazowych Cytation. Praca ta była wspierana przez grant Wright State Foundation (dla L.E.W.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5-etynylo-2'-deoksyurydynaKarbosynterNE08701
biotyna azydek pikolyluKliknij Narzędzia chemiczne1167-5
CuSO4Fisher ScientificC1297-100G
Cy3 azydek pikolyluClick Narzędzia chemiczne1178-1
Czytnik płytek cytacyjnych MikroskopBiotek
EVOSThermo Fisher Scientific
Roztwór nadtlenku wodoruSigma-Aldrich216763
Na askorbinianSigma-Aldrich11140-250G
NucBlue Fixed Cell Stain Ready SondyInvitrogenR37606DAPI Nuclear Stain
OdysseyBlocking Buffer
Li-Cor 927-40000Usługi mikroskopii elektronowej15710
PBSFisher ScientificSH3002802
Chlorek soduSigma Life ScienceS3014-5kg
Streptawidyna Sprzężona peroksydaza chrzanowaTechnologiesS911
Super Signal ELISA FemtoThermo ScientificPI137075Podłoże ELISA
Synergy Plate ReaderBiotek
THPTAClick Narzędzia chemiczne1010-100
Tris Chlorowodorek hydroksymetyloaminometanu (Tris-HCl)Fisher ScientificBP153-500
Triton X 100Bio-Rad1610407
Tween 20Fisher ScientificBP337-100
paraformaldehydu Life

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fuster, J. J., et al. Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies. Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).
  2. Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
  3. Cizek, S. M., et al. Risk factors for atherosclerosis and the development of preatherosclerotic intimal hyperplasia. Cardiovascular pathology the Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 16 (6), 344-350 (2007).
  4. Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. Journal of Investigative Dermatology. 136, e1-e7 (2016).
  5. Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).
  6. Sletten, E., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).
  7. Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).
  8. Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).
  9. Jiang, H., et al. Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).
  10. Izquierdo, E., Delgado, A. Click chemistry in sphingolipid research. Chemistry and Physics of Lipids. 215, 71-83 (2018).
  11. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
  12. Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).
  13. Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells. The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).
  14. Stoddart, M. J. Mammalian cell viability: methods and protocols. , Humana Press. New York, NY. (2011).
  15. Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling. Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).
  16. Bescancy-Webler, C., et al. Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study. Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).
  17. Diermeier-Daucher, S., et al. Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry. Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).
  18. Cieślar-Pobuda, A., Los, M. J. Prospects and limitations of “Click-Chemistry”-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2′deoxyuridine (EdU). Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test proliferacji EdUdetekcja metod chemii klikodczyt fluorescencyjnyodczyt luminescencyjnyczynnik wzrostu pochodzenia p ytkowegofiksacja paraformaldehydempermeabilizacja TX 100obrazuj cy czytnik p ytekr czne liczenie kom rek

Powiązane artykuły