Aktywowana usieciowana agaroza do szybkiego rozwoju żywic chromatograficznych o powinowactwie - wychwytywanie przeciwciał jako studium przypadku

Summary

W tej procedurze, ligand epitopowy oparty na DsRed jest unieruchamiany w celu wytworzenia wysoce selektywnej żywicy o powinowactwie do wychwytywania przeciwciał monoklonalnych z surowych ekstraktów roślinnych lub supernatantów do hodowli komórkowych, jako alternatywa dla białka A.

Abstract

Oczyszczanie przeciwciał monoklonalnych (mAb) jest zwykle osiągane za pomocą chromatografii powinowactwa do białka A, która może stanowić do 25% całkowitych kosztów procesu. Alternatywne, ekonomiczne etapy wychwytywania są zatem cenne dla produkcji na skalę przemysłową, w której produkowane są duże ilości pojedynczego mAb. W tym miejscu przedstawiamy metodę immobilizacji liganda epitopowego na bazie DsRed do usieciowanej żywicy agarozowej, co pozwala na selektywne wychwytywanie przeciwciała neutralizującego wirusa HIV 2F5 z surowych ekstraktów roślinnych bez użycia białka A. Liniowy epitop ELDKWA został najpierw genetycznie połączony z białkiem fluorescencyjnym DsRed, a białko fuzyjne uległo ekspresji w transgenicznych roślinach tytoniu (Nicotiana tabacum) przed oczyszczeniem za pomocą immobilizowanej chromatografii powinowactwa jonów metali. Ponadto metoda oparta na aktywowanej usieciowanej agarozie została zoptymalizowana pod kątem wysokiej gęstości ligandów, wydajnego sprzężenia i niskich kosztów. pH i skład buforu oraz stężenie rozpuszczalnego liganda były najważniejszymi parametrami podczas procedury sprzęgania, która została ulepszona dzięki podejściu opartemu na projektowaniu eksperymentów. Uzyskaną żywicę powinowactwa przetestowano pod kątem jej zdolności do selektywnego wiązania docelowego mAb w surowym ekstrakcie roślinnym, a bufor elucyjny zoptymalizowano pod kątem wysokiego odzysku mAb, aktywności produktu i stabilności żywicy powinowactwa. Metodę można łatwo dostosować do innych przeciwciał z liniowymi epitopami. Nowe żywice umożliwiają łagodniejsze warunki elucji niż białko A i mogą również obniżyć koszty początkowego etapu wychwytywania do produkcji mAb.

Introduction

Produkty biofarmaceutyczne są ważne dla leczenia szerokiego spektrum chorób w prawie każdej gałęzi medycyny¹. Przeciwciała monoklonalne (mAb) dominują na rynku biofarmaceutycznym, a światowa sprzedaż ma osiągnąć prawie 110 miliardów euro w 2020 r. ². Preferowaną platformą ekspresji mAb są linie komórkowe jajnika chomika chińskiego, które zazwyczaj wytwarzają wysokie miana mAb do 10 g∙^L-1 w hodowli supernatant^3,4. Jednak produkcja mAb w hodowlach komórkowych ssaków jest kosztowna ze względu na wysoki koszt pożywki i konieczność sterylnej fermentacji⁵. Platformy wyrażeń alternatywnych, takie jak zakłady, potencjalnie oferują szybsze, prostsze, tańsze i bardziej skalowalne podejście do produkcji przemysłowej^6,7.

Oprócz kosztów związanych z hodowlą komórek ssaków, powszechne stosowanie chromatografii powinowactwa do białka A do wychwytywania produktów jest głównym czynnikiem kosztotwórczym dla przemysłowej produkcji mAb. Białko A występuje naturalnie na powierzchni komórek Staphylococcus aureus i wiąże się z regionem krystalizowalnym (Fc) niektórych mysich i ludzkich przeciwciał, działając w ten sposób jako mechanizm obronny w celu uniknięcia humoralnego układu odpornościowego⁸. Białko A stało się złotym standardem w branży do wychwytywania mAb z supernatantów z hodowli komórkowych i jest również szeroko stosowane przez społeczność badawczą, ponieważ jest wysoce selektywne, zazwyczaj osiągając czystość mAb ~ 95% w jednym kroku⁸. Nic dziwnego, że sprzedaż białka A w ciągu ostatnich dwóch dekad ściśle odzwierciedlała sprzedaż mAbs⁸. W zależności od skali produkcji, koszty białka A mogą odpowiadać ponad 25% całkowitych kosztów procesu, a tym samym wpływać na cenę rynkową terapeutycznych mAb, która może wynosić do 2 000 € ^{g-1 5,9}. W związku z tym alternatywne żywice chromatograficzne o podobnej wydajności oczyszczania mogą znacznie obniżyć koszty produkcji, dzięki czemu terapie oparte na przeciwciałach będą dostępne dla większej liczby pacjentów^10,11,12. Takie alternatywy mogą również obejść wady chromatografii białka A, w tym trudne warunki elucji przy niskim pH (zwykle <3,5), które mogą potencjalnie powodować zmiany konformacyjne mAb, które sprzyjają agregacji¹³. Co ważne, białko A jest selektywne tylko dla regionu Fc niektórych podklas IgG, więc niefunkcjonalne cząsteczki ze skróconymi domenami wiążącymi mogą współoczyszczać się z nienaruszonym produktem⁵, podczas gdy pochodne mAb, takie jak zmienne fragmenty jednołańcuchowe, w ogóle nie wiążą się z białkiem A.

Tutaj opisujemy alternatywną żywicę chromatograficzną o powinowactwie do wychwytywania neutralizującego HIV mAb 2F5 za pomocą jej liniowego epitopu ELDKWA (jednoliterowy kod aminokwasu)^5,14. Genetycznie połączyliśmy epitop 2F5 z C-końcem fluorescencyjnego białka DsRed, które działało jako cząsteczka nośnikowa i reporterowa, i wytworzyliśmy powstałe białko DsRed-2F 5-Epitope (DFE) w transgenicznych roślinach tytoniu (Nicotiana tabacum). DFE oczyszczono za pomocą jednoetapowej unieruchomionej chromatografii powinowactwa jonów metali (IMAC). Immobilizację oczyszczonego liganda powinowactwa DFE na usieciowaną żywicę agarozową osiągnięto poprzez sprzężenie chemiczne przy użyciu usieciowanych kolumn agarozy aktywowanych N-hydroksysukcynimidem (NHS). Następnie wykorzystano statystyczne projekty eksperymentalne w celu optymalizacji procedury unieruchamiania i skuteczności sprzęgania¹⁵. Strategię oczyszczania mAb 2F5 oceniono pod kątem czystości przeciwciał, wydajności i stabilności liganda. W przeciwieństwie do białka A, które wiąże region Fc, DFE wiąże się z regionem determinującym komplementarność 2F5, zapewniając oczyszczanie cząsteczek z nienaruszonym paratopem. Naszą koncepcję można łatwo dostosować do dowolnego mAb z liniowym epitopem lub do innych ligandów powinowactwa opartych na peptydach, które można łatwo zidentyfikować za pomocą badań mikromacierzowych¹⁶.

Rysunek 1: Schemat przebiegu procesu przygotowania żywic powinowactwa do epitopów, które można wykorzystać do wychwytywania mAb z surowych ekstraktów roślinnych lub supernatantów do hodowli komórkowych. (A) Ligand powinowactwa DFE ulegał ekspresji w transgenicznych roślinach tytoniu. Etap wytrącania ciepła (B) został uwzględniony przed homogenizacją zebranych liści (C). (D) Surowy ekstrakt roślinny oczyszczono przez filtrację workową, filtrację wgłębną i sterylną filtrację 0,2 μm. (E) DFE został następnie oczyszczony przez IMAC. (F, G) Oczyszczony ligand powinowactwa DFE unieruchomiono na usieciowanych kolumnach agarozowych aktywowanych EDC/NHS. (H) Kultury bakteryjne zawierające przeciwciało kodujące T-DNA 2F5 wykorzystano do przejściowej ekspresji w roślinach N. benthamiana (I) hodowanych w fitotronie. (J) Liście N. benthamiana zebrano i przetworzono zgodnie z opisem w D. (K) mAb 2F5 oczyszczono z oczyszczonego ekstraktu przy użyciu kolumn powinowactwa DFE (L). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protocol

1. Uprawiaj transgeniczne rośliny tytoniu

UWAGA: Projekt białka fuzyjnego DFE i generowanie roślin transgenicznych są opisane gdzie indziej^5,17.

1. Kiełkuj transgeniczne sadzonki tytoniu w glebie. Nawadniać rośliny roztworem nawozu 1,0 g·^L-1. Przenieś rośliny do pojedynczych doniczek o wymiarach 100 mm x 100 mm x 60 mm (długość, szerokość, wysokość), gdy osiągną średnicę ~0,04 m.
2. Uprawiaj transgeniczne rośliny tytoniu w szklarni z 16-godzinnym fotoperiodem (reżim temperatury 25/22 °C jasny/ciemny), z wilgotnością względną 70% i automatycznym nawożeniem roztworem nawozu 1,0 g·^L-1 przez 15 minut co godzinę.
3. Po 7 tygodniach zbierz wszystkie liście z wyjątkiem czterech liści liścienia u podstawy łodygi rośliny. Natychmiast przetwórz zebrane liście, jak opisano poniżej.

2. Wytrącanie ciepła białek komórek gospodarza

1. Ustawić łaźnię wodną o pojemności roboczej 20 l w podgrzewanym naczyniu ze stali nierdzewnej (0,3 m x 0,3 m x 0,3 m). Na początku umieść pompę magnetyczną w łaźni wodnej, aby trwale mieszać ciecz o przepływie 5 l ^min-1. Zamontuj regulowany termostat na łaźni wodnej w celu regulacji temperatury (kroki 2.4 i 2.8).
   ostrożność: Wszystkie poniższe kroki do 2.10 obejmują obchodzenie się z gorącą cieczą. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym izolowane termicznie rękawice i okulary.
2. Dodać 15 l wody dejonizowanej do łaźni wodnej i podgrzać ciecz do temperatury 70 °C.
3. Umieść 10-litrowe wiadro wypełnione 5 litrami wody dejonizowanej na mieszadle magnetycznym. Dodać fosforan sodu do końcowego stężenia 120 mM. Doprowadzić pH do 8,14 za pomocą 10 M kwasu solnego. Gdy wszystkie składniki się rozpuszczą, dodać powstały w ten sposób skoncentrowany bufor do blanszowania (5 l) do łaźni wodnej z kroku 2.2.
4. Mieszać łaźnię wodną do momentu, gdy temperatura osiągnie 70 °C. W razie potrzeby użyć 10 M kwasu solnego, aby dostosować pH do 8,14. Kontynuuj mieszanie przez co najmniej 15 minut po osiągnięciu wymaganej temperatury i pH, aby upewnić się, że cały zespół jest w równowadze termicznej.
5. Przygotuj wiadro o pojemności 20 l (0,3 m x 0,3 m x 0,3 m) wypełnione wodą dejonizowaną o temperaturze ~17 °C (wymagane dla kroku 2.9).
6. Przygotować 400 g porcji zebranych liści tytoniu z kroku 1.3. Umieścić jedną porcję w perforowanym koszu (0,2 m x 0,2 m x 0,2 m; szerokość porów co najmniej 0,02 m x 0,02 m). Unikaj przepełniania kosza materiałem roślinnym lub zbyt ciasnego pakowania liści, aby uniknąć uszkodzenia tkanki.
7. Całkowicie zanurz kosz w gorącym buforze do blanszowania z kroku 2.4 i upewnij się, że wszystkie liście pozostały pod powierzchnią płynu. W razie potrzeby użyj termostabilnej silikonowej łyżki, aby przytrzymać liście pod powierzchnią.
8. Inkubuj liście tytoniu przez 1,5 minuty w płynie do blanszowania, podczas gdy pompa nadal miesza płyn. Monitoruj temperaturę cieczy przez cały okres inkubacji. Unikaj zatykania wlotu pompy liśćmi tytoniu.
9. Wyjmij kosz z liśćmi tytoniu z bufora do blanszowania i odcedź resztki buforu z liści przez 30 s. Przenieś kosz do wiadra wypełnionego zimną wodą (z kroku 2.5) i zanurz liście na 30 s. Wyjmij kosz i spuść resztki wody z liści przez 30 s przed homogenizacją (krok 3).
10. Powtórzyć kroki 2.6-2.9 z świeżymi podwielokrotnościami od 2.6, aż cała zebrana biomasa zostanie przetworzona. Stale monitorować i regulować pH oraz temperaturę buforu do blanszowania w łaźni wodnej.
    nuta: Blanszowany materiał roślinny można przechowywać na lodzie do 30 minut, gdy do przetworzenia całej biomasy wymaganych jest kilka cykli blanszowania. Blanszowane liście można również przechowywać w zamkniętych próżniowo torebkach w temperaturze –80 °C przez co najmniej 3 tygodnie. Zaleca się jednak natychmiastowe przetwarzanie, ponieważ długotrwałe przechowywanie może zmniejszyć wydajność DFE.

3. Ekstrakcja i klaryfikacja białek

UWAGA: Poniższe kroki dotyczą blendera z obracającymi się ostrzami. Nie pracuj w naczyniu blendera, gdy jest zasilany lub zamontowany na jednostce silnikowej.

1. Umieścić 150 g (mokra masa) blanszowanych liści tytoniu (krok 2.9) w naczyniu miksującym i dodać 450 ml buforu ekstrakcyjnego (50 mM fosforanu sodu, 500 mM chlorku sodu, 10 mM disiarczynu sodu, pH 7,5). Zamknij szczelnie nakrętkę blendera, aby zapobiec rozlaniu się materiału roślinnego lub bufora.
2. Homogenizuj liście przez 3x przez 30 s, z 30-sekundowymi przerwami między każdym impulsem. Upewnij się, że wszystkie liście są homogenizowane i żadne nie przyklejają się do górnej części naczynia miksera. W razie potrzeby otwórz blender podczas przerw i dociśnij liście, które przyklejają się do górnej części naczynia, za pomocą czystej silikonowej łyżki.
3. Po homogenizacji pobrać 1,0 ml próbki homogenatu do dalszej analizy (krok 7).
4. Zebrać homogenat w naczyniu o odpowiedniej wielkości (np. w przypadku pracy z całkowitą biomasą 1,0 kg, użyć naczynia o pojemności co najmniej 5 l). Powtarzać kroki 3.1-3.3, aż cała zblanszowana biomasa zostanie zhomogenizowana.
5. Zamontuj filtr workowy w uchwycie filtra i umieść inne naczynie o odpowiedniej wielkości (patrz 3.4) pod zespołem. Nanieść homogenat na filtr workowy w ilości ~0,15 L ^min-1. Po każdym litrze pobrać próbki filtratu workowego do dalszej analizy (etap 7) i zmierzyć zmętnienie puli filtratu workowego w postaci rozcieńczenia 1:10 w buforze ekstrakcyjnym za pomocą mętnościomierza lub podobnego urządzenia.
6. Dalej klarować basen filtratu workowego, używając 0,02^m2 kombinacji warstwy filtra wgłębnego K700 (góra) i KS50 (dół) na litr workowej puli filtratu. Stosować natężenie przepływu 3,0 l ^min-1·^m-2 do maksymalnego ciśnienia 0,2 MPa. Następnie usuń resztki cząstek, przepuszczając oczyszczony filtrat przez sterylny filtr 0,2 μm, jak opisano wcześniej⁵.

4. Oczyszczanie ligandu powinowactwa DFE

1. Przygotować system szybkiej chromatografii cieczowej białek przez przepłukiwanie buforem elucyjnym (10 mM fosforan sodu, 300 mM imidazol, pH 7,4), buforem płuczącym (10 mM fosforan sodu, pH 7,4) i buforem równowagowym (20 mM fosforan sodu, 500 mM chlorek sodu, pH 7,4). Zamontuj kolumnę zawierającą ~50 ml chelatującej usieciowanej żywicy agarozowej na kilogram biomasy liściowej (~2,5 l filtratu głębokościowego).
2. Napełnij kolumnę jonami niklu, nakładając na 5 objętości kolumny (CV) 200 mM roztworu siarczanu niklu i przemyć ją buforem elucyjnym o stężeniu 5 CV. Stosować natężenie przepływu 50 cm ^h-1 i monitorować sygnały UV przy 260, 280 i 558 nm dla wszystkich kolejnych etapów chromatografii.
3. Zrównoważyć kolumnę buforem równowagi o wartości 10 CV. Następnie załadować 50 CV oczyszczonego ekstraktu roślinnego (z kroku 3.6) na kondycjonowaną kolumnę.
4. Przepłukać kolumnę 10 CV buforu do mycia. Eluować białko fuzyjne DFE za pomocą buforu elucyjnego 5 CV i zebrać frakcję zawierającą produkt, gdy sygnały UV przy 280 nm i 558 nm wzrosną do więcej niż 5 mAU powyżej linii podstawowej.
5. Pobrać 0,2 ml próbki z frakcji elucyjnej w celu zmierzenia całkowitego stężenia białka rozpuszczalnego (TSP) (etap 7.1), stężenia DFE (kroki 7.2 i 7.3) oraz czystości DFE (etap 7.4).
6. Zamontuj kolumnę zawierającą ~50 ml usieciowanej żywicy dekstranowej na systemie chromatograficznym. Zrównoważyć kolumnę z 5 CV buforu sprzęgającego (200 mM HEPES, 500 mM chlorku sodu, pH 8,5). Wstrzyknąć 10 ml frakcji elucyjnej DFE (krok 4.4) w celu wymiany buforu i monitorować absorbancję promieniowania UV przy 280 i 558 nm.
7. Zbierz frakcję zawierającą DFE, gdy sygnały UV przy 280 nm i 558 nm wzrosną do więcej niż 5 mAU powyżej linii podstawowej. Pobrać próbkę o objętości 0,2 ml i określić stężenie TSP, stężenie DFE i czystość DFE (krok 7).
8. Zagęścić oczyszczoną próbkę DFE (z kroku 4.7) do 15 g ^L-1 za pomocą odśrodkowej rurki koncentratora o sile 3 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut w wirówce. Kontynuuj reakcję sprzęgania (krok 5).
   nuta: Przechowywać roztwór DFE w temperaturze 4 °C, jeżeli etap zatężania lub sprzęgania nie może być natychmiast przeprowadzony
.

5. Sprzężenie DFE z aktywowaną usieciowaną żywicą agarozową

UWAGA: Nie wymieniaj izopropanolu używanego do przechowywania kolumn aktywowanych przez NHS, dopóki wszystkie urządzenia i rozwiązania do łączenia nie będą gotowe. Nigdy nie pozwól, aby kolumny wyschły.

1. Skonfiguruj model projektowania eksperymentów (DoE) w celu optymalizacji sprzężenia DFE z aktywowaną żywicą, z pH, składem buforu i stężeniem DFE jako czynnikami. Szczegóły metody DoE są opisane w innym miejscu¹⁵.
2. Przygotować roztwór liganda powinowactwa (z kroku 4.8) w zakresie stężeń od 0,5–15 g·^L-1 lub zgodnie z definicją w DoE i przechowywać go na lodzie do czasu przygotowania reakcji sprzęgania (etap 5.5). Napełnić co najmniej dziesięć strzykawek o pojemności 2 ml roztworem DFE i przygotować adapter do zamontowania strzykawek na usieciowanych kolumnach agarozowych aktywowanych przez NHS o objętości łoża 1,0 ml.
3. Na każde 10 kolumn używanych do sprzęgania przygotować 30 ml roztworu dezaktywującego (0,5 M etanoloaminy, 0,5 M chlorku sodu, pH 8,3), 30 ml roztworu o niskim pH (0,1 M octanu sodu, 0,5 M chlorku sodu, pH 4,0) i 10 ml roztworu do przechowywania (0,05 M fosforanu disodowego, 0,1% (m/v) azydek sodu, pH 7,0).
4. Przygotować 20 ml 1 ml kwasu solnego o stężeniu 1 mM w probówce i inkubować na lodzie przez co najmniej 20 minut. Przygotować precyzyjną wagę do monitorowania frakcji przepływowych na wszystkich etapach reakcji sprzęgania (krok 5.7).
5. Otwórz szczelnie aktywowaną przez NHS usieciowaną kolumnę agarozową i zamontuj adapter strzykawki na wlocie kolumny. Zapobiegaj przedostawaniu się powietrza do kolumny, nakładając kroplę buforu na wlot adaptera przed podłączeniem go do strzykawki.
6. Przemyć kolumnę 6 ml lodowatego 1 mM kwasu solnego (z kroku 5.4) przy natężeniu przepływu <1 ml ^min-1 i natychmiast przejść do kroku 5.7.
7. Wstrzyknąć 1,5 ml roztworu DFE (krok 5.2) za pomocą strzykawki o pojemności 2 ml przy natężeniu przepływu <1 ml ^min-1 i zebrać frakcję przepływową na precyzyjnej skali (krok 5.4) do dalszej analizy (krok 7). Uszczelnić kolumnę na obu końcach i inkubować przez 15–45 minut w temperaturze 22 °C, w zależności od konfiguracji DoE.
8. Wstrzyknąć 6 ml roztworu dezaktywującego, a następnie 6 ml roztworu o niskim pH o szybkości przepływu <1 ml ^min-1 w celu usunięcia niekowalencyjnie związanych ligandów z żywicy. Następnie wstrzyknąć 6 ml roztworu dezaktywującego i inkubować kolumnę przez 15 minut.
9. Wstrzyknąć 6 ml roztworu o niskim pH do kolumny, a następnie 6 ml roztworu dezaktywującego. Następnie wstrzyknąć kolejne 6 ml roztworu o niskim pH do kolumny.
10. Wstrzyknąć 2 ml roztworu do przechowywania do kolumny i przechowywać w temperaturze 4 °C.

6. Testowanie oczyszczania mAb z ekstraktów z roślin klarowanych

1. Przygotuj 100 ml oczyszczonego ekstraktu roślinnego zawierającego 2F5⁵ lub supernatant z preferowanego komórkowego systemu ekspresji, również zawierający 2F5.
2. Przygotować bufor równowagowy (20 mM fosforanu sodu, 500 mM chlorku sodu, pH 7,4), bufor elucyjny o niskim pH (0,05 M cytrynian, 0,05 M chlorek sodu, pH 4,0–3,25) i bufor elucyjny o wysokiej sile jonowej (1,0–4,0 M chlorek magnezu, 0,1 M HEPES, pH 8,0)
3. Przepłukać system chromatograficzny. Zamontować kolumnę o powinowactwie DFE (od kroku 5.10) w układzie chromatograficznym i zrównoważyć z 5 CV buforu równowagowego przy natężeniu przepływu 1,0 ml ^min-1. Monitorować absorbancję promieniowania UV przy 280 nm.
   nuta: Ładowanie ekstraktu roślinnego lub supernatantu z kultur komórkowych do kolumny może spowodować wzrost ciśnienia wstecznego. Ustawić alarm wysokiego ciśnienia na 0,2 MPa, aby uniknąć uszkodzenia systemu chromatograficznego lub kolumny DFE.
4. Załadować 80 ml oczyszczonego ekstraktu roślinnego lub supernatantu (krok 6.1) do kolumny z natężeniem przepływu 0,5 ml ^min-1, aby zagwarantować czas kontaktu wynoszący 2 minuty. Zebrać próbki przepływowe we frakcjach o objętości 2 ml w celu rekonstrukcji krzywej przełomu (krok 7.3). Przechowywać próbki przepływowe w temperaturze 4 °C, jeżeli natychmiastowa analiza próbki nie jest możliwa
.
5. Przemyć kolumnę buforem równowagowym o stężeniu 6 CV. Pobrać próbkę prania na początku, w środku i na końcu tego etapu.
6. Elutę mAb 2F5 za pomocą 5 CV buforu elucyjnego o niskim pH lub buforu elucyjnego o wysokiej sile jonowej (0,1 M HEPES, 1,25 M chlorek magnezu, pH 8,0). Zbierz frakcję DFE, gdy sygnał UV 280 nm wzrośnie do 5 mAU powyżej linii podstawowej.
   1. Zoptymalizuj bufor elucyjny dla każdej pary epitop-przeciwciało. W przypadku 2F5 1,25 M chlorek magnezu osiągnął optymalną równowagę między odzyskiem produktu a stabilnością liganda.
      nuta: Roztwór chlorku magnezu jest podatny na wytrącanie się. Dlatego rozpuść chlorek magnezu w ~700 ml wody. Oddzielnie rozpuść HEPES w 100 ml wody i dostosuj pH do 8,0. Dodać rozpuszczony roztwór chlorku magnezu do roztworu HEPES i dodać wodę do końcowej objętości 1,0 l. Nie należy regulować pH po rozpuszczeniu chlorku magnezu, ponieważ spowoduje to wytrącanie się.
7. Przeanalizować wszystkie próbki pobrane podczas etapów 6.4–6.6 przy użyciu metody Bradforda, elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu litu (LDS-PAGE) i spektroskopii powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) (krok 7).

7. Przykładowa analiza

1. Zmierz stężenie TSP za pomocą metody Bradforda^18,19.
   1. W trzech egzemplarzach odpipetować 2,5 μl każdej próbki do pojedynczego dołka na 96-dołkowej płytce. Stosować osiem wzorców albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w trzech egzemplarzach w zakresie 0–2 000 mg·^L-1.
   2. Dodaj 200 μl odczynnika Bradford do każdej studzienki i wymieszaj, delikatnie pipetując w górę iw dół. Utrzymuj pipetę poziomo, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków, które zniekształcają późniejszy odczyt.
   3. Inkubować płytkę przez 10 minut w temperaturze 22 °C i zmierzyć absorbancję przy długości fali 595 nm w spektrofotometrze. Obliczyć stężenie TSP w próbkach w oparciu o krzywą wzorcową przechodzącą przez punkty odniesienia BSA.
2. Ilościowe określanie DFE za pomocą fluorymetrii
   1. W trzech egzemplarzach odpipetować 50 μl każdej próbki do pojedynczych dołków na czarnej 96-dołkowej płytce o połowie powierzchni. Uwzględnij sześć wzorców DsRed obejmujących zakres 0–225 mg·^L-1.
   2. Zmierzyć fluorescencję dwukrotnie za pomocą filtra wzbudzającego 530 ± 30 nm i filtra emisyjnego 590 ± 35 nm w spektrofotometrze. Obliczyć stężenie DFE w próbkach na podstawie krzywej wzorcowej przechodzącej przez punkty odniesienia DsRed.
3. Zmierz stężenie 2F5 za pomocą spektroskopii SPR²⁰.
   1. Przygotować bufor do pracy HBS-EP (10 mM kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES), 3 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), 150 mM chlorek sodu, 0,005% v/v Tween-20, pH 7,4) i przefiltrować go wysterylizować, przepuszczając przez próżniowy filtr butelkowy o wielkości 0,2 μm. Odgazuj bufor na 15 minut.
   2. Podłącz bufor roboczy HBS-EP do przyrządu SPR przed zadokowaniem układu powierzchniowego karboksymetylowanego dekstranu i zrównoważ system za pomocą funkcji prime. Rozpocznij przebieg ręczny z natężeniem przepływu 30 μl ^min-1 i kondycjonuj powierzchnię wióra, naprzemiennie wstrzykując 30 mM kwasu solnego i 25 mM wodorotlenku sodu (po dwa wstrzyknięcia) do komór przepływowych 1 i 2 przy natężeniu przepływu 30 μl ^min-1 przez 1 min.
   3. Przygotować 300 μl roztworu białka A o stężeniu 500 mg·^L-1 w 10 mM octanu sodu (pH 4,0). Rozmrozić fiolki zawierające 0,4 M chlorowodorku 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC) i 0,1 M NHS i odwirować przy 16 000 x g przez 1 minutę przed zmieszaniem 70 μl EDC i 70 μL NHS.
   4. Przenieść mieszaninę EDC/NHS i roztwór białka A do plastikowych fiolek na próbki o średnicy 7 mm i umieścić w stojaku na próbki. Aktywować powierzchnię chipa karboksymetylowanego dekstranu poprzez wstrzyknięcie mieszaniny EDC/NHS do komórek przepływowych 1 i 2 z natężeniem przepływu 10 μl ^min-1 przez 10 minut.
   5. Połączyć białko A z aktywowaną powierzchnią dekstranu karboksymetylonego, wstrzykując roztwór białka A na komórkę przepływową 2 z szybkością przepływu 15 μl ^min-1 przez 15 minut.
   6. Podczas sprzęgania białka A rozmrozić fiolkę z 1,0 M chlorowodorkiem etanoloaminy (pH 8,5) i odwirować przy 16 000 x g przez 1 minutę. Przenieść 150 μl do plastikowej fiolki o średnicy 7 mm i umieścić w urządzeniu. Po zakończeniu kroku 7.3.5 dezaktywuj powierzchnię chipa, wstrzykując roztwór etanoloaminy do komórek przepływowych 1 i 2 z natężeniem przepływu 10 μl ^min-1 przez 7 minut.
   7. Kondycjonować powierzchnię wióra, wstrzykując naprzemiennie 30 mM kwasu solnego i 25 mM wodorotlenku sodu (po dwa wstrzyknięcia) do komórek przepływowych 1 i 2 przy natężeniu przepływu 30 μl ^min-1 przez 0,5 min.
   8. Przygotować wzorce przeciwciała 2F5 w buforze biegowym HBS-EP o stężeniu 500 μg·^L-1 i rozcieńczyć próbki zawierające 2F5 w HBS-EP do stężenia końcowego w zakresie 20–1 000 μg·^L-1. Wstrzykiwać próbki i wzorce do komór przepływowych 1 i 2 z natężeniem przepływu 30 μl ^min-1 przez 3 minuty. Wstrzyknąć wzorzec 2F5 po każdych 15 próbkach.
   9. Odejmij sygnał jednostek względnych (RU) celi przepływowej 1 (celi odniesienia) od sygnału celi przepływowej 2 (celi pomiarowej) dla każdej próbki i oblicz stężenie przeciwciał na podstawie sygnału RU standardowych wstrzyknięć 2F5.
   10. Po każdym wstrzyknięciu próbki lub wzorca należy zregenerować powierzchnię wióra, wstrzykując 30 mM kwasu solnego o natężeniu przepływu 30 μL ^min-1 przez 0,5 minuty przez komory przepływowe 1 i 2.
   11. Wykreślić stężenie 2F5 dla każdej próbki przepływowej z kroku 6.4 w stosunku do objętości przepływu, aby uzyskać krzywą przebicia 2F5. Obliczyć ilość wstrzykniętego 2F5 po osiągnięciu 10% obciążenia stężeniem 2F5, aby uzyskać 10% dynamiczną zdolność wiązania (DBC).
4. Analizuj próbki białek za pomocą LDS-PAGE.
   1. Otwórz gotowy do użycia 4–12% żel poliakryloamidowy BisTris LDS i umieść go w module do elektroforezy. Przenieść 800 ml buforu do pracy (50 mM MES, 50 mM zasady Tris, 0,1% (m/v) SDS, 1 mM EDTA, pH 7,3) do modułu i dodać 0,5 ml roztworu przeciwutleniacza.
   2. W probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml wymieszać 10 μl buforu ładującego z 4 μl środka redukującego i 26 μl próbki białka. Inkubować probówkę w bloku grzewczym przez 10 minut w temperaturze 80 °C. Odwirowywać probówkę przy 500 x g przez 30 s.
   3. Załaduj żel poliakryloamidowy LDS (10 μl próbki na pas) i załaduj 5 μl wstępnie wybarwionego wzorca białkowego (10–180 kDa) na osobnym pasie.
   4. Zamknij komorę elektroforezy i podłącz zasilanie. Elektroforeza powinna trwać 40 minut i przy stałym napięciu 200 V.
   5. Usuń żel z komory elektroforezy. Otwórz poszycie żelu i myj żel przez 15 minut w wodzie na wytrząsarce z prędkością 19 obr./min. Barwić żel przez 1 godzinę w roztworze barwiącym na wytrząsarce z prędkością 19 obr./min.
   6. Odbarwić żel przez 1 godzinę w wodzie na shakerze z prędkością 19 obr./min. Zeskanuj żel za pomocą skanera do filmów.

Results

Ekspresja i oczyszczanie liganda powinowactwa

Białko fuzyjne DFE zostało wyrażone w transgenicznych roślinach tytoniu uprawianych w szklarni. Plon wyniósł ~120 mg·^kg-1 masy liści przy średniej biomasie ~130 g na roślinę. Czystość DFE wynosiła <5% TSP w surowych ekstraktach roślinnych przed blanszowaniem, ale wzrosła do ~40% po obróbce cieplnej w temperaturze 70 °C przez 1,5 min, co spowodowało wytrącenie >97% białek komórek gospodarza. Etap blanszowania można było łatwo zintegrować z rutyną zbioru i ekstrakcji (Rysunek 1) i zajął mniej niż 2 godziny dodatkowego czasu, wliczając w to ustawienie kąpieli wodnej. Całkowity odzysk DFE wynosił 23,5 mg^kg1 przy czystości >90%. Etapami odpowiedzialnymi za straty produktu były blanszowanie, filtracja wgłębna i IMAC, ze stratami właściwymi wynoszącymi odpowiednio 40%, 27% i 45%. Pojemność filtra wgłębnego wynosiła średnio 135 ± 36 L ^m-2 (±SD, n=3), a więc mieściła się w górnym zakresie wartości podawanych w literaturze²¹. Plon DFE wzrastał wraz z wiekiem rośliny (Rysunek 2).

Immobilizacja ligandu powinowactwa na kolumnach chromatograficznych aktywowanych przez NHS

Podczas wstępnych testów sprzęgania stwierdziliśmy, że bufor HEPES (pH 8,3) zwiększył skuteczność sprzężenia do 89 ± 6% (±SD, n=3) w porównaniu do 78 ± 9% (±SD, n=3) dla buforu wodorowęglanowego zalecanego przez producenta. W związku z tym HEPES był używany we wszystkich kolejnych eksperymentach sprzęgających. Wybrano podejście DoE, aby zoptymalizować wydajność sprzężenia DFE z usieciowaną żywicą agarozową aktywowaną przez NHS. Bezwzględna ilość DFE unieruchomionego na żywicy wzrastała wraz z masą DFE wstrzykniętego do kolumny i ustabilizowała się na poziomie ~15 g·^L-1, podczas gdy wydajność sprzężenia spadała w sposób ciągły w miarę wstrzykiwania większej ilości DFE (Rysunek 2). Wydajność sprzęgania była również o >50% niższa w buforze kwaśnym, co wskazuje na potrzebę przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem odpowiednich warunków sprzężenia dla każdego liganda w poszczególnych przypadkach. Za pomocą narzędzia do optymalizacji numerycznej oprogramowania DoE zidentyfikowano idealne warunki pod względem wydajności sprzężenia, bezwzględnej ilości unieruchomionego DFE i kosztów kolumny. Najbardziej pożądane warunki (pH 9,0 i 7,0 mg DFE na 1 ml usieciowanej żywicy agarozowej) znajdowały się na dużym płaskowyżu i dlatego były solidne. Cząsteczki DFE zachowywały swoją czerwoną fluorescencję nawet po sprzężeniu, a intensywność koloru odpowiadała całkowitej ilości unieruchomionego DFE (Rysunek 2). Dlatego kolor kolumny może być używany jako prosty parametr kontroli jakości do oszacowania wydajności sprzężenia i jakości kolumny. Fluorescencja potwierdziła również, że białko fuzyjne DFE składa się w stanie tetramerycznym natywnego DsRed.

Rysunek 2: Optymalizacja immobilizacji DFE do usieciowanej żywicy agarozowej aktywowanej przez NHS. (A) Żel LDS-PAA z nałożoną metodą western blot próbek homogenatu i elucji z nieblanszowanych i blanszowanych transgenicznych ekstraktów roślinnych DFE. Zbiór roślin odbywał się 38, 45 lub 52 dni po wysiewie. Western blot wykonano przy użyciu przeciwciał_{anty-His 6}⁵. (B) Całkowita ilość sprzężonego liganda powinowactwa DFE w zależności od pH sprzężenia i całkowitej masy oczyszczonego DFE wstrzykniętego na usieciowane kolumny agarozowe aktywowane przez NHS. Czerwone kropki wskazują rzeczywiste eksperymenty przeprowadzone w celu zbudowania modelu powierzchni odpowiedzi. C) kolumny powinowactwa DFE po procedurze sprzęgania. Liczby odpowiadają warunkom sprzężenia wyróżnionym w panelu B. dps = dni po wysiewie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Testowanie izolacji 2F5 przy użyciu żywicy o powinowactwie DFE

Rekombinowane przeciwciało 2F5 było przejściowo wytwarzane w roślinach Nicotiana benthamiana uprawianych w fitotronie⁵. Wychwytywanie 2F5 z surowego ekstraktu roślinnego testowano przy użyciu kolumn powinowactwa sprzężonych z ~7,0 mg oczyszczonego DFE (krok 6). Elucja z żywic białka A zwykle obejmuje kwaśny bufor (pH ~3,3)¹³. Dlatego wstępnie oceniliśmy różne elucyjne o niskim pH (pH 6,0–3,25) dla kolumn DFE. Elucja 2F5 zakończyła się sukcesem przy wartościach pH poniżej 4,5 z najwyższym odzyskiem ~35% przy pH 3,25. Jednak elucja o niskim pH inaktywowała zarówno przeciwciało (co potwierdziła spektrometria SPR), jak i ligand DFE (na co wskazuje utrata koloru i niższy DBC, Rysunek 3). To ostatnie było przewidywane, biorąc pod uwagę, że natywny DsRed ulega denaturacji przy pH <4,0^22,23. Aby uniknąć denaturacji produktu i liganda, przetestowaliśmy chlorek magnezu jako alternatywny środek elucyjny, ponieważ był on wcześniej używany do elucji mAb z innych żywic o powinowactwie²⁴. Stężenie chlorku magnezu wynoszące 1,25 M było wystarczające do wymycia 2F5 z żywicy o powinowactwie DFE z odzyskiem 105 ± 11% (±SD, n=3) i czystością 97 ± 3% (±SD, n=3). Ta wydajność była porównywalna z żywicami Protein A^25,26. Równowagowa stała dysocjacji (K_D) przeciwciała 2F5 oczyszczonego z DFE i syntetycznego liganda Fuzeonu wynosiła 791 pM, podczas gdy dla odpowiednika oczyszczonego z białka A wynosiła 763 pM⁵. Ponadto nie zaobserwowano znaczącej utraty koloru w żywicy w ciągu łącznie 25 cykli wiązania i elucji. DBC żywicy o powinowactwie DFE przy 10% przełomie 2F5 spadało liniowo w ciągu 25 cykli do ~15% wartości początkowej (Rysunek 3).

Rysunek 3: Badanie izolacji 2F5 z oczyszczonych ekstraktów roślinnych przy użyciu żywic o powinowactwie DFE. (A) Żywice o powinowactwie do DFE po jednym cyklu elucji przy użyciu o różnych wartościach pH w zakresie 4,0–3,0 i tych samych żywic po etapie neutralizacji przy pH 6,0. (B) Żywice o powinowactwie DFE po jednym i sześciu cyklach oczyszczania 2F5 przy użyciu 1,25 M lub 4,00 M chlorku magnezu jako eluentu. (C) Chromatogramy eksperymentów z obciążeniem czołowym (krzywe przebicia) w celu określenia zależnej od cyklu dynamicznej zdolności wiązania żywicy DFE przy użyciu chlorku magnezu jako eluentu. Krzywe przebicia zmierzono dla elucyjnych chlorku magnezu o długości 4,0 M i 1,25 M oraz różnych numerach cykli. (D) Zależna od cyklu dynamiczna zdolność wiązania DFE przy użyciu 1,25 M chlorku magnezu jako eluentu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Zastosowania nowej żywicy powinowactwa

Wykazaliśmy, że niestandardowe żywice chromatograficzne o powinowactwie do wychwytywania mAb można wytwarzać poprzez unieruchomienie liganda zawierającego epitop specyficzny dla mAb do usieciowanej agarozy aktywowanej przez NHS. Aby zaprojektować taką żywicę, konieczne było poznanie sekwencji epitopów i użycie epitopu liniowego. Powstałe żywice są korzystne dla wychwytywania mAb, ponieważ mogą potencjalnie zastąpić kosztowne etapy chromatografii powinowactwa białka A. Interakcja między 2F5 a DFE w naszym studium przypadku była pośredniczona przez wiązanie epitop-paratop, więc nasz ligand powinien być bardziej selektywny niż białko A, które wiąże się z regionem Fc większości mysich i ludzkich IgG. Ponieważ do każdego mAb potrzebne są indywidualne ligandy, nasza metoda może początkowo wydawać się odpowiednia głównie dla przeciwciał, które są wytwarzane na bardzo dużą skalę. Jednak łącząc nasze podejście z szybką ekspresją białek przejściowych pochodzenia roślinnego, nowe ligandy powinowactwa można przygotować w czasie krótszym niż 2 tygodnie²⁷ przy minimalnym wysiłku²⁸. W związku z tym metoda nadaje się również do oczyszczania mAb na małą skalę.

Produkcja i potencjalne ulepszenia ligandu powinowactwa

Zakłady oferują szybką i bezpieczną platformę do produkcji ligandów o powinowactwie ^5,29,30, takich jak białko fuzyjne DFE przedstawione w naszym studium przypadku. Blanszowanie materiału roślinnego znacznie zmniejszyło ilość białek komórek gospodarza w jednym kroku i można je było łatwo zintegrować ze standardową procedurą klarowania. Jednak odzysk liganda był niski w obecnej konfiguracji, prawdopodobnie ze względu na jego umiarkowaną stabilność termiczną i pewne niespecyficzne wiązanie z warstwami filtra, jak zgłoszono dla innych produktów 31,32,33. Inżynieria nośnika w celu zwiększenia jego stabilności termicznej może zatem pomóc w poprawie wydajności ligandów w przyszłości, jak opisano w przypadku kandydata na szczepionkę przeciwko malarii CCT, enzymu przeciwnowotworowego PpADI lub mezofilnej β-glukozydazy 34,35,36. To samo dotyczy etapu filtracji wgłębnej, w którym inżynieria białkowa może pomóc w zmniejszeniu niespecyficznego wiązania z materiałem filtracyjnym³⁷. Koszty produkcji DFE i podobnych ligandów można również obniżyć poprzez poprawę ogólnej wydajności klarowania przy użyciu flokulantów lub dodatków filtracyjnych^38,39.

Gdy DsRed jest używany jako nośnik, tworzy kompleks tetrameryczny. Jest to korzystne, ponieważ zwiększa liczbę epitopów na ligand, ale może również sprawić, że ligand będzie bardziej podatny na demontaż lub denaturację podczas chromatografii powinowactwa. Monomeryczne białko nośnikowe, takie jak mCherry, może być zatem preferowane, ponieważ jest stabilne przy niskim pH⁴⁰, a włączenie tandemowych powtórzeń epitopu zwiększyłoby awidność liganda, a tym samym zwiększyłoby pojemność żywicy ^5,26,41. W przypadku prostych białek epitopowych nośnikowych (tj. takich, które nie mają wiązań dwusiarczkowych ani modyfikacji potranslacyjnych) systemy produkcji mikrobiologicznej mogą obniżyć koszty produkcji i sprawić, że ligandy będą bardziej konkurencyjne w stosunku do białka A. Na przykład białko zielonej fluorescencji uległo ekspresji w komórkach bakteryjnych z wydajnością ~1 g·^kg-1 biomasy, co znacznie obniżyłoby koszty produkcji ligandów⁴².

Niezależnie od gospodarza ekspresji, podczas sprzęgania wymagany był oczyszczony ligand powinowactwa, aby zminimalizować immobilizację białek komórek gospodarza lub składników pożywki, które w przeciwnym razie mogą zmniejszyć selektywność i pojemność żywicy. Włączenie znacznika polihistydyny do oczyszczania IMAC zwiększyło czystość do ~90% w jednym kroku, ułatwiając szybką i niedrogą produkcję ligandów ^5,43,44. Jednak położenie znacznika fuzyjnego jest ważne, ponieważ może ono sterycznie utrudniać wiązanie epitopu lub indukować rozszczepienie znacznika lub epitopu od nośnika^45,46.

Immobilizacja ligandu powinowactwa na kolumnach chromatograficznych aktywowanych przez NHS

Unieruchomienie przeprowadzano ręcznie lub przy użyciu systemu chromatograficznego. Małe objętości na kolumnę wydawały się sprzyjać ręcznej obsłudze (np. ze względu na minimalne objętości odpadów). Jeśli jednak potrzebnych jest wiele/większe kolumny, system chromatograficzny ułatwia kontrolowanie warunków sprzężenia (np. regulowane natężenia przepływu), a zatem ma większe szanse na osiągnięcie powtarzalnych wyników pod względem DBC. Nasze dane sugerują, że bufor sprzęgający i pH mają istotny wpływ na wydajność sprzęgania i ogólne koszty kolumny. Badanie przesiewowe czynników, które wpływają na reakcję sprzęgania i dostosowanie ich do każdego białka nośnikowego (lub nawet do każdej fuzji nośnik-ligand) może zatem poprawić wydajność sprzęgania i wydajność żywicy, a my zalecamy takie podejście.

Testowanie izolacji 2F5 przy użyciu żywicy o powinowactwie DFE

Wydajność i czystość produktu są ważnymi aspektami wydajności żywicy, a w przypadku DFE osiągnęliśmy wydajność 105 ± 11% (±SD, n=3) i czystość 97 ± 3% (±SD, n=3), co jest porównywalne z wydajnością wzorcowych żywic białkowych A^25,26. Innym kluczowym wskaźnikiem wydajności dla żywic w ogóle (a w szczególności dla tych opartych na ligandach powinowactwa) jest DBC przy 10% przełomie produktu, ponieważ parametr ten wpływa na ilość żywicy wymaganej do określonego procesu, a tym samym na koszty. Dla liganda DFE początkowe DBC wynosiło ~4 g·^L-1 żywicy, co stanowi ~13% odpowiedniej wartości dla białka A w podobnych warunkach (tylko 2 minuty czasu kontaktu)^25,47, ale około 15-krotnie wyższe w porównaniu z innymi niestandardowymi żywicami o powinowactwie, takimi jak ligand anty-FSH-immunoaffinity, przy tym samym czasie przebywania wynoszącym 2 min⁴⁸. DBC DFE spadło do 15% wartości początkowej po 25 cyklach wiązania i elucji, podczas gdy do tej samej utraty DBC w komercyjnych żywicach białkowych A^potrzeba więcej niż 50 cykli. Należy jednak zauważyć, że nasz nośnik nie został jeszcze zoptymalizowany w takim samym stopniu jak białko A, które zostało kompleksowo zbadane i ulepszone w ciągu ostatnich czterech dekad⁸.

Do tej pory poprawiliśmy stabilność żywicy i odzysk produktu poprzez przejście z buforu elucyjnego o niskim pH na wysokie stężenie chlorku magnezu (ryc. 3), zgodnie z zaleceniami we wcześniejszych badaniach¹³. Charakterystyczny czerwony kolor liganda powinowactwa nie wyblakł znacząco podczas 25 cykli wiązania i elucji, więc spekulujemy, że endogenne proteazy roślinne w oczyszczonych ekstraktach roślinnych³¹ mogły się skrócić, a tym samym dezaktywować epitop ligandu. Dlatego zaprojektowanie łączników odpornych na proteazy do połączenia nośnika i epitopu może pomóc w utrzymaniu początkowego DBC przez wydłużoną liczbę cykli. Biorąc pod uwagę szybką i prostą ekspresję i oczyszczanie liganda DFE, jego proste sprzężenie z dostępnymi na rynku żywicami chromatograficznymi oraz doskonałą wydajność i czystość produktu, uważamy, że nasza metoda stanowi odpowiednią alternatywę dla białka A do oczyszczania mAb i pochodnych przeciwciał, które nie wiążą się z białkiem A, zwłaszcza jeśli ulepszenia nośnika i łącznika mogą poprawić stabilność DBC i liganda. Założenie to zostało poparte niewielką różnicą w stałej dysocjacji przeciwciała 2F5 oczyszczonego z DFE i przeciwciała 2F5 oczyszczonego z białka A⁵, co wskazuje, że nasz nowy ligand powinowactwa umożliwia odzyskanie wysokiej jakości przeciwciał monoklonalnych.

Korzyści i obecne ograniczenia metody

Wytwarzanie ligandu powinowactwa jako fuzji genetycznej z białkiem nośnikowym zwiększa rozpuszczalność w wodnych, a tym samym zgodność z typowymi warunkami sprzęgania ligandów. Natomiast ślepe peptydy pochodzące z syntezy peptydów w fazie stałej mogą mieć ograniczoną rozpuszczalność w tych warunkach ze względu na ich sekwencję⁵⁰, której nie można zmienić, ponieważ jest podyktowana sekwencją aminokwasową epitopu rozpoznawanego przez mAb do oczyszczenia. Inni zastosowali zatem syntezę ligandów peptydowych na żywicy⁵¹. Statyczna zdolność wiązania otrzymanej żywicy była wysoka (~80 g·^L-1), ale proces przygotowania żywicy jest długotrwały, nie stwierdzono dynamicznej zdolności wiązania, a uzyskana czystość i odzysk były niższe niż w naszym podejściu. Dodatkową zaletą liganda białka fuzyjnego w skali laboratoryjnej jest to, że ligand i jego warianty mogą być szybko produkowane, oczyszczane i testowane przy minimalnym wysiłku w łatwym w użyciu systemie ekspresji o wysokiej zawartości⁵².

Dwa obecne ograniczenia przedstawionej tutaj metody to niska zdolność dynamicznego wiązania wynosząca 3 g·^L-1 i jej 90% redukcja w ciągu 25 cykli wiązania i elucji⁵. Ograniczenia te można rozwiązać w przyszłości, stosując mniej rygorystyczne warunki obciążenia i zastępując obecny nośnik DsRed odpowiednio zaprojektowanym, bardziej stabilnym wariantem. Na przykład, podwojenie obecnego czasu kontaktu z 2 do 4 minut może potencjalnie podwoić zdolność dynamicznego wiązania, jak wykazano w przypadku niektórych żywic białkowych A²⁶.

Rozwiązywanie problemów

Poniższa tabela przedstawia potencjalne problemy, które mogą wystąpić podczas korzystania z tego protokołu, oraz zawiera wskazówki, jak je rozwiązać (Tabela 1).

Tabela 1: Potencjalne problemy, które można napotkać, i możliwe rozwiązania.
Krok protokołu	Problem	Couse	Naprawiać
1	Rośliny nie rosną	Zagrożone warunki wzrostu	Sprawdź pH i przewodność nawozu
			Sprawdź temperaturę i warunki oświetleniowe
2 oraz 3	Po ekstrakcji obecne są duże ilości białek komórek gospodarza	Niepełne opady	Sprawdź temperaturę podczas blanszowania
			Sprawdź mieszanie w kąpieli blanszującej
2 oraz 3	W ekstrakcie roślinnym nie znaleziono produktu	Zbyt wysoka temperatura blanszowania	Sprawdzaj temperaturę i pH podczas blanszowania
		Zbyt niskie pH w buforze blanszującym
3	Po ekstrakcji pozostają duże części łodygi lub liści	Niepełne mieszanie w blenderze	Upewnij się, że materiał roślinny nie tworzy korka w blenderze
3	Szybki wzrost ciśnienia podczas filtracji wgłębnej	Nieprawidłowy wybór i/lub orientacja filtra	Sprawdź typ i orientację filtra
4	Mało białka fuzyjnego podczas elucji / dużo białka fuzyjnego w przepływie	Żywica IMAC nie była naładowana jonami metali	Sprawdź, czy żywica IMAC została prawidłowo naładowana jonami
		Białko fuzyjne utraciło znacznik powinowactwa	Unikaj intensywnego nasłonecznienia i wysokich temperatur podczas uprawy roślin
4	Białko fuzyjne utracone podczas koncentracji	Białko fuzyjne związane z błoną	Sprawdź typ membrany
			Upewnij się, że współczynnik stężenia nie był zbyt wysoki
5	Niska wydajność sprzęgła	Nieprawidłowa sekwencja dodawania odczynnika sprzęgającego	Sprawdź etykiety odczynników i kolejność dodawania
		Nieprawidłowe przygotowanie kolumn przed sprzęgnięciem	Sprawdź warunki przygotowania kolumny
5 oraz 6	Niska wydajność mAb	Niska ekspresja mAb w biomasie roślinnej	Badanie ekspresji mAb w biomasie
		Niska gęstość ligandów	Sprawdź czystość preparatu białka fuzyjnego
7	Bardzo niskie/wysokie stężenia białka w teście Bradforda	Powstawanie pęcherzyków powietrza podczas pipetowania	Sprawdź, czy w 96-dołkowej pale nie ma pęcherzyków
7	Niskie stężenie mAb podczas pomiaru SPR	Upośledzony chip białkowy A	Porównaj z wynikami wzorca mAb o znanym stężeniu
		Nieprawidłowe rozcieńczenie próbki	Sprawdzić stopień rozcieńczania i bufor

Tabela 1: Rozwiązywanie problemów.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wiadro 10 l/20 l nie			Sprzęt do blanszowania
2100P Przenośny mętnościomierz	Hach	4650000	Mętnościomierz
i Auml; KTApure	GE Helthcare	29018226	System chromatograficzny
Allegra 25R	Beckman Coulter	369434	Zestaw
sprzęgła aminowego	Healthcare	BR100050	SPR Zestaw sprzęgający chipy
Zestaw sprzęgający aminy	Healthcare	BR100050	SPR Zestaw sprzęgający chipy
Przeciwciało 2G12	Fraunhofer IME	nie dotyczy	Norma dla SPR kwantyfikacja
Blender	Waring	800EG	Blender
BP-410	Fuhr	2632410001	Filtr workowy
CanoScan 5600F	Canon	2925B009	Skaner
Probówka wirówkowa 50 ml wolnostojąca	Labomedic	1110504	Rurka reakcyjna
Chelatująca sefaroza FF	GE Helthcare	17-0575-01	Żywica chromatograficzna
Warunki 3320	WTW	EKA 3338	Konduktometr
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n/a	DoE software
Discovery Compfort	Gilson	F81029	Pipeta wielokanałowa
Fosforan disodowy	Carl Roth GmbH	4984.3	Komponent medialny
Różnorodne butelki	Schott Duran	n/a	Butelki
szklane Dri Block DB8	Techne	Z381373	Blok grzewczy
DsRed	Fraunhofe IME	n/a	Standart
EDTA	Carl Roth GmbH	8043.2	Składnik buforowy
EnSpire	Perkin Elmer	2390-0000	Czytnik płytek
ETHG-912	Oregon Scientific	086L001499-230	Termometr
F9-C	GE Helthcare	29027743	Kolektor frakcji
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Nawóz
Forma - Zamrażarka ULT 86C	ThermoFisher	88400	Zamrażarka
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Składnik buforowy
Wirówka Hettich Mikro 200	Wirówka	Hettich	2400
HiPrep 26/10	GE Helthcare	GE17-5087-01	Kolumna chromtograficzna
HiTrap Sepharose aktywowana przez NHS HP, 1 ml	GE Helthcare	17-0716-01	Chromatografia kolumny
Kwas solny	Carl Roth GmbH	4625.1	Składnik buforowy
Imidazol	Carl Roth GmbH	3899.2	Składnik buforowy
K700	Pall	5302305	Warstwa filtra wgłębnego
KM02 basic	IKA	n/a	Mieszadło magnetyczne
KS50P 60D	Pall	B12486	Warstwa filtra wgłębnego
L/S 24	Masterflex	SN-06508-24
Rurka Lauda E300	Lauda Dr Wobser GmbH	Z90010	Cyrkulator zanurzeniowy
Chlorek magnezu	Carl Roth GmbH	KK36.2	Element buforowy
Masterflex L/S	Masterflex	HV-77921-75	Pompa perystaltyczna
Minisart 0,2 i mikro; m	Sartorius	16534K	Jednostka filtrująca
Nalgene Rapid-Flow PES Filtr butelkowy	Thermo Fischer Scientific	595-4520	Filtracja próżniowa SPR
Siarczan niklu	Carl Roth GmbH	T111.1	Składnik buforowy
Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS żele	Invitrogen	NP0336BOX	LDS-PAA żele
Novex X-cell Mini Cell	Invitrogen	EI0001	Komora PAGE
NuPAGE 20x bufor do biegania	Invitrogen	NP0002	Koncentrat buforowy
NuPAGE przeciwutleniacz	Invitrogen	NP0005	Przeciwutleniacz
PageRuler drabinka białkowa (10-180 kDa)	Invitrogen	26616	Standard białkowy
Perforowany bez			blanszowania
PH 3110	WTW	Miernik pH 2AA110
PowerPac HC	Biorad	1645052	Moduł do elektroforezy
Białko A z Staphylococcus aureus	Sigma-Aldrich	P7837-5MG	Powlekanie chipów SPR
Sephadex G-25 drobny, usieciowany dekstran	GE Helthcare	17003301	Żywica chromatograficzna
Łyżka silikonowa	n/a	/d	Łyżka
Simply Blue SafeStain	Invitrogen	LC6060	Żelowy roztwór barwiący
Octan sodu	Carl Roth GmbH	6773.1	Składnik buforowy
Octan sodu	Carl Roth GmbH	X891.1	Składnik medialny
Azydek sodu	Sigma Aldrich	S2002-100G	Składnik medialny
Chlorek sodu	Carl Roth GmbH	P029.2	Składnik buforowy
Cytrynian sodu	Carl Roth GmbH	HN13.2	Składnik buforowy
Wodorosiarczyn sodu	Carl Roth GmbH	243973-100G	Składnik medialny
Fosforan sodu	Carl Roth GmbH	T877.2	Składnik medialny
Czujnik powinowactwa SPR - High Capacity Amine	Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics	Układ SPR-AS-HCA	SPR
SPR-2/4 Plazmon powierzchniowy Analizator rezonansu	Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics	brak	urządzenia SPR
SSM3	Stuart	10034264	Mini Gyro-rocker
Podgrzewane naczynie, 20 L	Clatronic	n/a	Komora blanszowania
Sterylne strzykawki, 2 ml	B. Braun	4606027V	Strzykawka
Adpter strzykawki (Union Luer F)	GE Helthcare	181112-51	Adapter strzykawki
TE6101	Sartorius	TE6101	Waga precyzyjna
Tween-20 (Polysorbate)	Merck	8170721000	Składnik buforowy
Jednorożec 6.4	GE Helthcare	29056102	Oprogramowanie chromatograficzne
Worki	próżniowe Ikea	203.392.84	Przechowywanie roślin
VelaPad 60	Pall	VP60G03KNH4	Obudowa
Vortex-Genie 2	Przemysł naukowy	SI-0236	Obudowa kolumny Vortex
XK-26/20	GE Helthcare	28-9889-48	Kolumna chromtograficzna