Chloroplasty to organelle definiujące rośliny1. Obok wielu innych funkcji metabolicznych, rozwojowych i sygnalizacyjnych, chloroplasty odpowiadają za fotosyntezę – proces, w którym energia słoneczna jest wykorzystywana do zasilania komórkowych aktywności życia. W związku z tym chloroplasty są niezbędne nie tylko dla roślin, ale także dla licznych ekosystemów zależnych od roślin oraz dla rolnictwa. Chloroplasty składają się z tysięcy różnych białek, z których większość jest kodowana w jądrach i importowana z cytosolu, zanim zostanie wewnętrznie skierowana do jednego z wyraźnie odrębnych przedziałów wewnątrznarządowych1. Aby uzyskać pełniejsze zrozumienie rozwoju i funkcji chloroplastów oraz umożliwić biotechnologiczne strategie związane z manipulacją chloroplastami, które odpowiadają na globalne wyzwania związane z bezpieczeństwem żywnościowym lub bioenergią, konieczne będzie określenie celowania, lokalizacji i interakcji ważnych białek chloroplastów. Ta kolekcja metod opisuje zestaw krytycznie ważnych i uzupełniających się technik, które mogą być użyte do realizacji tych celów. Kolekcja koncentruje się głównie na szeroko stosowanej roślinie modelowej Arabidopsis thaliana (rzeżucha thale), ale metody te mogą być również adaptowane i stosowane do innych organizmów.
Zbiór zawiera opisy dwóch różnych technik analizy importu białek zakodowanych przez jądro do chloroplastów przez podwójną błonę. Artykuł autorstwa Ling i Jarvis2 opisuje metodę in vitro, w której izolowane chloroplasty są inkubowane z radioaktywnie znakowanym białkiem prekursorowym. Stopień, w jakim chloroplasty pobierają białko prekursorowe, określa się poprzez monitorowanie zmiany rozmiaru białka w wyniku rozszczepienia peptydów transytowych (celujących w sekwencję lidera), przy użyciu SDS-PAGE i obrazowania fosforowego. Przedstawiona metoda jest rozwinięciem podejścia, które od kilku dekad jest stosowane do badania importu białka chloroplastowego in vitro(3,4), i zawiera dodatkowe kroki umożliwiające ocenę reakcji urządzeń importowych na warunki stresowe doświadczane przez roślinę5. Z kolei artykuł autorstwa Lee i in.6 opisuje metodę in vivo opartą na przejściowej ekspresji chimerycznego białka prekursorowego, niosącego domenę fluorescencyjną, w nienaruszonych komórkach (protoplastach). W tym badaniu zakres importu białka chloroplastowego można śledzić na dwa sposoby: monitorując lokalizację i intensywność sygnału fluorescencyjnego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej; oraz analizując zmianę rozmiaru białka zachodzącą w wyniku rozszczepienia peptydów tranzytowych za pomocą immunoblottingu. Te dwie metody są bardzo komplementarne i mogą przynieść przekonujące rezultaty, gdy są stosowane równolegle5.
Po zaimportowaniu białka przez otoczkę do chloroplastu i usunięciu jego peptydu tranzytowego, może ono przyjąć swoją ostateczną konformację w stromie (głównym wewnętrznym wodnym przedziale organelli) lub uruchomić jeden z kilku wewnętrznych szlaków sortujących1. Jako miejsce bardzo licznych kompleksów fotosyntetycznych, błony tylakoidalne są głównym celem takiego wewnętrznego sortowania; W rzeczywistości celowanie w białko thylakoid obejmuje wiele mechanistycznie odrębnych szlaków. Artykuł autorstwa Ashera i in.7 opisuje szereg metod in vitro, które umożliwiają badanie różnych szlaków translokacji białek tarczakowych. Metody te polegają na inkubacji izolowanych tylakoidów z radioaktywnie znakowanym białkiem prekursorowym oraz, w niektórych przypadkach, z koncentrowanym ekstraktem stromalnym. Stopień, w jakim białko jest pobierane przez tylakoidy, jest monitorowany poprzez ocenę rozszczepienia sygnału docelowego oraz ochronę białka przed egzogennie aplikowaną termolizyną, przy użyciu SDS-PAGE i obrazowania fosforowego. Oczywiście tylakoidy nie są jedynym podprzedziałem chloroplastu i często pożądane jest posiadanie możliwości oceny innych przedziałów. W tym kontekście szczególnie ważny jest artykuł Bouchnaka i in.8 , ponieważ opisuje metody subfrakcjonacji chloroplastów w celu uzyskania wysokoczystych próbek odpowiadających błonom otoczkowym, stromom i tylakoidom. Po przygotowaniu frakcje te mogą być analizowane za pomocą immunoblottingu i/lub spektrometrii masowej, aby dostarczyć bogatych informacji na temat suborganellarnej lokalizacji białek chloroplastów9.
W odniesieniu do analizy interakcji białko-białko oraz zespołów kompleksów wielobiałkowych, w zbiorze opisane są dwie różne metodologie. Artykuł autorstwa Shanmugabalaji i in.10 przedstawia metodę oczyszczania powinowactwa wielobiałkowych kompleksów chloroplastów. Technika ta polega na analizie roślin transgenicznych wyrażających komponent interesującego kompleksu, który został zaprojektowany tak, aby nosił tag powinowactwa (tzw. tag oczyszczania powinowactwa tandemowego, czyli TAP). Zdolność tego tagu do silnego wiązania się z macierzą intymną jest wykorzystywana jako część strategii oczyszczania. Przedstawiona metoda koncentruje się szczególnie na oczyszczaniu mechanizmu importu białek chloroplastowych (obejmuje to kompleksy wielobiałkowe zwane TOC i TIC osadzone w błonach otoczkowych1), ale w zasadzie może być dostosowana do badania dowolnego z innych zespołów wielobiałkowych występujących w chloroplastach11. Artykuł autorstwa Rantala i in.12 opisuje uzupełniające podejście do charakteryzacji złożonej oparte na elektroforezie w warunkach natywnych. Technika ta, przedstawiona tutaj, polega na uwalnianiu kompleksów fotosyntetycznych z oczyszczonych tylakoidów przy użyciu łagodnego, niejonowego detergentu, a następnie ich rozdzielaniu za pomocą niebieskiego (BN)-PAGE. Pierwotna rozdzielczość kompleksów może być następowana przez drugi wymiar elektroforezy w warunkach denaturacji, co umożliwia wizualizację poszczególnych składników każdego kompleksu zidentyfikowanych w pierwszym wymiarze. Podobnie jak w metodzie TAP, to natywne podejście PAGE można z powodzeniem zaadaptować do badania innych kompleksów białkowych w organellu13,14. W obu przypadkach oczyszczone kompleksy można analizować na różne sposoby, w tym za pomocą immunoblotingu i spektrometrii mas.
Razem artykuły zawarte w tej kolekcji metod stanowią potężny zestaw technik uzupełniających, które w połączeniu z istniejącymi zasobami15,16 mogą znacznie pogłębić nasze zrozumienie różnych aspektów biogenezy i funkcji chloroplastów, szczególnie tych ściśle związanych z proteomem organellarnym. Ponieważ chloroplasty odpowiadają za większość naziemnej produkcji fotosyntetycznej, a ponadto odgrywają kluczową rolę w reakcjach roślin na środowisko (w tym zarówno na stresy biotyczne, jak i abiotyczne), te niezwykłe organelle nieuchronnie pozostaną głównym obszarem badań podstawowych i stosowanych na całym świecie przez wiele lat.