Ten artykuł demonstruje model do badania przebudowy serca po kriouszkodzeniu mięśnia sercowego u myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Model kriouszkodzeń do badania zawału mięśnia sercowego u myszy
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wykorzystanie modeli zwierzęcych jest niezbędne do opracowania nowych strategii terapeutycznych dla ostrego zespołu wieńcowego i jego powikłań. W tym artykule przedstawiamy mysi model zawału kriouszkodzenia, który generuje precyzyjne rozmiary zawałów o wysokiej odtwarzalności i powtarzalności. Krótko mówiąc, po intubacji i sternotomii zwierzęcia serce jest unoszone z klatki piersiowej. Sonda ręcznego systemu dostarczania ciekłego azotu jest nakładana na ścianę mięśnia sercowego w celu wywołania kriouszkodzenia. Upośledzoną czynność komór i przewodnictwo elektryczne można monitorować za pomocą echokardiografii lub mapowania optycznego. Przezścienna przebudowa mięśnia sercowego okolicy zawału charakteryzuje się odkładaniem kolagenu i utratą kardiomiocytów. W porównaniu z innymi modelami (np. ligacją LAD), ten model wykorzystuje ręczny system dostarczania ciekłego azotu do generowania bardziej jednolitych rozmiarów zawału.
Wprowadzenie
Ostra choroba wieńcowa (ACS) jest główną przyczyną zgonów w świecie zachodnim1,2. Ostra niedrożność tętnic wieńcowych prowadzi do aktywacji kaskady niedokrwiennej i martwicy dotkniętej chorobą tkanki serca3. Uszkodzony mięsień sercowy jest stopniowo zastępowany przez niekurczliwą tkankę bliznowatą, która objawia się klinicznie niewydolnością serca4,5. Pomimo ostatnich postępów w leczeniu OZW, częstość występowania OZW i niewydolności serca związanej z OZW rośnie, a możliwości terapeutyczne są ograniczone6,7. W związku z tym opracowanie modeli zwierzęcych do badania OZW i jego powikłań cieszy się ogromnym zainteresowaniem.
Do tej pory najczęściej używanym modelem zwierzęcym do badania ACS i indukowanej przez ACS przebudowy mięśnia sercowego jest podwiązanie lewej zstępującej tętnicy wieńcowej (LAD). Podwiązanie LAD prowadzi do ostrego niedokrwienia mięśnia sercowego, podobnie jak w ludzkiej tkance mięśnia sercowego podczas OZW. Jednak niespójne rozmiary zawałów pozostają piętą achillesową podwiązania LAD. Zmienność chirurgiczna i zmienność anatomiczna LAD prowadzą do niespójnych rozmiarów zawałów i utrudniają odtwarzalność i powtarzalność tej procedury8,9,10. Ponadto podwiązanie LAD ma wysoką śmiertelność śród- i pooperacyjną. Pomimo ostatnich wysiłków mających na celu poprawę odtwarzalności i zmniejszenie śmiertelności11,12, nadal potrzebna jest duża liczba zwierząt, aby prawidłowo ocenić terapie zapobiegające przebudowie.
Alternatywne modele ACS zostały zaproponowane i zbadane w ostatnich latach, w tym częstotliwość radiowa13, thermal14 lub urazy kriogeniczne15,16,17,18. Obecne metody kriouszkodzeń polegają na zastosowaniu metalowego pręta wstępnie schłodzonego w ciekłym azocie w celu uszkodzenia tkanki serca pacjenta15,16. Jednak tę procedurę należy powtórzyć kilka razy, aby wygenerować wystarczający rozmiar zawału. Ze względu na wysoką przewodność i niską pojemność cieplną pręta w porównaniu z tkanką, sonda szybko się nagrzewa, a tkanka jest chłodzona (a tym samym zawałowa) niejednorodnie. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opisujemy tutaj model kriozawału wykorzystujący ręczny system dostarczania ciekłego azotu. Model ten jest powtarzalny, łatwy do wykonania i można go szybko i niezawodnie ustanowić. Powstaje powtarzalna zmiana przezścienna zawału niezależnie od anatomii naczyń wieńcowych, co ostatecznie prowadzi do niewydolności serca. Metoda ta jest szczególnie przydatna do badania procesu przebudowy w celu oceny nowych strategii terapeutycznych, farmakologicznych i opartych na inżynierii tkankowej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Zwierzęta otrzymały humanitarną opiekę zgodnie z Przewodnikiem po zasadach postępowania ze zwierzętami laboratoryjnymi, przygotowanym przez Instytut Zasobów Zwierząt Laboratoryjnych i opublikowanym przez National Institutes of Health. Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez odpowiedzialne władze lokalne (Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Francisco (UCSF)).
1. Opieka nad zwierzętami
- Otrzymać myszy w wieku 14 tygodni o wadze około 27 g (np. z Instytutu Zwierząt Laboratoryjnych).
UWAGA: W tym artykule używane są myszy BALB/c. - Trzymaj myszy w konwencjonalnych warunkach w wentylowanych szafkach, karmiąc je standardową karmą dla myszy i autoklawowaną wodą ad libitum.
2. Przygotowanie myszy
- Użyj komory indukcyjnej, aby znieczulić mysz izofluranem (3,5%).
- Usuń włosy na klatce piersiowej i szyi za pomocą trymera do włosów.
- Umieść mysz w pozycji leżącej na podgrzewanej podkładce i utrzymuj znieczulenie za pomocą maski zakrywającej usta i nos myszy.
- Sprawdź, czy znieczulenie jest wystarczająco głębokie, ściskając tylne łapy i ogon, aby zweryfikować brak odruchów.
- Wstrzyknąć podskórnie buprenorfinę (0,03 mg/kg) w celu znieczulenia.
- Rozłóż tylne i przednie kończyny i ustal ich pozycję za pomocą taśmy.
- Za pomocą jodu powidonu zdezynfekuj ogolony obszar, a następnie szoruj 80% etanolem. Powtórz ten krok dwukrotnie.
- Użyj małych nożyczek, aby wykonać nacięcie skóry w linii środkowej od dolnej jednej trzeciej mostka do podbródka.
- Użyj zakrzywionych kleszczy i ostrożnie oddziel mięśnie wokół szyi, aby odsłonić tchawicę.
- Użyj mikronożyczek, aby wykonać tracheotomię między drugim a trzecim pierścieniem chrząstki.
- Ustaw wentylator na częstotliwość wentylacji 110/min z objętością oddechową 0,5 ml.
- Zdejmij maskę na twarz i włóż plastikową kaniulę (20 G), podłączoną do respiratora, do tchawicy. Przewietrzyć zwierzę.
UWAGA: Upewnij się, że kaniula wentylacyjna nie jest włożona zbyt głęboko, potwierdzając obustronną wentylację płuc. - Użyj kauteryzacji, aby odłączyć prawy mięsień piersiowy od jego mostka między trzecim a siódmym żebrem.
- Użyj bocznych skośnych nożyczek sprężynowych, aby przyciąć czwarte do szóstego żebra jak najbliżej mostka.
- Kauteryzuj tętnicę sutkową, jeśli widoczne jest krwawienie.
- Zmniejszyć izofluran do 2,5%.
- Przeanalizuj leżącą pod spodem tkankę łączną, aby uzyskać wyraźny widok do jamy klatki piersiowej.
- Użyj kleszczy, aby otworzyć osierdzie i odsłonić serce.
- Użyj mini retraktora Goldsteina, aby rozłożyć żebra i utrzymać otwartą jamę klatki piersiowej.
- Podnieś serce z jamy klatki piersiowej za pomocą pręta.
- Zmniejsz napięcie retraktora, aby zmniejszyć otwarcie klatki piersiowej i zapobiec cofaniu się serca.
- Schłodzić kriosondę (o średnicy 3 mm) przez 10 s.
- Zastosuj kriosondę na przedniej ścianie lewej komory i zamroź na 10 sekund, aby wytworzyć zawał kriouszkodzenia lewej komory.
UWAGA: Kriosonda może być stosowana do różnych ścian serca w zależności od pytania naukowego i potrzeby. - Przepłukać kriosondę solą fizjologiczną o temperaturze pokojowej, aby odłączyć sondę od ściany lewej komory.
- Użyj zwijacza, aby powiększyć otwór klatki piersiowej.
- Delikatnie przywróć serce do jamy klatki piersiowej za pomocą pręta.
- Usuń retraktor i połącz sternotomię pojedynczym węzłem za pomocą szwu 6-0.
- Zamknij jamę klatki piersiowej za pomocą szwu biegowego 6-0. Użyj strzykawki o pojemności 10 ml, aby usunąć resztki powietrza z klatki piersiowej przed zawiązaniem węzła.
- Dostosuj skórę na krawędzi ogona i zszyj ją do punktu ujścia tchawicy za pomocą szwu biegnącego (5-0).
- Ustaw izofluran na 1,5% i poczekaj, aż zwierzę zacznie spontanicznie oddychać.
- Usuń cewnik dotchawiczy i ponownie nałóż maskę na usta i nos zwierzęcia, aby utrzymać znieczulenie.
- Zamknij nacięcie tchawicy jednym 8-0 szew.
- Ustaw brzuszne mięśnie szyi z powrotem na ich pozycję, aby zakryć tchawicę.
- Wykonaj szew skórny.
- Dodaj metamizol do wody pitnej (50 mg metamizolu na 100 ml) w celu złagodzenia bólu przez 3 dni i codziennie monitoruj zwierzę.
UWAGA: Okres obserwacji dla tego modelu wynosi 8 tygodni. Pamiętaj, aby postępować zgodnie z wytycznymi swojej instytucji dotyczącymi schematu leczenia przeciwbólowego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Model zawału spowodowanego kriozabiegiem jest odpowiedni do badania ZWA i jego powikłań. W tym modelu obserwuje się niskie współczynniki śmiertelności oraz skuteczne powrotne procesy rekonwalescencji po zabiegu chirurgicznym. Uszkodzenie mięśnia sercowego wywołane kriozabiegiem prowadzi do obniżenia funkcji serca, rozprzęgania elektrycznego oraz przebijającego procesu przebudowy mięśnia.
Echokardiografię można wykorzystać do nieinwazyjnego monitorowania funkcji serca in vivo. W sercach uszkodz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym artykule opisano model kriouszkodzeń myszy w celu zbadania OZW i powiązanych opcji farmakologicznych i terapeutycznych.
Najważniejszym krokiem jest zastosowanie kriosondy na tkance serca. Czas kontaktu musi być ściśle kontrolowany, aby uzyskać optymalny rozmiar zawału i zagwarantować powtarzalne wyniki. Długotrwałe chłodzenie mięśnia sercowego doprowadzi do przerośniętych zawałów lub perforacji komór. Natomiast skrócony czas chłodzenia generuje ograniczone zmiany nasierdziowe i nie elimi...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Christiane Pahrmann za jej pomoc techniczną. D.W. była wspierana przez Fundację Maxa Kade'a. T.D. otrzymała granty od Fundacji Else Kröner (2012_EKES.04) i Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE2133/2-1_. S. S. otrzymała granty badawcze od Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SCHR992/3- 1, SCHR992/4-1).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10 ml Strzykawka | Thermo Scientific | 03-377-23 | |
| 5-0 szew prolenowy | Ethicon | EH7229H | |
| 6-0 szew prolenowy | Ethicon | 8706H | |
| 8-0 Szew etylon | Ethicon | 2808G | |
| Absorpcja Spears | Fine Science Tools | 18105-01 | |
| BALB/c | Laboratorium Jacksona | Numer katalogowy 000651 | |
| Bepanthen Maść do oczu i nosa | Bayer | 1578675 | Maść do oczu |
| Betadine Solution | Betadine Purdue Pharma | NDC: 67618-152 | |
| kleszcze | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | Kody NDC: 12496-0757-1, 12496-0757-5 | buprenorfiny |
| 3mm | Systemy kriogeniczne Brymill | Cry-AC-3 B-800 | |
| Etanol 70% | Th. Geyer | 2270 | |
| Kleszcze zakrzywione | S& T | 00284 | |
| Kleszcze drobne | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Kleszcze standardowe | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| Sonda anatomiczna brutto | Fine Science Tools | 10088-15 | |
| Maszynka do strzyżenia włosów | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| Zestaw do kauteryzacji wysokotemperaturowej | Bovie | 18010-00 | |
| ISOFLURANE | Henry Schein Zdrowie zwierząt | 029405 | |
| Cewnik dożylny 20G | B. Braun | 603028 | |
| Mini-Goldstein Retraktor | Fine Science Tools | 17002-02 | |
| NaCl 0,9% | B.Braun | PZN 06063042 Sztuka. Nr.: 3570160 | sól fizjologiczna |
| Uchwyt na igłę | Fine Science Tools | 12075-14 | |
| Uchwyt na igłę, zakrzywiony | aparat Harvarda | 72-0146 | |
| Novaminsulfon | Ratiopharm | PZN 03530402 | Tablica operacyjna Metamizolu |
| Braintree Scientific | 39OP | ||
| cienką końcówką | Bovie | H101 | |
| Fine Science Tools | 14028-10 | ||
| Wentylator dla małych zwierząt | Scientific | RV-01 | |
| Nożyczki sprężynowe - kątowe na bok | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Mikroskop chirurgiczny | Leica | M651 | |
| Transpore Taśma chirurgiczna | 3M | 1527-1 | |
| Vannas Nożyczki sprężynowe | Narzędzia do nauki | 15400-12 | |
| Waporyzator | Kent Scientific | VetFlo-1205S |
Bibliografia
- Writing Group. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 38-360 (2016).
- de Alencar Neto, J. N. Morphine, Oxygen, Nitrates, and Mortality Reducing Pharmacological Treatment for Acute Coronary Syndrome: An Evidence-based Review. Cureus. 10 (1), 2114(2018).
- Detry, J. M. The pathophysiology of myocardial ischaemia. European Heart Journal. 17, Suppl G 48-52 (1996).
- Ertl, G., Frantz, S. Healing after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 66 (1), 22-32 (2005).
- Jugdutt, B. I. Ventricular remodeling after infarction and the extracellular collagen matrix: when is enough enough. Circulation. 108 (11), 1395-1403 (2003).
- Velagaleti, R. S., Vasan, R. S. Heart failure in the twenty-first century: is it a coronary artery disease or hypertension problem. Cardiology Clinics. 25 (4), 487-495 (2007).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135 (10), 146-603 (2017).
- Morrissey, P. J., et al. A novel method of standardized myocardial infarction in aged rabbits. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (5), 959-967 (2017).
- Degabriele, N. M., et al. Critical appraisal of the mouse model of myocardial infarction. Experimental Physiology. 89 (4), 497-505 (2004).
- Chen, J., Ceholski, D. K., Liang, L., Fish, K., Hajjar, R. J. Variability in coronary artery anatomy affects consistency of cardiac damage after myocardial infarction in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 313 (2), 275-282 (2017).
- Reichert, K., et al. Murine Left Anterior Descending (LAD) Coronary Artery Ligation: An Improved and Simplified Model for Myocardial Infarction. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (122), e55353(2017).
- Kim, S. C., et al. A murine closed-chest model of myocardial ischemia and reperfusion. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (65), e3896(2012).
- Antonio, E. L., et al. Left ventricle radio-frequency ablation in the rat: a new model of heart failure due to myocardial infarction homogeneous in size and low in mortality. J Card Fail. 15 (6), 540-548 (2009).
- Ovsepyan, A. A., et al. Modeling myocardial infarction in mice: methodology, monitoring, pathomorphology. Acta Naturae. 3 (1), 107-115 (2011).
- Ciulla, M. M., et al. Left ventricular remodeling after experimental myocardial cryoinjury in rats. Journal of Surgical Research. 116 (1), 91-97 (2004).
- Grisel, P., et al. The MRL mouse repairs both cryogenic and ischemic myocardial infarcts with scar. Cardiovascular Pathology. 17 (1), 14-22 (2008).
- Duerr, G. D., et al. Comparison of myocardial remodeling between cryoinfarction and reperfused infarction in mice. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 961298(2011).
- Ma, N., et al. Intramyocardial delivery of human CD133+ cells in a SCID mouse cryoinjury model: Bone marrow vs. cord blood-derived cells. Cardiovascular Research. 71 (1), 158-169 (2006).
- Takagawa, J., et al. Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches. Journal of Applied Physiology (1985). 102 (6), 2104-2111 (2007).
- van den Bos, E. J., Mees, B. M., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (3), 1291-1300 (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
