Artykuł metodologiczny

Ekstrakcja kortyzolu z matryc płetw jesiotra i szczęk

7.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59961

⸱

10 września 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Animal Life Sciences, Kangwon National University, 2Team of An Educational Program for Specialists in Global Animal Science, Brain Korea 21 Plus Project, Konkuk University, 3Persian Gesture, 4Department of Animal Science and Technology, College of Animal Bioscience and Technology, Konkuk University, 5Department of Animal Science, Animal Physiology, AgResearch, 6Faculty of Agriculture, Animal Science Department, Ferdowsi University of Mashhad

W tym artykule

Podsumowanie

W tym badaniu prezentujemy protokół ekstrakcji kortyzolu z płetwy i szczęki jesiotra. Poziom kortyzolu w płetwach i szczękach badano dalej, porównując dwa rozpuszczalniki do mycia, a następnie testy ELISA. W ramach tego badania pilotażowo sprawdzono wykonalność kortyzolu w kości szczęki jako nowego wskaźnika stresu.

Streszczenie

Celem tego badania było opracowanie techniki ekstrakcji kortyzolu z płetw jesiotra za pomocą dwóch rozpuszczalników myjących (wody i izopropanolu) oraz ilościowe określenie wszelkich różnic w poziomach kortyzolu między trzema głównymi gatunkami jesiotrów. Płetwy zebrano z 19 ofiarowanych jesiotrów, w tym siedmiu bieługi (Huso huso), siedmiu syberyjskich (Acipenser baerii) i pięciu sevruga (A. stellatus). Jesiotry były hodowane w irańskich gospodarstwach przez 2 lata (2017-2018), a analizę ekstrakcji kortyzolu przeprowadzono w Korei Południowej (styczeń-luty 2019 r.). Kości szczęki pięciu H. huso wykorzystano również do ekstrakcji kortyzolu. Dane analizowano przy użyciu procedury ogólnego modelu liniowego (GLM) w środowisku SAS. Współczynniki zmienności wewnątrz i między testami wynosiły odpowiednio 14,15 i 7,70. Krótko mówiąc, technika ekstrakcji kortyzolu obejmowała dwukrotne przemycie próbek (300 ± 10 mg) 3 ml rozpuszczalnika (woda ultraczysta i izopropanol), obracanie z prędkością 80 obr./min przez 2,5 min, suszenie umytych próbek na powietrzu w temperaturze pokojowej (22-28 °C) przez 7 dni, dalsze suszenie próbek za pomocą ubijaka do kulek przy 50 Hz przez 32 minuty i mielenie ich na proszek, nałożenie 1,5 ml metanolu na wysuszony proszek (75 ± 5 mg) i powolne obroty (40 obr./min) przez 18 godzin w temperaturze pokojowej z ciągłym mieszaniem. Po ekstrakcji próbki odwirowano (9 500 x g przez 10 minut), a 1 ml supernatantu przeniesiono do nowej probówki do mikrowirówki (1,5 ml), inkubowano w temperaturze 38 °C w celu odparowania metanolu i analizowano za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA). Nie zaobserwowano różnic w poziomie kortyzolu w płetwach między gatunkami ani w poziomach kortyzolu w płetwach i szczękach między rozpuszczalnikami do prania. Wyniki tego badania pokazują, że macierz kości szczęki jesiotra jest obiecującym alternatywnym wskaźnikiem stresu dla matryc stałych.

Wprowadzenie

Kortyzol jest wiarygodnym wskaźnikiem stresu zwierząt. Ekstrakcja kortyzolu stanowi ważne ramy dla badaczy do monitorowania poziomu stresu i ogólnych wzorców stresorów. Na przykład w poprzednich badaniach przeprowadzono metodologiczną walidację pomiarów kortyzolu we włosach przy użyciu różnych metod u ludzi1,2, monkeys3,4, cattle5, sheep6 i goldfish7,8. Wykazano, że pomiary kortyzolu w matrycach takich jak łuski, śluz skórny, kał i krew9 dostarczają informacji o zdrowiu ryb. Gdy pobieranie krwi jest problematyczne lub brakuje łusek, potrzebne są alternatywne matryce do ekstrakcji kortyzolu. U ryb alternatywne matryce mogą obejmować kość szczęki, twardą tkankę podobną do ludzkiego zęba10.

Rozwój nowych matryc i sprawdzonych technik określania poziomów stresu ryb jest szczególnie interesujący dla przemysłu kawiorowego, gdzie jesiotry mogą doświadczać długotrwałej ekspozycji na czynniki stresu środowiskowego11. Płci jesiotra nie można określić przed ukończeniem 2 roku życia, a jesiotry nie mają łusek. Ponieważ kortyzol stopniowo gromadzi się w stałych matrycach na etapie wzrostu2,7,12, długoterminowe dane dotyczące akumulacji kortyzolu z twardych matryc, takich jak płetwy i kości szczęki, mogą dostarczyć wglądu w poziomy stresu na różnych etapach wzrostu. W przeciwieństwie do tego, poziom kortyzolu we krwi zapewnia migawkę poziomu stresu w momencie śmierci i nie może dokładnie reprezentować stresu podczas długotrwałych warunków chowu13,14. Wraz z rosnącą konkurencją na rynku kawioru, coraz ważniejszym obszarem badań stają się nowe podejścia mające na celu poprawę warunków stresowych w produkcji zdrowszych jaj wśród gatunków jesiotrów podczas długotrwałego chowu (8-12 lat lub dłużej). Ze względu na wysoki koszt jesiotra, zebrane próbki są niezwykle kosztowne (8 000-15 000 USD za dojrzałą rybę w zależności od gatunku i etapu wzrostu), co jest czynnikiem ograniczającym projekty badawcze. Jednak opracowanie odpowiedniej techniki ekstrakcji kortyzolu z płetw i szczęk jesiotra może być z pożytkiem zastosowane zarówno w systemach hodowli ryb, jak i w przypadku ryb dziko żyjących, w celu poprawy jakości i odłowu ikry jesiotra zarówno do celów konsumpcyjnych, jak i konserwatorskich.

Oprócz dostarczania wiarygodnych wyników6, wybór odpowiedniej techniki ekstrakcji kortyzolu ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że inne związki obecne w matrycy podczas przygotowywania próbki nie zaciemniają wyniku, co może prowadzić do niespójnych wyników. Równie ważne jest ustalenie, czy poziom kortyzolu w płetwach i szczękach ma wpływ na poziom hormonów w otaczającej wodzie. Heimbürge et al.15 zasugerowali, że na poziom kortyzolu może wpływać wiele czynników, w tym wiek, płeć, ciąża, pora roku, kolor12 oraz region ciała, z którego ekstrahowany jest kortyzol16. Dostępnych jest jednak niewiele informacji na temat wpływu rozpuszczalników myjących na ekstrakcję kortyzolu w matrycach ciała ryb8, a brak informacji na temat tych skutków u jesiotra, z wyjątkiem jaj jesiotra17.

Chociaż analiza wyjściowego poziomu kortyzolu z płetw i kości szczęk jesiotra wymaga eutanazji ryb, to podejście nie pociąga za sobą technik inwazyjnych wymaganych do pobierania próbek krwi u żywych jesiotrów. Próbki płetw i kości szczęki można łatwo pobrać, a ekstrakcję z tych tkanek można przeprowadzić szybko. Podobnie, ekstrakcja i analiza hormonów są proste i wymagają niewielkiego specjalistycznego sprzętu.

W tym badaniu prezentujemy nową i łatwą do zastosowania technikę ekstrakcji, płukania i oznaczania kortyzolu z płetw i kości szczękowych ryb, w celu określenia, czy poziomy kortyzolu mierzone z tych matryc mogą być wiarygodnie używane jako wskaźniki stresu. Zalety tej techniki to łatwe i nieinwazyjne podejście 8, mniejsza zmienność danych i niezawodne wyjście1,6,8,17; Technika ta ma zastosowanie do gatunków ryb bez łusek, takich jak jesiotr. Technika ta wymaga uboju ryb, doboru odpowiednich rozpuszczalników myjących2,4, odpowiedniego mielenia próbek3,5, profesjonalnego testu immunoenzymatycznego (ELISA) application5,7, oraz rozległej wiedzy na temat włączania źródeł kortyzolu do matryc stałych6.

Użyliśmy dwóch różnych rozpuszczalników myjących (ultraczysta woda i izopropanol), aby uzyskać podstawowy poziom kortyzolu w płetwach trzech gatunków jesiotrów: bieługi (Huso huso), syberyjskiego (Acipenser baerii) i sevrugi (A. stellatus), w standardowych warunkach środowiskowych dla każdego gatunku. Kości szczęki H. huso wykorzystano również do oceny stresu u jesiotra. Jest to pierwsze badanie mierzące poziom kortyzolu w kościach szczęk jesiotra. Wyniki tego badania dostarczą danych porównawczych dotyczących kortyzolu dla gatunków jesiotrów we wczesnej fazie wzrostu (~1 rok) przed określeniem płci.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Następujące procedury i metody eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Urząd ds. Dobrostanu i Etyki Zwierząt Kangwon National University, Chuncheon, Republika Korei.

1. Kolekcja płetw

  1. Łatwuj jesiotra delikatnie za pomocą siatki, aby zminimalizować obrażenia i stres.
  2. Przed eutanazją dokładnie opłucz rybę świeżą wodą, a następnie wytrzyj powierzchnię ciała chłonnym ręcznikiem.
  3. Uderz w głowę ryby plastikowym młotkiem, tak aby ryba została ogłuszona lub straciła przytomność. Zdejmij głowę za pomocą noża.
  4. Zmierz masę ciała (g) i długość (cm).
  5. Po eutanazji należy pobrać próbki płetw, tnąc je jak najbliżej ciała za pomocą wysterylizowanych nożyczek chirurgicznych.
    UWAGA: Dla każdej ryby należy używać indywidualnych, niepochodzących z recyklingu chłonnych ręczników. Dane opisowe dla gatunków wykorzystanych w tym badaniu były następujące: jesiotr bieługa (H. huso): wiek = 18 ± 2,1 miesiąca, masa ciała = 2 700 ± 300 g, długość ciała = 55 ± 5 cm; Jesiotr syberyjski (A. baerii): wiek = 9,6 ± 2,4 miesiąca, masa ciała = 1 750 ± 250 g, długość ciała = 45 ± 5 cm; jesiotr sevruga (A. stellatus): wiek = 14 ± 1,3 miesiąca, masa ciała = 1 000 ± 100 g, długość ciała = 65 ± 5 cm.

2. Przygotowanie płetwy do ekstrakcji kortyzolu

  1. Umieścić próbki żeber (jedna próbka na tkankę: ~3 g) na papierze do ważenia laboratoryjnego (107 mm × 210 mm) i suszyć w temperaturze pokojowej przez kilka dni do wyschnięcia.
  2. Zawiń próbki w arkusze folii aluminiowej, umieść w oznakowanych plastikowych torbach i przenieś do laboratorium.
  3. Przechowuj próbki w lodówce do dalszego wykorzystania, w tym mycia, ekstrakcji kortyzolu, suszenia i analizy ELISA (Rysunek 2).

3. Analiza kortyzolu w płetwach

  1. Skalibruj cyfrową wagę analityczną (dokładność: 0,0001) i odważ próbki od 300 ± 10 mg za pomocą papieru do ważenia na szalce wagi.
  2. Umyć próbki.
    1. Przenieść każdą próbkę do stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 15 l. Dodaj 3 ml izopropanolu do każdej probówki za pomocą pipety jednokanałowej o pojemności 5 000 μl.
    2. Obracaj rurki z prędkością 80 obr./min przez 2.5 minuty, aby wypłukać kortyzol i usunąć wszelkie potencjalne zanieczyszczenia zewnętrzne. Powtórz tę procedurę dwukrotnie.
    3. Umyte próbki należy suszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej (22–28 °C) przez 7 dni.
    4. Powtórz procedurę prania, używając ultraczystej wody jako środka piorącego.
  3. Wyciągnij kość szczęki z tkanki ciała za pomocą kleszczy do cięcia kości. Zastosować kroki 1.5-3.2.4 do próbek kości szczęki.
  4. Odważyć (75 ± 5 mg) wysuszone próbki żeber lub szczęk i żuchwy i mielić za pomocą ubijaka do kulek o częstotliwości 50 Hz przez 32 minuty.
    1. Dostarczyć 1,5 ml metanolu do każdej probówki zawierającej sproszkowaną płetwę lub szczękę za pomocą pipety o pojemności 1000 μl. Umieścić próbki na rotatorze probówkowym przy wolnych obrotach (40 obr./min) przez 18 godzin w temperaturze pokojowej w celu ekstrakcji kortyzolu z ciągłym mieszaniem.
  5. Po ekstrakcji kortyzolu odwirować próbki o masie 9 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu zebrać górną warstwę organiczną zawierającą kortyzol (1 ml) z każdej próbki i umieścić ją w oddzielnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    1. Wysuszyć próbki przez inkubację w temperaturze 38 °C w celu odparowania metanolu. Wyekstrahowane próbki kortyzolu należy przechowywać przez noc pod wyciągiem, aby metanol mógł się rozproszyć.
      UWAGA: Warstwa zawierająca kortyzol ma zwykle żółtawy kolor.

4. Wykrywanie kortyzolu w płetwach

  1. Rozmrażanie wysuszonych próbek płetw lub szczęk w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny przed użyciem zestawu ELISA.
  2. Dodać 400 μl buforu fosforanowego, wirować i wirować przy 1 500 x g przez 15 minut.
  3. Uruchom każdą próbkę (25 μl) dwukrotnie, aby poprawić dokładność i wiarygodność testu. Usuń wszystkie dane spoza krzywej standardowej jako wartości odstające.
  4. Ustaw czytnik mikropłytek na 450 nm, a następnie ustaw na μg dL-1 i odczytaj gęstość optyczną płytki.
    1. Użyj oprogramowania do mikropłytek z czteroparametrowym dopasowaniem krzywej regresji nieliniowej. Przelicz poziomy kortyzolu w próbkach uzyskanych z oprogramowania na pg mg-1, korzystając z następującego równania:
      F = 10 000E (A/B) (C/D),
      gdzie F = końcowa wartość poziomu kortyzolu w płetwie (pg mg-1), E = objętość (ml) buforu do oznaczania użytego do odtworzenia wysuszonego ekstraktu, A = stężenie (μg dL-1) dostarczone przez wynik testu, B = masa (mg) płetwy poddanej ekstrakcji, C = objętość (ml) metanolu dodanego do sproszkowanej płetwy, i D = objętość (ml) metanolu odzyskanego z ekstraktu, a następnie wysuszonego w dół3.

5.Analiza statystyczna

  1. Każdą próbkę należy podzielić na dwie podpróbki przed procedurą mycia, a następnie przeprowadzić ją w dwóch powtórzeniach podczas testu z użyciem zestawu ELISA (2 × 2 = 4 obserwacje na próbkę), aby zwiększyć moc testu i wiarygodność wyników.
  2. Porównaj działanie dwóch rozpuszczalników myjących i ich interakcje, stosując procedurę ogólnego modelu liniowego (GLM) w środowisku oprogramowania SAS do danych pomiarowych18.
  3. Różnice testowe między średnimi za pomocą testu Tukeya na poziomie istotności p < 0,05. Przyjmij 0,05 < p < 0,10 jako dowód tendencji, a nie jako znaczącą różnicę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiona technika ekstrakcji kortyzolu z płetw została opracowana i potwierdzona w niniejszym badaniu z wykorzystaniem trzech gatunków jesiotrów. Porównano poziomy kortyzolu uzyskane przy zastosowaniu wody ultramoczonej i izopropanolu jako rozpuszczalników do przemywania (Rycina 2). Zbadano zawartość kortyzolu w kościach szczęki H. huso, aby ustalić, czy kości szczęki jesiotrów mogą służyć jako alternatywna matryca w miejsce płetw. Wpływ rozpusz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jesiotr jest czasami nazywany "żywą skamieliną", ponieważ w ciągu ostatnich tysiącleci wykazywał niewiele adaptacji. Rodzaj jesiotra Acipenser obejmuje 27 gatunków, które produkują kawior; Jednak trzy gatunki (Beluga, Baerii i Sevruga) produkują większość światowej podaży kawioru. Jesiotry są podatne na przełowienie i ingerencję w ich naturalne środowisko, a zatem są bardziej krytycznie zagrożone niż jakakolwiek inna grupa gatunków. Jesiotr należy do najstarszej grupy żyjących kręgowców, która istnieje od 150 mi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca została przeprowadzona przy wsparciu Wspólnego Programu Badawczego na rzecz Rozwoju Nauki i Technologii Rolnictwa (Tytuł projektu: Analiza zmian produktywności zwierząt gospodarskich ze zmianami klimatu, Nr projektu. PJ012771), Administracja ds. Rozwoju Obszarów Wiejskich, Republika Korei. Również to badanie zostało wsparte grantem (nr PJ01344604) z Zespołu ds. Żywienia i Fizjologii Zwierząt, Narodowy Instytut Nauk o Zwierzętach, RDA, Seul, Korea Południowa. Autorzy wyrażają wdzięczność dyrektorowi generalnemu Persian Gesture Mohammadowi Hassanowi Salmanzadehowi i jego zespołowi, którzy dostarczyli ryby z trzech gatunków jesiotrów badanych w tym badaniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Lateksowe rękawice chirurgiczne do utylizacjiAnsell63754090
Waga elektroniczna o wadze 100 kgPipeta serologiczna Baskoolnikoo101 EM
o pojemności do 24 mlBecton Dickinson Falcon35-7550
Czytnik mikropłytek z filtrami referencyjnymi 450 nm i 490 do 492 nmBioTek8041000
Zbiorniki na odczynnikiBrandTech703459
Plastikowa torba do przechowywania na zamek błyskawiczny Cleanwrap30cm x100m
Alkohol izopropylowyDaejung chemikalia i Metale 5035-4400
Alkohol metylowyDaejung chemicals & Metale 5558-4100
Rotator rurowy- MX-RL-ProDLAB Scientific 824-2222217777
Precyzyjna pipeta do 1,5 i 10 mlEppendorf Research PlusM21518D
  Precyzyjna pipeta do dostarczania 15 i 25 μ LEppendorf Research PlusR25623C
Papier do ważenia (107 x 210 mm)Fisherbrand09-898-12B
Ubijak do koralików, 50/60 Hz 2AGeneReach Biotechnology Corptp0088
Rotator płytowy z orbitą zdolną do 500 obr./minHangzhou Miu Instrument MU-E30-1044
Jednorazowe rurki polipropylenowe na co najmniej 24 mlHyundai Micro H20050
WyciągKwang Dong IndustrialKD 901-22128175
Mikrowirówka o pojemności 1500 x gLabo Gene  9.900.900.729
Mini mieszalnik wirowyLMSVTX-3000L 
Rolka z folii aluminiowej Lotte Lotte AluminiumB0722X5FK5
Waga cyfrowaMettler Toledo   ME204
Woda ultraczystaMDMMDM-0110
Końcówki do pipetNeptune ScientificREF 2100.N
Duża siatka na rybyStaw H2OHoz135 
Zestaw kortyzolu w ślinieSalimetrics1-3002-4
Kleszczyki do cięcia kościSankyo26-188A
do dostarczania 50 μ L oraz 200 μ LVITLAB18A68756
RęcznikYuhan Kimberly1707921546
Bibuła (107 i razy; 210)Yuhan Kimberly41117
Platforma Precyzyjna pipeta wielokanałowa

Bibliografia

  1. Meyer, J. S., Novak, M. A. Hair cortisol: a novel biomarker of hypothalamic-pituitary- adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
  2. Ghassemi Nejad, J., et al. A cortisol study: facial hair and nails. Journal of Steroids Hormonal Sciences. 7, 1-5 (2016).
  3. Meyer, J. S., Novak, M. A., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882(2014).
  4. Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147, 255-261 (2006).
  5. Ghassemi Nejad, J., Ataallahi, M., Park, H. K. Methodological validation of measuring Hanwoo hair cortisol concentration using bead beater and surgical scissors. Journal of Animal Science and Technology. 61, 41-46 (2019).
  6. Ghassemi Nejad, J., et al. Wool cortisol is a better indicator of stress than blood cortisol in ewes exposed to heat stress and water restriction. Animal. 8, 128-132 (2014).
  7. Brossa, A. C. Cortisol in skin mucus and scales as a measure of fish stress and habitat quality. Ph.D. dissertation. , Faculty of Veterinary Medicine, Universitat Autonoma de Barcelona. Ph.D. dissertation (2018).
  8. Carbajal, A., et al. Cortisol detection in fish scales by enzyme immunoassay: biochemical and methodological validation. Journal of Applied Ichthyology. 34, 1-4 (2018).
  9. Bertotto, D., et al. Alternative matrices for cortisol measurement in fish. Aquaculture Research. 41, 1261-1267 (2010).
  10. Ghassemi Nejad, J., Jeong, C., Shahsavarani, H., Sung, I. K., Lee, J. Embedded dental cortisol content: a pilot study. Endocrinology & Metabolic Syndrome. 5, 240(2016).
  11. Pankhurst, N. W. The endocrinology of stress in fish: an environmental perspective. General and Comparative Endocrinology. 170, 265-275 (2011).
  12. Ghassemi Nejad, J., Kim, W. B., Lee, B. H., Sung, K. I. Coat and hair color: hair cortisol and serotonin levels in lactating Holstein cows under heat stress conditions. Animal Science Journal. 88, 190-194 (2017).
  13. Baker, M. R., Gobush, K. S., Vynne, C. H. Review of factors influencing stress hormones in fish and wildlife. Journal of Nature Conservation. 21, 309-318 (2013).
  14. Aerts, J., et al. Scales tell a story on the stress history of fish. PLoS One. 10, e0123411(2015).
  15. Heimbürge, S., Kanitz, E., Otten, W. The use of hair cortisol for the assessment of stress in animals. General and Comparative Endocrinology. , 10-17 (2019).
  16. Ghassemi Nejad, J., et al. Comparing hair cortisol concentrations from various body sites and serum cortisol in Holstein lactating cows and heifers during thermal comfort zone. Journal of Veterinary Behavior: Clinical and Application Research. 30, 92-95 (2019).
  17. Bussy, U., Wassink, L., Scribner, K. T., Li, W. Determination of cortisol in lake sturgeon (Acipenser fulvescens) eggs by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 1040, 162-168 (2017).
  18. SAS. 1999. SAS. User's Guide (Version 8.01 Edition). , SAS Inst. Inc. Cary, NC, USA. (1999).
  19. Barton, B. A. Stress in fishes: a diversity of responses with particular reference to changes in circulating corticosteroids. Integrative and Comparative Biology. 42, 517-525 (2002).
  20. Ghassemi Nejad, J., et al. Measuring hair and blood cortisol in sheep and dairy cattle using RIA and ELISA assay: a comparison. Biological Rhythm Research. Accepted. , (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Macierz kostna uchwyprzemywanie izopropanolemekstrakcja metanolemmielenie w homogenizatorze kuleczkowymseparacja przez wirowanieanaliza ELISAog lny model liniowywska nik stresu

Powiązane artykuły