Tutaj opisujemy protokół wprowadzania nokautu genu do zewnątrzkomórkowego amastigotu Trypanosoma cruzi za pomocą systemu CRISPR/Cas9. Fenotyp wzrostu może być śledzony albo przez liczenie komórek w aksenowej kulturze amastigotów, albo przez proliferację wewnątrzkomórkowych amastigotów po inwazji komórek gospodarza.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wprowadzenie nokautu genu bezpośrednio do stadium amastigoty Trypanosoma cruzi za pomocą systemu CRISPR/Cas9
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Trypanosoma cruzi to chorobotwórczy pasożyt pierwotniaka, który powoduje chorobę Chagasa głównie w Ameryce Łacińskiej. W celu zidentyfikowania nowego celu terapeutycznego przeciwko T. cruzi ważne jest zweryfikowanie istotności docelowego genu w stadium pasożyta u ssaków, amastigoty. Amastigoty T. cruzi replikują się w komórce gospodarza; W związku z tym trudno jest przeprowadzić eksperyment z nokautem bez przejścia przez inne etapy rozwoju. Niedawno nasza grupa poinformowała o warunkach wzrostu, w których amastigota może replikować się aksenicznie przez okres do 10 dni bez utraty swoich właściwości podobnych do amastigoty. Wykorzystując tę czasową kulturę amastigoty aksonicznej, z powodzeniem wprowadziliśmy gRNA bezpośrednio do amastygoty wykazującej ekspresję Cas9, aby spowodować nokaut genów i przeanalizowaliśmy ich fenotypy wyłącznie w stadium amastigoty. W tym raporcie opisujemy szczegółowy protokół produkcji zewnątrzkomórkowych amastigotów pochodzących z in vitro oraz wykorzystania kultury aksenicznej w eksperymencie nokautu za pośrednictwem CRISPR/Cas9. Fenotyp wzrostu amastigotów z nokautem można ocenić albo na podstawie liczby komórek w kulturze aksenicznej, albo na podstawie replikacji wewnątrzkomórkowego amastigotu po inwazji komórek gospodarza. Metoda ta omija różnicowanie stadiów pasożyta normalnie związane z wytwarzaniem transgenicznej lub nokautującej amastigoty. Wykorzystanie czasowej kultury aksenicznej amastigoty ma potencjał do rozszerzenia swobody eksperymentalnej badań specyficznych dla danego etapu u T. cruzi.
Wprowadzenie
Trypanosoma cruzi jest czynnikiem wywołującym chorobę Chagasa, która jest rozpowszechniona głównie w Ameryce Łacińskiej1. T. cruzi ma charakterystyczne etapy cyklu życiowego, ponieważ przemieszcza się między wektorem owada a ssaczym żywicielem2. T. cruzi replikuje się jako epimastigota w jelicie środkowym krwiopijnego pluskwiaka triatominowego i różnicuje się w zakaźną metacykliczną trypomastigotę w jelicie tylnym, zanim zostanie osadzona na ludzkim lub zwierzęcym żywicielu. Gdy trypomastigota dostanie się do organizmu żywiciela przez miejsce ukąszenia lub przez błonę śluzową, pasożyt atakuje k....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Przegląd całego przebiegu eksperymentu przedstawiono na Rysunku 1.
Rysunek 1: Przegląd eksperymentu z nokautem z wykorzystaniem EA. Trypomastigoty pochodzące z hodowli tkankowych są zbierane i różnicowane w formy amastygote (EA). gRNA jest transfekowane do amastygot wykazujących....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Izolacja trypomastigotów za pomocą procedury wypływania (swim-out)
Aby zebrać świeże trypomastigoty zanieczyszczonych, starych EA za pomocą procedury wypływania (swim-out), pellety komórkowe należy inkubować przez co najmniej 1 h. Inkubacja pelletów przez więcej niż 2 h nie zwiększa znacząco liczby trypomastigot pływających w roztworze (Rycina 2B). W tym konkretnym doświadczeniu procent trypomastigot w początkowej mieszaninie wynosił 38%, a procen.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wykazaliśmy, że kultura aksoniczna amastigotów T. cruzi może być wykorzystana w nokaucie genów za pośrednictwem CRISPR / Cas9, poprzez elektroportowanie gRNA bezpośrednio do EA wykazującego ekspresję Cas9. W ten sposób można ocenić istotność genu docelowego, szczególnie w stadium amastigoty, bez przechodzenia przez inne etapy rozwoju.
Innym korzystnym aspektem transfekcji amastigotów jest wygoda w testowaniu dużej liczby docelowych genów. Po ustaleniu wspólnej hodowli T. cruzi
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca została częściowo wsparta przez JSPS KAKENHI Grant Number 18K15141 dla Y.T.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 20% roztwór formaliny | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 068-03863 | komórki mocujące |
| 25 cm2 kolba hodowlana z podwójnym uszczelnieniem | AGC Techno Glass | 3100-025 | |
| 75 cm2 kolba hodowlana z podwójnym uszczelnieniem | AGC Techno Glass | 3110-075 | |
| Mikroskop fluorescencyjny All-in One | Keyence | BZ-X710 | |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (dla kontroli) | Niestandardowa | sekwencja docelowa IDT = GGACGGCACCTTCATCTACAAGG | |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (dla TcCGM1) | Niestandardowa | sekwencja docelowa IDT = TAGCCGCGATGGAGAGTTTATGG | |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (dla TcPAR1) | Niestandardowa | sekwencja docelowa IDT = CGTGGAGAACGCCATTGCCACGG | |
| Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA | IDT | 1072532 | do wyżarzania za pomocą crRNA |
| Amaxa Urządzenie Nucleofector | LONZA | AAN-1001 | elektroporacja |
| Podstawowy zestaw nukleofektorów pasożytów 2 | LONZA | VMI-1021 | elektroporacja |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | składnik pożywki do amastigogenezy in vitro |
| Hemocytometr jednorazowy Burker-Turk | Watson | 177-212C | zliczanie komórek |
| Coster 12-dołkowe przezroczyste płytki wielodołkowe poddane działaniu TC | Corning | 3513 | |
| DMEM | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 044-29765 | pożywka hodowlana |
| płodowa surowica bydlęca, zdefiniowany | hyklon | SH30070,03 | inaktywacja termiczna przed użyciem |
| Roztwór siarczanu G-418 | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 077-06433 | wybór transformantu |
| chlorku hemin | Sigma-Aldrich | H-5533 | składnik pożywki LIT |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | barwienie jąder |
| Bulion do infuzji wątroby, Difco | Becton Dickinson | 226920 | składnik podłoża LIT |
| MES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 349-01623 | składnik pożywki do amastigogenezy in vitro |
| PBS (–) | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 166-23555 | |
| Jodek propidium | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | barwienie martwych komórek |
| RPMI 1646 | Sigma-Aldrich | R8758 | podłoże do metacyklogenezy |
Bibliografia
- World Health Organization. (WHO) Fact sheet: Chagas disease (American trypanosomiasis). , [updated 2017 Mar; cited 2017 Aug], at http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/ (2017).
- Clayton, J. Chagas disease 101. Nature. 465 (n7301_supp), S4-S5 (2010).
- Apt, W.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
