Method Article

Solidny test oparty na reakcji łańcuchowej polimerazy do ilościowego oznaczania powtórzeń trinukleotydu cytozyno-guaninowo-guaninowego w genie łamliwego X upośledzenia umysłowego-1

DOI:

10.3791/59963

⸱

September 16th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Central Laboratory, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, 3Shenzhen Research Institute, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Genetics and Metabolism, Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 5PerkinElmer Diagnostics, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 7Maternal-Fetal Medicine Institute, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dokładny i solidny test oparty na reakcji łańcuchowej polimerazy do ilościowego oznaczania powtórzeń trinukleotydu cytozyny-guaniny-guaniny w genie Fragile X-1 ułatwia diagnostykę molekularną i badania przesiewowe zespołu łamliwego chromosomu X i zaburzeń związanych z łamliwym chromosomem X dzięki krótszemu czasowi realizacji i inwestycji w sprzęt.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zespół łamliwego chromosomu X (FXS) i związane z nim zaburzenia są spowodowane ekspansją powtórzeń trinukleotydu cytozyna-guanina-guanina (CGG) w regionie 5' nietranslacji (UTR) promotora genu Fragile X-1 (FMR1). Konwencjonalnie analiza fragmentów elektroforezy kapilarnej na analizatorze genetycznym jest stosowana do wymiarowania powtórzeń CGG FMR1, ale dodatkowa analiza Southern blot jest wymagana do dokładnego pomiaru, gdy liczba powtórzeń jest wyższa niż 200. W tym miejscu przedstawiamy dokładną i solidną metodę opartą na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) do oznaczania ilościowego powtórzeń CGG FMR1. Pierwszym etapem tego testu jest amplifikacja PCR sekwencji powtórzeń w 5'UTR promotora FMR1 przy użyciu zestawu Fragile X PCR, a następnie oczyszczanie produktów PCR i wymiarowanie fragmentów na mikroprzepływowym przyrządzie do elektroforezy kapilarnej, a następnie interpretacja liczby powtórzeń CGG poprzez odniesienie wzorców ze znanymi powtórzeniami za pomocą oprogramowania analitycznego. Ten test oparty na PCR jest powtarzalny i jest w stanie zidentyfikować pełny zakres powtórzeń CGG promotorów FMR1, w tym tych z liczbą powtórzeń większą niż 200 (sklasyfikowane jako pełna mutacja), 55 do 200 (premutacja), 46 do 54 (pośrednia) i 10 do 45 (normalna). Jest to opłacalna metoda, która ułatwia klasyfikację zaburzeń związanych z FXS i łamliwym chromosomem X dzięki solidności i szybkiemu czasowi raportowania.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zespół łamliwego chromosomu X (FXS) i zaburzenia związane z łamliwym chromosomem X, np. zespół drżenia i ataksji (FX-TAS) oraz pierwotna niewydolność jajników (FX-POI) są głównie spowodowane ekspansją powtórzeń trinukleotydowych cytozyny-guaniny (CGG) w nietranslacyjnym regionie 5' (UTR) genu Fragile X-1 (FMR1) na Xq27.31,2. Białko kodowane przez FMR1 (FMRP) jest białkiem wiążącym RNA związanym z polirybosomami, które działa w rozwoju neuronów i plastyczności synaptycznej poprzez regulację alternatywnego splicingu, stabilności i transportu dendrytycznego mRNA lub modulację syntezy częściowych białek postsynaptycznych 3,4,5,6,7.

Dynamiczna zmienność z rozmiarem powtórzeń CGG wynoszącym >200 jest opisana jako pełna mutacja, która indukuje nieprawidłową hipermetylację i późniejsze wyciszenie transkrypcji promotora >FMR18. Wynikający z tego brak lub brak białka FMRP zaburza normalny rozwój neuronów i powoduje FXS9, charakteryzujące się różnymi objawami klinicznymi, w tym umiarkowaną lub ciężką niepełnosprawnością intelektualną, opóźnieniem rozwoju, zachowaniami nadpobudliwymi, słabymi kontaktami i objawami autystycznymi10,11,12. Objaw u kobiet z FXS jest na ogół łagodniejszy niż u mężczyzn. Wielkość powtórzeń CGG w zakresie od 55 do 200 i od 45 do 54 jest klasyfikowana odpowiednio jako stan premutacji i stan pośredni. Ze względu na wysoki stopień niestabilności, rozmiar powtórzeń CGG w allelu premutacji lub allelu pośrednim przypuszczalnie zwiększa się, gdy jest przenoszony z rodziców na potomstwo13,14. Tak więc nosiciele z allelami premutacji są narażeni na wysokie ryzyko urodzenia dzieci dotkniętych FXS z powodu ekspansji powtórzeń, aw niektórych przypadkach allele pośrednie mogą zwiększyć swój rozmiar powtórzeń do pełnego zakresu mutacji w ciągu dwóch pokoleń15,16. Co więcej, samce z premutacją również zwiększają ryzyko rozwoju FX-TAS17,18,19, podczas gdy samice z premutacją są predysponowane zarówno do FX-TAS, jak i FX-POI20,21,22. Ostatnio doniesiono, że zaburzenia ze spektrum autyzmu z opóźnieniem rozwoju i problemami w zachowaniach społecznych występują u dzieci z allelami premutacji FMR123,24.

Określenie dokładnej wielkości powtórzeń CGG ma ogromne znaczenie dla klasyfikacji i przewidywania zaburzeń związanych z FXS i łamliwym chromosomem X25,26. Historycznie rzecz biorąc, reakcja łańcuchowa polimerazy specyficzna dla regionu powtórzeń CGG (PCR) z rozmiarem fragmentu oraz analiza Southern blot była złotym standardem w profilowaniu molekularnym FMR1 CGG repeat27. Jednak tradycyjny specyficzny PCR jest mniej wrażliwy na duże premutacje z ponad 100 do 130 powtórzeniami i nie jest w stanie amplifikować pełnych mutacji27,28. Co więcej, elektroforeza kapilarna w tradycyjnym analizatorze genetycznym do powtarzalnego wymiarowania nie wykrywa produktów FMR1 PCR z ponad 200 powtórzeniami CGG. Analiza Southern blot umożliwia różnicowanie szerszego zakresu wielkości powtórzeń, od normalnej do pełnej liczby powtórzeń mutacji, i jest szeroko stosowana do potwierdzania pełnych mutacji (u mężczyzn) i różnicowania heterozygotycznych alleli z pełną mutacją od pozornie homozygotycznych alleli o normalnych rozmiarach powtórzeń (u kobiet). Jednak rozdzielczość do ilościowego określania powtórzeń jest ograniczona. Co ważniejsze, ta strategia testowania krok po kroku jest pracochłonna, czasochłonna i nieopłacalna.

Tutaj prezentujemy dokładną i solidną metodę opartą na PCR do ilościowego oznaczania powtórzeń CGG FMR1. Pierwszym etapem tego testu jest amplifikacja PCR sekwencji powtórzeń w 5'UTR promotora FMR1 przy użyciu zestawu Fragile X PCR. Produkty PCR są oczyszczane, a wymiarowanie fragmentów odbywa się na mikroprzepływowym przyrządzie do elektroforezy kapilarnej, a następnie interpretacja liczby powtórzeń CGG za pomocą oprogramowania analitycznego poprzez odniesienie wzorców ze znanymi powtórzeniami w oparciu o założenie, że długość fragmentu PCR jest wprost proporcjonalna do liczby powtórzeń CGG. System PCR zawiera odczynniki, które ułatwiają amplifikację wysoce bogatego w GC regionu powtórzeń trójnukleotydowych. Ten test oparty na PCR jest powtarzalny i zdolny do identyfikacji wszystkich zakresów powtórzeń CGG promotorów FMR1. Jest to opłacalna metoda, która może znaleźć szerokie zastosowanie w diagnostyce molekularnej i badaniach przesiewowych FXS i zaburzeń związanych z łamliwym chromosomem X przy krótszym czasie realizacji i inwestycjach w sprzęt, a tym samym może być stosowana w szerszym spektrum laboratoriów klinicznych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etyczna aprobata została udzielona przez Joint Chinese University of Hong Kong―New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee (Numer referencyjny: 2013.055)

1. Amplifikacja PCR

  1. Przed rozpoczęciem należy wyjąć mieszaninę buforową PCR, rozcieńczalnik do próbek i próbki DNA (zarówno testowe, jak i referencyjne DNA) (patrz tabela materiałów) z zamrażarki w temperaturze -20 °C i przechowywać je w temperaturze pokojowej przez 20–30 minut, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i DNA są całkowicie rozmrożone. Odwiruj i krótko odkręć przed użyciem.
  2. Zmierzyć stężenie próbek DNA za pomocą spektrofotometru (patrz tabela materiałów). Stężenie DNA powinno wynosić 25 ng/μl; W razie potrzeby rozcieńczyć rozcieńczalnikiem do próbki do odpowiedniego stężenia.
    nuta: DNA powinno zostać wyekstrahowane i oczyszczone w celu usunięcia substancji zakłócających, takich jak białka i wysokie stężenia soli. Do późniejszej amplifikacji i analizy PCR należy użyć niezdegradowanego, wysokiej jakości DNA (A260/A280: 1,8–2,0 i A260/A230: >1,0).
  3. Oznacz dołki na płytce PCR lub probówkach PCR o pojemności 0,2 ml w celu identyfikacji referencyjnych i badanych próbek DNA.
  4. Obliczyć liczbę reakcji PCR wymaganych dla badanych próbek, 2 próbek referencyjnych i ujemnej próbki kontrolnej. Przygotować PCR Master Mix, dodając 15 μl mieszaniny buforowej PCR, 2,6 μl rozcieńczalnika do próbek i 0,4 μl polimerazy dla każdej reakcji.
    nuta: Kontrola ujemna przy użyciu rozcieńczalnika do próbek jest niezbędna do monitorowania wydajności PCR. Przygotuj główną mieszankę PCR w temperaturze pokojowej, NIE pipetuj lodu. Mieszanina buforowa PCR jest lepka. Wymieszaj tubkę, a następnie krótko odkręć przed użyciem.
  5. Wiruj główną mieszankę PCR z kroku 1.4 przez 10–20 s i odwiruj. Powoli dozować 18 μl mieszaniny do każdej studzienki lub probówki.
  6. Odwiruj i odwiruj próbki DNA. Odpipetować 2 μl każdego DNA do odpowiedniego dołka lub probówki, aby uzyskać końcową objętość PCR wynoszącą 20 μl. Wymieszać, pipetując w górę i w dół 5 razy.
    nuta: Całkowita ilość DNA na reakcję powinna wynosić 50–100 ng. Ilości DNA większe niż 150 ng na 20 μl reakcji PCR mogą powodować słabą amplifikację dużych powtarzających się alleli. W przypadku DNA o niższym stężeniu ilość rozcieńczalnika próbki w mieszance wzorcowej PCR można zastąpić roztworem DNA.
  7. Uszczelnij płytkę za pomocą samoprzylepnego uszczelniacza do płyt lub zaślepek do tub.
  8. Umieść szczelnie zapieczętowaną płytkę lub probówki do PCR w termocyklerze z podgrzewaną pokrywą. Uruchom program z następującymi ustawieniami: 95 °C przez 5 minut, następnie 25 cykli denaturacji w temperaturze 98 °C przez 35 s, wyżarzanie w temperaturze 59 °C przez 35 s i przedłużanie w temperaturze 72 °C przez 4 minuty; końcowy etap w temperaturze 72 °C przez 10 min. Przechowywać produkty PCR w temperaturze 4 °C w cyklerze do czasu wyjęcia w celu dalszego przetwarzania.
  9. Po amplifikacji PCR należy natychmiast oczyścić i przeanalizować produkty lub przechowywać w temperaturze od +2 do +8 °C przez noc. Alternatywnie produkt może być przechowywany do 30 dni w temperaturze od -30 do -16 °C.

2. Oczyszczanie produktów PCR

  1. Rozgrzej wytrząsarkę inkubatora do temperatury 65 °C.
  2. Dla każdej reakcji PCR dodać 80 μl 1x buforu TE (patrz tabela materiałów) do 20 μl każdego produktu PCR z sekcji 1.
  3. Przenieść mieszaninę próbki na płytkę czyszczącą do PCR (patrz tabela materiałów) za pomocą pipety wielokanałowej.
  4. Pozostawić płytkę odkrytą i umieścić ją w wytrząsarce inkubatora, a następnie inkubować w temperaturze 65 °C, wytrząsając z prędkością 1 200 obr./min przez 10 minut.
  5. Po inkubacji ustaw przyrząd próżniowy na 250 mbar (lub 25 kPa, 188 mmHg, 7,4 cala Hg) i zasysaj roztwór przez filtr przez 15 minut. W studzienkach nie powinno pozostać żadne płyny.
  6. Schłodzić wytrząsarkę inkubatora do temperatury 25 °C.
  7. Po pierwszym zasysaniu wyłącz próżnię i dodaj 50 μl 1x buforu TE do każdej studzienki. Nie mieszać. Zasysać roztwór przez 10 minut, korzystając z ustawień podciśnienia w kroku 2.5.
  8. Osusz spód płyty filtracyjnej, mocno dociskając ją do stosu ręczników papierowych.
  9. Dodaj 20 μL buforu 1x TE do dolnej środkowej części każdej studzienki. Umieścić płytkę w wytrząsarce inkubatora i inkubować w temperaturze 25 °C, wytrząsając z prędkością 1 200 obr./min przez 5 minut.
  10. Po inkubacji przenieść >15 μl każdego oczyszczonego DNA PCR z kroku 2.9 na świeżą 96-dołkową płytkę PCR. Oczyszczone DNA może być analizowane bezpośrednio lub alternatywnie może być przechowywane w temperaturze od -30 do -16 °C do czasu, gdy będzie to potrzebne.

3. Wymiarowanie fragmentów produktów PCR

  1. Przed rozpoczęciem należy odczekać, aż koncentrat barwnika DNA, matryca żelu DNA, marker DNA, drabinka DNA i oczyszczone próbki DNA z etapu 2 zrównoważą się do temperatury pokojowej przez 30 minut.
  2. Ustawić stację zalewania.
    1. Wymienić strzykawkę (patrz Tabela materiałów) w przypadku użycia nowej partii odczynników.
    2. Wyreguluj płytkę podstawy, zwolnij dźwignię zacisku strzykawki i przesuń ją do górnej pozycji.
  3. Uruchom oprogramowanie do klejenia (patrz Tabela materiałów) i przygotuj mieszankę żelu i barwnika.
  4. Wiruj koncentrat barwnika przez 10 s i odwiruj. Dodać 25 μl barwnika do fiolki z matrycą żelową. Dobrze zmieszaj zmieszany roztwór i odwiruj.
    1. Przenieś mieszankę żelu i barwnika do filtra wirowego. Umieść filtr wirowy w mikrowirówce i wiruj przez 10 minut w temperaturze pokojowej przy 1,500 x g ± 20%.
      nuta: Chronić roztwór barwnikiem przed światłem i przechowywać w temperaturze 4 °C po użyciu. Mieszankę żelowo-barwnikową można użyć na około 15 chipsów po przygotowaniu. Za każdym razem przed użyciem pozwól, aby mieszanina żelu i barwnika zrównoważyła się do temperatury pokojowej przez 30 minut.
  5. Załaduj mieszankę żelu i barwnika.
    1. Włóż nowy chip DNA do stacji zasysającej. Dodaj 9 μl mieszanki żelu i barwnika do studzienki oznaczonej literą "G". Upewnij się, że tłok jest umieszczony na znaku 1 ml, a następnie zamknij stację zasysającą.
    2. Wcisnąć tłok strzykawki w dół, aż zostanie przytrzymany przez zacisk. Poczekaj dokładnie 30 sekund, a następnie zwolnij klips. Odczekać 5 sekund, a następnie powoli pociągnąć tłok z powrotem do pozycji 1 ml.
    3. Otwórz stację zasysania i dodaj 9 μl mieszanki żelowo-barwnikowej do studzienek oznaczonych literą "G".
  6. Dodać 5 μl markera do studzienki oznaczonej symbolem drabinki, a także dodać 5 μl markera do każdej z 12 studzienek na próbki. Nie zostawiaj żadnych studzienek pustych.
  7. Dodać 1 μl drabinki DNA do studzienki oznaczonej symbolem drabinki. Dodać 1 μl produktu PCR (zużyte studzienki) z kroku 3.1 lub 1 μl ultraczystej wody (niewykorzystane studzienki) do każdej z 12 studzienek na próbki. Umieść wiór poziomo w adapterze mieszalnika wirowego i wiruj przez 1 minutę we wskazanym ustawieniu (2 400 obr./min).
  8. Włóż chip do bioanalizatora i uruchom chip w instrumencie w ciągu 5 minut.
  9. Po zakończeniu testu należy natychmiast usunąć zużyty chip z urządzenia.
  10. Powoli dodaj 350 μl wody dejonizowanej do jednego z dołków czyścika elektrod. Otwórz pokrywę bioanalizatora i umieść w niej środek do czyszczenia elektrod. Zamknij pokrywkę i inkubuj przez około 10 sekund. Otwórz pokrywę i wyjmij środek do czyszczenia elektrod. Odczekaj kolejne 10 sekund, aby woda z elektrod odparowała, a następnie zamknij pokrywę.

4. Analizuj wyniki wymiarowania fragmentów

UWAGA: Próbki referencyjne powinny być amplifikowane i analizowane przez ten sam termocykler i bioanalizator w tej samej partii z nieznanymi próbkami.

  1. Po zakończeniu przebiegu bioanalizatora wyeksportuj dane szczytowe z każdego przebiegu jako plik tabeli .csv do dalszej analizy.
  2. Uruchom oprogramowanie analityczne i otwórz wyeksportowany plik tabeli szczytów .csv z kroku 4.1.
  3. Na karcie menu QC przejrzyj linię regresji dopasowaną do czterech punktów (pokazanych na wykresie jako niebieskie romby) z dwóch próbek referencyjnych. Wartość R2 linii regresji powinna wynosić >0,98 (typowe wartości przekraczają 0,999).
  4. Na karcie menu Wyniki sprawdź rozmiar powtórzeń każdej próbki, której długość fragmentu jest automatycznie wykreślana względem krzywej standardowej regresji liniowej uzyskanej z próbek referencyjnych. Oprogramowanie zapewnia również klasyfikację każdej próbki według różnych wytycznych.
  5. Na karcie menu Eksport wyeksportuj raport wyników dla każdej próbki z numerami powtórzeń i klasyfikacją diagnostyczną, a także podsumowanie informacji o próbce i raport kontroli jakości dla każdej serii.
    nuta: Oprogramowanie analityczne umożliwia korzystanie z niestandardowych wytycznych klasyfikacyjnych, takich jak wytyczne American College of Medical Genetics (ACMG) lub Clinical Molecular Genetics Society/ European Society of Human Genetics (CMGS/ESHG), a także predefiniowanych kryteriów klasyfikacji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki wymiarowania próbki referencyjnej żeńskiej sprzed mutacji (NA20240, powtórzenia 30 i 80) oraz pełnej próbki referencyjnej żeńskiej mutacji (NA20239, powtórzenia 20 i 200) są pokazane odpowiednio w Rysunek 1A i Rysunek 1B. Zazwyczaj w profilu wielkości fragmentu znajdują się dwa piki znacznika (dolny znacznik 50 par zasad [bp] i górny znacznik 10,380 pz). Zwykle występuje pik kompleksu starterów o wielkości blisko 95 pz. Za pomocą próbki referencyjnej można skonstru...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FXS jest drugą najczęstszą przyczyną upośledzenia intelektualnego po trisomii 21, odpowiadając za prawie połowę upośledzenia umysłowego sprzężonego z chromosomem X30, które może dotknąć około 1 na 4 000 mężczyzn i 1 na 8 000 kobiet. Co ważniejsze, prawie 1 na 250-1000 samic jest nosicielką premutacji, a częstość ta wynosi 1 na 250-1600 u mężczyzn 26,31,32,33. Ponieważ ry...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te badania były wspierane przez granty z Projektu Zarządzania Kryzysowego NSFC (Grant nr 81741004), Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 81860272), Głównego Planu Badawczego Prowincjonalnej Fundacji Nauki i Technologii Guangxi (Grant No. AB16380219), grant Chińskiej Fundacji Nauk Podoktoranckich (grant nr 2018M630993) oraz Fundacja Nauk Przyrodniczych Guangxi (grant nr 2018GXNSFAA281067).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agilent 2100 Bioanalizator: 0,2 ml probówki do PCRAxygenPCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalizator instrument: 1x bufor TE, pH 8,0, bez rnazyAmbionAM9849
Agilent 2100 Instrument do bioanalizatora: 2100AgilentG2939AA
Agilent 2100 Instrument do bioanalizatora: 96-dołkowa płytka do PCRThermo FisherAB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer Instrument: Wkład elektrodyAgilentSupplies Wyposażenie 2100 Bioanayzer
Agilent 2100 Bioanalyzer Instrument: Mieszalnik wirowy IKAAgilentSupplies wyposażenie urządzenia 2100 Bioanayzer
Agilent 2100 Bioanalyzer Instrument: Oprogramowanie do wymiarowania 2100 Oprogramowanie eksperckieAgilentWyposażenie urządzenia 2100 Bioanayzer
Agilent 2100 Bioanalizator przyrządu: Chipy testoweAgilentDostarcza wyposażenie urządzenia 2100 Bioanayzer
Zestaw Agilent DNA 7500Agilent5067-1506Do wymiarowania fragmentów
Zestaw Agilent DNA 7500: Drabinka DNA 7500 (żółta nasadka)Zestaw AgilentW: Zestaw Agilent DNA 7500 (numer katalogowy: 5067-1506)
Zestaw Agilent DNA 7500: Markery DNA 7500 (zielona nasadka)Zestaw AgilentIn: Zestaw Agilent DNA 7500 (numer katalogowy: 5067-1506)
Zestaw Agilent DNA 7500: Chipy DNAAgilent Zestaw AgilentIn (numer katalogowy: 5067-1506)
Zestaw Agilent DNA 7500: Koncentrat barwnika DNA (niebieska nakrętka)Zestaw AgilentIn: Zestaw Agilent DNA 7500 (numer katalogowy: 5067-1506)
Zestaw Agilent DNA 7500: Fiolka z żelem DNA (czerwona nakrętka)Zestaw AgilentIn: Zestaw Agilent DNA 7500 (numer katalogowy: 5067-1506)
Zestaw Agilent DNA 7500: Środek do czyszczenia elektrodZestaw AgilentIn : Zestaw Agilent DNA 7500 (numer katalogowy: 5067-1506)
Zestaw Agilent DNA 7500: Filtr wirowyAgilentZapasy zestawu Agilent DNA 7500 (numer katalogowy: 5067-1506)
Zestaw Agilent DNA 7500: StrzykawkaAgilentMateriały eksploatacyjne zestawu Agilent DNA 7500 (numer katalogowy: 5067-1506)
Stacja do zasysania chipówAgilent5065-4401Dostarcza wyposażenie urządzenia 2100 Bioanayzer
Cubee Mini-wirówkaGeneReachaqbd-i
Płyta filtracyjna Rozdzielacz próżniowy: MultiScreenHTS Kolektor próżniowyMerck MilliporeMSVMHTS00Przyrząd próżniowy do próżni płyty filtracyjnej Kolektor do oczyszczania produktu PCR
Próżnia na płycie filtracyjnej Kolektor: Korek silikonowyMerck MilliporeXX2004718Próżnia w płycie filtracyjnej Kolektor
Próżnia w płycie filtracyjnej Kolektor: Pompa próżniowaMerck MilliporeWP6122050Próżnia w płycie filtracyjnej Kolektor
Podciśnienie w płycie filtracyjnej Kolektor: Pojemnik na odpadyMerck MilliporeXX1004705Płyta filtracyjna próżniowa Kolektor
FragilEase Fragile X Zestaw PCRPerkinElmer3101-0010Do amplifikacji PCR

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Verkerk, A. J., et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell. 65, 905-914 (1991).
  2. Fu, Y. H., et al. Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox. Cell. 67, 1047-1058 (1991).
  3. Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. C., Bassell, G. J. Local functions for FMRP in axon growth cone motility and activity-dependent regulation of filopodia and spine synapses. Molecular and Cellular Neurosciences. 32, 37-48 (2006).
  4. Didiot, M. C., et al. The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer. Nucleic Acids Research. 36, 4902-4912 (2008).
  5. Bechara, E. G., et al. A novel function for fragile X mental retardation protein in translational activation. PLoS Biology. 7, e16(2009).
  6. Ascano, M. Jr, et al. FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression. Nature. 492, 382-386 (2012).
  7. Kenny, P. J., et al. MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements. Cell Reports. 9, 1729-1741 (2014).
  8. Oberle, I., et al. Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome. Science. 252, 1097-1102 (1991).
  9. Hagerman, R., Lauterborn, J., Au, J., Berry-Kravis, E. Fragile X syndrome and targeted treatment trials. Results and Problems in Cell Differentiation. 54, 297-335 (2012).
  10. Hatton, D. D., et al. Autistic behavior in children with fragile X syndrome: prevalence, stability, and the impact of FMRP. American Journal of Medical Genetics Part A. 140A, 1804-1813 (2006).
  11. Mattei, J. F., Mattei, M. G., Aumeras, C., Auger, M., Giraud, F. X-linked mental retardation with the fragile X. A study of 15 families. Human Genetics. 59, 281-289 (1981).
  12. Backes, M., et al. Cognitive and behavioral profile of fragile X boys: correlations to molecular data. American Journal of Medical Genetics. 95, 150-156 (2000).
  13. Nolin, S. L., et al. Fragile X analysis of 1112 prenatal samples from 1991 to 2010. Prenatal Diagnosis. 31, 925-931 (2011).
  14. Nolin, S. L., et al. Expansion of the fragile X CGG repeat in females with premutation or intermediate alleles. American Journal of Human Genetics. 72, 454-464 (2003).
  15. Fernandez-Carvajal, I., et al. Expansion of an FMR1 grey-zone allele to a full mutation in two generations. Journal of Molecular Diagnostics. 11, 306-310 (2009).
  16. Terracciano, A., et al. Expansion to full mutation of a FMR1 intermediate allele over two generations. European Journal of Human Genetics. 12, 333-336 (2004).
  17. Garcia-Arocena, D., Hagerman, P. J. Advances in understanding the molecular basis of FXTAS. Human Molecular Genetics. 19, R83-R89 (2010).
  18. Juncos, J. L., et al. New clinical findings in the fragile X-associated tremor ataxia syndrome (FXTAS). Neurogenetics. 12, 123-135 (2011).
  19. Hagerman, R. J., et al. Intention tremor, parkinsonism, and generalized brain atrophy in male carriers of fragile X. Neurology. 57, 127-130 (2001).
  20. Conway, G. S. Premature ovarian failure and FMR1 gene mutations: an update. Annales d'endocrinologie. 71, 215-217 (2010).
  21. Conway, G. S., Hettiarachchi, S., Murray, A., Jacobs, P. A. Fragile X premutations in familial premature ovarian failure. Lancet. 346, 309-310 (1995).
  22. Van Esch, H., Buekenhout, L., Race, V., Matthijs, G. Very early premature ovarian failure in two sisters compound heterozygous for the FMR1 premutation. European Journal of Medical Genetics. 52, 37-40 (2009).
  23. Bourgeois, J. A., et al. A review of fragile X premutation disorders: expanding the psychiatric perspective. Journal of Clinical Psychiatry. 70, 852-862 (2009).
  24. Farzin, F., et al. Autism spectrum disorders and attention-deficit/hyperactivity disorder in boys with the fragile X premutation. Journal of Developmental and Behavioral Pediatrics. 27, S137-S144 (2006).
  25. Hantash, F. M., et al. FMR1 premutation carrier frequency in patients undergoing routine population-based carrier screening: insights into the prevalence of fragile X syndrome, fragile X-associated tremor/ataxia syndrome, and fragile X-associated primary ovarian insufficiency in the United States. Genetics in Medicine. 13, 39-45 (2011).
  26. Kraan, C. M., et al. FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts. Genetics in Medicine. 20 (12), 1627-1634 (2018).
  27. Saul, R. A., Tarleton, J. C. FMR1-Related Disorders. GeneReviews. , (2012).
  28. Amos Wilson, J., et al. Consensus characterization of 16 FMR1 reference materials: a consortium study. Journal of Molecular Diagnostics. 10, 2-12 (2008).
  29. Kwok, Y. K., et al. Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats. Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).
  30. Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. W., Morgan, K. Prevalence of carriers of premutation-size alleles of the FMRI gene--and implications for the population genetics of the fragile X syndrome. American Journal of Human Genetics. 57, 1006-1018 (1995).
  31. Tassone, F., et al. FMR1 CGG allele size and prevalence ascertained through newborn screening in the United States. Genome Medicine. 4, 100(2012).
  32. Dombrowski, C., et al. Premutation and intermediate-size FMR1 alleles in 10572 males from the general population: loss of an AGG interruption is a late event in the generation of fragile X syndrome alleles. Human Molecular Genetics. 11, 371-378 (2002).
  33. Cronister, A., Teicher, J., Rohlfs, E. M., Donnenfeld, A., Hallam, S. Prevalence and instability of fragile X alleles: implications for offering fragile X prenatal diagnosis. Obstetrics and Gynecology. 111, 596-601 (2008).
  34. Hayward, B. E., Kumari, D., Usdin, K. Recent advances in assays for the fragile X-related disorders. Human Genetics. 136, 1313-1327 (2017).
  35. Seltzer, M. M., et al. Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample. American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).
  36. Hayward, B. E., Usdin, K. Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders. Methods in Molecular Biology. , 49-59 (1942).
  37. Orrico, A., et al. Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case. American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).
  38. Schmucker, B., Seidel, J. Mosaicism for a full mutation and a normal size allele in two fragile X males. American Journal of Medical Genetics. 84, 221-225 (1999).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fragile X Mental Retardation 1 GeneCGG Trinucleotide Repeat QuantificationPolymerase Chain Reaction AssayMicrofluidic Capillary ElectrophoresisFragile X Syndrome DiagnosisPremutation Full Mutation ClassificationPCR Product PurificationFragment Size AnalysisDNA Sample PreparationGenetic Analyzer Sizing

Related Articles