Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykonywanie ksenoprzeszczepów mięśni szkieletowych u myszy z niedoborem odporności

10.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59966

⸱

16 września 2019

 ,  ,  , 
1Graduate Program in Cellular and Molecular Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Neurology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Kennedy Krieger Institute, 4Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Skomplikowane choroby ludzkie mogą być trudne do modelowania w tradycyjnych systemach modeli laboratoryjnych. W tym miejscu opisujemy chirurgiczne podejście do modelowania choroby mięśni ludzkich poprzez przeszczepienie biopsji ludzkich mięśni szkieletowych myszom z niedoborem odporności.

Streszczenie

Efekty leczenia obserwowane w badaniach na zwierzętach często nie znajdują podsumowania w badaniach klinicznych. Chociaż problem ten jest wieloaspektowy, jedną z przyczyn tego niepowodzenia jest stosowanie nieodpowiednich modeli laboratoryjnych. Modelowanie złożonych chorób człowieka w tradycyjnych organizmach laboratoryjnych jest trudne, ale problem ten można obejść dzięki badaniom nad ludzkimi ksenoprzeszczepami. Opisana przez nas metoda chirurgiczna pozwala na stworzenie ksenoprzeszczepów mięśni szkieletowych u ludzi, które mogą być wykorzystywane do modelowania chorób mięśni oraz do przeprowadzania przedklinicznych badań terapeutycznych. Zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Institutional Review Board (IRB) próbki mięśni szkieletowych są pobierane od pacjentów, a następnie przeszczepiane myszom gospodarzom NOD-Rag1null IL2rγnull (NRG). Myszy te są idealnymi gospodarzami do badań transplantacyjnych ze względu na ich niezdolność do wytwarzania dojrzałych limfocytów, a tym samym nie są w stanie rozwinąć komórkowych i humoralnych adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych. Myszy gospodarzy są znieczulane izofluranem, a mięśnie piszczelowe przednie i prostownikowe długie palca myszy są usuwane. Fragment ludzkiego mięśnia jest następnie umieszczany w pustym przedziale piszczelowym i zszywany do bliższych i dalszych ścięgien mięśnia strzałkowego długiego. Ksenografowany mięsień jest spontanicznie unaczyniany i unerwiany przez mysiego gospodarza, w wyniku czego powstaje solidnie zregenerowany ludzki mięsień, który może służyć jako model do badań przedklinicznych.

Wprowadzenie

Stwierdzono, że tylko 13,8% wszystkich programów rozwoju leków będących w trakcie prób klinicznych kończy się sukcesem i prowadzi do zatwierdzonych terapii1. Chociaż ten wskaźnik sukcesu jest wyższy niż wcześniej zgłaszane 10,4%2, nadal istnieje znaczne pole do poprawy. Jednym ze sposobów zwiększenia wskaźnika sukcesu badań klinicznych jest ulepszenie modeli laboratoryjnych stosowanych w badaniach przedklinicznych. Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) wymaga badań na zwierzętach, aby wykazać skuteczność leczenia i ocenić toksyczność przed badaniami klinicznymi fazy 1. Jednak często występuje ograniczona zgodność w wynikach leczenia między badaniami na zwierzętach a badaniami klinicznymi3. Ponadto konieczność przeprowadzenia przedklinicznych badań na zwierzętach może stanowić barierę nie do pokonania dla rozwoju terapii w chorobach, w przypadku których brakuje zaakceptowanego modelu zwierzęcego, co często ma miejsce w przypadku chorób rzadkich lub sporadycznych.

Jednym ze sposobów modelowania chorób ludzkich jest przeszczepianie ludzkiej tkanki myszom z niedoborem odporności w celu wygenerowania ksenoprzeszczepów. Modele ksenoprzeszczepów mają trzy kluczowe zalety: po pierwsze, mogą one odzwierciedlać złożone nieprawidłowości genetyczne i epigenetyczne, które występują w chorobach ludzkich, a które mogą nigdy nie być możliwe do odtworzenia w innych modelach zwierzęcych. Po drugie, ksenoprzeszczepy mogą być wykorzystywane do modelowania rzadkich lub sporadycznych chorób, jeśli dostępne są próbki od pacjentów. Po trzecie, ksenoprzeszczepy modelują chorobę w ramach kompletnego systemu in vivo. Z tych powodów stawiamy hipotezę, że wyniki skuteczności leczenia w modelach ksenoprzeszczepów z większym prawdopodobieństwem przełożą się na badania na pacjentach. Ksenoprzeszczepy ludzkich nowotworów zostały już z powodzeniem wykorzystane do opracowania metod leczenia powszechnych nowotworów, w tym szpiczaka mnogiego, a także spersonalizowanych terapii dla poszczególnych pacjentów4,5,6,7.

Ostatnio ksenoprzeszczepy zostały wykorzystane do opracowania modelu choroby mięśni u ludzi8. W tym modelu próbki biopsji mięśni ludzkich są przeszczepiane do tylnych kończyn myszy NRG z niedoborem odporności w celu utworzenia ksenoprzeszczepów. Przeszczepione ludzkie włókna mięśniowe obumierają, ale ludzkie komórki macierzyste mięśni obecne w ksenoprzeszczepie następnie rozszerzają się i różnicują w nowe ludzkie włókna mięśniowe, które ponownie zasiedlają przeszczepioną ludzką blaszkę podstawną. Dlatego zregenerowane włókna mięśniowe w tych ksenoprzeszczepach są całkowicie ludzkie i są spontanicznie rewaskularyzowane i unerwione przez mysiego gospodarza. Co ważne, tkanka mięśniowa pacjenta z dystrofią mięśniowo-łopatkowo-ramienną (FSHD) przeszczepiona myszom podsumowuje kluczowe cechy choroby człowieka, a mianowicie ekspresję czynnika transkrypcyjnego DUX48. FSHD jest spowodowany nadekspresją DUX4, który jest epigenetycznie wyciszony w normalnej tkance mięśniowej9,10. W modelu ksenoprzeszczepu FSHD wykazano, że leczenie morfoliną specyficzną dla DUX4 skutecznie hamuje ekspresję i funkcję DUX4 i może być potencjalną opcją terapeutyczną dla pacjentów z FSHD11. Wyniki te pokazują, że ksenoprzeszczepy mięśni ludzkich są nowym podejściem do modelowania chorób mięśni u ludzi i testowania potencjalnych terapii u myszy. Tutaj szczegółowo opisujemy chirurgiczną metodę tworzenia ksenoprzeszczepów ludzkich mięśni szkieletowych u myszy z niedoborem odporności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszelkie wykorzystanie próbek badawczych pobranych od ludzi zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Radę Przeglądową (IRB) Johns Hopkins w celu ochrony praw i dobrostanu uczestników. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Johns Hopkins zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health (NIH) dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych. Do przeprowadzenia eksperymentów z ksenoprzeszczepem wykorzystano samce myszy gospodarzy NOD-Rag1null IL2rγnull (NRG) w wieku 8-12 tygodni. Myszy te są utrzymywane w szafach z wentylacją, a dostarczane im powietrze jest filtrowane przez filtry HEPA, temperowane i nawilżane; podawana jest również nadchlorowana woda filtrowana metodą odwróconej osmozy. Myszy mają do dyspozycji wodę oraz naświetlaną dietę antybiotykową (Tabela materiałów) ad libitum, a w pomieszczeniu zapewniono cykl 14 h światła i 10 h ciemności, sterowany przez centralny czasomierz.

1. Przygotowanie sprzętu

  1. Pozyskać myszy NOD-Rag1null IL2r γnull (NRG) w wieku 8–12 tygodni.
  2. Zautoklawować sprzęt chirurgiczny: nożyczki, pęsety, uchwyt do igieł, zszywacz chirurgiczny (Tabela materiałów), klipsy do ran, chusteczki chirurgiczne (Tabela materiałów) oraz zlewkę (Ryc. 1A).
  3. Przygotować 50 mL pożywki mięśniowej (20% płodowej surowicy bydlęcej, 2% ekstraktu z embrionu kurczaka, 1% antybiotyku/antymykotyku w pożywce Hams F10). Wszystkie odczynniki/leki/roztwory używane podczas operacji przechowywać w temperaturze pokojowej, chyba że protokół stanowi inaczej.
  4. Przygotować strzykawkę 1 mL z igłą 26 G o długości 3/8 cala zawierającą 2 mg/mL środka przeciwbólowego (Tabela materiałów) i umieścić na lodzie. Środek przeciwbólowy można rozcieńczyć do odpowiedniego stężenia przy użyciu sterylnego roztworu soli fosforanowej (PBS).

2. Przygotowanie chirurgiczne

  1. Pobrać biopsję mięśnia ludzkiego zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IRB od pacjentów, których mięśnie wykazują siłę > 4-/5 w skali MRC (Medical Research Council)12. Umieścić materiał badawczy w szalce Petriego o wymiarach 10 mm x 15 mm zawierającej pożywkę do mięśni.
    UWAGA: Skala MRC jest stosowana w praktyce klinicznej do oceny siły mięśni, gdzie 0 oznacza brak skurczu, 5 normalną siłę, a 4 (od 4- do 4+) ruch przeciwko oporowi12. Stwierdzono, że mięśnie z lekką lub umiarkowaną słabością (MRC > 4-/5) zazwyczaj wykazują patologię choroby, ale nie są w znacznym stopniu zastąpione przez tkankę tłuszczową lub włóknienie, co w obu przypadkach utrudnia regenerację ksenoprzeszczepu. W przypadku tkanek z autopsji, gdy aktualny wynik w skali MRC nie jest dostępny, jakość mięśnia można ocenić poprzez obserwację makroskopową. Biopsje mięśni o bladoróżowym wyglądzie lub z dużymi obszarami tkanki tłuszczowej prawdopodobnie nie zostaną pomyślnie ksenoprzeszczepione.
  2. Usunąć pozostałą powięź lub tkankę tłuszczową z preparatu za pomocą nożyczek chirurgicznych, korzystając ze stereomikroskopu i źródła światła w celu lepszej wizualizacji.
  3. Podzielić biopsję mięśnia na kawałki o wymiarach około 7 mm x 3 mm x 3 mm za pomocą nożyczek chirurgicznych, korzystając ze stereomikroskopu i źródła światła. Upewnić się, że włókna w preparacie są ułożone podłużnie.
  4. Umieścić szalkę Petriego z podzielonym mięśniem na lodzie. Średnio ksenoprzeszczepy są przechowywane w pożywce przez 4 godziny podczas przeprowadzania operacji. Jednakże biopsje były przechowywane w pożywce przez 24 h przed ksenoprzeszczepieniem i opóźnienie to nie wydawało się negatywnie wpływać na transplantację ani regenerację.
  5. Umieścić syntetyczne, niewchłanialne szwy (Tabela materiałów) w szalce Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm zawierającej 70% etanol.
  6. Przygotować obwód znieczulenia do procedury podwójnej: ustawić obwód oddechowy Mapleson E na stereomikroskopie i umieścić komorę indukcyjną w komorze bezpieczeństwa biologicznego (Rysunek 1A,B).
  7. Zważyć mysz NRG, umieszczając ją w autoklawowanym zlewku na wadze, a następnie przenieść do komory indukcyjnej. Zindukować znieczulenie przy użyciu 3% izofluranu. Po osiągnięciu odpowiedniej głębokości znieczulenia — ocenianej na podstawie częstości oddechów, rozluźnienia mięśni i braku ruchów dobrowolnych — zmniejszyć ustawienie parownika do 1,5% na resztę operacji.
  8. Przenieść mysz z komory indukcyjnej do obwodu oddechowego Mapleson E i nałożyć maść oftalmiczną na oczy.
  9. Usunąć włosy nad mięśniem piszczelowym przednim (TA) od kostki do kolana za pomocą trymera, a następnie zastosować 1-minutową kurację lotionem do usuwania włosów (Tabela materiałów) (Rysunek 2A).
  10. Zdezynfekować miejsce operacyjne, przecierając nogę roztworem powidon-jodu. Następnie wypłukać pozostały powidon-jod 70% etanolem.
  11. Wstrzyknąć myszy podskórnie lek przeciwbólowy, taki jak karprofen (Tabela materiałów), w dawce 5 mg/kg.

3. Operacja ksenoprzeszczepu

  1. Przytwierdź nogę taśmą i wykonaj proste nacięcie nad mięśniem piszczelowym przednim (TA) za pomocą nożyczek i pęsety irydowej, zaczynając od ścięgien dystalnych i kończąc poniżej kolana (Rycina 2B).
  2. Oddziel skórę od mięśnia, stosując tępą dyssekcję nożyczkami chirurgicznymi.
  3. Przetnij epimysjum mięśnia TA nożyczkami, zaczynając od ścięgna i kończąc na kolanie.
    UWAGA: Jest to nacięcie bardzo powierzchowne (mniej niż 0.5 mm; Rycina 2B, czarna przerywana linia); leżący pod spodem mięsień TA nie powinien zostać uszkodzony podczas tego procesu, ponieważ utrudniłoby to jego usunięcie. Przy prawidłowym wykonaniu włókna mięśniowe widocznie się rozluźnią.
  4. Przetnij ścięgno dystalne mięśnia TA nożyczkami, chwyć ścięgno pęsetą irydową i pociągnij mięsień TA w górę w stronę kolana (Rycina 2C).
  5. Przetnij ścięgno dystalne mięśnia prostownika palców długiego (EDL) nożyczkami i pociągnij EDL w górę w stronę kolana (Rycina 2D). Gdy ścięgno proksymalne mięśnia strzałkowego długiego (PL) stanie się widoczne, usuń EDL za pomocą nożyczek (Rycina 2D, zielona przerywana linia).
  6. Usuń mięsień TA nożyczkami (Rycina 2D, niebieska przerywana linia) i użyj nasączonej PBS gazika chirurgicznego, wywierając lekki nacisk w celu uzyskania hemostazy (Rycina 2E).
  7. Przewlecz szew przez proksymalne ścięgno mięśnia strzałkowego długiego (PL) i przytnij, pozostawiając około 1.5 cala nici po obu stronach ścięgna (Rycina 2F).
  8. Wykonaj pierwszą połowę dwuręcznego chirurgicznego węzła kwadratowego, ale nie zaciskaj go: utworzy to pętlę. Umieść ksenoprzeszczep w tej pętli i zaciśnij ją, aby zabezpieczyć przeszczep. Dokończ drugą połowę węzła kwadratowego (Rycina 2G,H). W ten sposób ksenoprzeszczep zostanie przyszyty do proksymalnego ścięgna PL.
  9. Przewlecz szew przez dystalne ścięgno PL i powtórz technikę węzła kwadratowego z kroku 3.8, aby przywiązać ksenoprzeszczep do ścięgna dystalnego (Rycina 2H,I).
    UWAGA: Tętnica i żyła kostki przyśrodnia mogą znajdować się blisko lub na wierzchu dystalnego ścięgna PL. Nie przeprowadzaj szwów przez te naczynia ani wokół nich. Łatwo jest rozpoznać nieprawidłowe umiejscowienie szwu, ponieważ naczynia pobleją lub zaczną krwawić. Jeśli tak się stanie, usuń szew i umieść go w innym miejscu.
  10. Naciągnij skórę nad mięśniem z ksenoprzeszczepem, zaklej klejem chirurgicznym i załóż 2-3 zszywki chirurgiczne nad nacięciem (Rycina 2J).
  11. Umieść mysz w czystej klatce na podgrzewanej podkładce do rekonwalescencji. Monitoruj mysz do czasu pełnego odzyskania przytomności, a następnie okresowo w ciągu następnych kilku dni pod kątem objawów miejscowej lub systemowej infekcji oraz aby upewnić się, że miejsce operowane nie otworzyło się.
    UWAGA: Pojedyncza dawka leku przeciwbólowego, zgodnie z opisem w kroku 2.1, jest zazwyczaj wystarczająca do uśmierzenia bólu. Należy jednak monitorować myszy pod kątem uporczywego bólu (np. kulawizna, zwichrzona sierść, zgarbiona postawa) i w razie potrzeby podać kolejną dawkę leku przeciwbólowego 24 h po operacji.

4. Pobieranie ksenoprzeszczepów

UWAGA: Ksenoprzeszczepy są zazwyczaj pobierane od 4 do 6 miesięcy po operacji. Jednakże, pobieranie przeprowadzano nawet do 12 miesięcy po operacji.

  1. Umieścić przykryty zlew zawierający 20 ml 2-metylobutanu w pojemniku z suchym lodem na minimum 30 min przed pobraniem ksenoprzeszczepu.
  2. Wprowadzić znieczulenie przy użyciu 3% izofluranu w komorze indukcyjnej. Po osiągnięciu odpowiedniej głębokości znieczulenia zmniejszyć ustawienie parownika do 1,5% na pozostałą część zabiegu.
  3. Przenieś mysz z komory indukcyjnej do układu oddechowego Maplesona E, umieszczonego pod stereomikroskopem.
  4. Usuń owłosienie znajdujące się nad mięśniem piszczelowym przednim od kostki do kolana, używając trymera oraz kremu do depilacji. Przez skórę widoczne są szwy utrzymujące ksenoprzeszczep na miejscu (Rysunek 3A).
  5. Przytwierdź kończynę taśmą, a następnie za pomocą nożyczek i pęsety irysowej rozetnij skórę nad ksenoprzeszczepem, aż oba szwy staną się widoczne (Rysunek 3B). Skórę pokrywającą ksenoprzeszczep można usunąć w sposób pokazany na filmie, aby ułatwić wyjęcie ksenoprzeszczepu.
  6. Użyj skalpela, aby przeciąć tkankę pomiędzy ksenoprzeszczepem a kością piszczelową (Rysunek 3B, strzałka oznacza początkowe miejsce i kierunek nacięcia). Pozwoli to na uwolnienie jednej strony ksenoprzeszczepu.
  7. Użyć skalpela, aby przeciąć tkankę między mięśniem PL a mięśniem brzuchatym łydki (Rycina 3C, inacięcie wzdłuż epimysjum oznaczone strzałką). PL zostanie usunięty wraz z ksen przeszczepem.
  8. Przetnij poniżej szwu dystalnego i przez dystalną część ścięgna PL (Rycina 3D, wyciąć wzdłuż linii przerywanej).
  9. Usuń ksen przeszczep i więzadło PL, chwytając szew pęsetą irydową i odchylając go w stronę kolana, a następnie użyj nożyczek, aby odciąć go od znajdującego się pod spodem mięśnia (Rysunek 3E).
  10. Przetnij nożyczkami powyżej szwu proksymalnego, aby usunąć ksenoprzeszczep oraz PL (Rysunek 3Fwyciąć wzdłuż linii przerywanej w 3E).
  11. Umieść preparat na niewielkim kawałku tektury lub tworzywa sztucznego i przytwierdź go szpilkami tak blisko szwów, jak to możliwe. Podczas przypinania preparatu delikatnie rozciągnij mięsień, aby zapewnić zachowanie orientacji włókien podczas procesu szybkiego mrożenia. Po stabilnym umocowaniu szpilek przesuń mięsień w górę szpilek, tak aby spoczywał tuż nad tekturą.
    UWAGA: Alternatywnie jeden koniec ksenoprzeszczepu można zamocować w tragakancie na korku lub całkowicie zanurzyć w związku do optymalnego mrożenia tkanek (O.C.T.) w formie do krioembeddingu. Przy zachowaniu należytej staranności obie metody pozwalają na zachowanie konformacji mięśnia.
  12. Szybko zamrozić ksenoprzeszczep w schłodzonym 2-metylobutanie.
  13. Przechowywać ksenoprzeszczep w temperaturze -80 °C.
  14. Bezpośrednio po pobraniu ksenoprzeszczepu przeprowadzić eutanazję myszy zgodnie z wytycznymi American Veterinary Medical Association:
    1. Umieść myszy w szczelnej komorze z odpowiednim systemem odprowadzania gazów odpadowych. Do indukcji znieczulenia zastosuj izofluran w stężeniu 3-4%.
    2. Po osiągnięciu odpowiedniej głębokości znieczulenia — ocenianej na podstawie częstości oddechów, rozluźnienia mięśni oraz braku ruchów dobrowolnych — należy zwiększyć ustawienie waporyzatora do 5% w celu wywołania śmierci. Pozostawić myszy w komorze przez dodatkowe 2 min po ustaniu oddechów. Śmierć stwierdza się poprzez obserwację braku regeneracji myszy w ciągu 10 min po przedawkowaniu izofluranu.
    3. Na koniec przeprowadź u myszy zwichnięcie karku.
      UWAGA: W przypadku myszy z ksenoprzeszczepami obustronnymi, ksenoprzeszczep przeciwstawny można zachować do późniejszej kolekcji. Aby przeprowadzić kolekcję przeżywalności, należy naciąć skórę nad ksenoprzeszczepem pojedynczym prostym cięciem za pomocą nożyczek chirurgicznych, a następnie usunąć ksenoprzeszczep zgodnie z opisem w krokach od 4.6 do 4.10. Następnie należy zamknąć skórę nad pustą przestrzenią piszczelową, używając kleju chirurgicznego i zszywek. Myszy należy podać środek przeciwbólowy zgodnie z opisem w kroku 2.1, a następnie umieścić zwierzę w czystej klatce na ogrzewanej podkładce w celu rekonwalescencji. Należy monitorować mysz aż do pełnego odzyskania przytomności, a w kolejnych dniach okresowo sprawdzać, czy nie występują objawy miejscowej lub systemowej infekcji oraz czy miejsce operacyjne nie rozwarstwiło się.

5. Immunohistochemia ksenoprzeszczepów

  1. Za pomocą kriotomatu wykonać przekroje o grubości 10 do 12 μm z zebranego ksenoprzeszczepu na szkiełka dodatnio naładowane (Tabela materiałów).
  2. Napełnić naczynie do barwienia metanolem i schłodzić w temperaturze -20 °C przez 30 min.
  3. Umieścić szkiełka w lodowatym metanolu na 10 min w celu utrwalenia i permeabilizacji przekrojów ksenoprzeszczepu.
  4. Umieścić szkiełka w naczyniu do barwienia i przemyć 3x solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) przez 5 min.
  5. Zablokować przeciwciałami anty-mysimi IgG (Tabela materiałów) przez 2 h w temperaturze 4 °C.
  6. Inkubować z przeciwciałami pierwotnymi, takimi jak spektryna, laminy A/C i embrionalna miozyna (Tabela materiałów) w PBS z dodatkiem 2% surowicy koziej przez noc w temperaturze 4 °C.
  7. Umieścić szkiełka w naczyniu do barwienia i przemyć 3x solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) przez 5 min.
  8. Inkubować z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z barwnikiem fluorescencyjnym (Tabela materiałów) w PBS z dodatkiem 2% surowicy koziej przez 1 h w temperaturze pokojowej.
  9. Umieścić szkiełka w naczyniu do barwienia i przemyć 3x solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) przez 5 min.
  10. Nanieść medium montażowe (Tabela materiałów) na przekroje ksenoprzeszczepu, nałożyć szkiełko nakrywki i uszczelnić ją lakierem do paznokci.

Seria sekcji anatomicznych mięśni; etapy ukazujące struktury EDL, TA i PL; badanie naukowe.
Rysunek 2: Operacja przeszczepu ksenogenicznego. (A) Owłosienie zostaje usunięte z pola operacyjnego. (B) Wykonano nacięcie nad mięśniem piszczelowym przednim (TA). Dystalne ścięgna mięśnia TA oraz mięśnia prostownika długiego palców (EDL) zaznaczono strzałkami. Czarna przerywana linia wskazuje miejsce przecięcia epymyzjum w kroku 3.3. (C) Dystalna część ścięgna m. TA zostaje przecięta, a mięsień odciągnięty w kierunku kolana. (D) Ścięto ścięgno mięśnia prostownika długiego palców (EDL), a następnie odciągnięto EDL w górę w stronę kolana. Uwidacznia to proksymalną część ścięgna mięśnia strzałkowego długiego (PL), oznaczoną strzałką. Linie przerywane wskazują miejsce cięcia nożyczkami w celu usunięcia EDL (kolor zielony) i PL (kolor niebieski). (E) Usunięto mięsień piszczelowy długi (EDL) oraz mięsień trójgłowy łydki (TA). (F) Szew zostaje umieszczony w proksymalnej części ścięgna mięśnia długiego odcinka przyśrodkowego (PL). (GKsenoprzeszczep umieszcza się w pustym przedziale piszczelowym i przyszywa do proksymalnego końca ścięgna mięśnia płaszczowatego długiego (PL) za pomocą chirurgicznego węzła kwadratowego wiązanego dwiema rękami.H) Szew zostaje przeprowadzony przez dystalny koniec ścięgna PL (oznaczony strzałką), a następnie przy użyciu drugiego dwuręcznego chirurgicznego węzła kwadratowego wszywa się ksenoprzeszczep do ścięgna dystalnego. (IKsenoprzeszczep zostaje w pełni wszczepiony i zaszyty do PL.J) Skórę zamyka się za pomocą kleju chirurgicznego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Sekwencja procedury chirurgicznej na modelu szczura, schemat przedstawiający etapy nacięcia i preparacji mięśni.
Rysunek 3: Pobranie ksenoprzeszczepów po 4 miesiącach. (A) Włosy zostają usunięte z pola operacyjnego. Szwy są widoczne pod skórą. (B) Usunięto skórę pokrywającą ksenoprzeszczep. Następnie ksenoprzeszczep uchwycono pęsetą irydologiczną w miejscu dystalnego szwu i delikatnie pociągnięto do góry. Rozpoczynając od kostki, skalpelem wykonano nacięcie wzdłuż kości piszczelowej, aby uwolnić ksenoprzeszczep. Strzałka wskazuje miejsce rozpoczęcia nacięcia wzdłuż kości piszczelowej. (COdsuwając mięsień brzuchaty łydki na bok, staje się widoczna słaba biała linia epimysjum oddzielająca mięsień strzałkowy długi (PL) od mięśnia brzuchatego łydki (wskazana strzałką). Za pomocą skalpela należy przeciąć wzdłuż tej linii, aby oddzielić mięsień PL od pozostałych mięśni kończyny.DPrawa strona ksenoprzeszczepu oraz PL są teraz oddzielone od pozostałych mięśni nogi i są gotowe do usunięcia. Linia przerywana wskazuje miejsce nacięcia nożyczkami chirurgicznymi w celu rozpoczęcia usuwania ksenoprzeszczepu i PL.EPo przecięciu poniżej szwu dystalnego odchyl ksenoprzeszczep w stronę kolana. Linia przerywana wskazuje miejsce cięcia nożyczkami chirurgicznymi w celu usunięcia ksenoprzeszczepu oraz więzadła PL z przedziału piszczelowego.F) Pusta komora piszczeli po pomyślnym usunięciu ksenoprzeszczepu i PL. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jak wykazali Yuanfan Zhang i współpracownicy, ten protokół chirurgiczny jest prostą metodą wytwarzania ksenoprzeszczepów ludzkiego mięśnia szkieletowego8. Zregenerowane ksenoprzeszczepy ulegają spontanicznej innerwacji i wykazują funkcjonalną kurczliwość. Ponadto ksenoprzeszczepy mięśni od pacjentów z FSHD odwzorowują zmiany w ekspresji genów obserwowane u pacjentów z FSHD8.

W naszym doświadczeniu około 7 na 8 ksenoprzeszczepów wykonanych z próbe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów są innowacyjnym sposobem modelowania chorób mięśni i przeprowadzania badań przedklinicznych. Opisana tutaj metoda tworzenia ksenoprzeszczepów mięśni szkieletowych jest szybka, prosta i powtarzalna. Operacje jednostronne można wykonać w ciągu 15 do 25 minut lub obustronne w ciągu 30 do 40 minut. Obustronne ksenoprzeszczepy mogą zapewnić dodatkową elastyczność eksperymentalną. Na przykład, naukowcy mogą przeprowadzić miejscowe leczenie jednego ksenoprzeszczepu, z drugim pozostawiony...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Stowarzyszenie Zapalenia Mięśni i Fundację Petera Bucka. Chcielibyśmy podziękować dr Yuanfan Zhang za podzielenie się swoją wiedzą i szkoleniem w zakresie techniki chirurgicznej ksenoprzeszczepu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szalka Petriego 100 mm x 15 mmFisher ScientificFB0875712
2-metylobutanFisherO3551-4
Szkło z mikro pokrywą 20 mm x 30 mmVWR48393-151
Waga dla zwierzątKent ScientificSCL-1015
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczyCorning, Cellgro30-004-CI
AutoClip SystemFST12020-00
Castroviejo Uchwyt na igłyFST12565-14
Ekstrakt z zarodków pisklątDokładnykriostat
CM1860Leica BiosystemsCM1860UV
CoplinThermo Scientific19-4
Szpilki preparacyjneFisher ScientificS13976
Suchy lód - granulatFisher ScientificNC9584462
Embrionalne przeciwciało miozynyDSHBF1.652zalecane stężenie 1:10
EtanolFisher Scientific459836
Płodowa surowica bydlęcaGE Healthcare Life SciencesSH30071.01
Fiber-Lite MI-150Dolan-JennerMi-150
KleszczeFST11295-20
Kozia anty-mysie IgG1, Alexa Fluor 488InvitrogenA-21121zalecane stężenie 1:500
Kozia anty-mysia IgG2b, AlexaFluor 594InvitrogenA-21145zalecane stężenie 1:500
Guma tragakantowaSigmaG1128
Szynki F-10 MediumCorning10-070-CV
Histoacryl Blue Miejscowy klejdo skóry Uszczelka tkankowaTS1050044FP
Przeciwciało A / C specyficzne dla ludzkiej laminyAbcamab40567Zalecane stężenie 1:50-1:100
Ludzkie przeciwciało spektrynowe swoisteLeica BiosystemsNCLSPEC1zalecane stężenie 1:20-1:100
Komora indukcyjnaVetEquip941444
Kleszcze do tęczówkiFST11066-07
Napromieniowane globalnie 2018 (Uniprim 4100 ppm)EnvigoTD.06596Antybiotykowa dieta dla gryzoni w celu ochrony przed infekcjami dróg oddechowych
IsofluraneMWI Veterinary Supply502017
KimwipesKimberly-Clark34155chusteczki chirurgiczne
Mapleson E Breathing CircuitVetEquip921412
MetanolFisher ScientificA412
Mobilna maszyna anestezjologicznaVetEquip901805
Zestaw podstawowy myszy na myszyVector LaboratoriesBMK-2202odczynnik blokujący IgG mysz
Lakier do paznokciMikroskopia elektronowa Sciences72180
NAIR Balsam/olejek do usuwania włosówFisher ScientificNC0132811
NOD-Rag1null IL2rg null (NRG)Laboratorium Jacksona0077992 do 3 miesięcy
Związek O.C.T.Fisher Scientific23-730-571
TlenAirgasOX USPEA
PBS (buforowany solą fizjologiczną)Fisher Scientific4870500
Jod powidonu Roztwór przygotowawczyDynarex1415
ProLong™ Złoty uchwyt AntifadeFisher ScientificP10144 (bez DAPI); P36935 (z DAPI)
Maść oftalmiczna PuralubeDechra17033-211-38
Rimadyl (karprofen) do wstrzykiwańPatterson Veterinary10000319chirurgiczny środek przeciwbólowy, podawany podskórnie w dawce 5 mg / kg
Ostrza skalpela - #11FST10011-00
Rękojeść skalpela - #3FST10003-12
Stereo MikroskopAccu-scope3075
Superfrost Plus Szkiełka mikroskopoweFisher Scientific12-550-15
Szew, syntetyczny, niewchłanialny, 30 cali długości, igła CV-11CovidienVP-706-X
1ml Strzykawka (26 gauge, igła 3/8 cala)do 329412BD Biosciences
Kent ScientificCL9990-KIT
Nożyczki sprężynowe Vannas, krawędź tnąca 8,0 mmFST15009-08
Filtr z węglem aktywnym VaporGaurdVetEquip931401
Klipsy do nawijania, 9 mmFST12022-09
UV CE650TL Słoik do barwienia Trymer

Bibliografia

  1. Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 0, 1-14 (2018).
  2. Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32, 40-51 (2014).
  3. Perel, P., et al. Comparison of treatment effects between animal experiments and clinical trials: systematic review. BMJ. 334, 1-6 (2007).
  4. Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
  5. Roberts, K. G., et al. Targetable Kinase-Activating Lesions in Ph-like Acute Lymphoblastic Leukemia. New England Journal of Medicine. 371, 1005-1015 (2014).
  6. Kim, J., et al. GDF11 Controls the Timing of Progenitor Cell Competence in Developing Retina. Science. 308, 1927-1930 (2005).
  7. Sako, D., et al. Characterization of the ligand binding functionality of the extracellular domain of activin receptor type IIB. Journal of Biological Chemisty. 285, 21037-21048 (2010).
  8. Zhang, Y., et al. Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders. Human Molecular Genetics. 23, 3180-3188 (2014).
  9. Gabellini, D., Green, M. R., Tupler, R. Inappropriate Gene Activation in FSHD : A Repressor Complex Binds a Chromosomal Repeat Deleted in Dystrophic Muscle. Cell. 110, 339-348 (2002).
  10. Lemmers, R. J. L. F., et al. A Unifying Genetic Model for Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy. Science. 329, 1650-1654 (2010).
  11. Chen, J. C. J., et al. Morpholino-mediated Knockdown of DUX4 Toward Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy Therapeutics. Molecular Therapy. 24, 1405-1411 (2016).
  12. Medical Research Council. Aids to the investigation of the peripheral nervous system. , Her Majesty’s Stationary Office. London. (1943).
  13. Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21, 2348-2356 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Ksenoprzeszczepy ludzkich mięśnitransplantacja mięśni szkieletowychmodelowanie chorób mięśniprzedkliniczne testy terapeutyczneprzygotowanie biopsji mięśniaregeneracja ksenoprzeszczepuizolacja włókien mięśniowychbarwienie miozyny embrionalnejidiopatyczna zapalna miopatia
Wykonywanie ksenoprzeszczepów mięśni szkieletowych u myszy z niedoborem odporności
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.