Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Specyficzny dla cyklu komórkowego pomiar γH2AX i apoptozy po stresie genotoksycznym za pomocą cytometrii przepływowej

12.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59968

⸱

1 września 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1CCU Molecular and Radiation Oncology, German Cancer Research Center, 2Department of Radiation Oncology, Heidelberg University Hospital, 3Department of Radiation Oncology, Freiburg University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowana metoda łączy ilościową analizę pęknięć dwuniciowych DNA (DSB), dystrybucji cyklu komórkowego i apoptozy, aby umożliwić specyficzną dla cyklu komórkowego ocenę indukcji i naprawy DSB, jak również konsekwencji niepowodzenia naprawy.

Streszczenie

Przedstawiona metoda lub nieco zmodyfikowane wersje zostały opracowane do badania konkretnych odpowiedzi na leczenie i skutków ubocznych różnych terapii przeciwnowotworowych stosowanych w onkologii klinicznej. Umożliwia ilościową i podłużną analizę odpowiedzi na uszkodzenia DNA po stresie genotoksycznym, wywołanym radioterapią i wieloma lekami przeciwnowotworowymi. Metoda obejmuje wszystkie etapy odpowiedzi na uszkodzenie DNA, zapewniając punkty końcowe dla indukcji i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA (DSB), zatrzymania cyklu komórkowego i śmierci komórki przez apoptozę w przypadku niepowodzenia naprawy. Połączenie tych pomiarów dostarcza informacji na temat efektów leczenia zależnych od cyklu komórkowego, a tym samym umożliwia dogłębne badanie wzajemnych zależności między proliferacją komórkową a mechanizmami radzenia sobie z uszkodzeniem DNA. Ponieważ działanie wielu leków przeciwnowotworowych, w tym chemioterapeutyków i promieniowania jonizującego, jest ograniczone lub silnie różni się w zależności od określonych faz cyklu komórkowego, analizy korelacyjne opierają się na solidnej i wykonalnej metodzie oceny wpływu leczenia na DNA w sposób specyficzny dla cyklu komórkowego. Nie jest to możliwe w przypadku testów z pojedynczym punktem końcowym, co stanowi istotną zaletę prezentowanej metody. Metoda nie jest ograniczona do żadnej konkretnej linii komórkowej i została dokładnie przetestowana na wielu liniach komórek nowotworowych i normalnych tkankowych. Może być szeroko stosowany jako kompleksowy test genotoksyczności w wielu dziedzinach onkologii poza radioonkologią, w tym w ocenie środowiskowych czynników ryzyka, badaniach przesiewowych leków i ocenie niestabilności genetycznej w komórkach nowotworowych.

Wprowadzenie

Celem onkologii jest zabijanie lub inaktywacja komórek rakowych bez uszkadzania normalnych komórek. Wiele terapii bezpośrednio lub pośrednio indukuje stres genotoksyczny w komórkach nowotworowych, ale także w pewnym stopniu w normalnych komórkach. Chemioterapia lub leki celowane są często łączone z radioterapią w celu zwiększenia wrażliwości radioterapii napromieniowanego nowotworu1,2,3,4,5, co pozwala na zmniejszenie dawki promieniowania w celu zminimalizowania normalnego uszkodzenia tkanek.

Promieniowanie jonizujące i inne czynniki genotoksyczne wywołują różne rodzaje uszkodzeń DNA, w tym modyfikacje zasad, wiązania krzyżowe nici oraz pęknięcia jedno- lub dwuniciowe. Pęknięcia dwuniciowe DNA (DSB) są najpoważniejszymi zmianami w DNA, a ich indukcja jest kluczem do zabijania komórek przez promieniowanie jonizujące i różne leki cytostatyczne w radiochemioterapii. DSB nie tylko szkodzą integralności genomu, ale także sprzyjają powstawaniu mutacji6,7. Dlatego podczas ewolucji rozwinęły się różne szlaki naprawy DSB i mechanizmy eliminacji nieodwracalnie uszkodzonych komórek, takich jak apoptoza. Cała odpowiedź na uszkodzenie DNA (DDR) jest regulowana przez złożoną sieć szlaków sygnałowych, które sięgają od rozpoznawania uszkodzeń DNA i zatrzymania cyklu komórkowego, aby umożliwić naprawę DNA, do zaprogramowanej śmierci komórki lub inaktywacji w przypadku niepowodzenia naprawy8.

Przedstawiona metoda cytometrii przepływowej została opracowana do badania DDR po stresie genotoksycznym w jednym kompleksowym teście, który obejmuje indukcję i naprawę DSB, a także konsekwencje niepowodzenia naprawy. Łączy w sobie pomiar szeroko stosowanego markera DSB γH2AX z analizą cyklu komórkowego i indukcją apoptozy, przy użyciu klasycznej analizy subG1 i bardziej szczegółowej oceny aktywacji kaspazy-3.

Połączenie tych punktów końcowych w jednym teście nie tylko redukuje czas, robociznę i koszty, ale także umożliwia specyficzny dla cyklu komórkowego pomiar indukcji i naprawy DSB, a także aktywację kaspazy-3. Takie analizy nie byłyby możliwe w przypadku niezależnie przeprowadzonych testów, ale są one bardzo istotne dla kompleksowego zrozumienia reakcji na uszkodzenie DNA po stresie genotoksycznym. Wiele leków przeciwnowotworowych, takich jak związki cytostatyczne, jest skierowanych przeciwko dzielącym się komórkom, a ich skuteczność jest silnie uzależniona od etapu cyklu komórkowego. Dostępność różnych procesów naprawy DSB zależy również od etapu cyklu komórkowego i wyboru ścieżki, co ma kluczowe znaczenie dla dokładności naprawy, a to z kolei decyduje o losie komórki9,10,11,12. Ponadto pomiar poziomów DSB specyficzny dla cyklu komórkowego jest dokładniejszy niż analiza zbiorcza, ponieważ poziomy DSB są zależne nie tylko od dawki związku genotoksycznego lub promieniowania, ale także od zawartości DNA w komórce.

Metoda została wykorzystana do porównania skuteczności różnych radioterapii w celu pokonania mechanizmów oporności w glejaku13 oraz do zbadania wzajemnych zależności między promieniowaniem jonizującym a lekami celowanymi w kostniakomięsaku14,15 i atypowe teratoidalne raki rabdoidowe16. Dodatkowo, opisana metoda jest szeroko stosowana do analizy skutków ubocznych radio- i chemioterapii na mezenchymalne komórki macierzyste17,18,19,20,21,22,23,24, które są niezbędne do naprawy prawidłowych uszkodzeń tkanek wywołanych leczeniem i mają potencjalne zastosowanie w medycynie regeneracyjnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie

  1. Przygotować ≥1 x 105 komórek/próbkę w dowolnym naczyniu hodowlanym jako materiał wyjściowy.
    1. Na przykład przeprowadź eksperyment z przebiegiem czasu po wystawieniu komórek glejaka U87 na promieniowanie jonizujące: napromieniuj sub-konfluentne komórki U87 w kolbach T25 w trzech egzemplarzach dla każdego punktu czasowego. Wybierz wczesne punkty czasowe (15 minut do 8 godzin po napromieniowaniu), aby śledzić kinetykę naprawy DSB (poziom γH2AX) i późne punkty czasowe (24 godziny do 96 godzin), aby ocenić resztkowe poziomy DSB, efekty cyklu komórkowego i apoptozę.
      nuta: Protokół nie ogranicza się do eksperymentów z napromienianiem ani żadnej konkretnej linii komórkowej. Został przetestowany na wielu liniach komórkowych wszystkich typów, z różnych gatunków i pod kątem różnych warunków leczenia.
  2. Przygotuj następujące roztwory, w tym 10% nadmiaru objętości.
    1. Przygotować 2 ml na próbkę roztworu utrwalającego składającego się z 4,5% paraformaldehydu (PFA) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Przygotuj roztwór na świeżo. Rozcieńczyć PFA w PBS przez podgrzanie do temperatury 80 °C, powoli mieszając pod wyciągiem. Przykryj kolbę folią aluminiową, aby zapobiec utracie ciepła. Pozwól roztworowi ostygnąć do temperatury pokojowej i dostosuj ostateczną objętość. Przepuścić roztwór przez złożony filtr celulozowy klasy 3hw (patrz Tabela Materiałów).
      ostrożność: Opary PFA są toksyczne. Wykonaj ten krok pod wyciągiem i odpowiednio zutylizuj odpady PFA.
    2. Przygotować 3 ml na próbkę roztworu do permeabilizacji składającego się z 70% etanolu w lodowatymH2O. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
    3. Przygotować 7 ml na próbkę roztworu płuczącego składającego się z 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS.
    4. Przygotować 100 μl na próbkę 3% BSA w PBS jako rozcieńczalnik przeciwciał.
    5. Przygotować 100-250 μl na próbkę roztworu do barwienia DNA składającego się z 1 μg/ml 4',6-diamidyn-2-fenylindoldolu (DAPI) w PBS.
  3. Ustawić wirówkę dla probówek o pojemności 15 ml na 5 minut przy 200 x g i temperaturze 7 °C. Poczekaj, aż wirówka ostygnie i użyj tych ustawień dla wszystkich etapów wirowania.

2. Pobieranie próbek

  1. W przypadku przetwarzania komórek adherentnych (np. komórek glejaka U87 wyhodowanych w kolbach T25 z 5 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą w temperaturze 37 °C i 5% atmosferze dwutlenku węgla), należy postępować zgodnie z krokami 2.1.1 i 2.1.2. W przypadku komórek zawiesiny należy przejść bezpośrednio do kroku 2.1.2.
    1. Zebrać pożywkę w probówce wirówkowej. Odłączyć komórki przy użyciu rutynowej metody hodowli komórkowej, która może obejmować użycie trypsyny, kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) lub innych środków oddzielających komórki.
      1. W przypadku komórek U87 należy podgrzać PBS i trypsynę/EDTA (patrz tabela materiałów) do temperatury 37 °C, przemyć warstwę komórkową 1 ml PBS, inkubować komórki przez 1-2 minuty z 1 ml trypsyny/EDTA i wspomóc oderwanie komórek, stukając w kolbę. Zebrać cały roztwór płuczący i zawiesinę komórek w probówce z pożywką.
    2. Odwirować komórki, wyrzucić pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS.
  2. Kilkakrotnie pipetować komórki w górę i w dół, aby zapewnić zawiesinę pojedynczej komórki i przenieść zawiesinę komórek do probówki z 2 ml roztworu utrwalającego (4,5% PFA/PBS, 3% stężenie końcowe).
    ostrożność: Opary PFA są toksyczne. Wykonaj ten krok pod wyciągiem i odpowiednio zutylizuj odpady PFA.
  3. Inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Odwirować komórki i odrzucić supernatant przez dekantację.
  5. Poluzuj osad komórek, stukając w rurkę i ponownie zawieś komórki w 3 ml 70% etanolu. Przejdź bezpośrednio do następnego kroku lub przechowuj próbki w temperaturze 4 °C przez okres do kilku tygodni.

3. Mycie i barwienie

  1. Odwirować komórki i odrzucić supernatant przez dekantację.
  2. Poluzuj osad komórkowy, stukając w rurkę. Zawiesić komórki w 3 ml roztworu płuczącego (0,5% BSA/PBS), odwirować i wyrzucić supernatant.
  3. Powtórz etap mycia 1x z 3 ml, a następnie 1x z 1 ml roztworu myjącego. W ostatnim etapie należy ostrożnie wyrzucić supernatant przez pipetowanie. Uważaj, aby nie zassać granulki.
  4. Rozcieńczyć przeciwciała przeciwko γH2AX, fosfohistonowi H3 (Ser10) i kaspazie-3 (patrz tabela materiałów) w 100 μl/próbkę rozcieńczalnikiem przeciwciał (3% BSA/PBS).
  5. Poluzować osad komórkowy, stukając w probówkę i ponownie zawiesić komórki w 100 μl roztworu przeciwciała przygotowanego w kroku 3.4. Począwszy od tego etapu, należy przechowywać próbki w ciemności.
  6. Próbki należy inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  7. Odwirować komórki i ostrożnie odrzucić supernatant przez pipetowanie. Uważaj, aby nie zassać granulki.
  8. Poluzuj osad komórkowy, stukając w probówkę i ponownie zawieś komórki w 100-250 μl roztworu do barwienia DNA (1 μg/mL DAPI/PBS).
    1. Użyj 100 μl, jeśli obecne są 1-2 x105 komórek i zwiększ objętość dla większej liczby komórek (250 μl dla ≥1 x 106 komórek). Przejdź bezpośrednio do następnego kroku lub przechowuj próbki w ciemności w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
      nuta: W przypadku niektórych typów komórek optymalizacja stężenia DAPI może pomóc w poprawie separacji faz cyklu komórkowego.
  9. Odpipetować próbki przez nasadkę sitka w probówce z próbką o wielkości porów 35 μm.

4. Pomiar

  1. Umieścić próbki na lodzie, uruchomić cytometr przepływowy (patrz tabela materiałów) skonfigurowany z układem optycznym zgodnie z tabelą 1 i nacisnąć przycisk Prime. W razie potrzeby włącz laser ultrafioletowy (długość fali 355 nm) oddzielnie i ustaw moc na 20 mW za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
  2. Otwórz oprogramowanie do akwizycji (patrz Spis materiałów), zaloguj się i utwórz nowy eksperyment, klikając przycisk Nowy eksperyment na pasku narzędzi przeglądarki.
  3. Użyj okna Inspector (Inspektor), aby dostosować nazwę eksperymentu i wybierz opcję "5 Log Decades" (5 dekad logarytmicznych) do wyświetlenia wykresu.
  4. Kliknij przycisk Nowy próbk na pasku narzędzi przeglądarki i rozwiń nowy wpis, klikając symbol "+" po jego lewej stronie, aby wyświetlić pierwszą rurkę. Wybierz odpowiednią ikonę i typ, aby zmienić nazwę próbki (np. typ komórki) i probówkę (identyfikator próbki). Kliknij wskaźnik rury pierwszej rury (symbol przypominający strzałkę po jej lewej stronie), aby zmienić kolor na zielony (aktywny).
  5. Otwórz zakładkę Parametry w oknie Cytometr i wybierz parametry zgodnie z Tabelą 1. Usuń wszystkie niepotrzebne parametry.
    UWAGA: nazwy parametrów mogą się różnić w zależności od niestandardowych ustawień wstępnych (np. Cy3 zamiast Alexa555). Upewnij się, że wybór jest zgodny z filtrami optycznymi i detektorami w Tabeli 1. Ścieżki świetlne wszystkich fluoroforów są w tym układzie w pełni niezależne i kompensacja nakładania się widma nie jest wymagana; Może to być jednak konieczne, jeśli używana jest inna konfiguracja optyczna.
  6. Otwórz okno Arkusz roboczy i utwórz wykresy zgodnie z Rysunek 1. Narysuj 2 wykresy punktowe i 4 histogramy za pomocą odpowiednich przycisków paska narzędzi i kliknij etykiety osi, aby wybrać odpowiednie parametry (rozproszenie przednie (FSC-A) kontra rozproszenie boczne (SSC-A), DAPI-W kontra DAPI-A oraz histogram dla DAPI-A i każdego fluoroforu sprzężonego z przeciwciałami.
  7. Podłącz próbkę kontrolną do cytometru i naciśnij przycisk Uruchom na przyrządzie. Wybierz pierwszą rurkę w oknie przeglądarki oprogramowania i kliknij przycisk Uzyskaj dane na pulpicie nawigacyjnym akwizycji. Dostosuj objętość wtrysku próbki za pomocą przycisków Low, Mid lub High oraz pokrętła dostrajania na instrumencie. Najlepiej pracować na niskim ustawieniu, ale staraj się pozyskiwać co najmniej 100 zdarzeń na sekundę (patrz Pulpit nawigacyjny akwizycji).
  8. Dostosuj napięcia detektora dla FSC, SSC i DAPI w zakładce Parametry w oknie Inspektora, korzystając z wykresów kropkowych w Rysunek 1 jako wskazówkę. Przełącz na skalę logarytmiczną dla parametrów FSC i SSC, jeśli populacja komórek wydaje się zbyt rozproszona na skali liniowej.
  9. Naciśnij przycisk Standby na cytometrze i kontynuuj konfigurację arkusza roboczego w oprogramowaniu.
    1. Użyj narzędzia Bramka wielokątna, aby zdefiniować populację komórek na wykresie FSC-A i SSC-A, a narzędzia Bramka prostokątna, aby zdefiniować populację SingleCells na wykresie DAPI-W i DAPI-A. Naciśnij Ctrl + G, aby wyświetlić hierarchię populacji i kliknij domyślne nazwy bram, aby je zmienić.
    2. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy wszystkie histogramy i wybierz Pokaż populacje | SingleCells z menu kontekstowego.
  10. Zoptymalizuj napięcia detektora dla fluoroforów sprzężonych z przeciwciałami, aby pokryć pełny zakres dynamiki, następnie pobierając próbki kontrolne i poddane działaniu substancji. Zmaksymalizuj stosunek sygnału do szumu i unikaj nasycenia detektora. Upewnij się, że pik Alexa488 w populacji SingleCells nie jest obcięty w próbce kontrolnej ani poddanej działaniu środka.
  11. Naciśnij przycisk Standby na cytometrze i opcjonalnie wykonaj kroki 4.11.1-4.11.3 w oknie Arkusz roboczy oprogramowania, aby uzyskać przybliżone oszacowanie efektów leczenia podczas pobierania próbki.
    1. Wybierz pozycję SingleCells w hierarchii populacji i użyj narzędzia Bramka prostokątna, aby zdefiniować populację G1 na wykresie DAPI-W i DAPI-A. Kliknij prawym przyciskiem myszy histogram Alexa488 i wybierz Pokaż populacje | G1 z menu kontekstowego.
    2. Kliknij prawym przyciskiem myszy histogram Alexa488 i wybierz Utwórz widok statystyk z menu kontekstowego. Kliknij prawym przyciskiem myszy widok statystyk i wybierz polecenie Edytuj widok statystyk. Przejdź do zakładki Statystyki i zaznacz pole wyboru dla mediany sygnału Alexa488 w populacji G1 (dezaktywuj wszystkie inne opcje).
    3. Wybierz SingleCells w hierarchii populacji i użyj narzędzia Interval Gate, aby zdefiniować populacje subG1, M i Casp3+ w histogramach DAPI-A, Alexa555-A (Cy3-A w Rysunek 1) i Alexa647-A.
  12. Naciśnij przycisk Uruchom na cytometrze i zmierz próbki za pomocą pulpitu akwizycji w oprogramowaniu. Ustaw bramkę zatrzymującą na Wszystkie zdarzenia lub bramkę komórek (jeśli występuje wiele małych cząstek), a liczbę zdarzeń do zarejestrowania na 10 000.
  13. Kliknij przycisk Następna rura, aby utworzyć nową próbkę, zmień jej nazwę w oknie przeglądarki, kliknij opcję Pobierz dane, aby rozpocząć pobieranie i kliknij pozycję Nagraj dane, aby rozpocząć nagrywanie.
  14. Wybierz punkt menu Plik | Eksport | FCS z paska menu, aby wyeksportować dane. Opcjonalnie wybierz punkt menu Plik | Eksport | Eksperymenty, aby zapisać eksperyment jako dodatkowy plik zip, aby umożliwić ponowne zaimportowanie eksperymentu w późniejszym czasie.
    nuta: Konfigurację istniejących eksperymentów można łatwo ponownie wykorzystać za pomocą punktu menu Edycja | Duplikat bez danych.

5. Ocena danych

  1. Przeciągnij i upuść pliki ".fcs" do przeglądarki próbek w oprogramowaniu do analizy cytometrii przepływowej (patrz tabela materiałów). Zastosuj strategię bramkowania pokazaną w Rysunek 2. Upewnij się, że bramki pasują do odpowiedniej populacji we wszystkich próbkach przed przystąpieniem do następnej bramki potomnej.
    1. Aby zastosować zmiany do wszystkich próbek, wybierz zmienioną bramkę w przeglądarce próbek, skopiuj ją, naciskając Ctrl + C, wybierz bramkę nadrzędną, naciśnij Ctrl + Shift + E, aby wybrać równoważne węzły we wszystkich próbkach i naciśnij Ctrl + V, aby wkleić lub zastąpić bramkę. Nie używaj bramek grupowych.
    2. Kliknij dwukrotnie pierwszą próbkę w przeglądarce, aby otworzyć wykres SSC-A vs. FSC-A. Użyj narzędzia Wielokąt na pasku narzędzi, aby zdefiniować populację komórek (Rysunek 2, wykres 1), wykluczając zanieczyszczenia z analizy. Upewnij się, że bramka jest wystarczająco szeroka w kierunku prawego górnego rogu, aby pomieścić zmiany związane z leczeniem, ale ogranicz granicę skierowaną do lewego dolnego rogu działki, aby niezawodnie wykluczyć komórkę.
    3. Kliknij dwukrotnie bramkę Komórki, aby otworzyć nowe okno wykresu i zmień osie na DAPI-W (pionowe) vs. DAPI-A (poziome), klikając etykiety osi. Użyj narzędzia Prostokąt, aby zdefiniować populację SingleCells (Rysunek 2, wykres 2), wyłączając z analizy dublety lub grudki komórek (dublety komórek G1 mają taką samą intensywność DAPI-A jak komórki G2 i M, ale znacznie wyższą wartość DAPI-W).
      nuta: Różna liczba komórek w różnych próbkach spowoduje zmiany w ogólnej sile sygnału DAPI-A z powodu równowagowego wiązania DAPI z DNA. Nie wpłynie to na analizę cyklu komórkowego, ale może być konieczne dostosowanie prawej granicy próbki pojedynczej bramki komórkowej po próbce, aby uwzględnić te przesunięcia.
    4. Kliknij dwukrotnie bramkę SingleCells, aby otworzyć nowe okno wykresu i zmień osie, aby pokazać histogram DAPI-A. Użyj narzędzia Dwusieczna, aby odróżnić pojedyncze komórki o normalnej zawartości DNA (populacja cyklu komórkowego) od komórek apoptotycznych ze zdegradowanym DNA (populacja subG1). Następnie wybierz nowe bramki w przeglądarce i naciśnij Ctrl + R, aby odpowiednio zmienić ich nazwy (Rysunek 2, wykres 3).
    5. Wybierz bramkę CellCycle w przeglądarce i wybierz Narzędzie | Biologia | Cykl komórkowy... z paska menu, aby otworzyć narzędzie do modelowania cyklu komórkowego. Wybierz Dean-Jett-Fox25,26 w sekcji Model, aby oszacować częstotliwość komórek w fazie G1, S i G2/M (Rysunek 2, wykres 4). Ograniczeń należy używać tylko w przypadku słabej wydajności modelowania (zminimalizować odchylenie średniej kwadratowej między modelem a danymi).
    6. Utwórz bramki dla fazy G1 (narzędzie Elipsa), S (narzędzie Wielokąt) i G2 + M (narzędzie Elipsa) na wykresie DAPI-W vs. DAPI-A populacji CellCycle, aby umożliwić pomiar γH2AX specyficzny dla cyklu komórkowego (Rysunek 2, wykres 5). Nie używaj narzędzia do modelowania do automatycznego bramkowania cyklu komórkowego na podstawie histogramu DAPI-A, ponieważ może to być niedokładne.
      nuta: Może być konieczne przesunięcie bramek wzdłuż osi DAPI-A próbka po próbce, aby uwzględnić wyżej wymienione przesunięcia w ogólnej sile sygnału DAPI. Przesuwaj tylko trzy bramki jako grupę i nie zmieniaj kształtu poszczególnych bramek, aby uniknąć stronniczości.
    7. Użyj narzędzia Dwusieczna, aby rozróżnić fosfo-histony H3-dodatnie (M) i -ujemne (M-) komórki na histogramie Alexa555-A populacji CellCycle (Rysunek 2, wykres 6). Przytrzymaj Ctrl i wybierz bramki G2 + M i M-. Naciśnij Ctrl + Shift + A, aby utworzyć bramkę G2 (G2 + M i M-).
    8. Użyj narzędzia Dwusieczna, aby rozróżnić komórki kaspazy-3-dodatnie (Casp3+) i -ujemne (Casp3-) na histogramie Alexa647-A populacji SingleCells (Rysunek 2, wykres 7). Ustaw próg tak, aby średnia populacji Casp3+ w nieleczonych kontrolach wynosiła ~0,8%, aby zapewnić wysoką czułość i zminimalizować różnice między testami.
    9. Naciśnij Ctrl + T, aby otworzyć Edytor tabel i skonfigurować go zgodnie z Rysunek 3. Przeciągnij i upuść różne populacje z przeglądarki próbki do Edytora tabel i kliknij dwukrotnie wiersze, aby zmienić ustawienia statystyki, parametrów i nazw. Usuń niepotrzebne wiersze, które są automatycznie dodawane po przeciągnięciu i upuszczeniu ikony modelowania cyklu komórkowego, zaznaczając wiersze i naciskając Del.
    10. Wybierz opcję Do pliku, format i miejsce docelowe w sekcji Wyjście wstążki menu, a następnie kliknij przycisk Utwórz tabelę, aby wyeksportować dane jako plik ".xlsx".
  2. Skorzystaj z oprogramowania do obliczania tabel (patrz tabela materiałów) w celu dalszej analizy danych zgodnie z plikiem uzupełniającym 1 (FACS_Analysis_Template_(1).xlsx).
    1. Skoryguj częstości komórek w różnych fazach cyklu komórkowego tak, aby ich suma wynosiła 100%, stosując wzór X' = X * 100 / Σ (wszystkie fazy cyklu komórkowego), gdzie X': wartość skorygowana, X: wartość surowa, do każdej fazy cyklu komórkowego.
      nuta: Odchylenia od sumy 100% występują z powodu niedokładności w modelowaniu cyklu komórkowego, ale zwykle są niewielkie (<5%).
    2. Znormalizuj medianę intensywności γH2AX do zawartości DNA w różnych fazach cyklu komórkowego, dzieląc wartości w fazie S przez 1,5, a w fazie G2 i M przez 2,0.
    3. Aby obliczyć połączony znormalizowany poziom γH2AX w całej populacji komórek, użyj wzoru IA = IG1 * G1 + IS * S + IG2 * G2 +I M * M, gdzieI A, IG1, I S, IG2, IM są znormalizowanymi medianami intensywności γH2AX odpowiednio dla wszystkich, G1, S, G2, M komórek i G1, S, G2, M to skorygowana częstość komórek w danej fazie cyklu komórkowego.
    4. Dla znormalizowanych poziomów γH2AX i częstości komórek subG1 i kaspazy-3-dodatnich odejmij średnią wartość nietraktowanych kontroli od każdej próbki.
    5. Obliczyć średnią i odchylenie standardowe każdego parametru ze wszystkich powtórzonych próbek, a następnie przedstawić wyniki na wykresach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ludzkie komórki glejaka U87 lub LN229 poddano napromieniowaniu dawką 4 Gy fotonów lub jonów węgla. Poziomy γH2AX specyficzne dla fazy cyklu komórkowego oraz apoptozę mierzono w różnych punktach czasowych do 48 h po napromieniowaniu, stosując przedstawioną tutaj metodę cytometrii przepływowej (Rysunek 3). W obu liniach komórkowych jony węgla wywołały wyższe szczytowe poziomy γH2AX, które spadały wolniej i pozostawały istotnie podwyższone od 24 do 48 h w porównaniu z napromieniowaniem fotonowy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisywana metoda jest łatwa w użyciu i oferuje szybki, dokładny i powtarzalny pomiar odpowiedzi na uszkodzenie DNA, w tym indukcję i naprawę pęknięcia podwójnej nici (DSB), efekty cyklu komórkowego i apoptozę śmierci komórki. Połączenie tych punktów końcowych zapewnia pełniejszy obraz ich wzajemnych relacji niż poszczególne testy. Metoda ta może być szeroko stosowana jako kompleksowe badanie genotoksyczności w dziedzinie biologii radiacyjnej, terapii i ochrony, a bardziej ogólnie w onkologii (np. do oceny środowiskowych ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy zespołowi Zakładu Cytometrii Przepływowej w Niemieckim Centrum Badań nad Rakiem (DKFZ) za wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 000 i mikro; Końcówki filtracyjne LNerbe plus07-693-8300
100-1,000 µ Pipeta LEppendorf3123000063
12 mm x 75 mm Probówki z nasadką sitka komórkowego, 35 &mikro; m rozmiar oczekBD Falcon352235
probówki 15 mlBD Falcon352096
200 &mikro; Końcówki filtra LNerbe plus07-662-8300
20-200 µ L pipetaEppendorf3123000055
4',6-Diamidin-2-fenylindol (DAPI)Sigma-AldrichD9542Rozpuścić w wodzie o stężeniu 200 &mikro; g/ml i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 ° C
Przeciwciało anty-H2A.X Phospho (Ser139) przeciwko H2A.X Fluor 488, RRID: AB_2248011BioLegend613406Rozcieńczyć 1:20
Alexa Fluor 647 Antyaktywne przeciwciało przeciw kaspazie-3 królika, AB_1727414Pharmingen560626Rozcieńczony 1:20
BD FACSPrzedstaw odchudzany BDBiosciences340345Do rutynowego czyszczenia cytometru po pomiarze
BD FACSRinse roztwórBD Biosciences340346Do rutynowego czyszczenia cytometru po pomiarze
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)BiochromL 182Rozpuścić w wodzie do stężenia 1x Zmodyfikowana
pożywka Eagle's Medium firmy Dulbecco ze stabilną glutaminąBiochromFG 0415Rutynowy materiał do hodowli komórkowej dla przykładowej linii komórkowej użytej w protokole
Absolutny etanolVWR20821.330
Oprogramowanie ExcelMicrosoft
FBS Superior (płodowa surowica bydlęca)BiochromS 0615Rutynowy materiał do hodowli komórek dla przykładowej linii komórkowej użytej w protokole
FlowJo v10 softwareLLCzamówienie
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01Podłoże do zatapiania do opcjonalnego przygotowania preparatów mikroskopowych z barwionych próbek
Filtry celulozowe składane, klasa 3hwNeoLab11416
Cytometr LSRII lub LSRFortessaBD Biosciences
MG132Calbiochem474787opcjonalny lek do apoptozy kontrola pozytywna
Multifuge 3SR+Heraeus
ParaformaldehydAppliChemA3813Przygotuj świeży 4,5% roztwór. Rozcieńczyć w PBS przez podgrzanie do 80 & deg; C z powolnym mieszaniem pod wyciągiem. Przykryj kolbę folią aluminiową, aby zapobiec utracie ciepła. Pozwól roztworowi ostygnąć do temperatury pokojowej i dostosuj ostateczną objętość. Przepuść roztwór przez filtr celulozowy.
Fosfo-histon H3 (Ser10) (D2C8) XP Królik mAb (koniugat Alexa Fluor® 555) RRID: AB_10694639Technologia sygnalizacji komórkowej#3475Rozcieńczony 3:200
PIPETBOY acu 2Integra Biosciences155 016
Pipety serologiczne, 10 mlCorning4488
Pipety serologiczne, 25 mlCorning4489
Pipety serologiczne, 5 mlCorning4487
SuperKillerTRAIL (zmodyfikowany ligand indukujący apoptozę związaną z TNF)BiomolAG-40T-0002-C020opcjonalny lek do apoptozy kontrola pozytywna
Kolby do hodowli komórkowych T25Greiner bio-one690160Rutynowy materiał do hodowli komórkowej dla przykładowej linii komórkowej stosowanej w protokole
Trypsin/EDTAPAN BiotechP10-025500Rutynowy materiał do hodowli komórkowej dla przykładowej linii komórkowej użytej w protokole
U87 MG komórki glejaka wielopostaciowegoATCCATCC-HTB-14Przykładowa linia komórkowa wykorzystana w protokole
online

Bibliografia

  1. Jensen, A., et al. Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518). BMC Cancer. 6, 122(2006).
  2. Oertel, S., et al. Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec). Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).
  3. Timke, C., et al. Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy. Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).
  4. Zhang, M., et al. Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761. Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).
  5. Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
  6. Hoeijmakers, J. H. DNA Damage, Aging, and Cancer. New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).
  7. Rodgers, K., McVey, M. Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).
  8. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives. Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  9. Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle. Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).
  10. Escribano-Díaz, C., et al. A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice. Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
  11. Bakr, A., et al. Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice. Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).
  12. Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation. Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).
  13. Lopez Perez, R., et al. DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells. Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).
  14. Oertel, S., et al. Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines. Radiation oncology. 6 (1), 119(2011).
  15. Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
  16. Thiemann, M., et al. In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model. Radiation Oncology. 7 (1), 52(2012).
  17. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).
  18. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy. Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).
  19. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition. Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).
  20. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin. Scientific Reports. 6, 20035(2016).
  21. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment. Scientific Reports. 6, 26645(2016).
  22. Rühle, A., et al. Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells. Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).
  23. Münz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312(2018).
  24. Rühle, A., et al. The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).
  25. Dean, P. N., Jett, J. H. Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry. Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).
  26. Fox, M. H. A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry. Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).
  27. Costes, S. V., Boissière, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts. Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).
  28. Meyer, B., Voss, K. -O., Tobias, F., Jakob, B., Durante, M., Taucher-Scholz, G. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6109-6118 (2013).
  29. Lopez Perez, R., et al. Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci. FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).
  30. Schipler, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice. Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).
  31. Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. DNA fragmentation by charged particle tracks. Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).
  32. Friedland, W., et al. Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping. Scientific Reports. 7, 45161(2017).
  33. Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy. Frontiers in Oncology. 6, 130(2016).
  34. Böcker, W., Iliakis, G. Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells. Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).
  35. Löbrich, M., et al. γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization. Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza cyklu komórkowegopomiar gamma-H2AXodpowiedź na uszkodzenia DNAdetekcja apoptozyzatrzymanie cyklu komórkowegonaprawa pęknięć dwuniciowych DNAfosfo-histona H3aktywacja kaspazy-3
Specyficzny dla cyklu komórkowego pomiar γH2AX i apoptozy po stresie genotoksycznym za pomocą cytometrii przepływowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.