Przedstawiamy protokół użycia mikromatrycy białkowej zbudowanej przez drukowanie antygenów grypy na szkiełkach pokrytych nitrocelulozą do jednoczesnego sondowania surowicy pod kątem wielu izotypów przeciwciał przeciwko ponad 250 antygenom z różnych szczepów wirusa, umożliwiając w ten sposób pomiar szerokości przeciwciał w surowicy dla różnych podtypów wirusa.
Artykuł metodologiczny
Wykorzystanie mikromacierzy antygenu grypy do pomiaru szerokości przeciwciał w surowicy w różnych podtypach wirusa
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wirus grypy pozostaje istotną przyczyną śmiertelności na całym świecie ze względu na ograniczoną skuteczność obecnie dostępnych szczepionek. Kluczowym wyzwaniem dla opracowania uniwersalnych szczepionek przeciw grypie jest duża różnorodność antygenowa wynikająca z dryfu antygenowego. Sprostanie temu wyzwaniu wymaga nowatorskich narzędzi badawczych do pomiaru zakresu przeciwciał w surowicy skierowanych przeciwko wielu szczepom wirusa w różnych podtypach antygenowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół analizy zakresu przeciwciał w surowicy przeciwko różnym szczepom wirusa grypy przy użyciu mikromacierzy białkowej antygenów grypy.
Ta mikrotablica antygenów grypy jest skonstruowana poprzez drukowanie oczyszczonych antygenów hemaglutyniny i neuraminidazy na membranie pokrytej nitrocelulozą za pomocą drukarki mikromatrycowej. Surowice ludzkie są inkubowane na mikromacierzy w celu wiązania przeciwciał przeciwko antygenom grypy. Przeciwciała drugorzędowe sprzężone z kropkami kwantowymi są używane do jednoczesnego wykrywania przeciwciał IgG i IgA wiążących się z każdym antygenem w mikromacierzy. Ilościowe wiązanie przeciwciał mierzy się jako intensywność fluorescencji za pomocą przenośnego imagera. Wykazano, że reprezentatywne wyniki wykazują odtwarzalność testu w pomiarze przeciwciał grypy swoistych dla podtypu i reagujących krzyżowo w surowicach ludzkich.
W porównaniu do tradycyjnych metod, takich jak ELISA, mikromatryca antygenu grypy zapewnia multipleksowane podejście o wysokiej przepustowości, zdolne do testowania setek surowic na wiele izotypów przeciwciał przeciwko setkom antygenów w krótkim czasie, a tym samym ma zastosowanie w nadzorze serologicznym i opracowywaniu szczepionek. Ograniczeniem jest niemożność odróżnienia przeciwciał wiążących od przeciwciał neutralizujących.
Wprowadzenie
Wirus grypy jest odpowiedzialny za utratę 20 milionów lat życia rocznie z powodu śmierci lub niepełnosprawności, w tym 1% wszystkich zgonów na całym świecie każdego roku, z nieproporcjonalnym wpływem na osoby starsze i populacje w tropikach i krajach rozwijających się1,2,3. Oprócz obciążenia chorobami wynikającymi z sezonowych epidemii, pojawienie się nowych szczepów grypy w wyniku reselekcji genetycznej, czy to naturalnie u wspólnych gospodarzy, czy też sztucznie w celu bioterroryzmu, może prowadzić do ogólnoświatowych pandemii o szybkim rozprzestrzenianiu się i wysokiej śmiertelności4,5. Chociaż obecnie dostępnych jest wiele szczepionek przeciw grypie, ich skuteczność jest ograniczona przez specyficzność podtypu6, co stwarza potrzebę opracowania uniwersalnych szczepionek przeciw grypie, które zapewniają długotrwałą odporność przeciwko wielu szczepom wirusa7.
Kluczowym wyzwaniem dla rozwoju uniwersalnych szczepionek przeciw grypie jest wysoka różnorodność antygenowa między szczepami. Specyficzność antygenowa obecnych szczepionek w połączeniu ze zmiennością antygenową krążących wirusów tworzy niezgodność między szczepami szczepionkowymi a krążącymi szczepami. Daje to ewolucyjną przewagę sprzyjającą dalszemu genetycznemu oddalaniu się od szczepów szczepionkowych podczas epidemii, często ograniczając skuteczność szczepionki do mniej niż 50%8,9. Dodatkowym źródłem niedopasowania antygenowego są mutacje wirusa adaptujące jaja powstające podczas produkcji szczepionki, które prowadzą do powstania przeciwciał, które słabo wiążą się z krążącymi wirusami10,11.
Pokonanie tego wyzwania wysokiej różnorodności antygenowej będzie wymagało nowych narzędzi badawczych, aby scharakteryzować zakres wcześniej istniejących i wywołanych odpowiedzi immunologicznych w klinicznie istotnych wariantach antygenowych w próbkach surowicy i błony śluzowej. Obecnie dostępne metody, w tym hamowanie hemaglutynacji (HAI), mikroneutralizacja (MN) i tradycyjny ELISA, ograniczają się do wykrywania przeciwciał przeciwko pojedynczemu szczepowi wirusa na raz, więc ich zastosowanie do wykrywania wielu izotypów przeciwciał przeciwko wielu szczepom wirusa szybko wyczerpuje dostępne próbki kliniczne i zasoby laboratoryjne. Ponadto HAI i MN wymagają hodowli żywych wirusów, która jest dostępna tylko w specjalistycznych laboratoriach.
Mikromacierze białkowe, potencjalnie składające się z tysięcy antygenów wydrukowanych na szkiełkach pokrytych nitrocelulozą, jak pokazano w Rysunek 1, mogą zaspokoić tę potrzebę12. Te mikromacierze mogą być produkowane i sondowane w sposób wysokoprzepustowy, przy jednoczesnym zużyciu niewielkich ilości próbek klinicznych w celu określenia ilościowych poziomów izotypu/podtypu przeciwciał przeciwko każdemu pojedynczemu antygenowi w macierzy. To podejście do odkrywania antygenów zostało zastosowane do diagnostyki i opracowywania szczepionek przeciwko wielu patogenom zakaźnym13. Do tej pory wyprodukowaliśmy mikromacierze białkowe dla ponad 35 patogenów, w tym ponad 60 000 białek o całkowitej ekspresji, i wykorzystaliśmy je do zbadania ponad 30 000 surowic ludzkich od osób zakażonych i kontrolnych. Niedawno opracowana przenośna platforma obrazowania dla preparatów mikromacierzowych sprawiła, że metodologia ta stała się bardziej dostępna dla użytkownika końcowego14.
Opierając się na obszernej wcześniejszej pracy wielu współpracowników w tej dziedzinie15,16,17,18,19, niedawno opracowano mikromacierz białka grypy, która zawiera ponad 250 oczyszczonych wariantów antygenowych hemaglutyniny (HA) z reprezentacją wszystkich 18 podtypów12,20. Korzystając z tej metodologii, wykazano, że naturalna infekcja grypą generuje szeroko reaktywne przeciwciała IgG i IgA przeciwko filogenetycznie pokrewnym podtypom HA, podczas gdy domięśniowe szczepienie przeciw grypie generowało tylko przeciwciała IgG specyficzne dla podtypu21. Wykazano jednak, że dodanie adiuwanta, który aktywuje receptory toll-podobne do szczepionek przeciw grypie, rozszerza wywołaną odpowiedź przeciwciał IgG w podtypach HA w badaniach na zwierzętach22.
Ta mikromatryca jest obecnie używana do badania surowic pobranych z prospektywnego badania kohortowego studentów, którzy byli obserwowani pod kątem infekcji grypą. W tym miejscu przedstawiono metodologię mikromacierzy antygenu grypy z wykazaniem odtwarzalności testu w celu wykrycia przeciwciał specyficznych dla podtypu i reagujących krzyżowo w podzbiorze próbek z tego badania.
Protokół
Wszystkie ludzkie surowice są traktowane i usuwane zgodnie z zatwierdzonymi instytucjonalnymi protokołami bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu osobistego sprzętu ochronnego. Wszyscy pracownicy laboratoriów uczestniczący w tym protokole przeszli szkolenie w zakresie bezpieczeństwa biologicznego i etyki badań.
1. Wyprodukuj mikromatryce antygenu grypy
- Zaprojektuj i uzyskaj zestaw antygenów dla mikromacierzy
- Otrzymaj wyrażone i oczyszczone antygeny białkowe w postaci liofilizowanego proszku.
- Drukowanie antygenów na szkiełkach mikromacierzowych
- Rozpuść każdy liofilizowany antygen do stężenia 0,1 mg/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) z 0,001% Tween-20 (T-PBS). Przenieść 10 μl każdego odtworzonego antygenu do indywidualnych studzienek na niepoddanej działaniu 384-dołkowej płytki o płaskim dnie.
- Wydrukuj antygeny za pomocą drukarki mikromatrycowej (drukarka mikromacierzy używana w tym badaniu nie jest już dostępna na rynku, patrz Dyskusja) z niskoobjętościowymi szpilkami do mikromacierzy, które zasysają antygen do kanału próbki i osadzają go poprzez bezpośredni kontakt i działanie kapilarne na 16-padowych szkiełkach szklanych pokrytych nitrocelulozą.
- Zaprogramuj oprogramowanie drukujące (np. Gridder) z konfiguracją płyty źródłowej i parametrami drukowania.
- Użyj menu rozwijanego, aby wybrać nazwę typu płyty, która będzie używana w tej metodzie drukowania. Do tego badania użyj niepoddanej obróbce 384-dołkowej płytki o płaskim dnie.
- Zaznacz pole tekstowe obok opcji Liczba płyt i wpisz liczbę płyt próbnych, które będą używane w tym protokole drukowania. Do tego badania użyj 1 płytki.
- Wybierz konfigurację pinów, która ma być używana z tą metodą. Do tego badania użyj konfiguracji 8-pinowej.
- Upewnij się, że przesunięcia początku to odległości (w kierunkach X i Y) między punktem początkowym slajdu (który jest skalibrowany w sekcji Administracyjne) a miejscem, w którym kołki drukowania rozpoczną drukowanie na slajdach.
- Korzystając z karty Projekt tablicy, zdefiniuj rozmiar i kształt tablic (odstępy między kropkami i liczba punktów na podtablicę). Na potrzeby tego badania wydrukuj 324 plamki (średnica 180 μm z odstępem 300 μm) na 16-padowych szkiełkach w formacie 18x18 za pomocą 8 pinów.
- Wybierz parametry określające, w jaki sposób kołki drukujące pobierają i dozują próbki. W tym badaniu każdy szpilka zasysa 250 nL roztworu antygenu i drukuje 1 nL na każdym z 40 punktów (w sumie 20 szkiełek dla wszystkich 8 pinów)
- Skonfiguruj protokół czyszczenia pinów i protokół blottingu. W tym badaniu każdy pin drukuje antygen, jest zanurzany w sterylnym ddH2O w sonikowanym pojemniku do mycia, a następnie odsysany następny antygen.
- Określ kolejność, w jakiej bloki próbki są drukowane na slajdach. Oprogramowanie macierzy skonstruuje plik z adnotowanym indeksem siatki (.gal) w celu opisania rozmieszczenia antygenów w każdej mikrotablicy.
UWAGA: Górny rząd jest używany dla powierników (z fluorescencją na wszystkich długościach fal stosowanych w obrazowaniu, np. mieszanina koniugatu streptawidyny Qdot 585 nm i koniugatu streptawidyny Qdot 800 nm w tym badaniu) do orientowania siatek podczas obrazowania. W przypadku długich nakładów antygeny na płytce źródłowej mogą być okresowo ponownie zawieszane przez pipetowanie w górę i w dół, a następnie wirowanie, lub można przygotować i użyć nowej płytki źródłowej.
- Zaprogramuj oprogramowanie drukujące (np. Gridder) z konfiguracją płyty źródłowej i parametrami drukowania.
- Umieść szkiełka mikromacierzy bez sondy w światłoodpornym pudełku i przechowuj w szafie eksykatora w temperaturze pokojowej do długotrwałego przechowywania.
UWAGA: W tym momencie protokół może zostać wstrzymany na czas nieokreślony.
- Przeprowadzanie kontroli jakości (wymaga znaczników polihistydynowych)
- Przymocuj szkiełko do komór pomiarowych i ponownie uwodnić za pomocą buforu blokującego, jak opisano w kroku 2.1.1-2.1.2 i pokazano na rysunku 2.
- Rozcieńczyć mysie przeciwciało monoklonalne poli-His w stosunku 1:100 w przefiltrowanym buforze blokującym 1x.
UWAGA: Jeżeli nieoczyszczone antygeny białkowe (np. wyrażane w systemie transkrypcji i translacji in vitro) są bezpośrednio używane do drukowania mikromacierzy, należy dodać składniki systemu ekspresji białek (np. lizat E. coli) w stosunku 1:10 z buforem blokującym używanym do rozcieńczania surowicy w celu zablokowania wszelkich przeciwciał skierowanych przeciwko tym składnikom. - Dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała poli-He do każdej komory szkiełkowej zawierającej podkładkę do matrycy po aspiracji i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce. Umyj 3x buforem T-TBS zgodnie z opisem w kroku 2.2.1. Rozcieńczyć sprzężone z biotyną kozie przeciwciało anty-mysie IgG w stosunku 1:200 w buforze blokującym, dodać 100 μl na basenik po aspiracji i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce. Mycie 3x za pomocą bufora T-TBS.
- Rozcieńczyć koniugat streptawidyny Qdot 585 nm do 4 nM w buforze blokującym, dodać 100 μl na basenik po aspiracji i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce. Umyj 3x buforem T-TBS, a następnie raz buforem TBS (bez Tween).
- Zdemontuj i określ ilościowo slajdy zgodnie z opisem w kroku 2.2.5 – 3.1.2.
UWAGA: Antygeny białkowe muszą zawierać10 znaczników Jego, aby można było korzystać z tego protokołu kontroli jakości. Alternatywnie, jeśli dołączony jest inny znacznik, można przeprowadzić kontrolę jakości za pomocą przeciwciała lub liganda dla tego znacznika.
2. Surowice pomiarowe na obecność przeciwciał grypy za pomocą mikromacierzy
- Inkubować surowice na mikromacierzach w celu wiązania przeciwciał
- Przymocuj szkiełka mikromacierzy do komór za pomocą klipsów i umieść w ramkach, jak pokazano na rysunku 3.
UWAGA: Zawsze unikaj dotykania podkładki mikromacierzy rękami i instrumentami. Upewnij się, że prowadnice są zorientowane stroną z podkładką do góry i małym wycięciem w prawym górnym rogu. - Ponownie uwodnić szkiełka mikromacierzy ze 100 μl na studzienkę przefiltrowanego 1x buforu blokującego i rozcieńczyć surowicę 1:100 w 100 μl buforu blokującego (można użyć nietraktowanych płytek 96-dołkowych lub probówek 2 ml). Inkubować zarówno uwodnione szkiełka mikromacierzy w zakrytych ramkach, jak i rozcieńczone surowice oddzielnie przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100-250 obr./min. Wszystkie kolejne etapy inkubacji należy wykonać podobnie na wytrząsarce.
UWAGA: Surowice należy podzielić na porcje i zamrozić w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania, aby zminimalizować cykle zamrażania i rozmrażania, a przed użyciem należy je wirować w celu wymieszania i odwirować w celu usunięcia cząstek stałych. Uważnie obserwuj komory suwakowe podczas i po tym etapie, aby wykryć wszelkie wycieki, które wymagają ponownego montażu komór suwakowych. - Używając końcówek do pipet podłączonych do przewodu próżniowego z wtórną kolbą zbiorczą, ostrożnie odessać bufor blokujący z rogu każdej komory, nie dotykając podkładek. Wszystkie kolejne kroki aspiracji należy wykonywać podobnie. Rozcieńczone surowice dodać do podpasek szybko po aspiracji, aby nie dopuścić do wyschnięcia podpasek.
- Umieść przykryte ramki na tacach w dodatkowym pojemniku otoczonym wilgotnymi ręcznikami papierowymi i szczelnie zamkniętymi, aby zapobiec parowaniu. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce kołyszącej (alternatywnie można inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100-250 obr./min).
- Przymocuj szkiełka mikromacierzy do komór za pomocą klipsów i umieść w ramkach, jak pokazano na rysunku 3.
- Znakowane przeciwciała surowicy związane z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z kropkami kwantowymi
- Ostrożnie odessać surowice z komór, jak opisano powyżej, dodać 100 μl buforu T-TBS na studzienkę (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20 w ddH2O dostosowanych do pH 7,5 i przefiltrowanych, można uzyskać komercyjnie) i inkubować przez 5 minut na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100-250 obr./min. Powtórz ten krok prania w sumie 3 razy (wszystkie kolejne kroki prania są wykonywane podobnie).
- Przygotować mieszaninę przeciwciał drugorzędowych rozcieńczoną do 1 μM w buforze blokującym i dokładnie wymieszać pipetując przed użyciem i w jego trakcie, aby zachować jednorodność.
UWAGA: Aby zachować odtwarzalność testu, ta sama partia każdego przeciwciała drugorzędowego powinna być używana do wszystkich eksperymentów sondujących, dla których planowane jest ilościowe porównanie danych z różnych doświadczeń. Specyficzne stężenie przeciwciała drugorzędowego może wymagać zmiany w zależności od powinowactwa; Postępuj zgodnie z protokołami producenta, jeśli są dostępne. - Odessać bufor z komór po końcowym myciu, dodać 100 μl na studzienkę mieszaniny przeciwciał wtórnych i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
- Odessać mieszaninę przeciwciał wtórnych przemyć 3x buforem T-TBS, a następnie przemyć raz buforem TBS (bez Tween).
- Ostrożnie zdemontować szkiełka do mikromatryc z komór, aby nie dotykać podkładek, delikatnie spłukać przefiltrowanym ddH2O i wysuszyć, umieszczając w probówkach o pojemności 50 ml i odwirowując przy 500 x g przez 10 minut.
- Umieścić szkiełka z sondą mikromacierzą w światłoszczelnym pudełku i przechowywać w szafie eksykatora w temperaturze pokojowej do długotrwałego przechowywania.
UWAGA: W tym momencie protokół może zostać wstrzymany na okres do 1 tygodnia.
3. Ilościowe określenie wiązania przeciwciał z antygenami w mikromacierzy
- Wizualizacja szkiełek z mikromacierzy i ilościowe określenie intensywności fluorescencji punktowej w celu pomiaru wiązania przeciwciał
- Pozyskiwanie obrazów preparatów z mikromacierzą za pomocą przenośnego imagera z wbudowanym oprogramowaniem.
- Na karcie Configure Imager (Konfiguruj imager) wybierz odpowiednią konfigurację slajdu. Do tego badania użyj szkiełek z 16 padami.
- Na karcie Image Control wybierz odpowiedni kanał fluorescencyjny i dostosuj wzmocnienie, czas ekspozycji i czas akwizycji w zależności od reaktywności surowicy, aby uzyskać optymalne obrazy. W tym badaniu kanały fluorescencyjne dla IgA i IgG wynosiły odpowiednio 585 nm i 800 nm, a ustawienia obrazowania to wzmocnienie 50, czas ekspozycji 500 ms i czas akwizycji 1 s.
- Kliknij Przechwyć, aby rozpocząć proces pobierania obrazu.
UWAGA: Slajdy z mikromatrycą mogą być ponownie obrazowane przy wielu ustawieniach bez degradacji sygnału, o ile są przechowywane w ciemności i suchości. Można stosować inne systemy obrazowania, jeśli są kompatybilne ze szkiełkami.
- Wykrywaj plamki w tablicy za pomocą siatek zorientowanych na podstawie znaczników odniesienia i mierz intensywność plamki jako medianę intensywności pikseli pomniejszoną o tło mierzone wokół plam. Wykonaj ten algorytm kwantyfikacji w partii za pomocą wbudowanego oprogramowania do obrazowania, które wykorzystuje plik .gal skonstruowany w kroku 1.2.2 do łączenia intensywności plamki z poszczególnymi antygenami w każdej mikromacierzy.
- W panelu Informacje o pliku prześlij plik .gal, wybierając go z folderu na komputerze, a następnie w sekcji Opcje analizy określ folder, w którym mają zostać zapisane pliki wyjściowe analizy.
- Na karcie Image Control (Kontrola obrazu) otwórz jeden z pobranych obrazów, które mają zostać określone ilościowo, i wybierz przycisk Auto w prawym górnym rogu.
- W sekcji Array Analysis (Analiza tablicy) w prawym dolnym rogu utwórz szablon odniesienia zgodnie z instrukcjami oprogramowania.
- Kliknij Analiza wsadowa, wybierz folder zawierający obrazy do określenia ilościowego, a następnie wybierz szablon odniesienia, który został utworzony w poprzednim kroku. Oprogramowanie analizuje każdy obraz i określa ilościowo intensywność plamki.
UWAGA: Ten krok spowoduje wygenerowanie pliku .csv zawierającego intensywność punktową określającą ilościowo przeciwciała w każdej próbce surowicy, które wiążą się z każdym pojedynczym antygenem na mikromacierzy, które można następnie manipulować w oprogramowaniu do manipulacji arkuszami kalkulacyjnymi lub analizy.
- Analizuj surowe dane, aby porównać wiązanie przeciwciał między antygenami i próbkami surowicy. W tym badaniu przeciwciała IgA i IgG mierzone jako intensywność plamki fluorescencyjnej 585 nm i 800 nm porównano we wszystkich antygenach między 2 niezależnymi seriami eksperymentu przy użyciu różnych szkiełek w różnych dniach, a następnie przeprowadzono analizę korelacji w celu zmierzenia odtwarzalności testu.
UWAGA: W przypadku nieoczyszczonych białek drukowanych jako mieszanina ekspresyjna, analizę danych należy rozpocząć od odjęcia tła od kontroli bez DNA.
- Pozyskiwanie obrazów preparatów z mikromacierzą za pomocą przenośnego imagera z wbudowanym oprogramowaniem.
Wyniki
W ramach demonstracji protokołu, w badaniu z wykorzystaniem mikromacierzy antygenów grypy przeanalizowano surowice bazowe pobrane od 16 osób uczestniczących w prospektywnym badaniu kohortowym studentów monitorowanych pod kątem infekcji grypą. Aby wykazać powtarzalność testu, próbki te poddano analizie dwukrotnie, na różnych szkiełkach i w różnych dniach.
Do niniejszego badania wykorzystano oczyszczone antygeny grypy zawierające znaczniki His10, które pozyskano od dostawcy komercyjnego (patrz Tabela materiałów) oraz od współpracowników. Antygeny te obejmują łącznie 251 antygenów HA, w tym 63 globularne domeny głowy (HA1) oraz 186 białek o pełnej długości (HA0), w tym 96 monomerycznych białek HA0 oraz 90 trimeryzowanych białek HA0 zawierających fuzyjną domenę trimeryzacji („foldon”)23. Pełna lista antygenów i kontroli użytych w tym badaniu została zawarta w Pliku uzupełniającym. W badaniu tym jako przeciwciała wtórne zastosowano przeciwciała kozie przeciwko ludzkim IgG sprzężone z kropką kwantową emitującą przy 800 nm (GAH-IgG-Q800) oraz przeciwciała kozie przeciwko ludzkim IgA sprzężone z kropką kwantową emitującą przy 585 nm (GAH-IgA-Q585) w celu multipleksowej detekcji przeciwciał IgG i IgA, jak pokazano na Ryc. 3. Porównano wiązanie przeciwciał IgG i IgA do różnych podtypów i form molekularnych antygenów HA grypy w surowicach uzyskanych z opisanej powyżej kohorty klinicznej.
Wynikowa mapa ciepła przedstawiona jest na Rysunku 4, a reprezentacja graficzna na Rysunku 5. Na tych rysunkach, w celu oszczędności miejsca, oznakowano jedynie klinicznie istotne podtypy o wysokiej reprezentacji na macierzy, gdzie znak „+” oznacza wszystkie pozostałe podtypy o wyższym numerze, a podtypy mniejszościowe lub słabiej reprezentowane zostały uwzględnione zgodnie z kolejnością (np. H2 pomiędzy H1 a H3). Pełna lista szczepów i podtypów znajdujących się na macierzy została dołączona jako Plik uzupełniający. Dane te wykazują, że przeciwciała przeciwko grupie głowy HA są specyficzne dla podtypu, z oczekiwaną wysoką ilością przeciwciał przeciwko szczepom powszechnie występującym klinicznie (H1N1, H3N2 i B) oraz niską ilością przeciwciał przeciwko innym szczepom. Jednak przeciwciała przeciwko całemu HA, który obejmuje domenę trzonka, wykazują większą reaktywność krzyżową między podtypami, a efekt ten wydaje się być wzmocniony, gdy cały HA jest trymeryzowany. Wynik ten nie jest zaskakujący, ponieważ cały HA zawiera region trzonka, który jest wysoce konserwatywny pomiędzy podtypami. Zatem przeciwciała przeciwko cząsteczkom całego HA z podtypów nieklinicznych (np. H5 i H7) prawdopodobnie reprezentują przeciwciała anty-trzonkowe, pierwotnie wywołane przeciwko podtypom klinicznym (np. H1 i H3), które wykazują reaktywność krzyżową z regionami trzonka innych podtypów HA na macierzy. Kwestia ta ilustruje znaczenie uwzględnienia na macierzy zarówno głowy HA, jak i całej cząsteczki HA, aby odróżnić przeciwciała przeciwko regionom głowy i trzonka, które wykazują odmienne profile reaktywności.
Test wykazuje dobrą powtarzalność w kolejnych seriach pomiarowych. W drugiej serii odnotowano nieco niższy poziom przeciwciał IgG we wszystkich szczepach, choć wzorzec rozkładu między szczepami pozostał spójny. Ten ogólny, niewielki spadek wynika prawdopodobnie ze zmienności między partiami przeciwciał wtórnych, które zostały zmienione między seriami dla IgG, ale nie dla IgA. Dlatego, zgodnie z protokołem, zaleca się stosowanie tej samej partii każdego przeciwciała wtórnego we wszystkich eksperymentach, w których planowane jest porównanie ilościowe. Jeśli z powodu dużej liczby próbek konieczne jest użycie różnych partii przeciwciał, zalecamy uwzględnienie wspólnych próbek między seriami eksperymentalnymi z różnymi partiami przeciwciał, aby umożliwić porównanie ilościowe z korektą.
Rysunek 1: Schemat mikromacierzy białkowej. Każdy szkiełko zawiera wiele pól, z których każde posiada pojedynczą macierz składającą się z setek antygenów naniesionych na plamki ułożone w siatkę; każda plamka zawiera jeden antygen zaadsorbowany na trójwymiarowej topografii powierzchni nitrocelulozowej, do której wiążą się przeciwciała z surowicy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Schemat protokołu nanoszenia i hybrydyzacji mikroarray antygenów grypy. Od lewej do prawej: mikroarray jest nanoszone na slajdy powlekane nitrocelulozą, które służą do wykrywania przeciwciał IgG i IgA w surowicach przy użyciu przeciwciał wtórnych sprzężonych z kropkami kwantowymi; slajdy są obrazowane za pomocą przenośnego skanera, a wyniki analizowane w celu wygenerowania mapy ciepła. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Procedura mocowania komory sondowania do szkiełka z mikromacierzą. Od A do F: komorę sondowania umieszcza się na górze szkiełka w odpowiedniej orientacji, mocuje do szkiełka za pomocą poziomych klipsów po bokach, a następnie umieszcza w tacy do sondowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4: Reprezentatywne wyniki mikrotablicy antygenów grypy. Mapy ciepła przedstawiają specyficzne dla antygenu odpowiedzi przeciwciał, gdzie każdy wiersz reprezentuje pojedynczy antygen uporządkowany według cząsteczki, podtypu i szczepu, a każda kolumna reprezentuje pojedynczy cykl badania jednej próbki, uporządkowany według izotypu przeciwciała i cyklu (A, biały = 0, czarny = 20000, czerwony = 40000 intensywność fluorescencji). Podtypy antygenów, obejmujące wszystkie podtypy hemaglutyniny od 1 do 18 oraz wszystkie podtypy neuraminidazy od 1 do 10, są rozmieszczone pionowo i opisane po lewej stronie. Porównanie intensywności fluorescencji między dwoma cyklami wykazuje dobrą powtarzalność testu w regresji liniowej dla IgA (B) i IgG (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 5: Szerokość spektrum przeciwciał w surowicy zmierzona na mikrotablicy antygenów grypy. Surowicze IgA (A) i IgG (B) zostały pogrupowane według form molekularnych i podtypów HA i NA, aby wykazać wysoką specyficzność przeciwciał przeciwko grupie głowy HA dla podtypów klinicznych oraz wysoką reaktywność krzyżową przeciwciał przeciwko pełnemu białku HA i trymeryzowanemu pełnemu białku HA z uwzględnieniem regionu trzonka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Plik uzupełniający: Lista antygenów na mikromacierzy antygenów grypy. Przedstawiono zawartość dla wszystkich 324 punktów na macierzy, w tym pól pustych, punktów referencyjnych, kontroli (ludzkie IgG i IgA oraz przeciwciała anty-ludzkie IgG i IgA w stężeniach 0.1 mg/mL i 0.3 mg/mL) oraz antygenów wraz z informacjami o źródle, formie cząsteczkowej, podtypie i szczepie. Skróty oznaczają: w przypadku źródła: Sino = Sino Biological Inc., FKL = Florian Krammer Laboratory; w przypadku formy cząsteczkowej: HA1 = główka HA, HA0 = całe HA, HA2 = trzonek HA, NP = nukleoproteina. Dla antygenów pochodzących z Sino Biological Inc. podano numery katalogowe; dla antygenów pochodzących z Krammer Laboratory wymieniono identyfikatory antygenów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Opisany tutaj protokół mikromacierzy antygenu grypy można dostosować do każdego projektu, który wymaga analizy odpowiedzi przeciwciał na wiele antygenów. Platforma mikromacierzy może być używana z dowolnym pożądanym zestawem antygenów białkowych wyrażonych w dowolnym systemie, który może osiągnąć wydajność 0,1 mg/ml lub wyższą z oczyszczaniem lub bez, jak opisano wcześniej12. Jeżeli nieoczyszczone antygeny białkowe (np. wyrażane w systemie transkrypcji i translacji in vitro) są bezpośrednio używane do drukowania mikromacierzy, składniki systemu ekspresji białek (np. lizat E. coli ) należy dodać w stosunku 1:10 do buforu blokującego używanego do rozcieńczania surowic i przeciwciał kontroli jakości w celu zablokowania wszelkich przeciwciał skierowanych przeciwko tym składnikom. Konfiguracje szkiełek są dostępne z mniejszą liczbą większych padów na każdym szkiełku, aby pomieścić większą liczbę antygenów na matrycę. Do tego badania użyliśmy drukarki mikromacierzy GeneMachines OmniGrid 100, która wykorzystuje piny, które bezpośrednio stykają się z powierzchnią nitrocelulozy, aby osadzać miejsca na tablicy. Chociaż ta drukarka mikromatrycowa nie jest już dostępna na rynku, inne dostępne na rynku drukarki mikromacierzy mogą być używane w tym protokole, ale mogą wymagać niestandardowych pinów (kontaktowych lub bezdotykowych) i oprogramowania oraz powinny mieć wystarczającą rozdzielczość punktową i kompatybilność ze slajdami i imagerem. W zależności od reaktywności surowic można stosować rozcieńczenia od 1:50 do 1:400. Bufor bez surowicy może być stosowany jako kontrola ujemna, podczas gdy przeciwciała monoklonalne, o których wiadomo, że wiążą się z antygenem, mogą być stosowane jako kontrola pozytywna.
Użytkownicy powinni zdawać sobie sprawę z kilku problemów związanych z rozwiązywaniem problemów. Celem kontroli jakości przy użyciu przeciwciał przeciwko znacznikowi He jest sprawdzenie, czy nie ma antygenów, dla których drukowanie nie powiodło się. Wszelkie plamki, które konsekwentnie dają niski sygnał podczas kontroli jakości wielu macierzy, prawdopodobnie reprezentują niewystarczającą ilość wydrukowanego antygenu. Możliwe przyczyny to agregacja lub wytrącanie się lub antygen w płytce źródłowej lub słaby kontakt między pinem drukującym a szkiełkiem mikromatrycy ze względu na zmienną grubość podkładki nitrocelulozowej. W tym momencie nie przeprowadzamy normalizacji testu w oparciu o ilościowe wyniki kontroli jakości, biorąc pod uwagę, że na wykryte wiązanie przeciwciał anty-He może mieć wpływ dostępność tego znacznika, która zależy od trójwymiarowej konformacji specyficznej dla każdego antygenu.
Mikromacierz antygenu grypy ma kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi metodami, takimi jak ELISA, i jest uzupełnieniem testów funkcjonalnych, takich jak HAI i MN. 16-padowa mikromacierz białkowa to technologia oszczędzająca próbki, która może jednocześnie mierzyć przeciwciała wielu izotypów przeciwko około 300 antygenom z 1 μl surowicy. Liczbę antygenów można zwiększyć do tysięcy, zmniejszając liczbę elektrod na szkiełku. Test multipleksowy oszczędza również czas personelu i zasoby eksploatacyjne, biorąc pod uwagę, że setki surowic można zbadać pod kątem przeciwciał w ciągu 2 dni, a wszystkie materiały inne niż szkiełka i odczynniki nadają się do ponownego użycia, więc nie generują dużych ilości odpadów z tworzyw sztucznych.
Podczas gdy drukarki mikromatrycowe mogą nie być szeroko rozpowszechnione, preparaty mikromatrycowe mogą być drukowane w centralnej lokalizacji, a następnie transportowane do użytkownika końcowego w celu przeprowadzenia pomiarów. Jedynym sprzętem wymaganym do sondowania jest tani i przenośny imager. Celem rozpowszechnienia tego protokołu jest rozpowszechnienie wykorzystania tej techniki.
Głównymi ograniczeniami mikromacierzy antygenu grypy jest brak możliwości scharakteryzowania funkcji i kinetyki wykrytych przeciwciał. Mikromacierz wykrywa poliklonalny zestaw przeciwciał wiążących dla każdego antygenu. Przeciwciała te mogą, ale nie muszą, działać w neutralizacji wirusa w testach HAI i MN. Jednak testy HAI i MN wymagają hodowli żywego wirusa z związaną z tym potrzebą specjalistycznych urządzeń z wysokiej jakości szafami bezpieczeństwa biologicznego do testowania przeciwciał przeciwko ptasim podtypom grypy, podczas gdy mikromacierz białkowa nie zawiera składników żywego wirusa, więc może być wykorzystana w każdym podstawowym laboratorium. Jeśli chodzi o kinetykę wiązania, pojedyncze rozcieńczenie surowicy badanej za pomocą tablicy zawierającej pojedyncze stężenie każdego antygenu daje pojedynczy punkt danych, który reprezentuje złożony ilość i powinowactwo zsumowane dla wszystkich przeciwciał wiążących się z antygenem. Aby w pełni określić kinetykę wiązania antygen-przeciwciało, wymagane są wielokrotne stężenia antygenu i/lub seryjne rozcieńczenia surowicy.
Pomimo tych ograniczeń, mikromacierz antygenu grypy jest użytecznym narzędziem do charakteryzowania szerokiego zakresu przeciwciał grypy w całym krajobrazie antygenowym, które mogą uzupełniać testy funkcjonalne, które są bardziej ograniczone pod względem przepustowości i dostępności.
Oświadczenia
Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Prof. Donowi Miltonowi (Institute of Applied Public Health, University of Maryland, College Park, MD, USA) za zebranie ludzkich surowic zgodnie z protokołem IRB Uniwersytetu Maryland #313842 ufundowanym przez DARPA N66001-18-2-4015 P00001. Autorzy pragną również podziękować prof. Florianowi Krammerowi (Icahn School of Medicine, Mt. Sinai, NY, USA) za dostarczenie trimeryzowanych antygenów HA i NA ufundowanych przez ODNI IARPA DJF-15-1200-K-0001725. S. Khan jest częściowo wspierany przez National Center for Research Resources i National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, poprzez grant KL2 TR001416. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy NIH.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 16-padowe szkiełka szklane pokryte nitrocelulozą | Grace Bio Labs | 305016 | |
| 1x bufor blokujący GVS FAST | Fischer Scientific | 10485356 | |
| ArrayCam | Grace Bio Labs | 400S | Inne urządzenia do obrazowania mogą być używane do wizualizacji slajdów, jeśli są w stanie osiągnąć rozdzielczość plamek mikromacierzy oraz długości fal wzbudzenia i emisji kropek kwantowych. |
| Przeciwciało anty-myszo-IgG sprzężone z biotyną Thermo | Fischer | 31800 | |
| HiBase 384-dołkowa płytka | Greiner Bio-One | T-3037-11 | |
| Piny do mikromacierzy | ArrayIt | GMP2 | Każda inna drukarka mikromacierzy może wymagać własnych niestandardowych pinów mikromacierzy. |
| Mysie przeciwciało monoklonalne poly-He | Sigma-Aldrich | H1029 | |
| OmniGrid 100 drukarka mikrotablicowa | GeneMachines | Wersja drukarki mikrotablicowej użytej w tej pracy nie jest już dostępna na rynku, ale zaktualizowanym podobnym sprzętem jest drukarka mikrotablicowa OmniGrid Accent firmy Digilab (Hopkinton, MA), a ten sam protokół można przeprowadzić z większością dostępnych na rynku drukarek mikrotablicowych. | |
| Komory ślizgowe ProPlate | Grace Bio Labs | 246890 | |
| Klipsy do prowadnic ProPlate | Ramki do prowadnic Grace Bio Labs | 204838 | |
| ProPlate | Grace Bio Labs | 246879 | |
| Quantum dot 585 nm sprzężone kozie przeciwciało anty-ludzkie-IgA | Grace Bio Labs | 110620 | |
| Quantum dot 585 nm koniugat streptawidyny | Thermo Fischer | Q10111MP | |
| Kropka kwantowa 800 nm sprzężone kozie przeciwciało anty-ludzkie-IgG | Grace Bio Labs | 110610 |
Bibliografia
- Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2010).
- Renegar, K. B., Crouse, D., Floyd, R. A., Krueger, J. Progression of influenza viral infection through the murine respiratory tract: the protective role of sleep deprivation. Sleep. 23 (7), 859-863 (2000).
- Li, L., et al. Heterogeneity in Estimates of the Impact of Influenza on Population Mortality: A Systematic Review. American Journal of Epidemiology. 187 (2), 378-388 (2018).
- Fauci, A. S. Seasonal and pandemic influenza preparedness: science and countermeasures. Journal of Infectious Diseases. 194 Suppl 2, S73-S76 (2006).
- Duggal, A., Pinto, R., Rubenfeld, G., Fowler, R. A. Global Variability in Reported Mortality for Critical Illness during the 2009-10 Influenza A(H1N1) Pandemic: A Systematic Review and Meta-Regression to Guide Reporting of Outcomes during Disease Outbreaks. PLoS One. 11 (5), 2009-2010 (2016).
- Demicheli, V., Jefferson, T., Ferroni, E., Rivetti, A., Di Pietrantonj, C. Vaccines for preventing influenza in healthy adults. Cochrane Database Systematic Reviews. 2, CD001269(2018).
- Erbelding, E. J., et al. A Universal Influenza Vaccine: The Strategic Plan for the National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Journal of Infectious Diseases. , (2018).
- Xie, H., et al. H3N2 Mismatch of 2014-15 Northern Hemisphere Influenza Vaccines and Head-to-head Comparison between Human and Ferret Antisera derived Antigenic Maps. Scientific Reports. 5, 15279(2015).
- Tricco, A. C., et al. Comparing influenza vaccine efficacy against mismatched and matched strains: a systematic review and meta-analysis. BMC Medicine. 11, 153(2013).
- Katz, J. M., Webster, R. G. Efficacy of inactivated influenza A virus (H3N2) vaccines grown in mammalian cells or embryonated eggs. Journal of Infectious Disease. 160 (2), 191-198 (1989).
- Zost, S. J., et al. Contemporary H3N2 influenza viruses have a glycosylation site that alters binding of antibodies elicited by egg-adapted vaccine strains. Proceedings of the National Academy of Science. 114 (47), 12578-12583 (2017).
- Davies, D. H., et al. Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (3), 547-552 (2005).
- Liang, L., Felgner, P. L. A systems biology approach for diagnostic and vaccine antigen discovery in tropical infectious diseases. Current Opinion in Infectious Diseases. 28 (5), 438-445 (2015).
- Jain, A., et al. Evaluation of quantum dot immunofluorescence and a digital CMOS imaging system as an alternative to conventional organic fluorescence dyes and laser scanning for quantifying protein microarrays. Proteomics. 16 (8), 1271-1279 (2016).
- Desbien, A. L., et al. Development of a high density hemagglutinin protein microarray to determine the breadth of influenza antibody responses. Biotechniques. 54 (6), 345-348 (2013).
- Mace, C. R., et al. Label-free, arrayed sensing of immune response to influenza antigens. Talanta. 83 (3), 1000-1005 (2011).
- Koopmans, M., et al. Profiling of humoral immune responses to influenza viruses by using protein microarray. Clinical and Microbiology Infections. 18 (8), 797-807 (2012).
- Bucukovski, J., Latorre-Margalef, N., Stallknecht, D. E., Miller, B. L. A Multiplex Label-Free Approach to Avian Influenza Surveillance and Serology. PLoS One. 10 (8), e0134484(2015).
- Meade, P., Latorre-Margalef, N., Stallknecht, D. E., Krammer, F. Development of an influenza virus protein microarray to measure the humoral response to influenza virus infection in mallards. Emerging Microbes and Infection. 6 (12), e110(2017).
- Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays. Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).
- Nakajima, R., et al. Protein Microarray Analysis of the Specificity and Cross-Reactivity of Influenza Virus Hemagglutinin-Specific Antibodies. mSphere. 3 (6), (2018).
- Van Hoeven, N., et al. A Formulated TLR7/8 Agonist is a Flexible, Highly Potent and Effective Adjuvant for Pandemic Influenza Vaccines. Scientific Reports. 7, 46426(2017).
- Krammer, F., et al. A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates. PLoS One. 7 (8), e43603(2012).
Przedruki i uprawnienia
Tagi
Pomiar szeroko ci przeciwciaantygeny hemaglutyniny i neuraminidazyprzeciwcia a sprz one z kropkami kwantowymiwysokoprzepustowy test multipleksowydetekcja za pomoc przeno nego obrazownikaprofilowanie przeciwcia w surowicyanaliza krajobrazu antygenowegowykrywanie przeciwcia reaktywnych krzy owozastosowania w nadzorze serologicznym
