Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials

Laurine Marger; Antonio Barone; Carla  P. Martinelli-Kl&#228;y; Leandra Schaub; Malin Strasding; Mustapha Mekki; Irena Sailer; Susanne  S Scherrer; St&#233;phane Durual

doi:10.3791/59976

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Research Article

Kalwaryjny model augmentacji kości u królika do oceny wzrostu kości i neowaskularyzacji w materiałach kościozastępczych

DOI: 10.3791/59976

August 13, 2019

Laurine Marger¹, Antonio Barone², Carla P. Martinelli-Kläy³, Leandra Schaub¹, Malin Strasding⁴, Mustapha Mekki¹, Irena Sailer⁴, Susanne S Scherrer¹, Stéphane Durual¹

¹Division of Fixed Prosthodontics and Biomaterials, Biomaterials Laboratory,University of Geneva, University Clinic of Dental Medicine, ²Department of Surgery, Division of Oral and Maxillofacial Surgery (HUG), Unity of Oral Surgery and Implantology,University of Geneva, University Clinic of Dental Medicine, ³Department of Surgery, Division of Oral and Maxillofacial surgery (HUG), Laboratory of Oral & Maxillofacial Pathology,University of Geneva, University Clinic of Dental Medicine, ⁴Division of Fixed Prosthodontics and Biomaterials,University of Geneva, University Clinic of Dental Medicine

Cite Watch Download PDF Download Material list

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

In This Article

Summary Abstract Introduction Protocol Representative Results Discussion Disclosures Acknowledgements Materials References Reprints and Permissions

Summary

Tutaj prezentujemy protokół chirurgiczny u królików, którego celem jest ocena materiałów zastępczych kości pod kątem zdolności do regeneracji kości. Za pomocą cylindrów PEEK przymocowanych do czaszek królików, osteokondukcja, osteoindukcja, osteogeneza i waskulogeneza wywołane przez materiały mogą być oceniane zarówno na żywych, jak i uśpionych zwierzętach.

Abstract

Podstawową zasadą modelu kalwarii królika jest pionowy wzrost nowej tkanki kostnej na szczycie korowej części czaszki. Model ten pozwala na ocenę materiałów kościozastępczych do regeneracji kości jamy ustnej i twarzoczaszki pod kątem wzrostu kości i wspomagania neowaskularyzacji. Po znieczuleniu i wentylacji zwierząt (intubacja dotchawicza), cztery cylindry wykonane z polieteroeteroketonu (PEEK) są przykręcane do czaszki, po obu stronach szwów środkowych i koronalnych. Pięć otworów śródszpikowych jest wierconych w obszarze kości ograniczonym przez każdy cylinder, umożliwiając napływ komórek szpiku kostnego. Próbki materiału umieszcza się w cylindrach, które są następnie zamykane. Na koniec miejsce operacji jest zszywane, a zwierzęta są budzone. Wzrost kości można ocenić na żywych zwierzętach za pomocą mikrotomografii. Po uśmierceniu zwierząt wzrost kości i neowaskularyzacja mogą być oceniane za pomocą mikrotomografii, immunohistologii i immunofluorescencji. Ponieważ ocena materiału wymaga maksymalnej standaryzacji i kalibracji, model kalwaryjny wydaje się idealny. Dostęp jest bardzo łatwy, kalibracja i standaryzacja są ułatwione dzięki zastosowaniu zdefiniowanych cylindrów, a cztery próbki mogą być oceniane jednocześnie. Ponadto można zastosować tomografię na żywo i ostatecznie można spodziewać się dużego spadku liczby zwierząt poddawanych eutanazji.

Introduction

Model augmentacji kości kalwarycznej został opracowany w latach 90-tych w celu optymalizacji koncepcji sterowanej regeneracji kości (GBR) w chirurgii jamy ustnej i twarzoczaszki. Podstawową zasadą tego modelu jest wzrost nowej tkanki kostnej pionowo na szczycie korowej części czaszki. W tym celu do czaszki mocuje się reaktor (np. tytanową kopułę, cylinder lub klatkę), aby chronić regenerację kości prowadzoną przez przeszczep (np. hydrożel, substytut kości itp.). Za pomocą tego modelu klatki tytanowe lub ceramiczne ¹^,²^,³^,⁴^,5^,⁶, membrany GBR7^,⁸^,9^,¹⁰, czynniki osteogenne¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷, nowe substytuty kości¹²^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,^21,²²^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹ lub mechanizm neowaskularyzacji podczas procesu regeneracji kości³⁰ zostało ocenionych.

Z translacyjnego punktu widzenia, model kalwaryczny reprezentuje wadę jednościenną, którą można porównać do wady IV klasy w szczęce³¹. Celem jest wyhodowanie nowej kości powyżej obszaru korowego, bez żadnego bocznego wsparcia ze strony endogennych ścian kostnych. Model jest zatem niezwykle rygorystyczny i ocenia rzeczywisty potencjał osteoprzewodnictwa pionowego w obrębie korowej części kości. Jeśli opisany tu model jest przede wszystkim przeznaczony do oceny osteokondukcji w substytutach kości, można również ocenić osteogenezę i/lub osteoindukcję, a także waskulogenezę¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,^21,²²^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹^,³⁰.

Zasadniczo z powodów etycznych, praktycznych i ekonomicznych, u królika opracowano model kalwaryjny, u którego metabolizm i struktura kości są dość istotne w porównaniu do human³². Spośród 30 odniesień przytoczonych powyżej, 80% korzystało z modelu kalwaryjnego królika¹^,²^,³^,⁴^,5^,⁶^,⁷^,⁸^,9^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁷^,²²^,²³^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹^,³⁰^,³³, co pokazuje znaczenie tego modelu zwierzęcego. W 2008 r. grupa Busenlechnera przeniosła model kalwarii na świnię, aby umożliwić jednoczesne porównanie ośmiu substytutów kości ²⁰ (w porównaniu z dwoma substytutami kości u królika). Z drugiej strony, nasza grupa przeniosła model kalwarii królika na owce. Krótko mówiąc, tytanowe kopuły zostały umieszczone na czaszkach owiec, aby scharakteryzować osteoprzewodnictwo nowego substytutu kości wydrukowanego w 3D. Badania te pozwoliły nam opracować i opanować model kalwarii oraz jego analizę¹⁶^,²¹.

Ostatnie trzy cytowane badania¹⁶^,²⁰^,²¹, wraz z kilkoma innymi badaniami¹²^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²²^,²³^,²⁴^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹, potwierdził ogromny potencjał modelu kalwaryjnego jako modelu przesiewowego i charakteryzacyjnego. Jednak, mimo że uzyskane wyniki były całkiem zadowalające, zwrócili również uwagę na pewne ograniczenia: (1) zastosowanie tytanowych kopułek, które zapobiegały dyfuzji promieniowania rentgenowskiego, a co za tym idzie, stosowanie mikrotomografii komputerowej na żywo. Nie można było ich usunąć przed obróbką histologiczną, co zmusiło naukowców do osadzenia próbek w żywicy poli(metakrylanu metylu) (PMMA). Uzyskane w ten sposób analizy w dużej mierze ograniczały się do topografii. (2) Wysokie koszty finansowe, w szczególności ze względu na koszty zwierząt oraz koszty związane z logistyką, utrzymaniem i chirurgią zwierząt. (3) Trudności w uzyskaniu zatwierdzeń etycznych dla dużych zwierząt.

Niedawne badanie przeprowadzone przez Polo, et al.²⁶ znacznie poprawiło model królika. Kopuły tytanowe zostały zastąpione zamykanymi cylindrami, które można było napełniać stałą objętością materiału. Cztery z tych cylindrów umieszczone były na czaszkach królików. Po zakończeniu prac butle można było wyjąć, dzięki czemu biopsje nie zawierały metalu, co wprowadziło znacznie większą elastyczność w przetwarzaniu próbek. Model kalwarii królika stał się atrakcyjny ze względu na jednoczesne testowanie przy niższych kosztach, łatwej obsłudze zwierząt i ułatwieniu przetwarzania próbek. Korzystając z tych ostatnich osiągnięć, jeszcze bardziej ulepszyliśmy model, zastępując tytan PEEK do produkcji cylindrów, umożliwiając w ten sposób dyfuzję promieniowania rentgenowskiego i zastosowanie mikrotomografii na żywych zwierzętach.

W tym artykule opiszemy procesy anestezjologiczne i chirurgiczne oraz pokażemy przykłady wyników, które można uzyskać za pomocą tego protokołu, tj. (immuno-)histologia, histomorfometria, mikrotomografia na żywo i ex vivo w celu oceny mechanizmów regeneracji kości i ilościowego określenia nowej syntezy kości wspieranej przez materiały substytucyjne kości.

Protocol

Zgodnie ze szwajcarskimi wymogami prawnymi, protokół został zatwierdzony przez komitet akademicki i nadzorowany przez kantonalne i federalne agencje weterynaryjne (autoryzacje nr GE/165/16 i GE/100/18).

1. Konkretne urządzenia i zwierzęta

Cylindry
1. Cylindry maszynowe z bocznymi wypustkami stabilizującymi z PEEK o średnicy wewnętrznej 5 mm, średnicy zewnętrznej 8 mm i wysokości 5 mm (Rysunek 1).
2. Maszynowe nasadki PEEK o konstrukcji umożliwiającej precyzyjne przypięcie do górnej części cylindra (grubość 1 mm).
3. Sterylizuj butle i nakrętki PEEK przez autoklawowanie przed zabiegiem.
1. Użyj samowiercących mikrośrub (wykonanych z dostępnego w handlu czystego tytanu (klasa 5)) do zamocowania cylindrów (o średnicy 1,2 mm, długości 4 mm). Sterylizuj w autoklawie przed zabiegiem.
zwierzęta
1. Kup trzymiesięczne białe króliki nowozelandzkie (samce lub samice) o wadze ~2,5 kg każdy.
  UWAGA: Króliki uzyskaliśmy poprzez hodowlę na Uniwersytecie Genewskim.

2. Chirurgia

Taca chirurgiczna
1. Miej w pogotowiu skalpele, nożyczki, dwa kleszcze, podnośnik okostny, strzykawki (1, 2, 5, 50 ml), silnik chirurgiczny, okrągłe wiertła chirurgiczne (średnica 0,8 mm), igły, sterylną sól fizjologiczną, cztery cylindry, osiem i śrubokręt.
Leczenie przedkliniczne
1. Zaaklimatyzować zwierzęta na tydzień przed zabiegiem.
2. Profilaktycznie podawać antybiotyk codziennie (5–10 mg/kg doustnie (PO)) od 2 godzin przed zabiegiem do 3 dni po zabiegu.
Znieczulenie i intubacja
1. Uspokoić zwierzęta poprzez domięśniowe wstrzyknięcie ketaminy (25 mg/kg, 50 mg/ml, 0,5 ml/kg) + ksylazyny (3 mg/kg, 20 mg/ml, 0,15 ml/kg). Poczekaj ~20 min, aż zwierzęta zasną
  głęboko (pełna atonia mięśni).
  UWAGA: Ta premedykacja pozwoli na prosty, szybki i bezbolesny proces intubacji. Indukowana jest głęboka analgezja i znieczulenie, jak opisano w kroku 2.3.8.
2. Umieścić kaniulę dożylną (IV) w żyle brzeżnej z ucha i trzymać ją zamkniętą do czasu zakończenia intubacji.
  UWAGA: Ta linia dożylna będzie służyć do perfuzji fentanylu i propofolu odpowiednio w celu głębokiego znieczulenia i znieczulenia (patrz krok 2.3.8).
3. Utrzymuj znieczulenie, podając 5% sewofluranu w czystym tlenie, aż do wykonania intubacji.
  UWAGA: Ten krok jest konieczny tylko wtedy, gdy zwierzę wykazuje oznaki przebudzenia (ruchy gałek ocznych, skurcze mięśni).
4. Znieczulić tchawicę miejscowo, rozpylając 10% lidokainy. Ułóż królika w pozycji leżącej i utrzymuj jego głowę w pionowym wyprostowaniu.
5. Wsuń pierwszą rurkę dotchawiczą o małej średnicy (2,5 mm) do tchawicy królika, aż będzie słyszalny przepływ powietrza w rurce. To otworzy krtań i ułatwi wprowadzenie ostatecznej rurki.
6. Wprowadzić prowadnicę (cewnik intubacyjny) do probówki, aby ustalić położenie rurki w tchawicy. Wyjmij rurkę o małej średnicy i wsuń ostateczną rurkę dotchawiczą (4.9 mm) na prowadnicę.
7. Zdejmij prowadnicę i napompuj balon na końcu rurki dotchawiczej, aby uszczelnić i zablokować urządzenie w tchawicy. Rurka pozostanie na swoim miejscu, ale można ją zabezpieczyć za pomocą sznurówki zawiązanej wokół czoła. Natychmiast przewietrzyć zwierzę (7 ml/kg, częstotliwość 40/min) 3% sewofluranem w czystym tlenie.
8. Ciągłe perfuzje (żyły usznej) fentanylu (0,01 mg/ml, 2–4 ml/h) w celu wywołania znieczulenia, 2–4 mg/kg (2%) propofolu (20 mg/ml, 4–8 ml/h) w celu wywołania znieczulenia i 4 ml/kg/h octanu Ringera w celu utrzymania warunków izowolumetrycznych.
9. Umieść sondę temperatury w odbycie. Monitoruj również czynność serca, temperaturę i nasycenie tlenem podczas całego procesu.
10. Kontroluj głębokość znieczulenia, monitorując autonomiczne oddychanie; jeśli zwierzę wykazuje oznaki autonomicznego oddychania, podaj mały bolus propofolu i fentanylu.
Przygotowanie strony
1. Umieść królika na podgrzewanej podkładce (39 °C) przykrytej podkładką pod materac (aby uniknąć poparzeń) na stole operacyjnym. Ogol skórę głowy.
2. Nałóż żel nawilżający na oczy, aby uniknąć podrażnień i wysuszenia. Zdezynfekuj miejsce, szorując skórę jodonem powidonu (10%). Następnie ułóż królika sterylną serwetą chirurgiczną i wytnij obszar dostępu do czaszki.
3. Zdezynfekuj miejsce operowane jodem powidonu (10%) po raz drugi. Nałóż żel nawilżający na oczy, aby uniknąć podrażnień i wysuszenia.
4. Przygotuj udrapowany stół (sterylną serwetę), na którym umieścisz całą tacę chirurgiczną.
Otwarcie pola operacyjnego
1. Znieczulenie miejscowe za pomocą podskórnego (SC) wstrzyknięcia lidokainy 2% (1 ml) w czaszkę.
2. Naciąć skórę (skalpelem) wzdłuż linii strzałkowej kalwarii, od oczodołów do zewnętrznej wypukłości potylicznej (~4 cm długości). Upewnij się, że okostna jest nacięta.
3. Delikatnie podnieś okostną (z windą okostną) po obu stronach nacięcia. Spłucz miejsce sterylną solą fizjologiczną.
Rozmieszczenie cylindrów
1. Zlokalizuj szwy środkowe i czołowe na czaszce (Rysunek 2A,B). Zauważ, że te linie anatomiczne tworzą krzyż. Cylindry zostaną umieszczone w każdym z kwadrantów zdefiniowanych przez krzyż, upewniając się, że krawędź cylindra nie znajduje się nad szwem (Rysunek 2C).
2. Umieść pierwszy cylinder w lewym górnym kwadrancie (lewa kość czołowa) i spróbuj położyć urządzenie płasko. Zamocuj w pozycji z silnym naciskiem dłoni i wkręć mikrośrubę, aż poczujesz opór. Upewnij się, że jest równo z powierzchnią zaczepu cylindra.
3. Powtórz tę samą procedurę na drugiej zakładce, aby mocno przymocować cylinder do czaszki. Upewnij się, że cylinder jest hermetycznie przymocowany do kości.
4. Powtórz procedurę na prawej górnej ćwiartce (prawa kość czołowa), lewej dolnej ćwiartce (lewa kość ciemieniowa) i prawej dolnej ćwiartce (prawa kość ciemieniowa).
Wiercenie w kości 5 otworów śródszpikowych w obszarze opisanym przez cylindry (
Rysunek 1)
1. Wywierć otwór śródszpikowy pod irygacją solą fizjologiczną (średnica 0,8 mm, głębokość ~1 mm) z okrągłym wiertłem na kości, pośrodku obszaru opisanego przez cylinder. Upewnij się, że pojawia się krwawienie.
2. Wywierć dwa dodatkowe otwory śródszpikowe wzdłuż osi przechodzącej przez dwie z zakładką, na wewnętrznych krawędziach cylindra. Wzdłuż prostopadłej osi wywierć jeszcze dwa otwory śródszpikowe na wewnętrznych krawędziach cylindra. Upewnij się, że pojawia się krwawienie.
3. Powtórz operację w trzech pozostałych cylindrach.
Napełnianie butli próbkami materiału i zakręcanie (rysunek 3)
1. Przygotuj żądany materiał kościozastępczy zgodnie z instrukcjami producenta lub specyfikacjami materiału.
2. Napełnij pierwszy cylinder po brzegi próbką materiału i zamknij cylinder, zakładając nakrętkę. Powtórz ten proces w pozostałych 3 cylindrach.
Zamknięcie pola operacyjnego
1. Zamknij skórę nad cylindrami za pomocą przerywanego, niewchłanialnego szwu.
2. Na ranę nałożyć opatrunek w sprayu.

3. Leczenie pooperacyjne

Zatrzymaj dopływ analgezji i znieczulenia (zatrzymanie perfuzji propofolu i fentanylu) i sprawdź, czy odzyskanie autonomicznego oddychania.
Zatrzymaj wentylację, gdy zwierzę odzyska autonomiczne oddychanie. Utrzymuj zwierzę pod czystym tlenem przed całkowitym przebudzeniem.
Wstrzyknąć chlorowodorek buprenorfiny SC (0,02 mg/kg, 0,03 mg/ml, 0,67 ml/kg) i powtarzać wstrzyknięcie co 6 godzin przez 3 dni jako analgezja pooperacyjna.
Przenieś zwierzę do jego zwykłego pomieszczenia z wodą i pełnym karmieniem.
Szwy należy usunąć po około 10 dniach od zagojenia się rany.

Representative Results

Model opisany tutaj jest poświęcony ocenie osteokondukcji w substytutach kości. Można również ocenić osteogenezę i/lub osteoindukcję substytutów kości zarówno (pre)ucellaryzowanych, jak i naładowanych cząsteczkami bioaktywnymi, a także waskulogenezę1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30. Można zastosować badanie kinetyczne, trwające od 3 dni do 3 miesięcy po operacji, w zależności od mechanizmów i wyników, które mają być analizowane. Klasyczna oś czasu pozwalająca na opisy we wczesnym i średnim czasie to: 2, 4, 6, 8 i 12 tygodni. Należy pamiętać, że co najmniej 6 próbek na punkt czasowy jest obowiązkowe w celu uzyskania istotnych wyników. Każda próbka, która ma być poddana badaniu, musi być umieszczona co najmniej raz w każdej pozycji na czaszce w danym punkcie czasowym (przydział losowy). Wreszcie, próbki pozorne (np. butle wypełnione zakrzepłą krwią) muszą być uwzględnione w protokole34.

Po zakończeniu operacji, wzrost kości może być monitorowany w różnych punktach czasowych za pomocą tomografii kostnej na żywych zwierzętach. Przykład pokazano na rysunku 4A,B. Dodatkowa analiza wymaga uśmiercenia zwierząt (śmiertelne wstrzyknięcie dożylne 150 mg/kg pentobarbitalu (100 mg/ml). Po eutanazji próbki są dzielone na sekcje, a butle są ostrożnie usuwane (ryc. 5). Biopsje utrwala się roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i 4% formaldehydu. Wzrost kości można następnie ocenić za pomocą mikrotomografii (ryc. 4, C, D). Próbki mogą być również przetwarzane w celu barwienia (immunologicznego) histologicznego. Analiza histomorfometryczna i specyficzne barwienia są następnie możliwe w celu bardziej szczegółowego zakończenia analizy (ryc. 6).

Rysunek 1: Specyfikacje butli PEEK. Na bocznych zaczepach stabilizujących wywiercono dwa otwory (o średnicy 0,8 mm) do przykręcenia. Położenie 5 otworów śródszpikowych (o średnicy 0,8 mm), które mają zostać wywiercone w czaszce w obszarze ograniczonym przez cylinder, są oznaczone czerwonymi kółkami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2
Ryc. 2: Reprezentatywny obraz czaszki królika i rozmieszczenie cylindrów. Zdjęcia przedstawiające szwy środkowe i koronalne na czaszce królika wyznaczające lewą i prawą kość ciemieniową i czołową (A,B). Umieszczenie cylindrów po obu stronach szwów (C). Podziałka = 5 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Reprezentatywny obraz cylindrów zamocowanych, napełnionych i pokrytych. Obrazek przedstawiający cztery cylindry przymocowane do czaszki królika za pomocą tytanowych. W obszarze ograniczonym przez każdy cylinder wywiercono 5 otworów śródszpikowych (o średnicy 0,8 mm, głębokości ~1 mm) pod irygacją za pomocą okrągłego wiertła, aby umożliwić migrację komórek kostnych. Cylindry wypełniono różnymi próbkami substytutów kości (skalibrowane objętości) przed zamknięciem (pokazano tylko jeden zamknięty cylinder). Podziałka = 5 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4
Rycina 4: Reprezentatywne obrazy z analizy mikrotomograficznej (mikro-CT). Ostatnim celem, jakim była ocena wzrostu kości przeprowadzonego za pomocą substytutów kości, 4 cylindry zostały przymocowane do czaszki królika za pomocą tytanowych i wypełnione materiałami substytutowymi kości. (A) Obrazowanie na żywo: dwuwymiarowy skan poprzeczny (14 min, 99 kV/88 μA z rozdzielczością 20 μm) cylindra po 12 tygodniach. (B) trójwymiarowa (3D) rekonstrukcja z analizy mikrotomografii komputerowej na żywo po 4 tygodniach (czerwone kółka: substytuty kości w cylindrach; czerwona strzałka: kontrola, w której cylinder jest wypełniony skrzepłą krwią). (C,D) Po eutanazji (12 tygodni) butle zostały usunięte przed stabilizacją i analizą mikrotomografii komputerowej. (C) Skan poprzeczny 2D (57 min, 99 kV/88 μA z rozdzielczością 10 μm) cylindra i rekonstrukcja 3D całkowitej nowej kości w cylindrze (D). Pokazane są cząstki substytutu kości (kolor czerwony), nowa kość (kolor zielony) i łożysko kostne (kolor żółty). Podziałka = 2 mm Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5
Rycina 5: Reprezentatywne obrazy biopsji po 4 tygodniach. Po eutanazji (4 tygodnie) próbki poddano cięciu blokowemu, a cylindry usunięto przed utrwaleniem w 4% formalinie, analizą mikro-CT i obróbką histologiczną. Podziałka = 5mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6
Rycina 6: Reprezentatywne zdjęcia odcinków (immunologiczno-)histologicznych. Mając na celu ocenę wzrostu kości i neowaskularyzację przeprowadzoną za pomocą substytutów kości, 4 cylindry zostały przymocowane do czaszki królika za pomocą tytanowych i wypełnione substytutami kości. Po eutanazji (12 tygodni) butle zostały usunięte przed utrwaleniem i obróbką histologiczną. (A) Barwienie Massona-Goldnera (50x): substytut kości pojawia się jako fioletowe cząstki otoczone nową kością w kolorze zielonym. (B) Plastry zostały zeskanowane i przetworzone w celu cyfrowej ekstrakcji materiału substytutu kości, aby można było łatwo określić ilościowo nową kość (czerwoną). (C) Barwienie immunologiczne CD31 (strzałki), typowego markera komórek śródbłonka i procesu neowaskularyzacji. (D) Barwienie immunofluorescencyjne (zielone) wysoce neowaskularnej strefy w której niektóre nowe naczynia włosowate wykazują wysoką ekspresję CD31 (strzałka). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Disclosures

Acknowledgements

Autorzy są wdzięczni firmie Geistlich AG (Wolhusen, CH) i Fundacji Osteology (Lucerna, CH) (grant nr 18-049) za wsparcie, a także Global D (Brignais, FR) za dostarczenie. Szczególne podziękowania kierujemy do dr B. Schaefera z firmy Geistlich. Jesteśmy również wdzięczni Eliane Dubois i Claire Herrmann za ich doskonałe opracowanie histologiczne i cenne rady. Na koniec serdecznie dziękujemy Xavierowi Belinowi, Sylvie Roulet i całemu zespołowi Pr Walid Habre, "eksperymentalnego chirurga Dpt", za ich niezwykłą pomoc techniczną.

Materials

Cook Strzykawki

Drugs
Enrofloksacyna Baytril 10%	Bayer
Antybiotyk Fentanyl	Bischel		Do znieczulenia
Ketalar 50mg/ml	Pfizer		Ketamina do znieczulenia
Lidohex	Bichsel		Żel nawilżający do oczu
Opsite	Smith i Siostrzeniec	66004978	Opatrunek w sprayu
Powidon jod 10%, Betadine	Mundipharma		środek przeciwinfekcyjny
Propofol 2%	Braun	3538710	Do znieczulenia
Rapidocain 2%	sintetica		Znieczulenie miejscowe
Octan Ringera	Fresenius Kabi		Kompensacja objętości
Rompun 2%	Bayer		Xylazin do znieczulenia
Sevoflurane 5%	Abbvie		Do znieczulenia
Sterylna sól fizjologiczna	Sintetica
Temgesic	Reckitt Benckiser		Chlorowodorek buprenorfiny, analgezja
Thiopental Inresa	Ospediala		Do znieczulenia
Xylocaine 10% spray	Astra Zeneca		Do intubacji
Nazwa<	strong>Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sprzęt
Fresenius Vial pilot C	Imexmed		Pompa infuzyjna
Podgrzewana podkładka	Aparat
HarvardaSsanie dominujące 50	Medela
Rurka ssąca Optimus	Promedical	80342.2
Silnik chirurgiczny	Schick dental	Qube	Wiercenie otworów śródszpikowych
Wentylacja	Maquet Servo1
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Materiał
Cylindry i nasadki	Boutyplast	Dostosowany	skład: PEEK (polieteroeteroketon)
Ręczny wałek samopodtrzymujący	GlobalD	ACT1K
Ruchomy uchwyt do wału samopodtrzymującego	GlobalD	MTM
Samowiercący	GlobalD	VA1.2KL4	z napędem krzyżowym wykonane z tytanu grade5, ISO 5832-3
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Taca chirurgiczna
Rurka dotchawicza Shiley średnica 2,5mm	Covidien	86233	Do intubacji
Rurka dotchawicza Shiley średnica 4,9mm	Covidien	107-35G	Do intubacji
Ethicon prolene 4-0	Ehticon	8581H	Kleszcze do szwów niewchłanialnych
	Marcel Blanc	BD027R	145 mm
Cewnik do intubacji	Przewodnik medyczny		dotyczący intubacji
Uchwyt na igłę	Marcel Blanc	BM008R
Igły BD Microlance3	Becton Dickinson	300300/304622	26G; 18G
Periosteal	HU-Friedy	P9X
Okrągłe wiertła chirurgiczne	Patterson	78000	o średnicy 0,8 mm, Wiercenie otworów śródszpikowych
Skalpel	Swann-Morton		n° 10 oraz n° 15
Nożyczki	Marcel Blanc	00657	180 mm
Omnifix	Braun	4616057V	5ml, 10ml i 50ml
Venflon G22	Braun	42690985-01	Vasofix bezpieczeństwo dla linii dożylnej ucha

References

Anderud, J., et al. Guided bone augmentation using a ceramic space-maintaining device. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology and Oral Radiology. 118 (5), 532-538 (2014).
Lundgren, A. K., Lundgren, D., Hammerle, C. H., Nyman, S., Sennerby, L. Influence of decortication of the donor bone on guided bone augmentation. An experimental study in the rabbit skull bone. Clinical Oral Implants Research. 11 (2), 99-106 (2000).
Lundgren, D., Lundgren, A. K., Sennerby, L., Nyman, S. Augmentation of intramembraneous bone beyond the skeletal envelope using an occlusive titanium barrier. An experimental study in the rabbit. Clinical Oral Implants Research. 6 (2), 67-72 (1995).
Slotte, C., Lundgren, D. Impact of cortical perforations of contiguous donor bone in a guided bone augmentation procedure: an experimental study in the rabbit skull. Clinical Implant Dentistry and Relat Research. 4 (1), 1-10 (2002).
Tamura, T., et al. Three-dimensional evaluation for augmented bone using guided bone regeneration. Journal of Periodontal Research. 40 (3), 269-276 (2005).
Yamada, Y., et al. Correlation in the densities of augmented and existing bone in guided bone augmentation. Clinical Oral Implants Research. 23 (7), 837-845 (2012).
Chierico, A., et al. Electrically charged GTAM membranes stimulate osteogenesis in rabbit calvarial defects. Clinical Oral Implants Research. 10 (5), 415-424 (1999).
Ikeno, M., Hibi, H., Kinoshita, K., Hattori, H., Ueda, M. Effects of the permeability of shields with autologous bone grafts on bone augmentation. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 28 (6), e386-e392 (2013).
Ito, K., Nanba, K., Murai, S. Effects of bioabsorbable and non-resorbable barrier membranes on bone augmentation in rabbit calvaria. Journal of Periodontology. 69 (11), 1229-1237 (1998).
Lee, Y. M., et al. Enhanced bone augmentation by controlled release of recombinant human bone morphogenetic protein-2 from bioabsorbable membranes. Journal of Periodontology. 74 (6), 865-872 (2003).
Fugl, A., et al. S-nitroso albumin enhances bone formation in a rabbit calvaria model. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 43 (3), 381-386 (2014).
Ikeno, M., Hibi, H., Kinoshita, K., Hattori, H., Ueda, M. Effects of self-assembling peptide hydrogel scaffold on bone regeneration with recombinant human bone morphogenetic protein-2. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 28 (5), e283-e289 (2013).
Ito, K., et al. Effects of ipriflavone on augmented bone using a guided bone regeneration procedure. Clinical Oral Implants Research. 18 (1), 60-68 (2007).
Jung, R. E., Hammerle, C. H., Kokovic, V., Weber, F. E. Bone regeneration using a synthetic matrix containing a parathyroid hormone peptide combined with a grafting material. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 22 (2), 258-266 (2007).
Minegishi, T., et al. Effects of ipriflavone on bone augmentation within a titanium cap in rabbit calvaria. Journal of Oral Science. 44 (1), 7-11 (2002).
Moussa, M., et al. Medium-Term Function of a 3D Printed TCP/HA Structure as a New Osteoconductive Scaffold for Vertical Bone Augmentation: A Simulation by BMP-2 Activation. Materials. 8 (5), 2174-2190 (2015).
Thoma, D. S., Kruse, A., Ghayor, C., Jung, R. E., Weber, F. E. Bone augmentation using a synthetic hydroxyapatite/silica oxide-based and a xenogenic hydroxyapatite-based bone substitute materials with and without recombinant human bone morphogenetic protein-2. Clinical Oral Implants Research. 26 (5), 592-598 (2014).
Busenlechner, D., et al. Resorption of deproteinized bovine bone mineral in a porcine calvaria augmentation model. Clinical Oral Implants Research. 23 (1), 95-99 (2012).
Busenlechner, D., et al. Paste-like inorganic bone matrix: preclinical testing of a prototype preparation in the porcine calvaria. Clinical Oral Implants Research. 20 (10), 1099-1104 (2009).
Busenlechner, D., et al. Simultaneous in vivo comparison of bone substitutes in a guided bone regeneration model. Biomaterials. 29 (22), 3195-3200 (2008).
Carrel, J. P., et al. A 3D printed TCP/HA structure as a new osteoconductive scaffold for vertical bone augmentation. Clinical Oral Implants Research. 27 (1), 55-62 (2016).
Murai, M., et al. Effects of different sizes of beta-tricalcium phosphate particles on bone augmentation within a titanium cap in rabbit calvarium. Dental Materials Journal. 25 (1), 87-96 (2006).
Nishida, T., et al. Effects of bioactive glass on bone augmentation within a titanium cap in rabbit parietal bone. Journal of Periodontology. 77 (6), 983-989 (2006).
Nyan, M., et al. Feasibility of alpha tricalcium phosphate for vertical bone augmentation. Journal of Investigating and Clinical Dentistry. 5 (2), 109-116 (2012).
Polimeni, G., et al. Histopathological observations of a polylactic acid-based device intended for guided bone/tissue regeneration. Clinical Implant Dentistry and Related Research. 10 (2), 99-105 (2008).
Polo, C. I., et al. Effect of recombinant human bone morphogenetic protein 2 associated with a variety of bone substitutes on vertical guided bone regeneration in rabbit calvarium. Journal of Periodontology. 84 (3), 360-370 (2013).
Slotte, C., Lundgren, D., Burgos, P. M. Placement of autogeneic bone chips or bovine bone mineral in guided bone augmentation: a rabbit skull study. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 18 (6), 795-806 (2003).
Tamimi, F. M., et al. Bone augmentation in rabbit calvariae: comparative study between Bio-Oss and a novel beta-TCP/DCPD granulate. Journal of Clinical Periodontology. 33 (12), 922-928 (2006).
Torres, J., et al. Effect of solely applied platelet-rich plasma on osseous regeneration compared to Bio-Oss: a morphometric and densitometric study on rabbit calvaria. Clinical Implant Dentistry and Related Research. 10 (2), 106-112 (2008).
Yamada, Y., et al. Angiogenesis in newly augmented bone observed in rabbit calvarium using a titanium cap. Clinical Oral Implants Research. 19 (10), 1003-1009 (2008).
Cordaro, L., Terheyden, H., Wismeijer, D., Chen, S., Buser, D. . ITI Treatment Guide. 7, (2014).
Pearce, A. I., Richards, R. G., Milz, S., Schneider, E., Pearce, S. G. Animal models for implant biomaterial research in bone: A review. European Cells & Materials. 13, 1-10 (2007).
Min, S., et al. Effects of marrow penetration on bone augmentation within a titanium cap in rabbit calvarium. Journal of Periodontology. 78 (10), 1978-1984 (2007).
Braun, T. M., Giannobile, W. V., Nevins, M. Ch. 4. Osteology guidelines for oral and maxillofacial regeneration Preclinical models for translational research. , 31-43 (2011).
Doro, D. H., Grigoriadis, A. E., Liu, K. J. Calvarial Suture-Derived Stem Cells and Their Contribution to Cranial Bone Repair. Frontiers in Physiology. 8, 956 (2017).
Russel, W., Burch, R. . The principles of humane experimental technique. , (1959).
Asvanund, P., Chunhabundit, P. Alveolar bone regeneration by implantation of nacre and B-tricalcium phosphate in guinea pig. Implant Dentistry. 21 (3), 248-253 (2012).
Gielkens, P. F., et al. Gore-Tex as barrier membranes in rat mandibular defects: an evaluation by microradiography and micro-CT. Clinical Oral Implants Research. 19 (5), 516-521 (2008).
Lioubavina, N., Kostopoulos, L., Wenzel, A., Karring, T. Long-term stability of jaw bone tuberosities formed by "guided tissue regeneration&#34. Clinical Oral Implants Research. 10 (6), 477-486 (1999).
Mardas, N., Kostopoulos, L., Stavropoulos, A., Karring, T. Osteogenesis by guided tissue regeneration and demineralized bone matrix. Journal of Clinical Periodontology. 30 (3), 176-183 (2003).
Stavropoulos, A., Kostopoulos, L., Mardas, N., Nyengaard, J. R., Karring, T. Deproteinized bovine bone used as an adjunct to guided bone augmentation: an experimental study in the rat. Clinical Implant Dentistry and Related Research. 3 (3), 156-165 (2001).
Stavropoulos, A., Kostopoulos, L., Nyengaard, J. R., Karring, T. Deproteinized bovine bone (Bio-Oss) and bioactive glass (Biogran) arrest bone formation when used as an adjunct to guided tissue regeneration (GTR): an experimental study in the rat. Journal of Clinical Periodontology. 30 (7), 636-643 (2003).
Stavropoulos, A., Kostopoulos, L., Nyengaard, J. R., Karring, T. Fate of bone formed by guided tissue regeneration with or without grafting of Bio-Oss or Biogran. An experimental study in the rat. Journal of Clinical Periodontology. 31 (1), 30-39 (2004).
Stavropoulos, A., Nyengaard, J. R., Kostopoulos, L., Karring, T. Implant placement in bone formed beyond the skeletal envelope by means of guided tissue regeneration: an experimental study in the rat. Journal of Clinical Periodontology. 32 (10), 1108-1115 (2005).
Thomaidis, V., et al. Comparative study of 5 different membranes for guided bone regeneration of rabbit mandibular defects beyond critical size. Medical Science Monitor. 14 (4), (2008).
Zhang, J. C., et al. The repair of critical-size defects with porous hydroxyapatite/polyamide nanocomposite: an experimental study in rabbit mandibles. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 39 (5), 469-477 (2010).
Zhang, X., et al. Osteoconductive effectiveness of bone graft derived from antler cancellous bone: an experimental study in the rabbit mandible defect model. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 41 (11), 1330-1337 (2012).
Bronoosh, P., et al. Effects of low-intensity pulsed ultrasound on healing of mandibular bone defects: an experimental study in rabbits. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 44 (2), 277-284 (2015).
Gomes, F. V., et al. Low-level laser therapy improves peri-implant bone formation: resonance frequency, electron microscopy, and stereology findings in a rabbit model. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 44 (2), 245-251 (2014).
Lalani, Z., et al. Spatial and temporal localization of secretory IgA in healing tooth extraction sockets in a rabbit model. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 62 (4), 466-472 (2004).
Osorio, L. B., et al. Post-extraction evaluation of sockets with one plate loss--a microtomographic and histological study. Clinical Oral Implants Research. 27 (1), 31-38 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request Permission

Play Video

Kalwaryjny model augmentacji kości u królika do oceny wzrostu kości i neowaskularyzacji w materiałach kościozastępczych